JP2022527709A - Ｃａｓ９／ｒｎｐおよびａａｖウイルスの組み合わせを使用したがん免疫療法のための、キメラ抗原受容体（ｃａｒ）－初代ｎｋ細胞の生成 - Google Patents

Abstract

組み込みのためにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系およびリボ核タンパク質のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達を使用して、細胞を遺伝子操作するための方法が開示される。一部の態様では、当該方法を実施するためのＡＡＶプラスミドが本明細書に開示される。【選択図】図１１

Description

近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が細胞の操作に使用されている。この技術は、ＤＮＡ切断を生成するか、または小さな置換もしくは小さな挿入を行うことによって、遺伝子をサイレンシングするためのロバストな方法であることが証明されている。しかしながら、その技術は、技術的なハードルに悩まされている。マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションなどの（任意のドナーＤＮＡまたはＲＮＡとともに）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞に送達するための技術は、インビボでの使用には適していない。さらに、ノックイン変異は、典型的には、インビトロ、インビボ、および臨床応用において非常に低い効率を有する。ウイルスベクターを使用して（任意のドナーＤＮＡまたはＲＮＡとともに）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞内に送達することは、インビボ適合性に対処するが、導入遺伝子のサイズに制限を有し、宿主免疫応答を誘導して、手順に関連する実質的な細胞アポトーシスをもたらし、遺伝子操作された細胞の産生を制限する可能性がある。必要とされるのは、細胞を遺伝子操作する新しい方法およびベクターである。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９遺伝子編集系を細胞に送達するための、ＡＡＶプラスミドに関連する方法および組成物が開示される。一部の態様では、ＡＡＶプラスミドは、導入遺伝子をさらに含む。

一態様では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系において使用するためのプラスミドが本明細書に開示され、プラスミドは、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを順に含み、左相同アームおよび右相同アームは、各々８００ｂｐ以下の長さ（例えば、プラスミド１および２の３０ｂｐ、プラスミド３および４の３００ｂｐ、プラスミド５および６の５００ｂｐ、または８００ｂｐ）である。一部の態様では、プラスミドは、導入遺伝子と右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含むことができる。

左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さまたは異なる長さである、任意の先行する態様のプラスミドもまた本明細書に開示される。

一態様では、１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰａｉｎｔ（または非相同末端結合）方法において使用するためのプラスミドが本明細書に開示され、コードされた核酸の順序は、ＰＡＭ、ｇＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｇＲＮＡが使用される場合、コードされた核酸のは、第１のＰＡＭ、第１のｇＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む。

一態様では、プラスミドの相同アームまたはＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、任意の先行する態様のプラスミドが本明細書に開示される。

導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、任意の先行する態様のプラスミドもまた開示される。

一態様では、任意の先行する態様のプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（血清型ＡＡＶ６のＡＡＶベクターなど）が、本明細書に開示される。一態様では、ＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶまたは自己相補的ＡＡＶであり得る。

ベクターが、ｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））、およびＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドをさらに含む、任意の先行するベクターもまた本明細書に開示される。

一態様では、任意の先行する態様のプラスミドまたはベクターを含む改変細胞が本明細書に開示される。

がんを有する対象に、任意の先行する態様の改変細胞を投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法もまた本明細書に開示される。

一態様では、相同性指向修復によって、細胞（初代細胞または増殖細胞を含むが、これらに限定されないＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞）を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、導入遺伝子は、相同アームと隣接しており、相同アームは、８００ｂｐ以下の長さである、得ることと、ｂ）細胞に、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、導入遺伝子は、細胞へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して細胞に導入され、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、細胞のＤＮＡ修復酵素は、導入遺伝子を標的配列で宿主ゲノムに挿入し（例えば、相同修復によって）、それによって、改変細胞を生成する。一部の態様では、ＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーションを介して細胞に導入され得る。一部の態様では、ＲＮＰ複合体は、同じまたは異なるＡＡＶ内でのウイルス送達（すなわち、重感染）を介して細胞に導入され得る。

一態様では、非相同末端結合によって、細胞（初代細胞または増殖細胞を含むが、これらに限定されないＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞）を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、導入遺伝子は、１つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡに隣接している（ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｏ）か、または２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡと隣接している（ｆｌａｎｋｅｄ ｂｙ）、得ることと、ｂ）細胞に、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、導入遺伝子は、標的細胞へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して細胞に導入され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体内で、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、切断し、細胞のＤＮＡ修復酵素は、導入遺伝子を標的配列で宿主ゲノムに挿入し（例えば、非相同末端結合によって）、それによって、改変細胞を生成する。

任意の先行する態様の細胞を遺伝子改変する方法であって、初代細胞は、感染および／またはエレクトロポレーションの前に、ＩＬ－２および／または照射されたフィーダー細胞の存在下で４日間インキュベートされる方法もまた本明細書に開示される。

任意の先行する態様の細胞を遺伝子改変する方法であって、感染および／またはエレクトロポレーションの後に、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに、改変細胞を増殖することをさらに含む方法もまた本明細書に開示される。

