JPWO2020205793A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2020205793A5 JPWO2020205793A5 JP2021560626A JP2021560626A JPWO2020205793A5 JP WO2020205793 A5 JPWO2020205793 A5 JP WO2020205793A5 JP 2021560626 A JP2021560626 A JP 2021560626A JP 2021560626 A JP2021560626 A JP 2021560626A JP WO2020205793 A5 JPWO2020205793 A5 JP WO2020205793A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kinase
- mrna
- item
- reaction mixture
- monophosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Description
当業者は、本明細書に記載の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することになるか、これらをルーチン以下の実験を用いて確認することができる。本明細書に記載の本実施形態の範囲は、上記記載に限定されるように意図されておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に示されたとおりである。当業者は、本記載の様々な変更及び改変が、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の意図または範囲から逸脱することなく成され得ることを認めるであろう。
項1
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、mRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
項2
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、ならびにviii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドRNAを生産する条件下で添加し;さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)さらにステップ(c)において生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、mRNAを生産する条件下でインキュベートすること、または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化もしくは物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項3
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップドRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択で、viii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
(d)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項4
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップド非テール化RNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でviii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)さらに、ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、非キャップドRNAを生産する条件下でインキュベートすること;または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、非キャップドRNAを、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより生産すること;ならびに
e)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項5
ステップ(c)(i)~(c)(v)を(c)の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項6
前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、項1または2に記載の方法。
項7
前記細胞RNAをバイオマスから得る、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項8
RNAを5’ヌクレオシド一リン酸に解重合する前記酵素がヌクレアーゼP1である、項1~4のいずれか1項に記載のステップ(a)の方法。
項9
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、前記PPK、NMPキナーゼ、前記NDPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項10
前記少なくとも1つのシチジン一リン酸キナーゼがThermus thermophilusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項11
前記少なくとも1つのウリジン一リン酸キナーゼがPyroccus furiosusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項12
前記少なくとも1つのグアノシン一リン酸キナーゼがThermatoga maritimaに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項13
前記少なくとも1つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがAquifex aeolicusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項14
前記少なくとも1つのポリリン酸キナーゼがDeinococcus geothermalisに由来するクラスIIIポリリン酸キナーゼ2である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項15
前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項16
前記RNAポリメラーゼがバクテリオファージT7RNAポリメラーゼまたはその変異体である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項17
前記DNAテンプレートが、i)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列;及び/またはii)転写プロモーター、iii)生じるmRNAのための5’非翻訳領域(5’UTR)をコードする配列、iv)生じるmRNAのための3’非翻訳領域(3’UTR)及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項18
前記DNAテンプレートがさらに、1つまたは複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)要素をコードする配列を含む、項17に記載の方法。
項19
前記DNAテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、項17または18に記載の方法。
項20
前記DNAテンプレートがプラスミドでコードされる、項17または18に記載の方法。
項21
前記プラスミドが、1つまたは複数のmRNAをコードする1つまたは複数のDNAテンプレートを含む、項20に記載の方法。
項22
プラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項20または21に記載の方法。
項23
プラスミドDNAを、IIS型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項22に記載の方法。
項24
プラスミドDNA及び/または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、項22または23に記載の方法。
項25
前記ポリ(A)ポリメラーゼが熱安定性である、項2または4に記載の方法。
項26
ステップ3dまたは4eの前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び/またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項27
前記メチルドナーがS-アデノシルメチオニンである、項3または4に記載の方法。
