JPWO2021163546A5

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Publication number: JPWO2021163546A5
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Publication date: 2024-02-20

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[本発明1001]
a）部分的二本鎖3'アダプター（3'PDSA）を、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端に結合させる段階であって、
3'PDSAの第1の鎖が、5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、
3'PDSAの第2の鎖が、5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含む、段階、
b）5'アダプターを該アニーリング部位にアニールする段階であって、5'アダプターが、5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）5'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、段階；
c）外因性UID配列および該第1のセグメントにわたり5'アダプターを伸長し、それにより、該外因性UID配列の相補体および該第1のセグメントの相補体を生成する段階、ならびに
d）該第1のセグメントの該相補体の3'末端を二本鎖DNA断片のワトソン鎖およびクリック鎖の5'末端に共有結合的に連結し、それにより、アダプターとライゲートした複数の二本鎖DNA断片を生成する段階
を含む方法。
[本発明1002]
前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的な第1のプライマー、および、前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的な第2のプライマーを用いて、アダプターとライゲートした前記複数の二本鎖DNA断片を増幅し、それにより、アンプリコンを生成する段階
をさらに含み、該アンプリコンが、複数の二本鎖ワトソンテンプレートおよび複数の二本鎖クリックテンプレートを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて前記二本鎖ワトソンテンプレートを選択的に増幅し、それにより、標的ワトソン増幅産物を作製する段階であって、ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットが、（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）標的選択的配列を含む第2のワトソン標的選択的プライマーを含む、段階
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
クリック標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて前記二本鎖クリックテンプレートを選択的に増幅し、それにより、標的クリック増幅産物を作製する段階であって、クリック標的選択的プライマー対の第1のセットが、（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分の相補体に相補的な配列を含む第1のクリック標的選択的プライマー、および（ii）第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む第2のクリック標的選択的プライマーを含む、段階
をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記3'PDSAの前記第2の鎖を除去して一本鎖3'アダプター（3'SSA）を生成する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記第2の鎖を除去する段階が、ステップb）の後、またはステップb）の前、またはステップb）の最中に存在する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記第2の鎖が、1つまたは複数のデオキシウリジンを含み、前記3'PDSAの前記第2の鎖を除去する段階が、該第2の鎖を分解するために3'デュプレックスアダプターをウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）と接触させることを含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記第2の鎖を除去する段階が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって達成され、該ポリメラーゼが、外因性UID配列および前記第1のセグメントにわたり5'アダプターを伸長する、本発明1005の方法。
[本発明1009]
1つまたは複数の前記アンプリコンの配列リードを決定する段階をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1010]
配列リードをUIDファミリーに割り当てる段階であって、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む、段階
をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
外因性UID配列とR1およびR2リード配列との空間的関係に基づき、各UIDファミリーの配列リードをワトソンサブファミリーおよびクリックサブファミリーに割り当てる段階をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
ワトソンサブファミリーの少なくとも50％が、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のワトソン鎖を正確に表すと該配列を特定する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
クリックサブファミリーの少なくとも50％が、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のクリック鎖を正確に表すと該配列を特定する段階をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、ワトソン鎖を正確に表すと該変異を特定する段階をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1015]
クリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、クリック鎖を正確に表すと該変異を特定する段階をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異およびクリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異が同じ変異である場合に、被分析DNA断片中の変異を特定する段階をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
UIDファミリーの各メンバーが、同じ内因性UID配列をさらに含み、内因性UID配列が、集団からの二本鎖DNA断片の末端を含む、本発明1010の方法。
[本発明1018]
前記二本鎖DNA断片集団が平滑末端を有する、本発明1001の方法。
[本発明1019]
a）二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端にライゲートされるように構成された部分的二本鎖3'アダプター（3'PDSA）の集団であって、
3'PDSAの第1の鎖が、5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、
3'PDSAの第2の鎖が、5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含む、集団；ならびに
b）該アニーリング部位にアニールするように構成された5'アダプターの集団であって、5'アダプターが、5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）3'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、集団
を含むシステム。
[本発明1020]
c）生物学的試料からの前記二本鎖DNA断片集団
をさらに含む、本発明1019のシステム。
[本発明1021]
前記二本鎖DNA断片集団が平滑末端を有する、本発明1020のシステム。
[本発明1022]
c）前記3'PDSAの前記第2の鎖を分解して一本鎖3'アダプター（3'SSA）を生成するための試薬
をさらに含む、本発明1019のシステム。
[本発明1023]
c）前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的な第1のプライマー、および、前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的な第2のプライマー
をさらに含む、本発明1019のシステム。
[本発明1024]
c）前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的なワトソンアンカープライマー、および
d）前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的なクリックアンカープライマー
をさらに含む、本発明1019のシステム。
[本発明1025]
c）（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む1つまたは複数の第1のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）各々が標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のワトソン標的選択的プライマー
を含むワトソン標的選択的プライマー対の第1のセット、ならびに
d）（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分の相補体に相補的な配列を含む1つまたは複数のクリック標的選択的プライマー、および（ii）各々が第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のクリック標的選択的プライマー
を含むクリック標的選択的プライマー対の第1のセット
をさらに含む、本発明1019のシステム。
[本発明1026]
a）i）脱リン酸化および末端平滑化された複数の二本鎖DNA断片であって、各々がワトソン鎖およびクリック鎖を含む、該二本鎖DNA断片；
ii）各々が5'→3'方向に、A）バーコード、およびB）ユニバーサル3'アダプター配列を含む、複数のアダプター；ならびに
iii）リガーゼ
を含む反応混合物を形成する段階と；
b）i）アダプターがワトソン鎖およびクリック鎖の3'末端にライゲートされ、ii）アダプターがワトソン鎖およびクリック鎖のいずれの5'末端にもライゲートされない
ように該反応混合物をインキュベートし、それにより、二本鎖ライゲーション産物を生成する段階と
を含む方法。
[本発明1027]
前記複数のアダプターの各々が、固有のバーコードを含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記二本鎖ライゲーション産物の各々が、バーコードを1つだけ有するワトソン鎖と、該ワトソン鎖上の該バーコードとは異なるバーコードを1つだけ有するクリック鎖とを含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
哺乳動物由来の試料から得られた二本鎖DNAテンプレートの標的領域における変異の存在または非存在を検出するためおよび変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するための方法であって、
A）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階；