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、一部の実施形態を例示し、説明とともに、開示される組成物および方法を例示する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および導入遺伝子の送達のためのＡＡＶベクターを使用した、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の概略図を示す。概略図は、相同性指向修復を介した導入遺伝子の組み込みにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の作用の詳細を示し、１９番染色体上のＡＡＶＳ１標的部位を示し、３０、３００、５００、または８００ｂｐの相同アームを有するドナープラスミドの詳細を提供する。 図１－１の続きである。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９含有プラスミドの概略図を示す。 単一のＰＡＭ＋ｃｒＲＮＡと、第２のＰＡＭ＋ｃｒＲＮＡを添加するプラスミド１１および１２（３Ａ）とを有する、本明細書でプラスミド９および１０（３Ｂ）と称されるＨＩＴＩまたはＣＲＩＳＰａｉｎｔなどの非相同末端結合方法で使用される導入遺伝子のプラスミドの概略図を示す。図は、ＰＡＭおよびｃｒＲＮＡを含むと理解されるｇＲＮＡを示すことに留意されたい。 単一のＰＡＭ＋ｃｒＲＮＡと、第２のＰＡＭ＋ｃｒＲＮＡを添加するプラスミド１１および１２（３Ａ）とを有する、本明細書でプラスミド９および１０（３Ｂ）と称されるＨＩＴＩまたはＣＲＩＳＰａｉｎｔなどの非相同末端結合方法で使用される導入遺伝子のプラスミドの概略図を示す。図は、ＰＡＭおよびｃｒＲＮＡを含むと理解されるｇＲＮＡを示すことに留意されたい。 ＮＫ細胞をトランスフェクトするためのＡＡＶ血清型の決定を示す。図４Ａは、異なるトランスフェクション条件下での様々なＡＡＶ血清型に対するＧＦＰの発現を示す。 ＮＫ細胞をトランスフェクトするためのＡＡＶ血清型の決定を示す。図４Ｂは、ＮＫ細胞におけるＡＡＶ６ゲノムＤＮＡのコピー数を示す。 ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座へのｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の組み込みが、ＰＣＲ（５Ａ）を使用して評価されたことを示す。ｍＣｈｅｒｒｙ１（フォワードプライマーは、配列番号２であり、リバースプライマーは、配列番号３である）およびｍＣｈｅｒｒｙ２（フォワードプライマーは、配列番号４であり、リバースプライマーは、配列番号５である）の増幅のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを示す。ｍＣｈｅｒｒｙの安定遺伝子発現が、フローサイトメトリー（５Ｂ）および蛍光顕微鏡検査（５Ｃ）を使用して研究されたことも示されている。＊結果は、１２個の設計されたＡＡＶ構築物のうちの２個を表す。使用されるｇＲＮＡ、ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１）。 図５Ａの続きである。 図５Ａの続きである。 ヒト初代ＮＫ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座へのｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の組み込みが、ＰＣＲ（６Ａ）を使用して評価されたことを示す。増殖後のｍＣｈｅｒｒｙの安定遺伝子発現が、フローサイトメトリー（６Ｂ）を使用して研究された。＊結果は、１２個の設計されたＡＡＶ構築物のうちの２個を表す。 図６Ａの続きである。 プラスミド１、２、３、４、５、６、７および８を含有するｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の概略図を示し、左相同アーム（ＬＨＡ）、スプライスアクセプター、導入遺伝子、ポリアデニル化ターミネーター、および右相同アーム（ＲＨＡ）の相対位置、ならびに構築物全体の対応する配列を示す。図７Ａおよび図７Ｂは、３０ｂｐの相同アームプラスミド１および２の概略図および配列（配列番号１３）を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、３００ｂｐの相同アームプラスミド３および４の概略図および配列（配列番号１４）を示す。図７Ｅおよび図７Ｆは、５００ｂｐの相同アームプラスミド５および６の概略図および配列（配列番号１５）を示す。図７Ｇおよび図７Ｈは、８００ｂｐのＬＨＡおよび１０００ｂｐのＲＨＡを含む８００ｂｐの相同アームプラスミド７および８の概略図および配列（配列番号１６）を示す。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 ＮＫの単離および増殖のスキームを示す。初代ヒトＮＫ細胞を、健康なドナーからのバフィーコートから単離し、ｍｂＩＬ２１ Ｋ５６２を使用して７日間増殖した。 単離されたＮＫ細胞のフローサイトメトリーの結果を示し、ＮＫ細胞の純度を示す。バフィーコートから単離された細胞を、ＣＤ３およびＣＤ５６の染色によってＴ細胞汚染について評価した。フローサイトメトリーの結果に基づいて、単離されたリンパ球は、＞９０％のＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性であった。 ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析は、ＮＫ細胞におけるＡＡＶＳ１が、遺伝子挿入に好適なクロマチンアクセシビリティを有することを示す。オープンクロマチン領域を表すＡＴＡＣ－ｓｅｑピーク。データは、ＡＡＶＳ１が、ナイーブおよび増殖７日目のＮＫ細胞において同様のクロマチンアクセシビリティを有することを示す。 ヒト初代ＮＫ細胞における目的の遺伝子を標的にするＣａｓ９／ＲＮＰの産生およびエレクトロポレーションを示す。ｇＲＮＡを作製するために、事前に転写されたｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡを９５℃で５分間アニールした。次いで、事前翻訳されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を、ｇＲＮＡと室温で１０分間混合した。Ｃａｓ９／ＲＮＰおよびエレクトロポレーションエンハンサーをＮＫ細胞に添加した。次いで、混合物をＬｏｎｚａ４Ｄヌクレオフェクションキュベットに移した。細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄを使用してＥＮ－１３８プログラムでエレクトロポレーションした。 ＩＣＥ解析は、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用したＮＫ細胞における成功した遺伝子（ＡＡＶＳ１）標的化を示す。ＩＣＥは、サンガーシーケンシングデータを使用して、ＣＲＩＳＰＲ編集の定量解析を生成する。この方法を使用して、我々は、８５％を超えるＮＫ細胞を、ＡＡＶＳ１遺伝子座で標的にすることに成功したことを示した。 ＡＡＶＳ１をノックアウトしても、ＮＫ細胞の細胞毒性を変えないことを示す。カルセイン－ＡＭ細胞毒性アッセイは、ＡＡＶＳ１－ＫＯおよび野生型ＮＫ細胞によるＡＭＬ細胞株に対するＮＫ細胞媒介性殺傷において差異を示さなかった。これは、ＮＫ細胞内のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とすることの安全性を実証する。 ヒト初代ＮＫ細胞を形質導入するためのＡＡＶの最良の血清型を同定することを示す。４つの異なる血清型のＡＡＶのうち、ＡＡＶ６で形質導入されたＮＫ細胞のみが、ＧＦＰの発現を示した（上位のパネル）。３００，０００のＭＯＩでのＮＫ細胞の形質導入の４８時間後に、ＡＡＶ６ウイルスゲノムを検出することができた（下位のパネル）。 ＨＲ指向性遺伝子挿入には、ＨＡの最適な長さが必要であることを示す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復機構は、Ｃａｓ９ ＤＳＢに続いて活性化され、遺伝子ノックアウトをもたらす。相同修復（ＨＲ）ＤＮＡ修復機構は、Ｃａｓ９標的部位（ＡＡＶＳ１）のための最適な相同アームを有するＤＮＡテンプレートの存在下で、その活性化が遺伝子挿入をもたらす経路である。左側のＨＡの場合、３０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐおよび８００ｂｐのＨＡ、右側のＨＡの場合、３０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐおよび１０００ｂｐを設計した。ＨＲテンプレートを、ｓｓＡＡＶ６またはｓｃＡＡＶ６ベクターのＩＴＲ内でクローニングした。 図１５－１の続きである。 Ｃａｓ９標的部位の隣接領域に対してＨＡを必要としない、ＣＲＩＳＰａｉｎｔアプローチによる遺伝子組み込みを示す。ＣＲＩＳＰａｉｎｔアプローチによる非相同遺伝子挿入（図１５Ａ）について、単一（ＰＡＭｇ）または二重（ＰＡＭｇＰＡＭｇ）ＡＡＶＳ１標的部位（ｃｒＲＮＡ＋ＰＡＭ配列）をＩＴＲ内に含めた。ＣＲＩＳＰａｉｎｔは、ＨＲ遺伝子挿入のためのＨＡを設計する時間のかかるプロセスを克服するのに役立つ（図１５Ｂ）。 図１６Ａ－１の続きである。 図１６Ａ－１の続きである。 フローサイトメトリーの結果は、ＨＥＫ２９３細胞における導入遺伝子発現に成功したことを示した。ベクターの精度をアッセイするための、ＨＥＫ２９３細胞への１μｇのｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡのエレクトロポレーションは、遺伝子発現に成功したことを示した。フローサイトメトリーは、ｍＣｈｅｒｒｙの安定発現を示した。 ナイーブおよび増殖ＮＫ細胞におけるＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ調節酵素の発現レベルを研究することを示す。ＨＲ関連酵素は、ナイーブＮＫ細胞と比較して、７日目の増殖ＮＫ細胞において上方調節された。ナイーブ細胞と増殖ＮＫ細胞との間には、非相同性関連酵素ＬＩＧ４の差はない。このデータは、７日目の増殖ＮＫ細胞が、ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔの両方による指向性遺伝子挿入のためのＡＡＶ６でのエレクトロポレーションおよび形質導入のための潜在的な最適条件を有することを示す。 遺伝子挿入のためのＣａｓ９／ＲＮＰのエレクトロポレーションおよびＡＡＶ６の形質導入の組み合わせを示す。ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡを送達するＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔウイルスの５００，０００、３００，０００、または１５０，０００のＭＯＩのｓｓＡＡＶ６またはｓｃＡＡＶ６を使用して、Ｃａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションした７日目の増殖ＮＫ細胞を形質導入した。 フローサイトメトリーの結果は、ＡＡＶ６のより高いＭＯＩで形質導入されたＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞において安定したｍＣｈｅｒｒｙ発現を示したことを示す。５００，０００のＭＯＩまたは３００，０００のＭＯＩのＨＲ－８００ｂｐを送達するｓｓＡＡＶまたはＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＰＡＭｇＰＡＭｇを送達するｓｃＡＡＶで形質導入された細胞間のｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＮＫ細胞のパーセンテージに有意差は見られなかった。したがって、残りの実験では、３００，０００のＭＯＩおよび１５０，０００のＭＯＩのＡＡＶ６を使用した。 ＣＲＩＰＳＲ改変初代ＮＫ細胞のフローサイトメトリーの結果が、高効率な導入遺伝子発現を実証したことを示す。ＮＫ細胞をＣａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションし、ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡテンプレートを送達する３００，０００のＭＯＩまたは１５０，０００のＭＯＩのｓｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶ６で形質導入した。ＣＲＩＳＰＲ改変の６日後、フローサイトメトリーの結果は、ｓｃＡＡＶ６を使用して、Ｃａｓ９標的部位の隣接領域に対して３００ｂｐの最小最適相同アーム長でｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡを送達することが、初代ＮＫ細胞における高効率な遺伝子挿入をもたらすことを示す。小さな導入遺伝子に対して５００ｂｐおよび８００～１０００ｂｐを含む大きなＨＡはまた、ＮＫ細胞への遺伝子挿入に利用することができる。大きな導入遺伝子について３０ｂｐのＨＡも遺伝子挿入に使用することができることを示している。加えて、ＣＲＩＳＰａｉｎｔが、ヒト初代ＮＫ細胞への遺伝子挿入に適用可能なアプローチであることを実証する。 ｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＮＫ細胞を、ｍｂ－ＩＬ２１発現フィーダー細胞上で増殖させることができることを示す。ｓｓＡＡＶ６－ＨＲ－８００ｂｐおよびｓｃＡＡＶ６－ＣＲＩＳＰａｉｎｔ－ＰＡＭｇＰＡＭｇで生成し、低効率を有したｍＣｈｅｒｒｙ ＮＫ細胞を、ＦＡＣＳで選別し、フィーダー細胞を使用して２０日間増殖させた。選別の２０日後のフローサイトメトリー結果は、ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔの両方を介して生成されたＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞における安定および富化したｍＣｈｅｒｒｙ発現を示した。

本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬（当然、変化し得るため）に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。

本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各終点は、他の終点と関連して、および他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、次いで「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が「値以下」であることが開示される場合、「値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５との間に加えて、１０超、１０以上、１０に等しい、１５未満、１５以下、および１５に等しいが開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。

本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するべく定義されたいくつかの用語を参照されたい。

「任意選択的」または「任意選択的に」とは、後で説明する事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、説明には、当該事象または状況が生じる事例および生じない事例を含む。

「プライマー」は、ある種の酵素マニピュレーションを支持することができ、酵素マニピュレーションが生じ得るように標的核酸とハイブリダイズすることができるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素マニピュレーションを妨げない、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。

「プローブ」は、典型的には、例えばハイブリダイゼーションを通して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で十分に理解され、本明細書で論じられる。典型的には、プローブは、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。

特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく（したがって、ＤＮＡおよびｍＲＮＡはともにタンパク質をコードする）、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡなど）をコードしてもよい。

「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、（ＤＮＡの場合）、インビトロまたはインビボでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドンおよび３’末端（Ｃ末端）での翻訳停止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列には、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸が挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。

本明細書で使用される場合、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される「天然に存在する」または「未改変」または「野生型」という用語は、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ実験室内でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、野生型である（および天然に存在する）。

「対象への投与」には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術）などを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される「同時投与」（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、またはａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または本質的に互いの直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」とは、例えば、循環系またはリンパ系への入口を通して、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超の領域）に薬剤を導入または送達する経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域またはそれに直接隣接する領域に薬剤を導入または送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、または無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。

薬剤の「有効量」とは、所望の効果を提供するのに十分な量の薬剤を指す。「有効」である薬剤の量は、対象の年齢および一般状態、特定の薬剤（複数可）などの多くの要因に応じて、対象によって異なるであろう。したがって、定量化された「有効量」を指定することは必ずしも可能ではない。しかしながら、任意の対象の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験を使用して当業者によって決定されてもよい。また、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、薬剤の「有効量」とは、治療上有効量および予防上有効量の両方をカバーする量も指すことができる。治療効果を達成するのに必要な薬剤の「有効量」は、対象の年齢、性別、および体重などの要因に従って変化し得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、一日に用量をいくつかに分割して投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して低減してもよい。

