JPWO2020198675A5

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Publication number: JPWO2020198675A5
Application number: JP2021557392A
Authority: JP
Publication date: 2023-03-31

Description

医薬品として使用するための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞もまた、本明細書に提供される。本発明は、医薬品の製造のための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞の使用をさらに提供する。本発明はまた、がんの治療に使用するための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞も提供する。本発明は、がんの治療のための医薬品の製造のための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞の使用をさらに提供する。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系とともに使用するためのプラスミドであって、前記プラスミドが、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを順に含み、前記左相同アームおよび右相同アームが、各々８００ｂｐ以下の長さである、プラスミド。
２．前記導入遺伝子と前記右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含む、上記１に記載のプラスミド。
３．前記左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さである、上記１または２に記載のプラスミド。
４．前記相同アームが、３０ｂｐの長さである、上記３に記載のプラスミド。
５．前記相同アームが、３００ｂｐの長さである、上記３に記載のプラスミド。
６．前記相同アームが、５００ｂｐの長さである、上記３に記載のプラスミド。
７．前記相同アームが、８００ｂｐの長さである、上記３に記載のプラスミド。
８．前記左相同アームおよび右相同アームが、異なる長さである、上記１または２に記載のプラスミド。
９．１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組み込み方法において使用するためのプラスミドであって、コードされた核酸の順序が、ＰＡＭ、ｃｒＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡが使用される場合、前記コードされた核酸のが、第１のＰＡＭ、第１のｃｒＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む、プラスミド。
１０．上記１～８のいずれかに記載のプラスミドの前記相同アームおよび上記９に記載のプラスミドの前記ＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、上記１～９のいずれかに記載のプラスミド。
１１．前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１～１０のいずれかに記載のプラスミド。
１２．上記１～１１のいずれかに記載のプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
１３．前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ６を含む、上記１２に記載のＡＡＶベクター。
１４．前記ベクターが、ｃｒＲＮＡ、トレーサーＲＮＡ（ｔｒｃｒＲＮＡ）、およびＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドをさらに含む、上記１２または１３に記載のＡＡＶベクター。
１５．前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、上記１２～１４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
１６．前記ベクターが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、上記１２～１５のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
１７．上記１～１１のいずれかに記載のプラスミドまたは上記１２～１６のいずれかに記載のＡＡＶベクターを含む、改変細胞。
１８．前記改変細胞が、ＣＡＲＮＫ細胞である、上記１７に記載の改変細胞。
１９．対象におけるがんを治療する方法であって、がんを有する対象に、上記１７または１８に記載の改変細胞を投与することを含む、方法。
２０．相同性指向修復によって、細胞を遺伝子改変する方法であって、
ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、前記導入遺伝子が、相同アームと隣接しており、前記相同アームが、８００ｂｐ以下の長さである、得ることと、
ｂ）前記細胞に、前記導入遺伝子および前記ＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、前記導入遺伝子が、前記細胞への前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、前記細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、前記細胞のＤＮＡ修復酵素が、前記導入遺伝子を、前記細胞の前記ゲノムＤＮＡ内の前記標的配列で宿主ゲノムに挿入し、それによって、改変細胞を生成する、方法。
２１．前記細胞が、初代細胞または増殖細胞である、上記２０に記載の方法。
２２．前記初代細胞が、感染の前に、ＩＬ－２の存在下で、４日間インキュベートされる、上記２１に記載の方法。
２３．前記初代細胞が、感染の前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、４日間増殖される、上記２２に記載の方法。
２４．感染の後に、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに前記改変細胞を増殖することをさらに含む、上記２０～２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記細胞が、ＮＫ細胞である、上記２０～２４のいずれかに記載の方法。
２６．前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体である、上記２０～２５のいずれかに記載の方法。
２７．前記ＲＮＰ複合体が、エレクトロポレーションを介して前記細胞に導入される、上記２０～２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記ＲＮＰ複合体が、トランスフェクションを介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、同じまたは異なるＡＡＶ上にコードされる、上記２０～２７のいずれかに記載の方法。
２９．相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、
（ａ）前記細胞内に、（ｉ）前記細胞のゲノム内の標的配列をコードするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ならびに（ｉｉ）各々８００ｂｐ以下の長さを有する第１および第２の相同アームに隣接する導入遺伝子を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを導入することであって、前記導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、導入することと、
（ｂ）前記細胞を、（ｉ）前記ＲＮＰ複合体が、前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、かつ（ｉｉ）前記細胞が、前記標的配列で前記細胞のゲノムに前記導入遺伝子を挿入し、ＨＤＲによって前記切断を修復し、それによって、前記導入遺伝子を前記ＤＳＢの部位で前記細胞のゲノムに組み込むのに十分な時間および条件下で、維持することと、を含む、方法。
３０．細胞が、初代細胞または増殖細胞である、上記２８に記載の方法。
３１．前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、上記２８または２９に記載の方法。
３２．前記クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、上記２８または２９に記載の方法。
３３．前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ａ）の前に、前記細胞をＩＬ－２の存在下で少なくとも約４日間インキュベートすることをさらに含む、上記２８または２９に記載の方法。
３４．前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ｂ）の後に、前記細胞をｍｂＩＬ－２１の存在下で少なくとも約４日間増殖させることをさらに含む、上記２８または２９に記載の方法。
３５．前記ｍｂＩＬ－２１が、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせを含む、上記３３に記載の方法。