B）増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーを生成するために、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を増幅する段階であって、増幅することが、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を、ユニバーサルプライマー対と全ゲノムPCR条件下で接触させることを含む、段階；
C）任意で、増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからワトソン鎖の一本鎖DNAライブラリーを生成する段階；
D）任意で、増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからクリック鎖の一本鎖DNAライブラリーを生成する段階；
E）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含むプライマー対を使用してワトソン鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階；
F）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含むプライマー対を使用してクリック鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階；
G）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のワトソン鎖における変異の存在または非存在を検出するために、ワトソン鎖のDNAライブラリーから増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
H）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のクリック鎖における変異の存在または非存在を検出するために、クリック鎖のDNAライブラリーから増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
I）変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するために、各シーケンシングリード中に存在する分子バーコードによってシーケンシングリードをグループ分けする段階
を含む方法。
[本発明1030]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階が、
i）二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端に3'デュプレックスアダプターをライゲートすることであって、3'デュプレックスアダプターが、
a）5'ホスフェート、第1の分子バーコード、および3'オリゴヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドと、それとアニールした
b）分解可能な3'ブロッキング基を含む第2のオリゴヌクレオチドと
を含み、3'オリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド配列が相補的である、こと；
ii）分解可能な3'ブロッキング基を分解すること；
iii）5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることであって、5'デュプレックスアダプターが、第2の分子バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含み、第2の分子バーコードが第1の分子バーコードとは異なっており、5'アダプターが、第1の分子バーコード上流の二本鎖DNA断片に、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを残したままライゲートされる、こと；ならびに
iv）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を生成するために、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めること
を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからワトソン鎖のDNAライブラリーを生成する段階が、
i）タグ付きワトソン鎖を有する二本鎖増幅産物を生成するために、第1のプライマーおよび第2のプライマーからなるプライマー対を使用して、増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーの第1のアリコートを増幅することであって、第1のプライマーがワトソン鎖にハイブリダイズすることが可能であり、第1のプライマーがタグを含む、こと；
ii）一本鎖タグ付きワトソン鎖および一本鎖クリック鎖を生成するために、タグ付きワトソン鎖を有する二本鎖増幅産物を変性させること；ならびに
iii）増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからワトソン鎖のDNAライブラリーを生成するために、一本鎖タグ付きワトソン鎖を回収すること
を含む、本発明1029の方法。
[本発明1032]
二本鎖DNAテンプレートが哺乳動物由来の試料から得られ、増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからクリック鎖のDNAライブラリーを生成する段階が、
i）タグ付きクリック鎖を有する二本鎖増幅産物を生成するために、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含むプライマー対を使用して、増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーの第2のアリコートを増幅することであって、第1のプライマーがクリック鎖にハイブリダイズすることが可能であり、第1のプライマーがタグを含む、こと；
ii）一本鎖タグ付きクリック鎖および一本鎖ワトソン鎖を生成するために、タグ付きクリック鎖を有する二本鎖増幅産物を変性させること；ならびに
iii）増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからクリック鎖のDNAライブラリーを生成するために、一本鎖タグ付きクリック鎖を回収すること
を含む、本発明1029～1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
哺乳動物がヒトである、本発明1029～1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を生成する段階の前に、
二本鎖DNA断片を生成するために二本鎖DNAを断片化する段階；
二本鎖DNA断片の5'末端を脱リン酸化する段階；および
二本鎖DNA断片の末端を平滑化する段階
をさらに含む、本発明1029～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
3'デュプレックスアダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端にライゲートすることが、3'デュプレックスアダプターと、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とをリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1029～1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
リガーゼがT4 DNAリガーゼである、本発明1035の方法。
[本発明1037]
分解可能な3'ブロッキング基を分解することが、3'デュプレックスアダプターをウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）と接触させることを含む、本発明1029～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることが、5'アダプターと、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とをリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1029～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
リガーゼが大腸菌（Escherichia coli）リガーゼである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めることが、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとをポリメラーゼおよびdNTPの存在下で接触させることを含む、本発明1029～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
ポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、本発明1040の方法。
[本発明1042]
5'アダプターを二本鎖DNA断片の各5'末端にライゲートすること、および二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間のギャップを埋めることが同時に行われる、本発明1029～1031のいずれかの方法。
[本発明1043]
増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーを生成するために、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を増幅する段階が、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片をユニバーサルプライマー対とPCR条件下で接触させることを含む、本発明1029～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
増幅することが全ゲノムPCRを含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
タグ付きプライマーがビオチン化プライマーであり、ビオチン化プライマーが、ビオチン化一本鎖ワトソン鎖およびビオチン化一本鎖クリック鎖を生成することができる、本発明1029～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
変性させるステップが、NaOH変性、熱変性、または両者の組み合わせを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
回収するステップが、タグ付きワトソン鎖をストレプトアビジン官能化ビーズと接触させること、およびタグ付きクリック鎖をストレプトアビジン官能化ビーズと接触させることを含む、本発明1045または本発明1046の方法。
[本発明1048]
回収するステップが、タグなしワトソン鎖を変性させることおよびタグなしワトソン鎖を変性させることをさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
回収するステップが、ストレプトアビジン官能化ビーズからビオチン化一本鎖ワトソン鎖を放出させることおよびストレプトアビジン官能化ビーズからビオチン化一本鎖クリック鎖を放出させることをさらに含む、本発明1047または本発明1048の方法。
[本発明1050]
タグ付きプライマーがリン酸化プライマーであり、リン酸化プライマーが、リン酸化一本鎖ワトソン鎖およびリン酸化一本鎖クリック鎖を生成することができる、本発明1029～1044のいずれかの方法。
[本発明1051]
変性させるステップがラムダエキソヌクレアーゼ消化を含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
ワトソン鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含み；クリック鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含む、本発明1029～1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
シーケンシングするステップがペアエンドシーケンシングを含む、本発明1029～1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