項28
前記1つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び/またはブルータングウイルスから得る、項3または4に記載の方法。
項29
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項30
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項31
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項32
PPK、任意選択でNMPキナーゼ、任意選択でNDPキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、RNAポリメラーゼ、ポリAポリメラーゼ、及び/またはキャッピング酵素を含む前記第2の反応混合物を、1つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項33
前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、項32に記載の方法。
項34
前記酵素を不活性化するか、または部分的に不活性化する温度が70℃~95℃である、項33に記載の方法。
項35
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が55℃に等しいか、またはそれよりも高い、項33に記載の方法。
項36
前記第2の反応混合物が、クロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製された1つまたは複数の酵素を含む、項32に記載の方法。
項37
前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、項32に記載の方法。
項38
濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記mRNAの精製をさらに含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項39
前記mRNAを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、項38に記載の方法。
項40
前記mRNAを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、項38または39に記載の方法。
項41
項1~40のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
項42
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、mRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産の後に前記DNAを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
項43
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート;viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、mRNAを生産する条件下でさらにインキュベートすること、または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、mRNAを、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより生産することを含む、前記方法。
項44
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ及びvii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップドRNAを生産する条件下で添加し;さらに任意選択でviii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産の後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
(d)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項45
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、vi)ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvii)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ及びviii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップド非テール化RNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;
(d)(i)ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、非キャップドRNAを生産する条件下でさらにインキュベートすること;または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより、非キャップドRNAを産生すること;ならびに
e)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項46
ステップ(c)(i)~(c)(v)を、(c)の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項47
前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、項42または43に記載の方法。
項48
前記細胞RNAをバイオマスから得る、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項49
前記RNA解重合酵素が、5’ヌクレオシド二リン酸(NDP)を作製するリボヌクレアーゼである、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項50
RNAを5’ヌクレオシド二リン酸に解重合する酵素がPNPアーゼである、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項51
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、PPK、NDPキナーゼ、NMPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項52
前記少なくとも1つのシチジン一リン酸キナーゼがThermus thermophilusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項53
前記少なくとも1つのウリジン一リン酸キナーゼがPyroccus furiosusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項54
前記少なくとも1つのグアノシン一リン酸キナーゼがThermatoga maritimaに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項55
前記少なくとも1つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがAquifex aeolicusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項56
前記少なくとも1つのポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisに由来するクラスIIIポリリン酸キナーゼ2である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項57
前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項58
前記RNAポリメラーゼがバクテリオファージT7RNAポリメラーゼまたはその変異体である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項59
前記DNAテンプレートが、i)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列;及び/またはii)転写プロモーター、iii)生じるmRNAのための5’非翻訳領域(5’UTR)をコードする配列、iv)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列、v)生じるmRNAのための3’非翻訳領域(3’UTR)及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項60
前記DNAテンプレートがさらに、1つまたは複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)要素をコードする配列を含む、項59のいずれか1項に記載の方法。
