JPWO2021261483A5

JPWO2021261483A5 -

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Publication number: JPWO2021261483A5
Application number: JP2022532492A
Authority: JP
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2023-04-28

Description

本件発明者らが検討したところ、国際公開第２０１７／１４２０２５号に記載の発明において具体化されているＭＲＭ法により蛋白質断片化率（Ｆｎ）を求める手法は、測定に供するまでの試料の前処理に通常２～３日もかかってしまい、しかも人の手による作業が頻繁に必要であり、誤差が生じやすいのみならず、同時に多検体を迅速に検査できる性質（以下、「ハイスループット性」という。）に関し難点があり、臨床的な実用に供しにくいという課題があることが分かった。

しかし、単に国際公開第２０１７／１４２０２５号に記載のＭＲＭ法をサンドイッチ法に変更しようとしても、サンドイッチ法については発明が具体化されてない場合もあり、直ちに実施するのが困難な場合があることが分かった。たとえば、特許文献１においては、中間の配列のピーク強度と、特定配列のピーク強度とから断片化率を求めているが、特定配列のピーク強度をサンドイッチ法で得ることは困難であった。本発明者らが鋭意検討してサンドイッチ法を適用したが、国際公開第２０１７／１４２０２５号に記載のＲＯＣ（receiver operating characteristic）－ＡＵＣ（area under the curve）値は得られなかった。

市販の抗ＨＥ４抗体（Product No.ab200828、Abcam）（抗Ｎ末端側領域抗体）を用いて、標準ペプチド１、標準ペプチド２及び標準ペプチド４に対して常法にてＥＬＩＳＡを行った際の、吸光度と標準ペプチドの濃度との相関をプロットしたグラフである。クレアチニン濃度を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化した値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。クレアチニン濃度を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化していない値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。クレアチニン濃度を基準量とした場合の、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフである。総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化した値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化していない値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフである。クレアチニン濃度を基準量とした場合の、新規被検体を修正判定値で判定した際の値を患者及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。

本実施形態における第一マイクロプレートは、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片と特異的に結合する２種の抗体を含み、前記２種の抗体のうちの１つがマイクロプレートＡに固相化されている。固相化は、全てのくぼみに行われていることが好ましいが、これに制限されるものではない。また、固相化される抗体は、前述の２つの抗体のうちの１つのみであることが好ましい。

（２－２）第一断片量の測定
各肺腺癌患者及び健常者から得られた試料中の第一断片量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96 well solid plates、Merck）の各ウェルに、一次抗体として前記した抗Ｎ末端側領域抗体を、１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（以下、「ＢＳＡ－ＰＢＳ」とする。）で１：４０００に希釈したものを１００μＬ添加し、４℃で一晩固定化した。その後ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ブロッキングワン（Product No.03953-66、ナカライテスク）を純水で１：５に希釈したものを１ウェルあたり２００μＬ加えて２５℃で２時間インキュベートし、その後Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ」とする。）で３回洗浄を実施した。その後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：３に希釈した試料を１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、二次抗体として第一抗Ｃ末端抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈したものを、１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、抗ニワトリＩｇＹ抗体である、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Chicken IgY(IgG)(H+L)、Product No.703-035-155、Jackson IRL）をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈して１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎにて洗浄を５回実施した。そして、基質としてTMB Substrate Ultra Solution（Product No.ES022-100ML、Merck)を１ウェルあたり１００μＬ添加した。２５℃で５～１０分酵素反応後に硫酸の添加によって反応をストップさせ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（iMark マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて測定した。測定した吸光度を、あらかじめ前記標準ペプチド１を用いて作成した検量線に当てはめ、第一断片量を算出した。

正規化していない第一判定値については、閾値を０．１４１としたときに、ＭＳＥが０．０００２４５と最小となった。また、正規化しない第二判定値については、閾値を０．４８５としたときに、ＭＳＥが０．０２と最小となった。また、正規化していない修正判定値（１０倍）については、閾値を２．１としたときに、ＭＳＥが０．００６９と最小となった。また、正規化していない修正判定値（２０倍）については、閾値を３．６６８としたときに、ＭＳＥが０．０３となった。さらに、正規化してない修正判定値（３０倍）については、閾値を５．１９２としたときに、ＭＳＥが０．０８７となった。

（３－１）総ＷＦＤＣ２蛋白質量の測定
実施例１と同じ試料について、試料中の総ＷＦＤＣ２蛋白質量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96 well solid plates、Merck）の各ウェルに、一次抗体として前記した第三抗Ｃ末端抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：８０００に希釈したものを１００μＬ添加し、４℃で一晩固定化した。その後ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ブロッキングワン（Product No. 03953-66、ナカライテスク）を純水で１：５に希釈したものを１ウェルあたり２００μＬ加えて２５℃で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：３に希釈した試料を１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で２時間でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、二次抗体として前記した抗Ｎ末端側領域抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：１０００に希釈したものを１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。前述の抗Ｎ末端側領域抗体を認識する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Rabbit IgG,Product No.711-035-152、Jackson IRL)をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈したものを１ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎにて洗浄を５回実施した。そして、基質としてTMB Substrate Ultra Solution（Product No.ES022-100ML、Merck）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。２５℃で５～１０分酵素反応後に硫酸の添加によって反応をストップさせ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（iMark マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて測定した。測定した吸光度を、あらかじめ前記標準ペプチド３を用いて作成した検量線に当てはめ、総ＷＦＤＣ２蛋白質量を算出した。