哺乳動物由来の試料から得られた二本鎖DNAテンプレートの標的領域中の変異の存在または非存在を検出するためおよび変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するための方法であって、
A）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階；
B）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片由来の増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからワトソン鎖のDNAライブラリーおよびクリック鎖のDNAライブラリーを生成する段階；
C）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーからなるプライマー対を使用して一本鎖ワトソン鎖から標的領域を増幅する段階；
D）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーからなるプライマー対を使用して一本鎖クリック鎖から標的領域を増幅する段階；
E）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のワトソン鎖における変異の存在または非存在を検出するために、ワトソン鎖のDNAライブラリーから増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
F）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のクリック鎖における変異の存在または非存在を検出するために、クリック鎖のDNAライブラリーから増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
G）変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するために、各シーケンシングリードに存在する分子バーコードによってシーケンシングリードをグループ分けする段階
を含む方法。
[本発明1055]
二本鎖DNAテンプレートがゲノムDNA試料であり、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階が、
i）3'デュプレックスアダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端にライゲートすることであって、3'デュプレックスアダプターが、
a）5'ホスフェート、第1の分子バーコード、および3'オリゴヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドと、それとアニールした
b）分解可能な3'ブロッキング基を含む第2のオリゴヌクレオチドと
を含み、3'オリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド配列が相補的である、こと；
ii）分解可能な3'ブロッキング基を分解すること；
iii）5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることであって、5'デュプレックスアダプターが、第2の分子バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含み、第2の分子バーコードが第1の分子バーコードとは異なっており、5'アダプターが第1の分子バーコード上流の二本鎖DNA断片に、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを残したままライゲートされる、こと；ならびに
iv）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を生成するために、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めること
を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
二本鎖DNAテンプレートが無細胞DNA試料であり、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片由来の増幅されたデュプレックスシーケンシングライブラリーからワトソン鎖のDNAライブラリーおよびクリック鎖のDNAライブラリーを生成する段階が、
i）ビオチン化ワトソン鎖を有する二本鎖増幅産物を生成するために、第1のプライマーおよび第2のプライマーからなるユニバーサルプライマー対を使用して二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を増幅することであって、増幅することが、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片をプライマー対と全ゲノムPCR条件下で接触させることを含み、第1のプライマーがワトソン鎖にハイブリダイズすることが可能であり、第1のプライマーがビオチン化される、こと；
ii）ビオチン化ワトソン鎖を有する二本鎖増幅産物をストレプトアビジン官能化ビーズと、ビオチン化ワトソン鎖がストレプトアビジン官能化ビーズに結合する条件下で接触させること；
iii）一本鎖ビオチン化ワトソン鎖をストレプトアビジン官能化ビーズに結合したままにするため、および一本鎖クリック鎖を放出させるために、ビオチン化ワトソン鎖を有する二本鎖増幅産物を変性させること；
iv）一本鎖クリック鎖を収集すること；
v）ストレプトアビジン官能化ビーズから一本鎖ビオチン化ワトソン鎖を放出させること；ならびに
vi）一本鎖ビオチン化ワトソン鎖を収集すること
を含む、本発明1054の方法。
[本発明1057]
二本鎖DNAテンプレートが、哺乳動物由来の試料から得られる、本発明1054～1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
哺乳動物がヒトである、本発明1054～1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を生成する段階の前に、
二本鎖DNA断片を生成するために二本鎖DNAを断片化する段階；
二本鎖DNA断片の5'末端を脱リン酸化する段階；および
二本鎖DNA断片の末端を平滑化する段階
をさらに含む、本発明1054～1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
3'デュプレックスアダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端にライゲートすることが、3'デュプレックスアダプターと、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とをリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1054～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
リガーゼがT4 DNAリガーゼである、本発明1060の方法。
[本発明1062]
分解可能な3'ブロッキング基を分解することが、3'デュプレックスアダプターをウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）と接触させることを含む、本発明1054～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることが、5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1054～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
リガーゼが大腸菌リガーゼである、本発明1063の方法。
[本発明1065]
二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めることが、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとをポリメラーゼおよびdNTPの存在下で接触させることを含む、本発明1054～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
ポリメラーゼがTaq-Bポリメラーゼである、本発明1065の方法。
[本発明1067]
5'アダプターを二本鎖DNA断片の各5'末端にライゲートすること、および二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間のギャップを埋めることが、同時に行われる、本発明1054～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を増幅することが、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片をプライマー対とPCR条件下で接触させることを含む、本発明1054～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
増幅することが全ゲノムPCRを含む、本発明1068の方法。
[本発明1070]
ワトソン鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含み；クリック鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含む、本発明1054～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
シーケンシングするステップがペアエンドシーケンシングまたはシングルエンドシーケンシングを含む、本発明1054～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
哺乳動物由来の試料から得られた二本鎖DNAテンプレートの標的領域における変異の存在または非存在を検出するためおよび変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するための方法であって、
A）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階；
B）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を、ユニバーサルプライマー対を使用して増幅する段階であって、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片をプライマー対と全ゲノムPCR条件下で接触させることを含む、段階；
C）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーからなるプライマー対を使用して、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する増幅された二本鎖DNA断片のワトソン鎖から標的領域を増幅する段階；
D）標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーからなるプライマー対を使用して、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する増幅された二本鎖DNA断片のクリック鎖から標的領域を増幅する段階；
E）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のワトソン鎖における変異の存在または非存在を検出するために、ワトソン鎖から増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
F）シーケンシングリードを生成するため、および標的領域のクリック鎖における変異の存在または非存在を検出するために、クリック鎖から増幅された標的領域をシーケンシングする段階；
G）変異が二本鎖DNAテンプレートの両方の鎖に存在するかを判定するために、各シーケンシングリードに存在する分子バーコードによってシーケンシングリードをグループ分けする段階
を含む方法。
[本発明1073]
二本鎖DNAテンプレートがゲノムDNA試料であり、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを各々有する該二本鎖DNA断片を生成する段階が、
i）3'デュプレックスアダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端にライゲートすることであって、3'デュプレックスアダプターが、