「薬学的に許容される」構成要素は、生物学的または他の望ましくないものではない構成要素、すなわち、著しく望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される製剤の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に組み込んで、本明細書に記載のように対象に投与することができる構成要素を指すことができる。ヒトへの投与に関して使用される場合、この用語は、一般に、構成要素が毒性試験および製造試験の必要な基準を満たしているか、またはそれが、米国食品医薬品局によって調製された不活性成分ガイドに含まれることを意味する。

「薬学的に許容される担体」（「担体」と称されることがある）は、一般に安全かつ無毒の薬学的または治療組成物の調製において有用な担体または賦形剤を意味し、獣医学的および／またはヒトの薬学的または治療的使用が許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、限定されないが、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョンなど）、および／または様々な種類の湿潤剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤で使用するために当該技術分野でよく知られた材料、および本明細書にさらに記載される材料を包含するが、これらに限定されない。

「薬理学的活性」（または単に「活性」）は、「薬理学的活性」誘導体または類似体において、親化合物と同じ種類の薬理学的活性を有し、程度がほぼ同等な誘導体または類似体（例えば、塩、エステル、アミド、複合体、代謝産物、異性体、断片など）を指し得る。

「治療剤」は、有益な生物学的効果を有する任意の組成物を指す。有益な生物学的効果としては、治療効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の治療、および予防効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態（例えば、非免疫原性がん）の予防の両方が挙げられる。これらの用語はまた、本明細書に具体的に言及される有益な薬剤の薬理学的に許容される活性な誘導体を包含し、限定されないが、塩、エステル、アミド、前駆薬剤、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含む。「治療剤」という用語が使用される場合、次いで、または特定の薬剤が具体的に同定される場合、この用語は、薬剤自体、ならびに薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、前駆薬剤、複合体、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むことを理解されたい。

組成物（例えば、薬剤を含む組成物）の「治療上有効量」または「治療上有効用量」は、所望の治療結果を得るのに有効な量を指す。一部の実施形態では、所望の治療結果は、Ｉ型糖尿病の制御である。一部の実施形態では、所望の治療結果は、肥満の制御である。所与の治療剤の治療上有効量は、典型的には、治療される障害または疾患の種類および重症度、ならびに対象の年齢、性別、および体重などの要因に関して異なるであろう。この用語はまた、疼痛緩和などの所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量、または治療剤の送達の速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、治療される状態、対象の耐容性、投与される薬剤および／または薬剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤の濃度など）、ならびに当業者によって理解される様々な他の因子に従って異なるであろう。場合によっては、所望の生物学的応答または医学的応答は、数日、数週間、または数年にわたって、組成物を複数回投与した後に達成される。

本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に援用される。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で論じられ、それらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に援用される。

Ｂ．プラスミドおよび細胞を遺伝子改変する方法
一態様では、ドナー導入遺伝子を細胞に送達し、当該導入遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて細胞に組み込むためのプラスミドが本明細書に開示される。

エンドヌクレアーゼ／ＲＮＰ（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰ）は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化した３成分性の組換えエンドヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）からなる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化したエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと称され得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的配列と複合体化した相補的反復ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス相補的反復ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズし得るＲＮＡからなる合成単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする。一部の場合では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドであり、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。これらのＣａｓ９／ＲＮＰは、機能複合体としてそれらが送達されるために、外来ＤＮＡに依存したアプローチと比較して、より高い効率でゲノム標的を切断することができる。加えて、細胞からのＣａｓ９／ＲＮＰの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのオフターゲット効果を低減することができる。

ＲＮＰ複合体を作製するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、約５０μＭ～約５００μＭ（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μＭ）、好ましくは１００μＭ～約３００μＭ、最も好ましくは約２００μＭの濃度の１：１、２：１、１：２の比で、９５℃で約５分間混合して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ）を形成することができる。次いで、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９など）の約２０μＭ～約５０μＭ（例えば、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７ ４８、４９、または５０μＭ）の最終希釈で混合することができる。

標的細胞中の標的配列に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的ＤＮＡに、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入、内因性ＤＮＡ断片の欠失、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座、またはそれらの組み合わせ、を導入することによってゲノムを改変することができる。したがって、本開示の方法を使用して、相同組換えのためにＤＮＡと組み合わせた場合、ノックアウト、またはノックインを生成することができる。本明細書では、Ｃａｓ９／ＲＮＰのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介した形質導入は、細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）における遺伝子改変の以前の制約を克服する容易かつ比較的効率的な方法であることが示される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、相同組換え（ＨＲ）の間、ドナーテンプレートＤＮＡとして機能するために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、高レベルの正確なゲノム編集を促進することが最近示されている。しかしながら、ＡＡＶの先行使用は、ＮＫ細胞が、ウイルスおよび細菌ベクター、ならびに当該ベクターによるＮＫ細胞のアポトーシスの誘導に耐性がある、それらの免疫機能により、制限されている。したがって、本方法以前は、ＮＫ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ改変は成功していなかった。さらに、約４．５キロベースの最大ＡＡＶパッケージング容量は、相同アームを含むドナーサイズを制限する。推奨されるのは、１００ｂｐを超える任意の転写産物および任意の導入遺伝子が、各アームに対して少なくとも８００ｂｐである相同アームを有し、多くの系が、８００ｂｐおよび１０００ｂｐの非対称アームを合計１８００ｂｐ使用することである。したがって、ＡＡＶベクターは、約２．５ｋｂを超える導入遺伝子を送達することができない。一態様では、表１に示されるように、３０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｂｐを含むが、これらに限定されない３０ｂｐ～１０００ｂｐの相同アームを有するドナー構築物プラスミドを含むＡＡＶ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレオチド送達系が、本明細書に開示される。例えば、相同アームは、相同組換え（ＨＲ）の場合、プラスミド１および２（図７Ａおよび図７Ｂ）のような対称的３０ｂｐ相同アーム、プラスミド３および４（図７Ｃおよび図７Ｄ）のような対称的３００ｂｐ相同アーム、プラスミド５および６（図７Ｅおよび図７Ｆ）のような対称的５００ｂｐ相同アーム、または８００ｂｐ左相同アーム（ＬＨＡ）および１０００ｂｐ右相同アーム（ＲＨＡ）を含む、プラスミド７および８（図７Ｇおよび図７Ｈ）のような非対称的８００ｂｐ相同アームであり得るか、あるいは相同性非依存的標的組み込み（ＨＩＴＩ）プラスミドを使用した非相同末端結合の場合、相同アームをまったく有しない（プラスミド９、１０、１１、および１２）ものであり得る。任意の既存のプラスミドに比べて、プラスミド１、２、３、４、５、および６の利点は、挿入だけでなく、大きな転写産物にも使用することができることである。プラスミド１、２、３、４、５、および６は、任意の細胞型でも使用することができ、臨床的に承認されたスプライスアクセプター（ＳＡ）（配列番号１０）および臨床的に承認されたポリアデニル化ターミネーター（ＰＡ）（例えば、ＢＧＨポリＡターミネーター配列番号１１など）を有する。プラスミド７および８は、臨床的に承認されたスプライスアクセプター（ＳＡ）および臨床的に承認されたポリアデニル化ターミネーター（ＰＡ）を有する。相同アームは、異なる導入遺伝子長に対応するために、対称的（各側の同じ長さ）または非対称的（各側の異なる長さ）であり得ることが理解され、本明細書で企図される。すなわち、相同アーム長は、ＬＨＡ ３０ｂｐ（配列番号２）およびＲＨＡ ３０ｂｐ（配列番号１）、ＬＨＡ ３０ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ ３０ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ（配列番号３）、ＬＨＡ ３０ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ（配列番号５）、ＬＨＡ ３０ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ（実際にプラスミド７および８の１０００ｂｐ、配列番号７）、ＬＨＡ ３０ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ ３０ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ、ＬＨＡ １００ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐ（配列番号４）およびＲＨＡ ３０ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ、ＬＨＡ ３００ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐ（配列番号６）およびＲＨＡ ３０ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ、ＬＨＡ ５００ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐ（配列番号８）およびＲＨＡ ３０ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ、ＬＨＡ ８００ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐ、ＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ ３０ｂｐ、ＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ １００ｂｐ、ＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ ３００ｂｐ、ＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ ５００ｂｐ、ＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ ８００ｂｐ、ならびにＬＨＡ １０００ｂｐおよびＲＨＡ １０００ｂｐを含むが、これらに限定されない左相同アーム（ＬＨＡ）長および右相同アーム（ＲＨＡ）長の組み合わせを有することができる。

プラスミド９、１０、１１、および１２は、プラスミド１～８または当該技術分野に記載される任意のプラスミドと著しく異なる。これらのプラスミドは、同じ臨床的に承認されたＳＡおよびＰＡを有し、任意の細胞型で使用することができるが、相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して組み込まれるのではなく、ＨＩＴＩ、ＣＲＩＳＰａｉｎｔ、または他の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して組み込まれる。したがって、それらはより高い効率で組み込まれるという利点がある。組み込みのための導入遺伝子を除去するための切断部位の同定を支援するために、プラスミドは、ドナー導入遺伝子組み込みを標的とするためのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）およびｃｒＲＮＡ（すなわち、ｇＲＮＡ）（配列番号９）を含む。プラスミド１１および１２は、ドナー導入遺伝子プラスミド上の少なくとも１つの部位を標的化するＣａｓ９の可能性を増加させるために、２つのＰＡＭ配列を含む。