項61
前記DNAテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、項59または60に記載の方法。
項62
前記DNAテンプレートがプラスミドでコードされる、項59または60に記載の方法。
項63
前記プラスミドが、1つまたは複数のmRNAをコードする1つまたは複数のDNAテンプレートを含む、項62に記載の方法。
項64
プラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項62または63に記載の方法。
項65
プラスミドDNAを、IIS型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項64に記載の方法。
項66
プラスミドDNA及び/または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、項64または65に記載の方法。
項67
前記ポリ(A)ポリメラーゼが熱安定性である、項43または45に記載の方法。
項68
ステップ44dまたは45eの前記1つまたは複数のキャッピング酵素が、ホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び/またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項69
前記メチルドナーがS-アデノシルメチオニンである、項44または45に記載の方法。
項70
前記1つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び/またはブルータングウイルスから得る、項44または45に記載の方法。
項71
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項72
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項73
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項74
前記PPK、任意選択で前記NDPキナーゼ、任意選択でNMPキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、前記RNAポリメラーゼ、前記ポリAポリメラーゼ、及び/または前記キャッピング酵素を含む前記第2の反応混合物を1つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項75
前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、項74に記載の方法。
項76
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が70℃~95℃である、項75に記載の方法。
項77
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が55℃に等しいか、またはそれよりも高い、項75に記載の方法。
項78
前記RNAポリメラーゼに、ヘキサヒスチジン-タグ付けし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製する、項32または74に記載の方法。
項79
前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、項74に記載の方法。
項80
濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記mRNAの精製をさらに含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項81
前記mRNAを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、項80に記載の方法。
項82
前記mRNAを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、項80または81に記載の方法。
項83
前記mRNAを、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーを使用してさらに精製する、項38~40または項80~82のいずれか1項に記載の方法。
項84
項42~83のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
項85
ステップ(a)及び(b)以外の手段により生産されたヌクレオチドをステップ(c)の前記反応混合物に添加し、それにより、ステップ(a)及び(b)の必要性を排除する、項1~40または42~83のいずれか1項に記載の方法。
項86
前記ヌクレオチドがNMP、NDP、NTP、またはそれらの混合物を含む、項85に記載の方法。
項87
前記ヌクレオチドが、非修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの混合物のうちの1つまたは複数からなる、項85に記載の方法。
項88
修飾ヌクレオチドでの1つまたは複数の非修飾ヌクレオチドの100%置換を伴うmRNAを作成するために、前記ヌクレオチドが1つまたは複数の非修飾NMP及び1つまたは複数の修飾NTPからなる、項87に記載の方法。
項89
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、及びGMP、ならびにシュードウリジン三リン酸(シュードUTP)を含む、項88に記載の方法。
項90
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP及びGMPをシュードUTP及び5-メチルシチジン三リン酸(5-メチルCTP)と共に含む、項88に記載の方法。
項91
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、UMP、及びGMPのうちの1つまたは複数を、シュードUTP及び/または5-メチルCTPと共に含有する混合物を含む、項87に記載の方法。
項92
修飾ヌクレオチドを細胞RNA由来ヌクレオチドに添加して、部分的に修飾されたmRNAを達成する、項1~91のいずれか1項に記載の方法。
項93
ステップ(c)またはステップ(d)において、前記ATPを直接的に添加する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項94
ステップ(c)またはステップ(d)において、精製AMPまたはADP及びリン酸ドナーをPPKの存在下で添加して、ATPを生産する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項95
ステップ(c)またはステップ(d)において、細胞RNAから得られたAMPまたはADP及びリン酸ドナーをPPKの存在下で添加して、ATPを生産する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項96
前記GTPを直接添加する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項97
精製GMPまたはGDP及びリン酸ドナーを1つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、GTPを生産する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項98
細胞RNAから得られたGMPまたはGDP及びリン酸ドナーを1つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、GTPを生産する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項99
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、PPK、NDPキナーゼ、NMPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られた細胞溶解産物を含む、項9または51に記載の方法。
項100
前記バイオマスが酵母を含む、項7または48に記載の方法。
項101
項85~100のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
項1
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、mRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
項2
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、ならびにviii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドRNAを生産する条件下で添加し;さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)さらにステップ(c)において生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、mRNAを生産する条件下でインキュベートすること、または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化もしくは物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項3