a）5'ホスフェート、第1の分子バーコード、および3'オリゴヌクレオチドを含む、第1のオリゴヌクレオチドと、それとアニールした
b）分解可能な3'ブロッキング基を含む第2のオリゴヌクレオチドと
を含み、3'オリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチド配列が相補的である、こと；
ii）分解可能な3'ブロッキング基を分解すること；
iii）5'アダプターを、二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることであって、5'デュプレックスアダプターが、第2の分子バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含み、第2の分子バーコードが第1の分子バーコードとは異なっており、5'アダプターが、第1の分子バーコード上流の二本鎖DNA断片に、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを残したままライゲートされる、こと；ならびに
iv）二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片を生成するために、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めること
を含む、本発明1072の方法。
[本発明1074]
二本鎖DNAテンプレートが無細胞DNA試料である、本発明1073の方法。
[本発明1075]
二本鎖DNAテンプレートがゲノムDNA試料である、本発明1072～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
哺乳動物がヒトである、本発明1072～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を生成する段階の前に、
二本鎖DNA断片を生成するために二本鎖DNAを断片化する段階；
二本鎖DNA断片の5'末端を脱リン酸化する段階；および
二本鎖DNA断片の末端を平滑化する段階
をさらに含む、本発明1072～1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
3'デュプレックスアダプターを二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各3'末端にライゲートすることが、3'デュプレックスアダプターと二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とをリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1072～1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
リガーゼがT4 DNAリガーゼである、本発明1050の方法。
[本発明1080]
分解可能な3'ブロッキング基を分解することが、3'デュプレックスアダプターをウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）と接触させることを含む、本発明1072～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
5'アダプターを二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片の各脱リン酸化5'末端にライゲートすることが、5'アダプターと二本鎖DNAテンプレートから得られた二本鎖DNA断片とをリガーゼの存在下で接触させることを含む、本発明1072～1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
リガーゼが大腸菌リガーゼである、本発明1081の方法。
[本発明1083]
二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間の一本鎖核酸のギャップを埋めることが、二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとをDNAポリメラーゼおよびdNTPの存在下で接触させることを含む、本発明1072～1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
DNAポリメラーゼがTaq-Bポリメラーゼである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
5'アダプターを二本鎖DNA断片の各5'末端にライゲートすることおよび二本鎖DNA断片の5'末端と5'アダプターとの間のギャップを埋めることが同時に行われる、本発明1072～1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを有する該二本鎖DNA断片を増幅することが、二本鎖DNA断片の各末端にデュプレックス分子バーコードを含む該二本鎖DNA断片をプライマー対とPCR条件下で接触させることを含む、本発明1072～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
増幅することが全ゲノムPCRを含む、本発明1086の方法。
[本発明1088]
ワトソン鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび3'デュプレックスアダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含み；クリック鎖のDNAライブラリーから標的領域を増幅する段階が、標的領域にハイブリダイズすることが可能な第1のプライマーおよび5'アダプターにハイブリダイズすることが可能な第2のプライマーを含む第2のプライマー対を使用する第2の増幅をさらに含む、本発明1072～1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
シーケンシングするステップが、ペアエンドシーケンシングを含む、本発明1072～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
a. 部分的二本鎖3'アダプターを、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端に結合させる段階であって、部分的二本鎖3'アダプターの第1の鎖が5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、部分的二本鎖3'アダプターの第2の鎖が5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含み、任意で、第2の鎖が分解可能である、段階；
b. アニーリング部位を介して5'アダプターを3'アダプターにアニールする段階であって、5'アダプターが5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）5'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、段階；
c. 5'アダプターを3'アダプターの外因性UID配列にわたり伸長して、伸長された5'アダプターを二本鎖DNA断片のワトソン鎖およびクリック鎖の5'末端に共有結合的に連結するために、ニックトランスレーション様反応を行う段階；
d. アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生するために、最初の増幅を行う段階；
e. アダプターとライゲートした1つまたは複数の二本鎖DNA断片の1つまたは複数のアンプリコンの配列リードを決定する段階；
f. 配列リードをUIDファミリーに割り当てる段階であって、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む、段階；
g. 外因性UID配列とR1およびR2リード配列との空間的関係に基づき、各UIDファミリーの配列リードをワトソンサブファミリーおよびクリックサブファミリーに割り当てる段階；
h. ワトソンサブファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のワトソン鎖を正確に表すと該配列を特定する段階；
i. クリックサブファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のクリック鎖を正確に表すと該配列を特定する段階；
j. ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、ワトソン鎖を正確に表す該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、該変異を特定する段階；
k. クリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、クリック鎖を正確に表す該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、該変異を特定する段階；ならびに
l. ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異およびクリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異が同じ変異である場合に、被分析DNA断片中の変異を特定する段階
を含む方法。
[本発明1091]
UIDファミリーの各メンバーが、同じ内因性UID配列をさらに含み、内因性UID配列が、集団からの二本鎖DNA断片の末端を含む、本発明1090の方法。
[本発明1092]
二本鎖DNA断片の末端を含む内因性UID配列が、少なくとも8、10、または15塩基を含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
外因性UID配列が各二本鎖DNA断片に固有である、本発明1090～1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
外因性UID配列が各二本鎖DNA断片に固有ではない、本発明1090～1092のいずれかの方法。
[本発明1095]
UIDファミリーの各メンバーが、同じ内因性UID配列および同じ外因性UID配列を含む、本発明1091～1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
ステップ（d）が、11サイクル以下のPCR増幅を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1097]
ステップ（d）が、7サイクル以下のPCR増幅を含む、本発明1096の方法。
[本発明1098]
ステップ（d）が、5サイクル以下のPCR増幅を含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
ステップ（d）が、少なくとも1サイクルのPCR増幅を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1100]
配列リードを決定する前に、アンプリコンが1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドについて富化される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1101]
富化することが、
a. ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて、標的ポリヌクレオチド配列を含むワトソン鎖のアンプリコンを選択的に増幅し、それにより、標的ワトソン増幅産物を作製することであって、ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットが、
（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のワトソン標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル3'アダプター配列の該一部分が、ユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位である、第1のワトソン標的選択的プライマー、および
（ii）標的選択的配列を含む第2のワトソン標的選択的プライマー
を含む、こと；ならびに