表１に示されるように、相同アームおよびの変化は、プラスミドが一本鎖または自己相補的であるかどうかと同様に、ドナー導入遺伝子を組み込む能力に劇的に影響を与えることができる。

加えて、一本鎖（ＳＳ）プラスミドを使用してより大きな導入遺伝子を挿入することの利点にもかかわらず、ＳＳプラスミドは、いくつかの細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）におけるＤＮＡ感知機構および細胞毒性を増加させる組み込み前に、細胞内で折り畳まれ、二本鎖ＤＮＡとして機能するにはより長い時間が必要である。この問題は、細胞内の外因性ＤＮＡへの曝露時間を減少させるために、自己相補的（ＳＣ）（二本鎖）構築物を使用することにより、本明細書では、プラスミド２、４、６、８、１０、および１２によって克服される。本開示のプラスミド。

本明細書では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を標的部位に標的化し、またドナープラスミドを切断して、ドナー導入遺伝子の宿主ＤＮＡへの組換えを可能にするために、ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用することが理解され、企図される。一部の場合では、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせて、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成する。開示されるプラスミドは、ＡＡＶＳ１と称される、ヒトの１９番染色体上のタンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のイントロン１を、導入遺伝子の組み込みの標的部位とした、ＡＡＶ組み込みを使用する。この遺伝子座は、「セーフハーバー遺伝子」であり、多くの細胞型において安定した長期の導入遺伝子発現を可能にする。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの破壊は、いかなる既知の疾患とも関連しないため、ＡＡＶＳ１遺伝子座は、導入遺伝子の標的化のための安全なハーバーとみなされることが多い。ＡＡＶＳ１部位が標的位置として使用されているため、ＣＲＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、当該ＤＮＡを標的にしなければならない。ここで、開示されるプラスミドで使用されるガイドＲＮＡは、ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１）、またはその任意の１０ヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンスの連続した断片を含む。ＡＡＶＳ１は、本明細書で例示的な目的のために使用されるが、他の「セーフハーバー遺伝子」が、同等の結果で使用され得、トランスフェクトされる特定の細胞型または導入遺伝子を考慮してより適切であれば、ＡＡＶＳ１に置換され得ることが理解され、本明細書で企図される。他のセーフハーバー遺伝子の例としては、限定されないが、Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＴＲＡＣが挙げられる。

上述のように、開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドおよび任意のドナー導入遺伝子を送達するためのベクターとしてのＡＡＶの使用は、最大で約４．５ｋｂに制限される。導入遺伝子の許容サイズを増加させる１つの方法は、典型的に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）のＣａｓ９を、異なる細菌源からの合成Ｃａｓ９またはＣａｓ９に交換することによって、追加の余地を生成することであることが理解され、本明細書で企図される。Ｃａｓ９の置換を使用して、標的特異性を増やすこともできるため、ｇＲＮＡを使用する必要がより少なくなる。したがって、例えば、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃａｓｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＬｂＣｐｆ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳｔＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、強化ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、Ｆｏｋｌ融合ｄＣａｓ９、増殖Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）、および／または触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、に由来し得る。

特定のＣａｓ９を使用すると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（または代替物）を使用して標的をスクリーニングするＰＡＭ配列を変えることができることが理解され、本明細書で企図される。本明細書で使用される場合、好適なＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ）ＮＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ）ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣＡｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ）、ＴＴＴＶ（ＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭおよびＡｓＣｐｆ１ ＰＡＭ）；ＴＹＣＶ（ＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭバリアントおよびＡｓＣｐｆ１ ＰＡＭバリアント）を含み、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴであり、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｒは、ＡまたはＧである。

一態様では、細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に提供され、細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的な対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを得ることであって、導入遺伝子は、相同アームと隣接している、得ることと、ｂ）細胞に、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、導入遺伝子は、標的細胞へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して細胞に導入され、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする。一態様では、本方法は、エレクトロポレーション（ＮＫ細胞を改変する場合などの）を介して、ＲＮＰ複合体を細胞に導入することをさらに含むことができる。一態様では、本方法は、標的細胞を、ＲＮＰ複合体を含む第２のＡＡＶウイルスで重感染させることをさらに含むことができる。導入遺伝子が十分に小さい一態様では、同じＡＡＶは、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体の両方を含むことができる。なおさらなる態様では、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体は、同じプラスミド上でコードされることができる。

本開示の方法は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞ならびに任意の他の細胞型を含む任意の細胞型で利用できることが理解され、本明細書で企図される。ヒトＮＫ細胞は、開示されるプラスミドおよびそれらの使用方法のための特に優れた標的である。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子を欠く標的細胞を感知し、死滅させる。ＮＫ細胞活性化受容体には、とりわけ、自然細胞毒性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６）、ならびにレクチン様受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１が含まれる。それらのリガンドは、ストレスを受けた細胞、形質転換した細胞、または感染した細胞で発現されるが、正常細胞では発現されないため、正常細胞は、ＮＫ細胞殺傷に対して耐性となる。ＮＫ細胞の活性化は、キラー免疫グロビン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＴＧＦβ、および白血球Ｉｇ様受容体－１（ＬＩＲ－１）などの抑制性受容体を介して負に調節される。一態様では、標的細胞は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変細胞の最終レシピエント）、ＮＫ細胞株（ＮＫ ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ－ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）、または初代ＮＫ細胞源もしくはＮＫ細胞株に由来する増殖ＮＫ細胞源からの初代ＮＫ細胞であり得る。

細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）の形質導入の前に、細胞を、細胞の増殖に好適な培地中でインキュベートすることができる。培養条件は、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞の添加を含み得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を遺伝子改変する方法であって、細胞の増殖を支持する培地中で細胞を形質導入する前に、細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間インキュベートすることをさらに含み、培地が、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞をさらに含む、方法が、本明細書に開示される。例えば、培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１を含むことができる。一態様では、培地はまた、抗ＣＤ３抗体を含むことができる。一態様では、フィーダー細胞は、細胞を刺激するフィーダー細胞から精製され得る。例えば、本明細書に開示される、請求項に記載の発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合型ＩＬ－１５および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ－２１、もしくはこれらの任意の組み合わせでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、あるいはＥＢＶ－ＬＣＬ、のいずれかであり得る。一部の態様では、フィーダー細胞は、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、細胞の培養に播種することができる。培養期間は、ＡＡＶ感染後１～１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３～７日間、最も好ましくは４～６日間であり得ることが理解され、本明細書で企図される。

初代細胞および増殖細胞（初代および増殖Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞を含むが、これに限定されない）のインキュベーション条件は、異なる場合があることを理解され、本明細書で企図される。一態様では、ＡＡＶ感染前の初代ＮＫ細胞の培養は、培地、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１など）、および／または抗ＣＤ３抗体を５日間未満（例えば、１、２、３、または４日間）含む。増殖ＮＫ細胞について、培養は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１など）および／または抗ＣＤ３抗体に加えて、またはそれに代えて、ＮＫフィーダー細胞の存在下で（例えば、１：１の比率で）行われ得る。増殖ＮＫ細胞の培養は、形質導入前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間行うことができる。したがって、一態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、肝細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を遺伝子改変する方法が、本明細書に開示され、ＡＡＶベクターでの感染および／またはエレクトロポレーション（ＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションを介して導入されるとき）の前に、初代細胞を、ＩＬ－２の存在下で４日間インキュベートすること、あるいはＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションを介して導入されるときに、ＡＡＶでの感染および／またはエレクトロポレーションの前に、増殖細胞を、照射されたフィーダー細胞の存在下で４、５、６、または７日間インキュベートすること、を含む。

細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）の形質導入（例えば、ＡＡＶ感染またはエレクトロポレーションを介して）後、改変細胞は、ようやく、改変細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を刺激するフィーダー細胞を含む培地で増殖させることができる。したがって、改変細胞は、照射されたフィーダー細胞を使用して、ＡＡＶ感染および／またはエレクトロポレーション（ＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションを介して導入されるとき）後に増殖することができるため、生存能および増殖可能性を保持する。例えば、本明細書に開示される、請求項に記載の発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合型ＩＬ－１５および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ－２１、もしくはこれらの任意の組み合わせでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、あるいはＥＢＶ－ＬＣＬ、のいずれかであり得る。一部の態様では、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、ＮＫ細胞の培養に播種することができる。培養期間は、感染および／またはエレクトロポレーション後１～１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３～７日間、最も好ましくは４～６日間であり得ることが理解され、本明細書で企図される。一部の態様では、改変ＮＫ細胞を培養するための培地は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１などのサイトカインをさらに含むことができる。