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップドRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択で、viii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
(d)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項4
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物が5’ヌクレオシド一リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iii)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップド非テール化RNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でviii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)さらに、ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、非キャップドRNAを生産する条件下でインキュベートすること;または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、非キャップドRNAを、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより生産すること;ならびに
e)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項5
ステップ(c)(i)~(c)(v)を(c)の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項6
前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、項1または2に記載の方法。
項7
前記細胞RNAをバイオマスから得る、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項8
RNAを5’ヌクレオシド一リン酸に解重合する前記酵素がヌクレアーゼP1である、項1~4のいずれか1項に記載のステップ(a)の方法。
項9
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、前記PPK、NMPキナーゼ、前記NDPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項10
前記少なくとも1つのシチジン一リン酸キナーゼがThermus thermophilusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項11
前記少なくとも1つのウリジン一リン酸キナーゼがPyroccus furiosusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項12
前記少なくとも1つのグアノシン一リン酸キナーゼがThermatoga maritimaに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項13
前記少なくとも1つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがAquifex aeolicusに由来する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項14
前記少なくとも1つのポリリン酸キナーゼがDeinococcus geothermalisに由来するクラスIIIポリリン酸キナーゼ2である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項15
前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項16
前記RNAポリメラーゼがバクテリオファージT7RNAポリメラーゼまたはその変異体である、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項17
前記DNAテンプレートが、i)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列;及び/またはii)転写プロモーター、iii)生じるmRNAのための5’非翻訳領域(5’UTR)をコードする配列、iv)生じるmRNAのための3’非翻訳領域(3’UTR)及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項18
前記DNAテンプレートがさらに、1つまたは複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)要素をコードする配列を含む、項17に記載の方法。
項19
前記DNAテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、項17または18に記載の方法。
項20
前記DNAテンプレートがプラスミドでコードされる、項17または18に記載の方法。
項21
前記プラスミドが、1つまたは複数のmRNAをコードする1つまたは複数のDNAテンプレートを含む、項20に記載の方法。
項22
プラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項20または21に記載の方法。
項23
プラスミドDNAを、IIS型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項22に記載の方法。
項24
プラスミドDNA及び/または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、項22または23に記載の方法。
項25
前記ポリ(A)ポリメラーゼが熱安定性である、項2または4に記載の方法。
項26
ステップ3dまたは4eの前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び/またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項27
前記メチルドナーがS-アデノシルメチオニンである、項3または4に記載の方法。
項28
前記1つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び/またはブルータングウイルスから得る、項3または4に記載の方法。
項29
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項30
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項31
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項3または4に記載の方法。
項32
PPK、任意選択でNMPキナーゼ、任意選択でNDPキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、RNAポリメラーゼ、ポリAポリメラーゼ、及び/またはキャッピング酵素を含む前記第2の反応混合物を、1つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項33
前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、項32に記載の方法。
項34
前記酵素を不活性化するか、または部分的に不活性化する温度が70℃~95℃である、項33に記載の方法。
項35
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が55℃に等しいか、またはそれよりも高い、項33に記載の方法。
項36
前記第2の反応混合物が、クロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製された1つまたは複数の酵素を含む、項32に記載の方法。
項37
前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、項32に記載の方法。
項38
濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記mRNAの精製をさらに含む、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項39
前記mRNAを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、項38に記載の方法。
項40