b. クリック標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて、同じ標的ポリヌクレオチド配列を含むクリック鎖のアンプリコンを選択的に増幅し、それにより、標的クリック増幅産物を作製することであって、クリック標的選択的プライマー対の第1のセットが、
（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のクリック標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル5'アダプター配列の該一部分がユニバーサル5'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位である、第1のクリック標的選択的プライマー、および
（ii）第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む第2のクリック標的選択的プライマー
を含む、こと
を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
非標的ポリヌクレオチドから標的ワトソン増幅産物および標的クリック増幅産物を精製する段階を含む、本発明1101の方法。
[本発明1103]
精製する段階が、標的ワトソン増幅産物および標的クリック増幅産物を固体支持体に結合させることを含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
第1のワトソン標的選択的プライマーおよび第1のクリック標的選択的プライマーが親和性結合対の第1のメンバーを含み、固体支持体が親和性結合対の第2のメンバーを含む、本発明1103の方法。
[本発明1105]
第1のメンバーがビオチンであり、第2のメンバーがストレプトアビジンである、本発明1104の方法。
[本発明1106]
固体支持体が、ビーズ、ウェル、メンブラン、チューブ、カラム、プレート、セファロース、磁気ビーズ、またはチップを含む、本発明1102～1105のいずれかの方法。
[本発明1107]
固体支持体に結合していないポリヌクレオチドを除去する段階を含む、本発明1102～1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
a. ワトソン標的選択的プライマーの第2のセットを用いて標的ワトソン増幅産物をさらに増幅し、それにより、標的ワトソンライブラリーのメンバーを作製する段階であって、ワトソン標的選択的プライマーの第2のセットが、
（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第3のワトソン標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル3'アダプター配列の該一部分がユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位である、第3のワトソン標的選択的プライマー、および
（ii）5'→3'方向に、R1シーケンシングプライマー部位と、同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、第4のワトソン標的選択的プライマー
を含む、段階；
b. クリック標的選択的プライマーの第2のセットを用いて標的クリック増幅産物をさらに増幅し、それにより、標的クリックライブラリーのメンバーを作製する段階であって、クリック標的選択的プライマーの第2のセットが、
（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第3のクリック標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル5'アダプター配列の該一部分がユニバーサル5'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位である、第3のクリック標的選択的プライマー、および
（ii）5'→3'方向に、R2シーケンシングプライマー部位と、第4のワトソン標的選択的プライマーの同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、第4のクリック標的選択的プライマー
を含む、段階
を含む、本発明1101～1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
第3のワトソン標的選択的プライマーおよび第3のクリック標的選択的プライマーが試料バーコード配列をさらに含む、本発明1108の方法。
[本発明1110]
第3のワトソン標的選択的プライマーが、シーケンサにおける第1の移植プライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする第1の移植配列をさらに含み、第3のクリック標的選択的プライマーが、シーケンサにおける第2の移植プライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする第2の移植配列をさらに含む、本発明1108または1109の方法。
[本発明1111]
第4のワトソン標的選択的プライマーが第2の移植配列をさらに含み、第4のクリック標的選択的プライマーが第1の移植配列をさらに含む、本発明1108～1110のいずれかの方法。
[本発明1112]
第1の移植配列がP7配列であり、第2の移植配列がP5配列である、本発明1110または1111の方法。
[本発明1113]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも50％に相当する、本発明1101～1112のいずれかの方法。
[本発明1114]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも70％に相当する、本発明1113の方法。
[本発明1115]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも80％に相当する、本発明1114の方法。
[本発明1116]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも90％に相当する、本発明1115の方法。
[本発明1117]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも50％に相当する、本発明1101～1112のいずれかの方法。
[本発明1118]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも70％に相当する、本発明1117の方法。
[本発明1119]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも80％に相当する、本発明1118の方法。
[本発明1120]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも90％に相当する、本発明1119の方法。
[本発明1121]
a. アダプターを被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片集団に結合させる段階であって、アダプターが、外因性UIDを含む二本鎖部分と、（i）R2シーケンシングプライマー部位を含む一本鎖3'アダプター配列および（ii）R1シーケンシングプライマー部位を含む一本鎖5'アダプター配列を含むフォーク型部分とを含む、段階；
b. アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生するために、最初の増幅を行う段階；
c. ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて、標的ポリヌクレオチド配列を含むワトソン鎖のアンプリコンを選択的に増幅し、それにより、標的ワトソン増幅産物を作製する段階であって、ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットが、
（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のワトソン標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル3'アダプター配列の該一部分がユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位である、第1のワトソン標的選択的プライマー、および
（ii）標的選択的配列を含む第2のワトソン標的選択的プライマー
を含む、段階
d. クリック標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて、同じ標的ポリヌクレオチド配列を含むクリック鎖のアンプリコンを選択的に増幅し、それにより、標的クリック増幅産物を作製する段階であって、クリック標的選択的プライマー対の第1のセットが、
ユニバーサル5'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のクリック標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル5'アダプター配列の該一部分がユニバーサル5'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位である、第1のクリック標的選択的プライマー、および
（ii）第2のクリック標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む第2のクリック標的選択的プライマー
を含む、段階；
e. 標的ワトソン増幅産物および標的クリック増幅産物の配列リードを決定する段階；
f. 配列リードをUIDファミリーに割り当てる段階であって、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む、段階；
g. 外因性UID配列とR1およびR2リード配列との空間的関係に基づき、各UIDファミリーの配列リードをワトソンサブファミリーおよびクリックサブファミリーに割り当てる段階；
h. ワトソンファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のワトソン鎖を正確に表すと該配列を特定する段階；
i. クリックファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のクリック鎖を正確に表すと該配列を特定する段階；ならびに
j. ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列およびクリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列が両方とも同じ変異を含有する場合に、被分析DNA断片中の変異を特定する段階
を含む方法。
[本発明1122]
標的ワトソン増幅産物および標的クリック増幅産物を非標的ポリヌクレオチドから精製する段階を含む、本発明1121の方法。
[本発明1123]
精製する段階が、標的ワトソン増幅産物および標的クリック増幅産物を固体支持体に結合させることを含む、本発明1122の方法。
[本発明1124]
第1のワトソン標的選択的プライマーおよび第1のクリック標的選択的プライマーが親和性結合対の第1のメンバーを含み、固体支持体が親和性結合対の第2のメンバーを含む、本発明1123の方法。
[本発明1125]
第1のメンバーがビオチンであり、第2のメンバーがストレプトアビジンである、本発明1124の方法。
[本発明1126]
固体支持体が、ビーズ、ウェル、メンブラン、チューブ、カラム、プレート、セファロース、磁気ビーズ、またはチップを含む、本発明1122～1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
固体支持体に結合していないポリヌクレオチドを除去する段階を含む、本発明1122～1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
a. ワトソン標的選択的プライマーの第2のセットを用いて標的ワトソン増幅産物をさらに増幅し、それにより、標的ワトソンライブラリーのメンバーを作製する段階であって、ワトソン標的選択的プライマーの第2のセットが、
（i）ユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位に相補的な配列を含む第3のワトソン標的選択的プライマー、および
（ii）5'→3'方向に、R1シーケンシングプライマー部位と、同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、第4のワトソン標的選択的プライマー
