JPWO2021078813A5

JPWO2021078813A5 - 熱応答性コンジュゲート

Info

Publication number: JPWO2021078813A5
Application number: JP2022523464A
Authority: JP
Publication date: 2023-10-24

Claims

（a）標的核酸を含むDNAサンプルを：
（i）DNAポリメラーゼ、
（ii）標的核酸に隣接するように設計された少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー、
（iii）dATP、dGTP、dCTP、およびdTTPの混合物、ならびに
（iv）負の温度感受性ポリマーに共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含むコンジュゲート
と接触させること、
（b）工程（a）の産物を、コンジュゲートが沈殿し、それによりDNAポリメラーゼが阻害されなくなる温度に加熱すること、
（c）例えば、標的核酸を変性させ、プライマーを標的核酸にアニーリングし、プライマーを伸長するPCR工程を実行することにより、標的核酸を増幅すること、
を含む、DNAサンプル中の標的核酸を増幅する方法であって、
工程(c)は少なくとも2回繰り返される、方法。
前記DNAポリメラーゼ阻害剤が、ビダラビン、ラミブジン、ジドブジン、リファマイシンSV一ナトリウム塩、ネオババイソフラボン、ヘキサプレニルヒドロキノン、アバカビルヘミ硫酸塩、アフィジコリン、ミトラマイシンA、テノホビル、またはチオルチンである、請求項１に記載の方法。
前記負の温度感受性ポリマーが、以下：
（i）ポリ（N-置換アクリルアミド）およびその誘導体、
（ii）ポリ（メチルビニルエーテル）、
（iii）ポリ（N-ビニルカプロラクタム）、
（iv）ポリ（2-置換2-オキサゾリン）およびその誘導体、
（v）ポリ（2-置換2-オキサジン）およびその誘導体、
（vi）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
（vii）エチルヒドロキシエチルセルロース、
（viii）ヒドロキシエチルセルロース、
（ix）ポリ（アスパラギン）およびその誘導体、ならびに
（x）PNiPMAM
から選択される、請求項１または２に記載の方法。
前記コンジュゲートが、35℃から65℃の間、好ましくは40℃から60℃の間、より好ましくは45℃から55℃の間の温度で沈殿する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
前記コンジュゲートが48℃から52℃の間の温度で沈殿する、請求項４に記載の方法。
沈殿温度より2℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より2℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、任意の先行する請求項に記載の方法。
沈殿温度より1℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より1℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項６に記載の方法。
前記コンジュゲートが、前記負の温度感受性ポリマーの末端または末端近くで共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含む、任意の先行する請求項に記載の方法。
前記DNAポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、任意の先行する請求項に記載の方法。
前記DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、請求項１０に記載の方法。
（a）DNAポリメラーゼ、および
（b）負の温度感受性ポリマーに共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含むコンジュゲート
を含む、キット。
前記コンジュゲートが、35℃から65℃の間、好ましくは40℃から60℃の間、より好ましくは45℃から55℃の間の温度で沈殿する、請求項１１に記載のキット。
前記コンジュゲートが、48℃から52℃の間の温度で沈殿する、請求項１２に記載のキット。
前記DNAポリメラーゼ阻害剤が、ビダラビン、ラミブジン、リファマイシンSV一ナトリウム塩、ネオババイソフラボン、ヘキサプレニルヒドロキノン、アバカビルヘミ硫酸塩、アフィジコリン、ミトラマイシンA、テノホビル、またはチオルチンである、請求項１１から１３のいずれかに記載のキット。
DNAポリメラーゼ阻害剤がジドブジンである、請求項１１から１３のいずれかに記載のキット。
沈殿温度より2℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より2℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項１１から１５のいずれかに記載のキット。
沈殿温度より1℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より1℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項１６に記載のキット。
前記コンジュゲートが、前記負の温度感受性ポリマーの末端または末端近くで共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含む、請求項１１から１７のいずれかに記載のキット。
前記DNAポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項１１から１８のいずれかに記載のキット。
前記DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、請求項１９に記載のキット。
（ii）負の温度感受性ポリマーに共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含むコンジュゲートと結合した（i）DNAポリメラーゼを含む、水性組成物。
前記コンジュゲートが、35℃から65℃の間、好ましくは40℃から60℃の間、より好ましくは45℃から55℃の間の温度で沈殿する、請求項２１に記載の水性組成物。
前記コンジュゲートが、48℃から52℃の間の温度で沈殿する、請求項２２に記載の水性組成物。
前記DNAポリメラーゼ阻害剤が、ビダラビン、ラミブジン、リファマイシンSV一ナトリウム塩、ネオババイソフラボン、ヘキサプレニルヒドロキノン、アバカビルヘミ硫酸塩、アフィジコリン、ミトラマイシンA、テノホビル、またはチオルチンである、請求項２１から２３のいずれかに記載の水性組成物。
前記DNAポリメラーゼ阻害剤がジドブジンである、請求項２１から２３のいずれかに記載の水性組成物。
沈殿温度より2℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より2℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項２１から２５のいずれかに記載の水性組成物。
沈殿温度より1℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より1℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項２６に記載の水性組成物。
前記コンジュゲートが、前記負の温度感受性ポリマーの末端または末端近くで共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含む、請求項２１から２７のいずれかに記載の水性組成物。
前記DNAポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項２１から２８のいずれかに記載の水性組成物。
前記DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである、請求項２９に記載の水性組成物。
負の温度感受性ポリマーに共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含み、該DNAポリメラーゼ阻害剤が、ビダラビン、ラミブジン、ジドブジン、リファマイシンSV一ナトリウム塩、ネオババイソフラボン、ヘキサプレニルヒドロキノン、アバカビルヘミ硫酸塩、アフィジコリン、ミトラマイシンA、テノホビル、またはチオルチンである、コンジュゲート。
前記コンジュゲートが、35℃から65℃の間、好ましくは40℃から60℃の間、より好ましくは45℃から55℃の間の温度で沈殿する、請求項３１に記載のコンジュゲート。
前記コンジュゲートが、48℃から52℃の間の温度で沈殿する、請求項３２に記載のコンジュゲート。
沈殿温度より2℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より2℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項３１から３３のいずれかに記載のコンジュゲート。
沈殿温度より1℃高い場合、前記コンジュゲートの10％以下が溶液中にあり、沈殿温度より1℃低い場合、前記コンジュゲートの90％以上が溶液中にある、請求項３４に記載のコンジュゲート。
前記コンジュゲートが、前記負の温度感受性ポリマーの末端または末端近くで共有結合したDNAポリメラーゼ阻害剤を含む、請求項３１から３５のいずれかに記載のコンジュゲート。
（a）標的核酸を含むRNAサンプルを：
（i）DNAポリメラーゼ、
（ii）少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー、
（iii）dATP、dGTP、dCTP、およびdTTPの混合物、ならびに
（iv）負の温度感受性ポリマーに共有結合したDNAポリメラーゼを含むコンジュゲート
と接触させること、
（b）工程（a）の産物を、コンジュゲートが沈殿し、それによりDNAポリメラーゼが阻害されなくなる温度に加熱すること、
（c）例えば、標的核酸を変性させ、プライマーを標的核酸にアニーリングし、プライマーを伸長することを実行することにより、標的核酸を増幅すること、
を含む、RNAサンプル中の標的核酸を増幅する方法であって、
工程(c)は少なくとも2回繰り返される、方法。