前記mRNAを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、項38または39に記載の方法。
項41
項1~40のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
項42
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、mRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産の後に前記DNAを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
項43
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ、vii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート;viii)1つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドRNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
d)(i)ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、mRNAを生産する条件下でさらにインキュベートすること、または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、mRNAを、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより生産することを含む、前記方法。
項44
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvi)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ及びvii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップドRNAを生産する条件下で添加し;さらに任意選択でviii)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産の後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;ならびに
(d)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項45
真核メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成するための無細胞反応方法であって、(a)反応混合物中で、細胞RNAと、RNAを解重合する1つまたは複数の酵素とを、前記細胞RNAが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第1の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと;ならびに
(b)前記反応混合物を、前記RNA解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること;ならびに
(c)ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、i)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー;ならびに任意選択でii)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、ならびに任意選択でiii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼを含む第2の反応混合物と共に、vi)ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにvii)少なくとも1つのRNAポリメラーゼ及びviii)mRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレートを、非キャップド非テール化RNAを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でix)少なくとも1つのデオキシリボヌクレアーゼを、RNA生産後に前記DNAを消化する条件下で添加すること;
(d)(i)ステップ(c)で生産された前記反応混合物を、ポリAポリメラーゼ及びATPの存在下で、非キャップドRNAを生産する条件下でさらにインキュベートすること;または
(ii)前記RNAポリメラーゼを、ステップ(c)の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリAポリメラーゼ及びATPの存在下でさらにインキュベートすることにより、非キャップドRNAを産生すること;ならびに
e)ステップ(c)からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、mRNAを生産することを含む、前記方法。
項46
ステップ(c)(i)~(c)(v)を、(c)の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項47
前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、項42または43に記載の方法。
項48
前記細胞RNAをバイオマスから得る、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項49
前記RNA解重合酵素が、5’ヌクレオシド二リン酸(NDP)を作製するリボヌクレアーゼである、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項50
RNAを5’ヌクレオシド二リン酸に解重合する酵素がPNPアーゼである、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項51
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、PPK、NDPキナーゼ、NMPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項52
前記少なくとも1つのシチジン一リン酸キナーゼがThermus thermophilusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項53
前記少なくとも1つのウリジン一リン酸キナーゼがPyroccus furiosusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項54
前記少なくとも1つのグアノシン一リン酸キナーゼがThermatoga maritimaに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項55
前記少なくとも1つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがAquifex aeolicusに由来する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項56
前記少なくとも1つのポリリン酸キナーゼが、Deinococcus geothermalisに由来するクラスIIIポリリン酸キナーゼ2である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項57
前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項58
前記RNAポリメラーゼがバクテリオファージT7RNAポリメラーゼまたはその変異体である、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項59
前記DNAテンプレートが、i)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列;及び/またはii)転写プロモーター、iii)生じるmRNAのための5’非翻訳領域(5’UTR)をコードする配列、iv)生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする配列、v)生じるmRNAのための3’非翻訳領域(3’UTR)及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項60
前記DNAテンプレートがさらに、1つまたは複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)要素をコードする配列を含む、項59のいずれか1項に記載の方法。
項61
前記DNAテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、項59または60に記載の方法。
項62
前記DNAテンプレートがプラスミドでコードされる、項59または60に記載の方法。
項63