を含む、段階；
b. クリック標的選択的プライマーの第2のセットを用いて標的クリック増幅産物をさらに増幅し、それにより、標的クリックライブラリーのメンバーを作製する段階であって、クリック標的選択的プライマーの第2のセットが、
（i）ユニバーサル3'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位に相補的な配列を含む第3のクリック標的選択的プライマー、および
（ii）5'→3'方向に、R2シーケンシングプライマー部位と、第4のワトソン標的選択的プライマーの同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、第4のクリック標的選択的プライマー
を含む、段階
を含む、本発明1121～1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
第3のワトソン標的選択的プライマーおよび第3のクリック標的選択的プライマーが試料バーコード配列をさらに含む、本発明1128の方法。
[本発明1130]
第3のワトソン標的選択的プライマーが、シーケンサにおける第1の移植プライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする第1の移植配列をさらに含み、第3のクリック標的選択的プライマーが、シーケンサにおける第2の移植プライマーとのハイブリダイゼーションを可能にする第2の移植配列をさらに含む、本発明1128または1129の方法。
[本発明1131]
第4のワトソン標的選択的プライマーが第2の移植配列をさらに含み、第4のクリック標的選択的プライマーが第1の移植配列をさらに含む、本発明1128～1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
第1の移植配列がP7配列であり第2の移植配列がP5配列である、本発明1130または1131の方法。
[本発明1133]
結合させる段階が、A尾部を有するアダプターを二本鎖DNA断片集団に結合させることを含む、本発明1121～1131のいずれかの方法。
[本発明1134]
結合させる段階が、A尾部を有するアダプターを集団中のDNA断片の両末端に結合させることを含む、本発明1133の方法。
[本発明1135]
結合させる段階が、
a. 部分的二本鎖3'アダプターを、二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端に結合させることであって、部分的二本鎖3'アダプターの第1の鎖が、5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）任意で外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、部分的二本鎖3'アダプターの第2の鎖が、5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含み、任意で、第2の鎖が分解可能である、こと；ならびに
b. アニーリング部位を介して5'アダプターを3'アダプターにアニールすることであって、5'アダプターが、5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）5'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、こと；ならびに
c. 3'アダプターにわたって5'アダプターを伸長して、伸長された5'アダプターを二本鎖DNA断片のワトソン鎖およびクリック鎖の5'末端に共有結合的に連結するために、ニックトランスレーション様反応を行うこと
を含む、本発明1121～1131のいずれかの方法。
[本発明1136]
UID配列が、集団からの二本鎖DNA断片の末端を含む内因性UID配列を含む、本発明1121～1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
二本鎖DNA断片の末端を含む内因性UID配列が、少なくとも8、10、または15塩基を含む、本発明1136の方法。
[本発明1138]
外因性UID配列が各二本鎖DNA断片に固有である、本発明1121～1136のいずれかの方法。
[本発明1139]
外因性UID配列が各二本鎖DNA断片に固有ではない、本発明1121～1136のいずれかの方法。
[本発明1140]
UIDファミリーの各メンバーが、同じ内因性UID配列および同じ外因性UID配列を含む、本発明1136～1139のいずれかの方法。
[本発明1141]
アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生することが、11サイクル以下のPCR増幅を含む、本発明1121～1140のいずれかの方法。
[本発明1142]
アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生することが、7サイクル以下のPCR増幅を含む、本発明1141の方法。
[本発明1143]
アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生することが、5サイクル以下のPCR増幅を含む、本発明1142の方法。
[本発明1144]
アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生することが、少なくとも1サイクルのPCR増幅を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1145]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも50％に相当する、本発明1121～1143のいずれかの方法。
[本発明1146]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも70％に相当する、本発明1145の方法。
[本発明1147]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも80％に相当する、本発明1146の方法。
[本発明1148]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、二本鎖DNA断片集団中の標的ポリヌクレオチドの少なくとも90％に相当する、本発明1147の方法。
[本発明1149]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも50％に相当する、本発明1121～1143のいずれかの方法。
[本発明1150]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも70％に相当する、本発明1149の方法。
[本発明1151]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも80％に相当する、本発明1150の方法。
[本発明1152]
標的ワトソンライブラリーのメンバーおよび標的クリックライブラリーのメンバーが、総DNA断片集団の少なくとも90％に相当する、本発明1151の方法。
[本発明1153]
配列リードの決定がテンプレート分子の両末端の配列決定を可能にする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1154]
テンプレート分子の両末端の決定がペアエンドシーケンシングを含む、本発明1153の方法。
[本発明1155]
配列リードの決定が、配列リードを生成するためのテンプレートの長さにわたるシングルリードシーケンシングを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1156]
配列リードの決定が、大規模並列シーケンサによるシーケンシングを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1157]
大規模並列シーケンサが、テンプレートポリヌクレオチドの両末端から配列リードを決定するように構成されている、本発明1156の方法。
[本発明1158]
二本鎖DNA断片集団が、長さ約50～600ntである1つまたは複数の断片を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1159]
二本鎖DNA断片集団が、長さ2000nt未満、1000nt未満、500nt未満、400nt未満、300nt未満、または250nt未満である1つまたは複数の断片を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1160]
最初の増幅の後で選択的増幅の前に、アンプリコンのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対応する一本鎖（ss）DNAライブラリーを調製する段階をさらに含む、本発明1101～1159のいずれかの方法。
[本発明1161]
ssDNAライブラリーの調製が、
a. 2つのプライマーを利用して増幅反応を行い、それにより、親和性結合対の第1のメンバーを含む鎖および親和性結合対の第1のメンバーを含まない鎖を含む増幅産物を作製することであって、2つのプライマーの一方だけが親和性結合対の第1のメンバーを含む、こと；
b. 増幅産物を固体支持体と接触させることであって、固体支持体が親和性結合対の第2のメンバーを含む、こと；
c. 親和性結合対の第1のメンバーを含む鎖を、親和性結合対の第1のメンバーを含まない鎖から分離するために、増幅産物を変性させること；ならびに
d. 親和性結合対の第1のメンバーを含む分離された鎖および親和性結合対の第1のメンバーを含まない分離された鎖を精製すること
を含む、本発明1160の方法。
[本発明1162]
親和性結合対の第1のメンバーがビオチンであり、親和性結合対の第2のメンバーがストレプトアビジンである、本発明1161の方法。
[本発明1163]
ssDNAライブラリーの調製が、
a. アンプリコンを2つの増幅反応に分割し、それにより、リン酸化鎖および非リン酸化鎖を含む増幅産物を作製することであって、各増幅反応がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用し、2つのプライマーの一方だけがリン酸化されている、こと；
b. 増幅産物を、5'ホスフェートを有する鎖を選択的に消化するエキソヌクレアーゼと接触させること
を含む、本発明1160の方法。
[本発明1164]
a. 第1の増幅反応において、フォワードプライマーがリン酸化されており、リバースプライマーがリン酸化されておらず；
b. 第2の増幅反応において、リバースプライマーがリン酸化されており、フォワードプライマーがリン酸化されていない、
本発明1163の方法。
[本発明1165]
エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、本発明1163の方法。
[本発明1166]
リン酸化が5'部位においてである、本発明1163～1165のいずれかの方法。
[本発明1167]
最初の増幅が、
a. プライマー対を用いて増幅し、それにより、親和性結合対の第1のメンバーを含む鎖および親和性結合対の第1のメンバーを含まない鎖を含む増幅産物を作製することであって、該プライマー対における2つのプライマーの一方だけが親和性結合対の第1のメンバーを含む、こと；
b. 増幅産物を固体支持体と接触させることであって、固体支持体が親和性結合対の第2のメンバーを含む、こと；
c. 親和性結合対の第1のメンバーを含む鎖を、親和性結合対の第1のメンバーを含まない鎖から分離するために、増幅産物を変性させること；ならびに
d. 親和性結合対の第1のメンバーを含む分離された鎖および親和性結合対の第1のメンバーを含まない分離された鎖を精製すること
を含む、本発明1090～1153のいずれかの方法。
[本発明1168]
親和性結合対の第1のメンバーがビオチンであり、親和性結合対の第2のメンバーがストレプトアビジンである、本発明1167の方法。
[本発明1169]
外因性UID配列がR2配列の下流およびR1配列の上流である場合に、UIDファミリーの配列リードがワトソンサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1170]
外因性UID配列がR1配列の下流およびR2配列の上流である場合に、UIDファミリーの配列リードがクリックサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1171]