Claims

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系とともに使用するためのプラスミドであって、前記プラスミドが、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを順に含み、前記左相同アームおよび右相同アームが、各々８００ｂｐ以下の長さである、プラスミド。
前記導入遺伝子と前記右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１に記載のプラスミド。
前記左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さである、請求項１に記載のプラスミド。
前記相同アームが、３０ｂｐ～８００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
前記左相同アームおよび右相同アームが、異なる長さである、請求項１に記載のプラスミド。
１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組み込み方法において使用するためのプラスミドであって、コードされた核酸の順序が、ＰＡＭ、ｃｒＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡが使用される場合、前記コードされた核酸のが、第１のＰＡＭ、第１のｃｒＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む、プラスミド。
前記相同アームが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載のプラスミド。
前記ＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、請求項６に記載のプラスミド。
前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミド。
請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ６を含む、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
前記ベクターが、ｃｒＲＮＡ、トレーサーＲＮＡ（ｔｒｃｒＲＮＡ）、およびＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドをさらに含む、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
請求項１～９のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項１０に記載のＡＡＶベクターを含む、改変細胞。
前記改変細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１４に記載の改変細胞。
がんを治療するための、請求項１５に記載の改変細胞。
相同性指向修復によって、細胞を遺伝子改変する方法であって、
ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、前記導入遺伝子が、相同アームと隣接しており、前記相同アームが、８００ｂｐ以下の長さである、ことと、
ｂ）前記細胞に、前記導入遺伝子および前記ＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、前記導入遺伝子が、前記細胞への前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、前記細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、前記細胞のＤＮＡ修復酵素が、前記導入遺伝子を、前記細胞の前記ゲノムＤＮＡ内の前記標的配列で宿主ゲノムに挿入し、それによって、改変細胞を生成する、方法。
前記初代細胞が、感染の前に、ＩＬ－２の存在下で、４日間インキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
前記初代細胞が、感染の前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、４日間増殖される、請求項１８に記載の方法。
感染の後に、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに前記改変細胞を増殖することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体である、請求項１７に記載の方法。
前記ＲＮＰ複合体が、エレクトロポレーションを介して前記細胞に導入される、請求項１７に記載の方法。
前記ＲＮＰ複合体が、トランスフェクションを介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、同じまたは異なるＡＡＶ上にコードされる、請求項１７に記載の方法。
相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、細胞を遺伝子改変する方法であって、
（ａ）前記細胞内に、（ｉ）前記細胞のゲノム内の標的配列をコードするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ならびに（ｉｉ）各々８００ｂｐ以下の長さを有する第１および第２の相同アームに隣接する導入遺伝子を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを導入することであって、前記導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、ことと、
（ｂ）前記細胞を、（ｉ）前記ＲＮＰ複合体が、前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、かつ（ｉｉ）前記細胞が、前記標的配列で前記細胞のゲノムに前記導入遺伝子を挿入し、ＨＤＲによって前記切断を修復し、それによって、前記導入遺伝子を前記ＤＳＢの部位で前記細胞のゲノムに組み込むのに十分な時間および条件下で、維持することと、を含む、方法。
細胞が、初代細胞または増殖細胞である、請求項１７または２４に記載の方法。
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２５に記載の方法。
前記クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項２４に記載の方法。
前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ａ）の前に、前記細胞をＩＬ－２の存在下で少なくとも約４日間インキュベートすることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ｂ）の後に、前記細胞をｍｂＩＬ－２１の存在下で少なくとも約４日間増殖させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
前記ｍｂＩＬ－２１が、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。