前記プラスミドが、1つまたは複数のmRNAをコードする1つまたは複数のDNAテンプレートを含む、項62に記載の方法。
項64
プラスミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項62または63に記載の方法。
項65
プラスミドDNAを、IIS型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、項64に記載の方法。
項66
プラスミドDNA及び/または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、項64または65に記載の方法。
項67
前記ポリ(A)ポリメラーゼが熱安定性である、項43または45に記載の方法。
項68
ステップ44dまたは45eの前記1つまたは複数のキャッピング酵素が、ホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び/またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項69
前記メチルドナーがS-アデノシルメチオニンである、項44または45に記載の方法。
項70
前記1つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び/またはブルータングウイルスから得る、項44または45に記載の方法。
項71
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項72
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項73
前記1つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、項44または45に記載の方法。
項74
前記PPK、任意選択で前記NDPキナーゼ、任意選択でNMPキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、前記RNAポリメラーゼ、前記ポリAポリメラーゼ、及び/または前記キャッピング酵素を含む前記第2の反応混合物を1つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項75
前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、項74に記載の方法。
項76
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が70℃~95℃である、項75に記載の方法。
項77
前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が55℃に等しいか、またはそれよりも高い、項75に記載の方法。
項78
前記RNAポリメラーゼに、ヘキサヒスチジン-タグ付けし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製する、項32または74に記載の方法。
項79
前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、項74に記載の方法。
項80
濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記mRNAの精製をさらに含む、項42~45のいずれか1項に記載の方法。
項81
前記mRNAを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、項80に記載の方法。
項82
前記mRNAを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、項80または81に記載の方法。
項83
前記mRNAを、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーを使用してさらに精製する、項38~40または項80~82のいずれか1項に記載の方法。
項84
項42~83のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
項85
ステップ(a)及び(b)以外の手段により生産されたヌクレオチドをステップ(c)の前記反応混合物に添加し、それにより、ステップ(a)及び(b)の必要性を排除する、項1~40または42~83のいずれか1項に記載の方法。
項86
前記ヌクレオチドがNMP、NDP、NTP、またはそれらの混合物を含む、項85に記載の方法。
項87
前記ヌクレオチドが、非修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの混合物のうちの1つまたは複数からなる、項85に記載の方法。
項88
修飾ヌクレオチドでの1つまたは複数の非修飾ヌクレオチドの100%置換を伴うmRNAを作成するために、前記ヌクレオチドが1つまたは複数の非修飾NMP及び1つまたは複数の修飾NTPからなる、項87に記載の方法。
項89
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、及びGMP、ならびにシュードウリジン三リン酸(シュードUTP)を含む、項88に記載の方法。
項90
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP及びGMPをシュードUTP及び5-メチルシチジン三リン酸(5-メチルCTP)と共に含む、項88に記載の方法。
項91
前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、UMP、及びGMPのうちの1つまたは複数を、シュードUTP及び/または5-メチルCTPと共に含有する混合物を含む、項87に記載の方法。
項92
修飾ヌクレオチドを細胞RNA由来ヌクレオチドに添加して、部分的に修飾されたmRNAを達成する、項1~91のいずれか1項に記載の方法。
項93
ステップ(c)またはステップ(d)において、前記ATPを直接的に添加する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項94
ステップ(c)またはステップ(d)において、精製AMPまたはADP及びリン酸ドナーをPPKの存在下で添加して、ATPを生産する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項95
ステップ(c)またはステップ(d)において、細胞RNAから得られたAMPまたはADP及びリン酸ドナーをPPKの存在下で添加して、ATPを生産する、項2、4、43、または45のいずれか1項に記載の方法。
項96
前記GTPを直接添加する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項97
精製GMPまたはGDP及びリン酸ドナーを1つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、GTPを生産する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項98
細胞RNAから得られたGMPまたはGDP及びリン酸ドナーを1つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、GTPを生産する、項3d、4e、44d、または45eのいずれか1項に記載の方法。
項99
ステップ(c)の前記第2の反応混合物が、PPK、NDPキナーゼ、NMPキナーゼ、デオキシリボ核酸(DNA)テンプレート、及び/または前記RNAポリメラーゼを産生する細胞から得られた細胞溶解産物を含む、項9または51に記載の方法。
項100
前記バイオマスが酵母を含む、項7または48に記載の方法。
項101
項85~100のいずれか1項に記載の方法により生産されたmRNA。
Claims (30)
- メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成する方法であって、(i)ヌクレオシド一リン酸、(ii)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー、(iii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、(iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、(v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、(vi)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、ならびにviii)RNAポリメラーゼを含む反応混合物を、ヌクレオチド三リン酸が生産され、前記ヌクレオチド三リン酸からポリAテールを備えたmRNAが生産される条件下でインキュベートすること;前記反応混合物からのバッファーを交換すること、及び前記反応混合物を1つまたは複数のキャッピング酵素、GTP、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、キャップドmRNAを生産することを含む、前記方法。