外因性UID配列がR2配列により大きく近接し、R1配列により小さく近接している場合に、UIDファミリーの配列リードがワトソンサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1172]
外因性UID配列がR1配列により大きく近接し、R2配列により小さく近接している場合に、UIDファミリーの配列リードがクリックサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1173]
外因性UID配列がR2配列のすぐ下流であるかまたは1～300、1～70、1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10、もしくは1～5ヌクレオチド以内である場合に、UIDファミリーの配列リードがワトソンサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1174]
外因性UID配列がR1配列のすぐ下流であるかまたは1～300、1～70、1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10、もしくは1～5ヌクレオチド以内である場合に、UIDファミリーの配列リードがクリックサブファミリーに割り当てられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1175]
二本鎖DNA断片集団が生物学的試料由来である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1176]
生物学的試料が対象から得られる、本発明1175の方法。
[本発明1177]
対象がヒト対象である、本発明1176の方法。
[本発明1178]
生物学的試料が液体試料である、本発明1175～1177のいずれかの方法。
[本発明1179]
液体試料が、全血、血漿、血清、痰、尿、汗、涙液、腹水、精液、および気管支肺胞洗浄液より選択される、本発明1178の方法。
[本発明1180]
液体試料が、無細胞試料または本質的に無細胞の試料である、本発明1178の方法。
[本発明1181]
生物学的試料が固体の生物学的試料である、本発明1175～1177のいずれかの方法。
[本発明1182]
固体の生物学的試料が腫瘍試料である、本発明1181の方法。
[本発明1183]
特定された変異が二本鎖DNA断片集団中に0.1％以下の頻度で存在する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1184]
特定された変異が二本鎖DNA断片集団中に0.1％～0.00001％の頻度で存在する、本発明1183の方法。
[本発明1185]
特定された変異が二本鎖DNA断片集団中に0.1％～0.01％の頻度で存在する、本発明1183の方法。
[本発明1186]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の標的ポリヌクレオチドを含む二本鎖DNA断片のうちの少なくとも50％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1187]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の標的ポリヌクレオチドを含む二本鎖DNA断片のうちの少なくとも70％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、本発明1186の方法。
[本発明1188]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の標的ポリヌクレオチドを含む二本鎖DNA断片のうちの少なくとも80％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、本発明1187の方法。
[本発明1189]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の標的ポリヌクレオチドを含む二本鎖DNA断片のうちの少なくとも90％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、本発明1188の方法。
[本発明1190]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片のうちの少なくとも50％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1191]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片のうちの少なくとも70％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1192]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片のうちの少なくとも80％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1193]
配列リードを決定する段階が、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片のうちの少なくとも90％のワトソン鎖およびクリック鎖両方から配列リードを決定することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1194]
前記本発明のいずれかの方法による被分析DNA断片中の1つまたは複数の変異の特定に関連する誤り率が、被分析DNA断片のワトソン鎖およびクリック鎖両方において変異が検出されることを必要としない、変異を特定する代替方法と比較して、少なくとも1/2、1/4、1/5、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、または1/100に低減している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1195]
代替方法が、標準的な分子バーコーディングまたは標準的なPCRベース分子バーコーディングを含む、本発明1194の方法。
[本発明1196]
代替方法が、
a. アダプターを被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片集団に結合させる段階であって、アダプターが、固有の外因性UIDを含む、段階；
b. アダプターとライゲートした二本鎖DNA断片を増幅してアンプリコンを産生するために、最初の増幅を行う段階；
c. アダプターとライゲートした1つまたは複数の二本鎖DNA断片の1つまたは複数のアンプリコンの配列リードを決定する段階；
d. 配列リードをUIDファミリーに割り当てる段階であって、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む、段階；
e. UIDファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片を正確に表すと該配列を特定する段階；および
f. 被分析DNA断片を正確に表すと特定された配列が、被分析DNA断片中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、該変異を特定する段階
を含む、本発明1195の方法。
[本発明1197]
前記本発明のいずれかの方法による被分析DNA断片中の1つまたは複数の変異の特定と関連する誤り率が、1×10 ^-2 以下、1×10 ^-3 以下、1×10 ^-4 以下、1×10 ^-5 以下、1×10 ^-6 以下、5×10 ^-6 以下、または1×10 ^-7 以下である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1198]
核酸試料からの配列リードデータを解析するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体であって、データが、前記本発明のいずれかの方法によって生成される、コンピュータ可読媒体。
[本発明1199]
a. 配列リードをUIDファミリーに割り当てるための（ここで、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む）；
b. 外因性UID配列とR1およびR2リード配列との空間的関係に基づき、各UIDファミリーの配列リードをワトソンサブファミリーおよびクリックサブファミリーに割り当てるための；
c. ワトソンサブファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のワトソン鎖を正確に表すと該配列を特定するための；
d. クリックサブファミリーのメンバーの閾値パーセントが、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のクリック鎖を正確に表すと該配列を特定するための；
e. ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、ワトソン鎖を正確に表す該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、該変異を特定するための；
f. クリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、クリック鎖を正確に表す該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、該変異を特定するための；
g. ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異およびクリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異が同じ変異である場合に、被分析DNA断片中の変異を特定するための
実行可能命令を含む、本発明1198のコンピュータ可読媒体。
[本発明1200]
外因性UID配列がR2シーケンシングプライマー結合部位のすぐ下流であるかまたは1～300ヌクレオチド以内である場合に、UIDファミリーメンバーをワトソンサブファミリーに割り当てることを含む、本発明1199のコンピュータ可読媒体。
[本発明1201]
外因性UID配列がR1シーケンシングプライマー結合部位のすぐ下流であるかまたは1～300ヌクレオチド以内である場合に、UIDファミリーメンバーをクリックサブファミリーに割り当てることを含む、前記本発明のいずれかのコンピュータ可読媒体。
[本発明1202]
配列リードを参照ゲノムにマッピングすることを含む、前記本発明のいずれかのコンピュータ可読媒体。
[本発明1203]
参照ゲノムがヒト参照ゲノムである、本発明1202のコンピュータ可読媒体。
[本発明1204]
試料中の変異の存在、非存在、または量に基づき治療選択肢のレポートを生成するためのコンピュータ実行可能命令をさらに含む、前記本発明のいずれかのコンピュータ可読媒体。
[本発明1205]
ネットワークを介したデータ伝送を可能にするコンピュータ実行可能コードをさらに含む、前記本発明のいずれかのコンピュータ可読媒体。
[本発明1206]
a. 核酸試料からの配列データを受信するように構成された記憶装置であって、データが前記本発明のいずれかの方法によって生成される、記憶装置；
b. 該記憶装置に通信可能に結合されたプロセッサであって、前記本発明のいずれかのコンピュータ可読媒体を含む、プロセッサ
を含むコンピュータシステム。
[本発明1207]
データを記憶装置に通信するように構成されたシーケンシングシステムをさらに含む、本発明1206のコンピュータシステム。
[本発明1208]
通信するようにまたはユーザに対してレポートを表示するように構成されたユーザインターフェースをさらに含む、前記本発明のいずれかのコンピュータシステム。
[本発明1209]
ネットワークを介してデータ解析の結果を伝送するように構成されたデジタルプロセッサをさらに含む、前記本発明のいずれかのコンピュータシステム。
[本発明1210]
a. 生物学的試料からの二本鎖DNA断片集団；
b. 前記本発明のいずれかの3'アダプターの集団；
c. 前記本発明のいずれかの5'アダプターの集団；
d. ニックトランスレーション様反応を行うための試薬；
e. 1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドについてアンプリコンを富化するための試薬；および
f. シーケンシングシステム
を含むシステム。
[本発明1211]