一態様では、開示されたプラスミドを使用して、がんの治療に有用な細胞を改変することができることが理解され、本明細書で企図される。がん免疫療法は、近年進歩してきており、遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、がん免疫療法で成功裏に展開された操作された免疫細胞の優れた例である。これらの細胞は、最近、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍に対する治療のためにＦＤＡによって承認されたが、これまでのところ、成功は、少数の標的化可能な抗原を有する疾患に限定され、そのような限られた抗原レパートリーを標的にすることは、免疫逃避によって失敗しやすい。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種異系Ｔ細胞によって引き起こされる移植片対宿主病のリスクのために、自己Ｔ細胞の使用に焦点が当てられてきた。対照的に、ＮＫ細胞は、抗原非依存的な様式で腫瘍標的を死滅させることができ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさないため、がん免疫療法の優れた候補となる。開示される改変プラスミドおよび方法を使用して、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞をがんに標的化するために、ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＡＲ ＮＫ細胞を生成することができることが理解され、本明細書で企図される。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」は、がん抗原を標的とし、受容体を発現する細胞を、標的抗原を発現するがん細胞にもたらすキメラ受容体を指す。典型的には、ＣＡＲは、腫瘍抗原の天然リガンド、ＭＨＣ分子によって提示される腫瘍抗原に由来するペプチドを認識する分子、またはがん抗原を標的とするＣＡＲ細胞の表面上に発現する抗体もしくはその断片（例えば、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖなど）を含む。受容体は、リンカーを介してシグナル伝達ドメイン（例えば、ＴおよびＮＫＧ２ＣについてのＣＤ３ζドメイン、ＮＫＰ４４、またはＮＫ細胞についてのＣＤ３ζドメインなど）に融合される。腫瘍抗原標的は、免疫応答、特にＢ細胞、ＮＫ細胞、およびＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合ドメインの選択は、治療される特定の種類のがんに依存する。腫瘍抗原は、当該技術分野で既知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ ＬＸ、ＣＳ－１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＨＥＲ２、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ－１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ－４、ＬＣＫ、ＯＹ－ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ－１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６－ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｌｅｗｉｓＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ－β、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ－４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ １、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座切断点、ＮＹ－ＢＲ－１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦ‐Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ－アセチル－ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体β、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ Ａｇ、Ｔｉｅ ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、ならびにメソセリンが挙げられる。腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下の、分化抗原、例えばチロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異性多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｉ ５；過剰発現胚抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現がん遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する独自の腫瘍抗原；例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス性抗原、例えばエプスタインバールウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が挙げられる。他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１ ６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質￥シクロフィル化 Ｃ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ－１、ＢＡＲＦ－１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴが挙げられる。

一態様では、細胞を遺伝子改変する開示された方法の１つの目的は、改変細胞を産生することであることが理解され、本明細書において企図される。したがって、本開示の方法によって作製される改変Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞が本明細書に開示される。

本開示全体を通して指摘されるように、開示される改変ＮＫ細胞は、理想的には、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞を、それ必要とする対象に養子移植するなどの免疫療法における使用に好適である。したがって、一態様では、操作された細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、当該方法は、ａ）改変される標的細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を得ることと、ｂ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、導入遺伝子は、相同アームと隣接しており、相同アームは、長さが８００ｂｐ未満である、得ることと、ｃ）細胞に、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体を導入することであって、導入遺伝子は、標的細胞へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して細胞に導入され、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、細胞のＤＮＡ修復酵素は、導入遺伝子を、標的細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列で宿主ゲノムに挿入し（例えば、相同修復によって）、それによって、操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を生成する、導入することと、ｄ）操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を対象に移植することと、を含む。一態様では、導入遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと同じプラスミド上に含まれるか、または同じもしくは異なるＡＡＶベクター内の第２のプラスミド上にコードされることができる。一態様では、標的細胞は、ＡＡＶを含む導入遺伝子による細胞の感染の前に、またはそれと同時に、エレクトロポレーションを介してＲＮＰ複合体で形質導入され得る。

一態様では、非相同末端結合によって、細胞（初代細胞または増殖細胞を含むが、これらに限定されないＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞）を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、導入遺伝子は、１つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡに隣接しているか、または２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡと隣接している、得ることと、ｂ）細胞に、導入遺伝子およびＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、導入遺伝子は、標的細胞へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して細胞に導入され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体内で、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、切断し、細胞のＤＮＡ修復酵素は、導入遺伝子を標的配列で宿主ゲノムに挿入し（例えば、非相同末端結合によって）、それによって、改変細胞を生成する。

一態様では、本開示の免疫療法の方法で使用される改変細胞細胞（例えば、改変Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変細胞の最終レシピエント）、細胞株（ＮＫ細胞株ＮＫ ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ－ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）、または初代細胞源もしくは細胞株に由来する増殖細胞の供与源からの初代細胞であり得る。初代細胞を使用することができるため、細胞の開示される改変は、エクスビボまたはインビトロで生じることができることが理解され、本明細書で企図される。

細胞細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）の形質導入後、改変（すなわち、操作された）細胞を対象に投与する前に、改変細胞を増殖および刺激することができる。例えば、免疫細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＭ）、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）、腫瘍浸潤ＮＫ細胞（ＴＩＮＫ）、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）は、対象に投与する前に、照射されたフィーダー細胞、形質膜（ＰＭ）粒子、またはエクソソーム（ＥＸ）発現膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）（ＰＭ粒子および、ＥＸエクソソーム発現ｍｂＩＬ－２１は、本明細書ではそれぞれ、ＰＭ２１粒子およびＥＸ２１エクソソームと称される）で増殖される。一部の態様では、増殖は、照射されたフィーダー細胞、形質膜（ＰＭ）粒子、もしくはエクソソーム発現膜結合型ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）、および／または膜結合型４－１ＢＢＬ（ｍｂ４－１ＢＢＬ）をさらに含むことができる。一部の態様では、改変（すなわち、操作された）細胞の刺激および増殖は、対象への改変細胞の投与後または投与と同時に、インビボで生じ得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、ＩＬ－２１もしくはｍｂＩＬ－２１を有するＰＭ粒子、ｍｂＩＬ－２１を有するエクソソーム、および／または照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞の投与を介して対象に細胞を移植した後で、対象において細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ＴＩＬ、ＭＩＬ、ＴＩＮＫ、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など）を増殖させる免疫療法の方法が、本明細書に開示される。一部の態様では、増殖は、ＩＬ－１５および／もしくは４－１ＢＢＬもしくはＰＭ粒子、エクソソーム、ならびに／または膜結合型ＩＬ－１５および／もしくは４－１ＢＢＬを発現する照射されたフィーダー細胞の投与をさらに含む。

開示される改変細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋細胞など、ならびに本明細書に開示されるＣＡＲ ＮＫ細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない）および改変細胞の養子移植の方法は、がんに対する効果的な免疫療法であり得ることが理解され、本明細書で企図される。本開示の方法および組成物を使用して、がんなどの未制御な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療することができる。異なる種類のがん（ｃａｎｃｅｒｓ）の非限定的なリストは、以下のとおりである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、固形組織のがん、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性がん、または一般的ながん。

開示される組成物を使用して治療することができる代表的であるが、非限定的ながんのリストは、以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部の扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽頭、喉頭、および肺の扁平上皮細胞癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、ならびに上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸癌、造血癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。

「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患または状態の強度または頻度、疾患または状態の症状、あるいは疾患または状態の根本的な原因を、部分的または完全に予防、遅延、治癒、快癒、緩和、軽減（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更、治療（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、安定化、軽減（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、および／または低減することを、意図または目的とする組成物の投与が含まれる。本発明による治療は、防止的、予防的、姑息的、または治療的に適用され得る。予防的治療は、発症前（例えば、がんの明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、がんの初期の兆候および症状時）、または確立されたがんの発達後に対象に投与される。予防的投与は、感染症の症状の発現の１日（数日）から数年前に行われ得る。

１．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブと遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の、配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド誘導体間で、ヌクレオチド特異的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動性の相互作用である。典型的には、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのワトソン－クリック面またはフーグスティーン面上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知のいくつかの条件およびパラメータによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度はすべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。

２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に既知である。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２～２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーション、続いて、洗浄温度がＴｍより約５℃～２０℃低いように選択される温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄、を伴い得る。フィルタ上に固定化された参照ＤＮＡの試料を目的の標識核酸にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、温度および塩条件を容易に経験的に決定する。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションに関してより高い。上述のように、または当該技術分野で知られているように、これらの条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションの好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）で、続いて６８℃で洗浄することができる。所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が減少するにつれて、さらに、可変性が検索される任意の領域のＧ－ＣまたはＡ－Ｔ豊富さに応じて、低減させることができる。所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が増加するにつれて、さらに、すべて当該技術分野で知られているように高い相補性が望まれる任意の領域のＧ－ＣまたはＡ－Ｔ豊富さに応じて、増加させることができる。

選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他方の核酸に結合した核酸の一方の量（パーセンテージ）を見ることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合されるときである。典型的には、非制限プライマーは、例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。この種類のアッセイは、制限プライマーおよび非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋ_ｄの１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍未満であるか、または核酸分子のうちの１つのみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または片方もしくは両方の核酸分子がそれらのｋ_ｄを上回る条件下で実施することができる。

選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素マニピュレーションを促進するために必要とされる条件下で、酵素的にマニピュレートされるプライマーのパーセンテージを調べることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマーが酵素マニピュレーションを促進する条件下で酵素的にマニピュレートされるときであり、例えば、酵マニピュレーションがＤＮＡ伸長であれば、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマー分子が伸長されるときである。また、好ましい条件には、製造業者によって示唆される条件、またはマニピュレーションを実施する酵素に適切な当該技術分野で示された条件、も含まれる。

正に相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するための様々な方法が、本明細書に開示されていることが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを提供し得ることが理解されるものの、特に指示しない限り、いずれかの方法のパラメータを満たすことは十分であろう。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要であった場合、これらの方法のいずれか１つで必要なパラメータ内で、ハイブリダイゼーションが生じる限り、本明細書に開示されているものとみなされる。

当業者であれば、組成物または方法が、いずれか集合的にまたは個別に、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１つを満たす場合、それが、本明細書に開示された組成物または方法であることを理解するであろう。

２．核酸
核酸に基づく本明細書に開示される様々な分子が存在し、例えば、核酸（例えば、ＴＧＦβＲ２をコードする核酸、またはＴＧＦＲβ２ノックアウトを作製するための本明細書に開示される核酸のいずれか）、またはその断片、ならびに様々な機能性核酸が含まれる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的な例が、本明細書で論じられる。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境中のアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から構成されることが有利であることが理解される。

ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を通して、一緒に連結され、ヌクレオシド間結合を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、およびチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシン一リン酸）または５’－ＧＭＰ（５’－グアノシン一リン酸）であろう。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。

ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに、何らかの種類の改変を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変は、当該技術分野で既知であり、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２－アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸部分における改変を含むであろう。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。

ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン－クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型構造に適合することができる。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。

他の種類の分子（複合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。複合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結され得る。そのような複合体としては、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。

ワトソン－クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン－クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン－クリック面は、プリン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位、ならびにピリミジン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。

フーグスティーン相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝に曝されるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のフーグスティーン面上で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。

ｂ）配列
本明細書に開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子、例えば、ＴＧＦβＲ２、に関連する様々な配列が存在し、これらのすべては、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体、ならびに他の類似体、およびこれらの遺伝子のアレル、ならびにスプライスバリアントおよび他の種類のバリアントの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々なタンパク質および遺伝子データベースで入手可能である。当業者は、配列の不一致および相違を解析する方法、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列に調整する方法を理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に開示され当該技術分野で既知の情報を与える任意の所与の配列について設計され得る。

ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示されるＴＧＦβＲ２および／またはＨＰＲＴ１などの開示される核酸と相互作用し得るプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態では、プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応を支持する。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長され得るであろう。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズするかもしくは別途会合する核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長によって産生される産物の組成物もしくは配列を誘導または影響する任意の方法を含む。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるが、これらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲまたは直接配列決定などのＤＮＡ増幅反応に使用される。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素技術を使用して伸長することができ、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長するように改変されることを理解されたい。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸もしくは核酸の領域にハイブリダイズするか、またはそれらは、核酸の相補体もしくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。

特定の実施形態では、核酸と相互作用するためのプライマーもしくはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅、またはプローブもしくはプライマーの単なるハイブリダイゼーションなどのプライマーの所望の酵素マニピュレーションを支持する任意のサイズであり得る。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長である。

他の実施形態では、プライマーまたはプローブは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。

ＴＧＦβＲ２およびＨＰＲＴ１遺伝子のプライマーは、典型的には、ＴＧＦβＲ２およびＨＰＲＴ１遺伝子の領域または完全な遺伝子を含有する増幅ＤＮＡ産物を産生するために使用される。一般に、典型的には、この産物のサイズは、サイズが３ヌクレオチド以内、または２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内に正確に決定され得るようになる。

特定の実施形態では、この産物は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長である。

他の実施形態では、産物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下である。

３．組成物の細胞への送達
インビトロまたはインビボのいずれかで、核酸を細胞に送達するために使用することができるいくつかの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系の２つのクラスに大別することができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどのいくつかの直接送達系を介して、またはカチオン性リポソームなどの細胞もしくは担体中の遺伝物質の移動を介して送達することができる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散などの物理的機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）、およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって記載されている。かかる方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用するために容易に適応可能である。特定の場合では、本方法は、大きなＤＮＡ分子で特異的に機能するように改変されるであろう。さらに、これらの方法を使用して、担体の標的化特性を使用することによって、特定の疾患および細胞集団を標的化することができる。

ａ）核酸ベースの送達系
導入ベクターは、遺伝子を細胞内に送達するために使用されるか（例えば、プラスミド）、または遺伝子を送達するための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として使用される任意のヌクレオチド構築物であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，（１９９３））。

本明細書で使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解せずに開示される核酸を細胞内に輸送し、それが送達される細胞内で遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む薬剤である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養ウイルス、シンドビス、およびＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む他のＲＮＡウイルスである。好ましくは、これらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーであって、ベクターとしての使用に適しているウイルスファミリーでもある。レトロウイルスとしては、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびＭＭＬＶの所望の特性をベクターとして発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード、すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を担持することができ、このために、一般的に使用されるベクターである。しかしながら、これらは、非増殖細胞において有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、取り扱いが容易であり、高い力価を有し、エアロゾル製剤で送達され、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、熱安定性があり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この種類の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を担持する。

ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するための化学的または物理的方法よりも高いトランザクション（遺伝子導入能力）能力を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的な初期遺伝子、構造的な後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写産物、複製およびキャプシド形成に必要な逆位末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして操作される場合、ウイルスは、典型的には、初期遺伝子のうちの１つ以上を除去し、除去されたウイルスＤＮＡの代わりに、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノムに挿入する。この種類の構築物は、最大約８ｋｂの外来遺伝物質を担持することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように操作された細胞株によって供給される。

（１）アデノ随伴ウイルスベクター
別の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠陥のあるパルボウイルスは、多くの細胞型に感染する可能性があり、ヒトに対して非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４～５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、１９番染色体に安定的に挿入することが知られている（例えば、ＡＡＶ組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）など）。この部位特異的組み込み特性を含有するベクターが好ましい。使用されるＡＡＶは、ＡＡＣ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、および例えば、ＡＡＶ－Ｒｈ７４などの組換え（ｒＡＡＶ）、および／または合成ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ、Ａｎｃ８０など）を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。ＡＡＶ血清型は、細胞または組織トロピズムに基づいて選択することができる。開示される組成物および方法において使用するためのＡＡＶベクターは、一本鎖（ＳＳ）または自己相補的（ＳＣ）であり得る。

別の種類のＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子に作用可能に連結された細胞特異的発現を指示するプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットに隣接する、一対の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含有する。この文脈において異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに対して天然ではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。

典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域が欠失され、安全な無細胞毒性ベクターが得られている。ＡＡＶ ＩＴＲ、またはその改変は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞毒性は付与せず、プロモーターは、細胞特異的発現を指示する。

したがって、開示されるベクターは、実質的な毒性なしに哺乳動物染色体に組み込むことができるＤＮＡ分子を提供する。

ウイルスおよびレトロウイルスにおける挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列（複数可）である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有し得る。

ＡＡＶのパッケージング容量が制限されることが理解され、本明細書で企図される。ＡＡＶベクターの負荷容量を克服する１つの方法は、２つのベクターの使用を通じてであり、導入遺伝子は、２つのプラスミド間で分割され、３’スプライスドナーおよび５’スプライスアクセプターは、導入遺伝子の２つの切片を単一の全長導入遺伝子に連結するために使用される。あるいは、２つの導入遺伝子は、実質的な重複で作製することができ、相同組換えは、２つのセグメントを全長転写産物に結合する。

４．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有し得る。

ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも、本明細書で有用である。

エンハンサーは、一般に、転写開始部位から一定距離になくても機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、およびコード配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にあってもよい。これらは、通常、１０～３００ｂｐの長さで、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答要素を含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答要素も含有し得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）から既知であるが、典型的には、一般的な発現用に真核生物細胞のウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００～２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマのエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーである。

プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって、調節することができる。また、ガンマ線照射などの照射への曝露、またはアルキル化の化学療法薬によって、ウイルスベクターの遺伝子発現を増強する方法も存在する。

特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間に特定の種類の細胞でのみ発現する場合であっても、すべての真核生物の細胞型において活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターのＬＴＲである。

すべての特定の調節要素は、クローニングされ、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用され得ることが示されてきた。グリア線維酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞で、遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。

また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位が、ｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物に使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。また、転写単位は、単独で、または上記配列と組み合わせて、構築物からの発現または安定性を改善する、他の標準的な配列を含有することも好ましい。

ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードするＥ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。

一部の実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであってもよい。哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に移行されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合、生存することができる。選択的レジームには、広く使用される２つの異なるカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝、および補充培地から独立して成長する能力を欠く変異細胞株の使用、に基づく。２つの例としては、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞、がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠損したヌクレオチドが補充培地に提供されない限り、生存することはできない。培地を補充する代替手段は、それぞれの遺伝子を欠く細胞に、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入することで、それらの成長要件を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することができないであろう。

第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択で生き残るであろう。このような優性選択の例としては、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を使用する。３つの実施例は、真核細胞の制御下の細菌遺伝子を用いて、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシン、への耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピュラマイシンが含まれる。

５．ペプチド
ａ）タンパク質バリアント
タンパク質バリアントおよび誘導体は、当業者によく理解され、アミノ酸配列改変を含むことができる。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失バリアントの３つのクラスのうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、１～４個の残基程度で、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合の挿入よりは小さいであろう。実施例に記載されるものなどの免疫原性融合タンパク質の誘導体は、インビトロで架橋することによって、またはその融合体をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することによって作製される。欠失は、タンパク質の配列から、１個以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、約２～６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらのバリアントは、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発がよく知られている。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度にいくつかの異なる場所で生じ得、挿入は、通常、約１～１０個のアミノ酸残基程度であり、欠失は約１～３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせ、を組み合わせて、最終構築物に到達することができる。変異は、配列をリーディングフレームから外れさせてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を生成しない。置換バリアントは、少なくとも１個の残基が除去され、その位置に、異なる残基が挿入されているバリアントである。このような置換は、概して、以下の表２および３に従って行われ、保存的置換と称される。

機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表３のものよりも保存性が低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスの立体構造としての置換エリアにおけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ、を維持することに対するそれらの効果が著しく異なる残基、を選択することによって行われる。一般に、タンパク質特性において最大の変化をもたらすことが予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに（またはそれによって）置換され、（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（またはそれによって）置換され、（ｃ）電気陽性側鎖、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基が、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに（またはそれによって）置換されるか、あるいは（ｄ）かさばった側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンに（またはそれによって）置換され、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増加させることによって置換される、置換であろう。

例えば、あるアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基に置き換えることは、保存的置換として当業者には既知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に置き換えること、またはある極性残基を別の極性残基に置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。このような、各明示的に開示された配列の保存的に置換されたバリエーションは、本明細書に提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。