- 前記1つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及びグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのCMPキナーゼがThermus thermophilusに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのUMPキナーゼがPyroccus furiosusに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのGMPキナーゼがThermatoga maritimaに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのNDPキナーゼがAquifex aeolicusに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのPPKがDeinococcus geothermalisに由来するクラスIII PPK2である、請求項1に記載の方法。
- 前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼがバクテリオファージT7RNAポリメラーゼまたはその変異体である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAテンプレートが、生じるmRNAのためのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするヌクレオチド配列;転写プロモーター;生じるmRNAのための5’非翻訳領域(5’UTR)をコードするヌクレオチド配列;生じるmRNAのための3’非翻訳領域(3’UTR)をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記DNAテンプレートがさらに、1つまたは複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)要素をコードする配列を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記DNAテンプレートが、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化したプラスミドDNAである、請求項10に記載の方法。
- 前記mRNAが5’末端に初期転写配列(ITS)を含み、前記ITSがT7クラスIIIプロモーターの下流で見い出されるコンセンサスITSである、請求項1に記載の方法。
- 前記mRNAが5’末端に初期転写配列(ITS)を含み、前記ITSがGGGAGACCAGGAATT(配列番号17)の6~15ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記mRNAの精製をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記mRNAを塩化リチウム沈殿により精製する、請求項15に記載の方法。
- 前記mRNAを高速液体クロマトグラフィーにより精製する、請求項15に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、非修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 修飾ヌクレオチドでの1つまたは複数の非修飾ヌクレオチドの100%置換を伴うmRNAを作成するために、前記ヌクレオチドが1つまたは複数の非修飾NMP及び1つまたは複数の修飾NTPを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、及びGMP、ならびにシュードウリジン三リン酸(シュードUTP)を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、非修飾AMP及びGMPをシュードUTP及び5-メチルシチジン三リン酸(5-メチルCTP)と共に含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、非修飾AMP、CMP、UMP、及びGMPのうちの1つまたは複数を、シュードUTP及び/または5-メチルCTPと共に含有する混合物を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記反応混合物を、1つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、請求項1に記載の方法。
- 前記不所望な酵素活性を、熱処理により不活性化するか、または部分的に不活性化する、請求項23に記載の方法。
- 前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が55℃に等しいか、またはそれよりも高い、請求項24に記載の方法。
- RNAポリメラーゼに、ヘキサヒスチジン-タグ付けし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製する、請求項24に記載の方法。
- メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成する方法であって、(i)ヌクレオシド一リン酸、(ii)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー、(iii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、(iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、(v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、(vi)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)RNAポリメラーゼ、ix)1つまたは複数のキャッピング試薬、x)GTP、ならびにxi)メチルドナーを含む反応混合物を、ヌクレオチド三リン酸が生産され、前記ヌクレオチド三リン酸からポリAテールを備えたキャップドmRNAが生産される条件下でインキュベートすることを含む、前記方法。
- 前記GTPを前記反応混合物に直接添加する、請求項27に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド一リン酸がGMPを含み、前記GTPが前記GMP及び前記GMPキナーゼにより生産される、請求項27に記載の方法。
- メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を合成する方法であって、(i)ヌクレオシド一リン酸、(ii)少なくとも1つのポリリン酸(PPK)キナーゼ及びリン酸ドナー、(iii)少なくとも1つのシチジン一リン酸(CMP)キナーゼ、(iv)少なくとも1つのウリジン一リン酸(UMP)キナーゼ、(v)少なくとも1つのグアノシン一リン酸(GMP)キナーゼ、(vi)少なくとも1つのヌクレオシド-二リン酸(NDP)キナーゼ、vii)ポリAテールを備えたmRNAをコードする少なくとも1つのDNAテンプレート、viii)1つまたは複数のキャッピング試薬、ならびにix)RNAポリメラーゼを含む反応混合物を、ヌクレオチド三リン酸が生産され、前記ヌクレオチド三リン酸からポリAテール及び5’キャップを備えたmRNAが生産される条件下でインキュベートすることを含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962826983P | 2019-03-29 | 2019-03-29 | |
US62/826,983 | 2019-03-29 | ||
PCT/US2020/025824 WO2020205793A1 (en) | 2019-03-29 | 2020-03-30 | Cell-free production of ribonucleic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022524166A JP2022524166A (ja) | 2022-04-27 |
JPWO2020205793A5 true JPWO2020205793A5 (ja) | 2023-04-06 |
Family
ID=72666925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021560626A Withdrawn JP2022524166A (ja) | 2019-03-29 | 2020-03-30 | リボ核酸の無細胞生産 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220162659A1 (ja) |
EP (1) | EP3947704A4 (ja) |
JP (1) | JP2022524166A (ja) |
KR (1) | KR20220004057A (ja) |
CN (1) | CN114423870A (ja) |
AU (1) | AU2020253354A1 (ja) |
CA (1) | CA3135368A1 (ja) |
IL (1) | IL286633A (ja) |