前記本発明のいずれかのコンピュータシステムをさらに含む、本発明1210のシステム。
[本発明1212]
a. （i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む1つまたは複数の第1のワトソン標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル3'アダプター配列の該一部分がユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位である、1つまたは複数の第1のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）各々が標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のワトソン標的選択的プライマー
を含むワトソン標的選択的プライマー対の第1のセット；
b.（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む1つまたは複数のクリック標的選択的プライマーであって、任意で、ユニバーサル5'アダプター配列の該一部分がユニバーサル5'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位である、1つまたは複数のクリック標的選択的プライマー、および（ii）各々が第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のクリック標的選択的プライマー
を含むクリック標的選択的プライマー対の第1のセット；
c. （i）ユニバーサル3'アダプター配列のR2シーケンシングプライマー部位に相補的な配列を含む1つまたは複数の第3のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）各々が5'→3'方向に、R1シーケンシングプライマー部位と、同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、1つまたは複数の第4のワトソン標的選択的プライマー
を含むワトソン標的選択的プライマー対の第2のセット；ならびに
d. （i）ユニバーサル3'アダプター配列のR1シーケンシングプライマー部位に相補的な配列を含む1つまたは複数の第3のクリック標的選択的プライマー、および
（ii）各々が5'→3'方向に、R2シーケンシングプライマー部位と、同じ標的ポリヌクレオチドに選択的な標的選択的配列とを含む、1つまたは複数の第4のクリック標的選択的プライマー
を含むクリック標的選択的プライマーの第2のセット
を含むキット。
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記明細書に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

Claims

a）部分的二本鎖3'アダプター（3'PDSA）を、被分析DNA試料中の二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端に結合させる段階であって、
3'PDSAの第1の鎖が、5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、
3'PDSAの第2の鎖が、5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含む、段階、
b）5'アダプターを該アニーリング部位にアニールする段階であって、5'アダプターが、5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）5'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、段階；
c）外因性UID配列および該第1のセグメントにわたり5'アダプターを伸長し、それにより、該外因性UID配列の相補体および該第1のセグメントの相補体を生成する段階、ならびに
d）該第1のセグメントの該相補体の3'末端を二本鎖DNA断片のワトソン鎖およびクリック鎖の5'末端に共有結合的に連結し、それにより、アダプターとライゲートした複数の二本鎖DNA断片を生成する段階
を含む方法。
前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的な第1のプライマー、および、前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的な第2のプライマーを用いて、アダプターとライゲートした前記複数の二本鎖DNA断片を増幅し、それにより、アンプリコンを生成する段階
をさらに含み、該アンプリコンが、複数の二本鎖ワトソンテンプレートおよび複数の二本鎖クリックテンプレートを含む、請求項1記載の方法。
ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて前記二本鎖ワトソンテンプレートを選択的に増幅し、それにより、標的ワトソン増幅産物を作製する段階であって、ワトソン標的選択的プライマー対の第1のセットが、（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む第1のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）標的選択的配列を含む第2のワトソン標的選択的プライマーを含む、段階、および/または
クリック標的選択的プライマー対の第1のセットを用いて前記二本鎖クリックテンプレートを選択的に増幅し、それにより、標的クリック増幅産物を作製する段階であって、クリック標的選択的プライマー対の第1のセットが、（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分の相補体に相補的な配列を含む第1のクリック標的選択的プライマー、および（ii）第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む第2のクリック標的選択的プライマーを含む、段階
をさらに含む、請求項2記載の方法。
前記3'PDSAの前記第2の鎖を除去して一本鎖3'アダプター（3'SSA）を生成する段階をさらに含み、ここで、前記第2の鎖を除去する段階が、ステップb）の後、またはステップb）の前、またはステップb）の最中に存在する、請求項1記載の方法。
前記第2の鎖が、1つまたは複数のデオキシウリジンを含み、ここで、
前記3'PDSAの前記第2の鎖を除去する段階が、該第2の鎖を分解するために3'デュプレックスアダプターをウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）と接触させることを含む、または、
前記第2の鎖を除去する段階が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって達成され、該ポリメラーゼが、外因性UID配列および前記第1のセグメントにわたり5'アダプターを伸長する、
請求項4記載の方法。
1つまたは複数の前記アンプリコンの配列リードを決定する段階、および
配列リードをUIDファミリーに割り当てる段階であって、UIDファミリーの各メンバーが同じ外因性UID配列を含む、段階
をさらに含む、請求項2記載の方法。
外因性UID配列とR1およびR2リード配列との空間的関係に基づき、各UIDファミリーの配列リードをワトソンサブファミリーおよびクリックサブファミリーに割り当てる段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
ワトソンサブファミリーの少なくとも50％が、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のワトソン鎖を正確に表すと該配列を特定する段階、および/または
クリックサブファミリーの少なくとも50％が、あるヌクレオチド配列を含有する場合に、被分析DNA断片のクリック鎖を正確に表すと該配列を特定する段階
をさらに含む、請求項7記載の方法。
ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、ワトソン鎖を正確に表すと該変異を特定する段階、
クリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列が、該配列中のある変異を欠いた参照配列と異なっている場合に、クリック鎖を正確に表すと該変異を特定する段階、および/または
ワトソン鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異およびクリック鎖を正確に表すヌクレオチド配列中の変異が同じ変異である場合に、被分析DNA断片中の変異を特定する段階
をさらに含む、請求項8記載の方法。
UIDファミリーの各メンバーが、同じ内因性UID配列をさらに含み、内因性UID配列が、集団からの二本鎖DNA断片の末端を含む、請求項6記載の方法。
前記二本鎖DNA断片集団が平滑末端を有する、請求項1記載の方法。
a）二本鎖DNA断片集団のワトソン鎖およびクリック鎖両方の3'末端にライゲートされるように構成された部分的二本鎖3'アダプター（3'PDSA）の集団であって、
3'PDSAの第1の鎖が、5' - 3'方向に、（i）第1のセグメント、（ii）外因性UID配列、（iii）5'アダプターに対するアニーリング部位、および（iv）R2シーケンシングプライマー部位を含むユニバーサル3'アダプター配列を含み、
3'PDSAの第2の鎖が、5'→3'方向に、（i）第1のセグメントに相補的なセグメント、および（ii）3'ブロッキング基を含む、集団；ならびに
b）該アニーリング部位にアニールするように構成された5'アダプターの集団であって、5'アダプターが、5'→3'方向に、（i）ユニバーサル3'アダプター配列に相補的でなく、R1シーケンシングプライマー部位を含む、ユニバーサル5'アダプター配列、および（ii）3'アダプターに対するアニーリング部位に相補的な配列を含む、集団
を含むシステム。
c）生物学的試料からの前記二本鎖DNA断片集団
をさらに含む、請求項12記載のシステム。
前記二本鎖DNA断片集団が平滑末端を有する、請求項13記載のシステム。
c）前記3'PDSAの前記第2の鎖を分解して一本鎖3'アダプター（3'SSA）を生成するための試薬
をさらに含む、請求項12記載のシステム。
c）前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的な第1のプライマー、および、前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的な第2のプライマー
をさらに含む、請求項12記載のシステム。
c）前記ユニバーサル3'アダプター配列に相補的なワトソンアンカープライマー、および
d）前記ユニバーサル5'アダプター配列の相補体に相補的なクリックアンカープライマー
をさらに含む、請求項12記載のシステム。
c）（i）ユニバーサル3'アダプター配列の一部分に相補的な配列を含む1つまたは複数の第1のワトソン標的選択的プライマー、および（ii）各々が標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のワトソン標的選択的プライマー
を含むワトソン標的選択的プライマー対の第1のセット、ならびに
d）（i）ユニバーサル5'アダプター配列の一部分の相補体に相補的な配列を含む1つまたは複数のクリック標的選択的プライマー、および（ii）各々が第2のワトソン標的選択的プライマー配列と同じ標的選択的配列を含む、1つまたは複数の第2のクリック標的選択的プライマー
を含むクリック標的選択的プライマー対の第1のセット
をさらに含む、請求項12記載のシステム。
a）i）脱リン酸化および末端平滑化された複数の二本鎖DNA断片であって、各々がワトソン鎖およびクリック鎖を含む、該二本鎖DNA断片；
ii）各々が5'→3'方向に、A）バーコード、およびB）ユニバーサル3'アダプター配列を含む、複数のアダプター；ならびに
iii）リガーゼ
を含む反応混合物を形成する段階と；
b）i）アダプターがワトソン鎖およびクリック鎖の3'末端にライゲートされ、ii）アダプターがワトソン鎖およびクリック鎖のいずれの5'末端にもライゲートされない
ように該反応混合物をインキュベートし、それにより、二本鎖ライゲーション産物を生成する段階と
を含む方法。
前記複数のアダプターの各々が、固有のバーコードを含み、ここで、前記二本鎖ライゲーション産物の各々が、バーコードを1つだけ有するワトソン鎖と、該ワトソン鎖上の該バーコードとは異なるバーコードを1つだけ有するクリック鎖とを含む、請求項19記載の方法。