置換または欠失変異誘発を用いて、Ｎ－グリコシル化（Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ－グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基のうちの１つを欠失させるか、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基で置換することによって達成される。

特定の翻訳後の誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミルおよびアスパリル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ ７９－８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、場合によっては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化、が挙げられる。

本明細書に開示されるタンパク質のバリアントおよび誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点からバリアントおよび誘導体を定義することによるものであることを理解されたい。記載の配列と、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらのバリアントおよび本明細書に開示される他のタンパク質が、具体的に開示される。当業者であれば、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を、容易に理解することができる。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルにあるように、２つの配列を整列した後に計算することができる。

相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ上で、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、行ってもよい。

核酸に関して、同じ種類の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６，１９８９．に開示されているアルゴリズムによって、得ることができる。

保存的変異および相同性の説明は、任意の組み合わせで、例えば、バリアントが保存的変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、一緒に組み合わせることができることが理解される。

本明細書は、様々なタンパク質およびタンパク質配列を論じるため、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸もまた開示されることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびにタンパク質配列の開示されたバリアントおよび誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸、が含まれるであろう。したがって、各特定の核酸配列が本明細書に記載されていない場合があるが、各配列およびすべての配列が、開示されたタンパク質配列を介して、実際に本明細書に開示および記載されていることを理解される。また、開示されたタンパク質の特定のバリアントが本明細書に開示されている生物内のタンパク質をコードする特定のＤＮＡ配列を示すアミノ酸配列はないが、そのタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた、本明細書に既知であり、開示され、記載されていることも理解される。

開示された組成物に組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表２および表３に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を負荷することによって、および、例えば、アンバーコドンを利用して、部位特異的な方法で、類似体アミノ酸をペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、容易にポリペプチド鎖に組み込まれ得る。

ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介して結合されていない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体についての結合としては、ＣＨ_２ＮＨ－－、－－ＣＨ_２Ｓ－－、－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ＝ＣＨ－－（シスおよびトランス）、－－ＣＯＣＨ_２－－、－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－－、および－－ＣＨＨ_２ＳＯ－が挙げられる（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０） ｐｐ．４６３－４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７－１８５（１９７９）（－－ＣＨ_２ＮＨ－－、ＣＨ_２ＣＨ_２－－）、Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３－１２４９（１９８６）（－－ＣＨ Ｈ_２－－Ｓ）、Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７－３１４（１９８２）（－－ＣＨ－－ＣＨ－－、シスおよびトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（１９８０）（－－ＣＯＣＨ_２－－）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（－－ＣＯＣＨ_２－－）、Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－－）、Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１－４４０４（１９８３）（－－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２－－）、およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９－１９９（１９８２）（－－ＣＨ_２－－Ｓ－－）に見出され得、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、－－ＣＨ_２ＮＨ－－である。ペプチド類似体は、ｂ－アラニン、ｇ－アミノ酪酸などの結合原子間に２つ以上の原子を有し得ることが理解される。

アミノ酸類似体および類似体ならびにペプチド類似体は、しばしば、より経済的な産生、より大きな化学的安定性、より強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広域の生物学的活性）、抗原性の低減などを有する。

Ｄ－アミノ酸は、ペプチダーゼなどによって認識されないため、Ｄ－アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を同じ種類のＤ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）で系統的に置換することを使用して、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化するまたは結合するために使用され得る。これは、ペプチドを、特定の立体構造に拘束するのに有益であり得る。

６．薬学的担体／薬学的製品の送達
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれと接触する薬学的組成物の他の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別途望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターとともに、対象に投与され得る材料、を意味する。担体は、当業者には周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために当然選択されるであろう。

組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に（局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む）など、投与され得る。本明細書で使用される場合、「局所鼻腔内投与」とは、鼻孔の一方または両方を介して組成物を鼻および鼻道に送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般状態、治療されるアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法などに応じて、対象によって異なるであろう。したがって、すべての組成物に対して正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を与える日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。

組成物の非経口投与は、使用される場合、概して、注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。最近改訂された非経口投与のアプローチでは、一定の投与量が維持されるような徐放または持続放出系の使用を伴う。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）中であってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的にし得る。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７－４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５－２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００－７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３－９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１－４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７－８０，（１９９２）、およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２－２０６５，（１９９１））。ビヒクル、例えば、「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌を標的化する脂質媒介性薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通したＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、ならびにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４－６２２０，（１９８９）、およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９－１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９－４０９（１９９１））。

左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを順に含むプラスミドもまた、本明細書に提供され、左相同アームおよび右相同アームは、各々８００ｂｐ以下の長さである。

一態様では、１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子を含むか、またはそれらからなるプラスミドが本明細書に提供され、コードされた核酸の順序は、ＰＡＭ、ｃｒＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡが使用される場合、コードされた核酸は、第１のＰＡＭ、第１のｃｒＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む。

医薬品として使用するための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞もまた、本明細書に提供される。本発明は、医薬品の製造のための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞の使用をさらに提供する。本発明はまた、がんの治療に使用するための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞も提供する。本発明は、がんの治療のための医薬品の製造のための、本発明のプラスミド、本発明のＡＡＶベクター、または本発明の改変細胞の使用をさらに提供する。

Ｃ．実施例
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法の作製方法および評価方法の完全な開示および説明を提供するために示されるものであり、純粋に例示的であることを意図するものであって、本開示を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、温度は℃、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。

１．実施例１
遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、がん免疫療法で成功裏に展開された操作された免疫細胞の優れた例である。これらの細胞は、最近、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍に対する治療のためにＦＤＡによって承認されたが、これまでのところ、成功は、少数の標的化可能な抗原を有する疾患に限定されている。また、ＮＫ細胞をより良い代替物とするいくつかの副作用を有する。

Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９／ＲＮＰ）を利用する、初代および増殖ヒト細胞（ＮＫ細胞を含む）のゲノム編集のためのＤＮＡを含まない技術が、本明細書に開示される（図１を参照のこと）。

非病原性ウイルスである天然組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ドナーベクターを用いた導入遺伝子送達は、相同性指向または相同性非依存的標的組み込みによる部位特異的遺伝子挿入（ＨＩＴＩ、ＣＲＩＳＰａｉｎｔ）を可能にすることが示されている（図３）。

異なる血清型のＡＡＶプラスミドからの必須配列を使用して、ＮＫ細胞およびＨＥＫ２９３細胞を含むヒト初代細胞への目的の遺伝子の指向性組み込みのために、Ｃａｓ９／ＲＮＰ（図２）と組み合わせて使用される１２個の新規プラスミドを開発した。

新たな方法論では、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体は、ＤＮＡを切断する（ＡＡＶＳ１遺伝子座において）。ＨＤＲ誘導遺伝子挿入または相同性独立誘導挿入（ＤＮＡテンプレートにｃｒＲＮＡ＋ＰＡＭ配列を提供することによって）のためのＣａｓ９切断部位に隣接する各側の標的とドナーＤＮＡとの間の３０～１０００ｂｐの相同アームを有する、我々の１２個のＡＡＶプラスミド（一本鎖または自己相補的）のうちの１つによって提供される選択したＤＮＡ断片（ＣＡＲ発現ＤＮＡまたはレポーター遺伝子）の存在下で、外因性遺伝子を、証明としてヒトＮＫ細胞およびＨＥＫ２９３細胞のゲノムに挿入した。

システムを試験するために、ＮＫ細胞を、導入遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドおよびプラスミドを送達されたＡＡＶでトランスフェクトした。ＮＫ細胞における感染のための適切なＡＡＶ血清型を決定するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード化をコードするプラスミドを含む様々なＡＡＶ血清型を使用して、様々なトランスフェクション条件下でＮＫ細胞に感染させた（図４Ａ）。ＡＡＶ６は、任意の培養条件下で一貫して最大の発現を提供することが決定された。さらに、ＡＡＶ６の感染は、３×１０^６のＭＯＩの後６時間、約２．５×１０^７コピーのウイルスを有するが、感染後４８時間までにほぼ検出不能なレベルに低下することが示された（４Ｂ）。これは、標的外感染のリスクの低下を示すため、特に重要である。

次に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーションし、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的にしたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子をコードするＡＡＶで感染させた（図５）。ｍＣｈｅｒｒｙ１またはｍＣｈｅｒｒｙ２のプライマーによるＰＣＲを使用して、ＨＥＫ２９３細胞内のｍＣｈｅｒｒｙの組み込みを試験した（５Ａ）。これらの結果をフローサイトメトリー（５Ｂ）および顕微鏡検査（５Ｃ）によって確認した。

次に、３０ｂｐの相同アーム、５００ｂｐの相同アーム、または８００ｂｐの相同アーム（６Ａ）を有するプラスミドのいずれかを使用して、ＡＡＶＳ１遺伝子座で安定した発現を有する同一の結果を示すヒト初代ＮＫ細胞（図６）を使用して実験を繰り返し、フローサイトメトリー（６Ｂ）によって確認した。様々なサイズの構築物を組み込みにおけるすべてのプラスミドの成功を表１に要約する。