SG (1) | SG11202110608YA (ja) |
WO (1) | WO2020205793A1 (ja) |
ZA (1) | ZA202107709B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112521437A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-19 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用 |
EP4329799A1 (en) * | 2021-04-30 | 2024-03-06 | Greenlight Biosciences, Inc. | Messenger rna therapeutics and compositions |
CA3225545A1 (en) * | 2021-09-16 | 2023-03-23 | Immunitybio, Inc. | Enzyme based system for production of messenger rna with increased transfection efficiency |
CN114736884B (zh) * | 2022-05-11 | 2023-10-20 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用 |
US20240110234A1 (en) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Amplification Compositions and Methods |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060211083A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-09-21 | Federico Katzen | Products and processes for in vitro synthesis of biomolecules |
WO2013071047A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-16 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for in vitro transcription of rna |
CA3020312A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
-
2020
- 2020-03-30 WO PCT/US2020/025824 patent/WO2020205793A1/en unknown
- 2020-03-30 CA CA3135368A patent/CA3135368A1/en active Pending
- 2020-03-30 CN CN202080036375.7A patent/CN114423870A/zh active Pending
- 2020-03-30 KR KR1020217035335A patent/KR20220004057A/ko unknown
- 2020-03-30 JP JP2021560626A patent/JP2022524166A/ja not_active Withdrawn
- 2020-03-30 EP EP20783451.6A patent/EP3947704A4/en not_active Withdrawn
- 2020-03-30 US US17/441,448 patent/US20220162659A1/en active Pending
- 2020-03-30 AU AU2020253354A patent/AU2020253354A1/en active Pending
- 2020-03-30 SG SG11202110608YA patent/SG11202110608YA/en unknown
-
2021
- 2021-09-23 IL IL286633A patent/IL286633A/en unknown
- 2021-10-12 ZA ZA2021/07709A patent/ZA202107709B/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Grosjean | Nucleic acids are not boring long polymers of only four types of nucleotides: a guided tour | |
US9938511B2 (en) | Enzymes | |
JP2019510504A5 (ja) | ||
US8512997B2 (en) | Thermostable biocatalyst combination for nucleoside synthesis | |
BR112020007068A2 (pt) | métodos e composições para produção de nucleosídeo trifosfato e ácido ribonucleico | |
Del Arco et al. | Purine and pyrimidine salvage pathway in thermophiles: a valuable source of biocatalysts for the industrial production of nucleic acid derivatives | |
JP2022524166A (ja) | リボ核酸の無細胞生産 | |
Feldstein et al. | Specific association between an endoribonucleolytic sequence from a satellite RNA and a substrate analogue containing a 2'-5'phosphodiester. | |
JPWO2020205793A5 (ja) | ||
WO2013156786A1 (en) | Polymerase capable of producing non-dna nucleotide polymers. | |
US8486666B2 (en) | Removal of the guanine cap on the 5′ terminus of RNA | |
US20040086880A1 (en) | Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure | |
US20230235372A1 (en) | Ab-initio, template-independent synthesis of nucleic acids using thermostable enzymes | |
Munir et al. | Characterization of Runella slithyformis HD-Pnk, a bifunctional DNA/RNA end-healing enzyme composed of an N-terminal 2′, 3′-phosphoesterase HD domain and a C-terminal 5′-OH polynucleotide kinase domain | |
Valsala et al. | Enzymes as molecular tools | |
EP4165176A2 (en) | Controlled template-independent synthesis of nucleic acids using thermostable enzymes | |
Akram et al. | Bacterial thermophilic DNA polymerases: A focus on prominent biotechnological applications | |
RU2777282C2 (ru) | Способы и композиции для получения нуклеозидтрифосфата и рибонуклеиновой кислоты | |
Forterre et al. | The interplay between RNA and DNA modifications: back to the RNA world | |
Aliyu et al. | Enzymes in Molecular Biotechnology | |
WO2024129235A1 (en) | Enzymatic synthesis of ntp and nqp | |
Tour | Nucleic Acids Are Not Boring Long Polymers of Only Four Types ofNucleotides | |
EP1457568A1 (en) | Process for producing 2 -deoxyguanosine | |
JPH03210190A (ja) | チアミンリン酸類の製造法 | |
CN117321218A (zh) | 用于核酸合成的可重复使用起始子的再生方法和套组 |