２．実施例２
ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用したＮＫ細胞の遺伝子改変は、ロバストな外来ＤＮＡおよびＲＮＡ感知機構のために困難であり、したがって、ＮＫ細胞への遺伝子送達方法の効率を制限する。この制限を克服するために、Ｃａｓ９／リボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９／ＲＮＰ）をヒト初代ＮＫ細胞に直接エレクトロポレーションするための新しい方法を開発した。本方法は、ＮＫ細胞のゲノムに二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、遺伝子ノックアウトに成功し、抗腫瘍活性が向上する。Ｃａｓ９タンパク質は、その速い作用およびクリアランスのために、ｍＲＮＡ送達よりも好ましい。遺伝子サイレンシングにおけるこの初期成功後、本方法は、遺伝子挿入のためにさらに開発された。ＤＳＢを導入するＣａｓ９の作用に続いて、相同組換え（ＨＲ）および相同非依存性修復として知られる、２つの独立した経路を利用して、損傷を修復することができる。目的の遺伝子をコードするＤＮＡテンプレートの存在下で、外因性遺伝子は、いずれかの修復機構を使用して、Ｃａｓ９標的部位に組み込むことができる。ウイルス法および非ウイルス法を含む、そのようなＤＮＡテンプレートを提供するためのいくつかの方法が存在する。非ウイルスアプローチでは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートは、典型的には、Ｃａｓ９／ＲＮＰとともにエレクトロポレーションされる。ウイルス遺伝子送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を臨床試験で安全に使用し、Ｔ細胞を含む感受性初代免疫細胞のベクターとして有効である。ＡＡＶベクターを介して送達される転写産物は、約４．７ｋｂの長さを有する直鎖一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（ｓｓＡＡＶ）または直鎖自己相補的（ｓｃ）ＤＮＡ（ｓｃＡＡＶ）としてパッケージ化することができる。ｓｃＡＡＶは、ｓｓＤＮＡを二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに変換するための第２の鎖生成の速度制限ステップを迂回するのに役立つ変異ＩＴＲを含有する。しかしながら、結果として、ｓｓＡＡＶと比較して、ｓｃＡＡＶはパッケージング容量の半分しか有さず、したがって、より大きな導入遺伝子には適していない。ｓｓＡＡＶおよびｓｃＡＡＶの両方が、ＮＫ細胞へのＤＮＡテンプレート送達のために設計および試験される。

ＨＲ機構を介した安定した遺伝子組み込みは、ＤＳＢの隣接領域のための最適な相同アームを導入遺伝子に提供することに依存する。相同アームの最適な長さを見出し、ｓｓＡＡＶおよびｓｃＡＡＶへの導入遺伝子のパッケージング容量を最適化するために、３０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、および８００～１０００ｂｐのＨＡを、Ｃａｓ９標的部位の右側および左側のために設計した。相同アームの設計は時間のかかる手順であり、複数の最適化を必要とするため、遺伝子挿入またはタグ付けのための相同性非依存的な方法であるＣＲＩＳＰａｉｎｔアプローチも調査した。本方法では、ｃｒＲＮＡおよびＰＡＭ配列を含む、同じＣａｓ９標的部位が、目的の遺伝子をコードするＤＮＡテンプレートに提供される。Ｃａｓ９複合体の導入のときに、テンプレートおよびゲノムＤＮＡの両方が同時に切断される。その結果、ＣＲＩＳＰａｉｎｔテンプレートは、非相同修復機構を介して組み込むことができる直線化された二本鎖ＤＮＡとして提示される。両方の方法で、概念の証明として、ｍＣｈｅｒｒｙを使用して、高効率かつ安定した導入遺伝子改変ＮＫ細胞を生成した。

３．実施例３
ａ）ヒトＮＫ細胞の精製および増殖
ＮＫ細胞を精製した。簡潔に述べると、ＮＫ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞富化カクテルを使用してＰＢＭＣから単離した（図８）。＞９０％のＣＤ３陰性／ＣＤ５６陽性集団としてフローサイトメトリーを使用して、精製ＮＫ細胞の表現型が決められた（図９）。これらの細胞を、精製の日に、照射されたｍｂＩＬ２１発現Ｋ５６２フィーダー細胞で２：１（フィーダー：ＮＫ）の比率で刺激した（図９）。刺激細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有する無血清ＡＩＭ－Ｖ／ＩＣＳＲ増殖培地中で７日間培養した。

ｂ）遺伝子挿入のためのゲノムセーフハーバーの標的化。
ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）は、宿主細胞の正常な機能の変化なしに改変され、導入遺伝子の適切な発現を可能にすることができるゲノム内の部位である。ＧＳＨの１つであり、ホスファターゼ１調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子内の例示的な遺伝子座である、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）を選択した。この遺伝子座は、いくつかの細胞型への指向性遺伝子挿入のために成功裏に使用されている。まず、ＡＡＶＳ１のクロマチンアクセシビリティを、ＡＴＡＣ－ｓｅｑアッセイによってナイーブおよび増殖ＮＫ細胞において評価し、ナイーブおよびＩＬ－２１増殖細胞の間に差を示さなかった（図１０）。前述のように、増殖ＮＫ細胞へのＣａｓ９／ＲＮＰのエレクトロポレーションを介して、１つのｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ。５’ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号１７））を使用して、ＡＡＶＳ１を標的化した。

簡潔に述べると、３×１０^６個の増殖ＮＫ細胞を採取し、１３ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、３００ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。細胞ペレットを、２０ｕｌのＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁した。細胞懸濁液に、５ｕｌの予備複合体化Ｃａｓ９／ＲＮＰ（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、標的ＡＡＶＳ１、ならびに１ｕｌの１００ｕＭのエレクトロポレーションエンハンサー（Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー）を添加した。ＣＲＩＳＰＲ反応の２６ｕｌの総体積を、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）１６ウェルストリップに移し、プログラムＥＮ－１３８を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、１２ウェルプレート（図１１）中の１００ＩＵのＩＬ－２を含有する２ｍｌの無血清培地に移し、３７℃、５％ＣＯ_２圧力でインキュベートした。

４８時間後、ＮＫ細胞ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ編集ＮＫ細胞における挿入欠失（インデル）の検出のために単離した。Ｃａｓ９標的部位に隣接する領域をＰＣＲ増幅し、増幅産物をサンガー配列決定した。ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩＣＥ）を使用して、インデルの頻度を分析した（図１２）。ＩＣＥ結果は、ＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞の８５％超が、ＡＡＶＳ１ Ｃａｓ９標的部位に少なくとも１つのインデルを有したことを示した。この遺伝子座におけるゲノム改変が、がん細胞を標的とする能力を妨げないことを確実にするために、ＡＡＶＳ１－ＫＯ ＮＫ細胞の細胞毒性を、ＡＭＬがん細胞株であるＫａｓｕｍｉを使用して評価した。カルセインＡＭアッセイを使用して、野生型とＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞との間に、それらの殺傷能力の差は観察されなかった（図１３）。

ｃ）ＤＮＡテンプレート送達のための様々なアデノ随伴ウイルスベクター血清型の試験。
初代ＮＫ細胞の形質導入のためのＡＡＶの最良の血清型を決定し、ＮＫ細胞に目的の遺伝子をコードする最高数のＤＮＡテンプレートを提供するために、我々は、ＧＦＰをコードするＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含むいくつかの血清型で、３００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞を形質導入した。ＡＡＶ６で形質導入されたＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって検出された最高発現レベルのＧＦＰを有した。重要なことに、ＡＡＶ６ウイルスゲノムは、ｑＰＣＲ解析によって形質導入後最大４８時間検出することができ、これは、Ｃａｓ９タンパク質のエンドヌクレアーゼ機能のための臨界時間である（図１４）。

ｄ）ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ遺伝子送達構築物の設計。
ＡＡＶＳ１遺伝子座が、がん細胞を標的とする能力を変更することなく、ＮＫ細胞において改変され得ることを成功裏に示した後、ＡＡＶＳ１における遺伝子挿入のためのｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達を評価した。ＨＲ指向性遺伝子挿入のために、Ｃａｓ９標的部位の隣接領域に相同アーム（ＨＡ）を有するｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡを、一本鎖または自己相補的ＡＡＶベクターの骨格にクローニングした。３０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐおよび１０００ｂｐのＨＡを右用に設計し、３０ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐおよび８００ｂｐを左用ＨＡに設計した（図１５）。ＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡテンプレートについては、単一（ＰＡＭｇ）または二重（ＰＡＭｇＰＡＭｇ）Ｃａｓ９標的配列は、ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の周りに組み込まれるが、ＩＴＲ内に組み込まれる。したがって、Ｃａｓ９は、ｇＤＮＡおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡテンプレートを同時に切断することができ、ゲノムＤＳＢでの組み込みを可能にする（図１６Ａ～１６Ｂ）。導入遺伝子をＡＡＶ６にパッケージングする前に、設計されたＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡテンプレートの精度を確保するために、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする環状ＤＮＡを、ＡＡＶＳ１を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰとともにＨＥＫ２９３細胞に共エレクトロポレーションした。結果は、ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡの両方が、ゲノムＤＳＢで成功裏に組み込まれ、ｍＣｈｅｒｒｙが効率的に発現されたことを示した（図１７）。

ｅ）初代ＮＫ細胞におけるＮＨＥＪおよびＨＲ経路を研究して、ゲノム編集のための最適経路を決定する。
ＣＲＩＳＰａｉｎｔおよびＨＲは、酵素反応によって調節される。ＣＲＩＳＰａｉｎｔは、ＬＩＧ４依存性プロセスであり、一方、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２などの他のタンパク質は、ＨＲを調節する。したがって、ＮＫ細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを分析して、どの修復経路がこの細胞型においてより効率的であり得るかを評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は、増殖ＮＫ細胞が、ナイーブＮＫ細胞と比較して、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のより高い発現を有し、これらの細胞におけるＬＩＧ４レベルの減少がないことを示し（図１８）、ＣＲＩＳＰａｉｎｔを介したＨＲまたはＮＨＥＪ指向性遺伝子挿入のいずれかに最適な条件を提供する。

ｆ）Ｃａｓ９／ＲＮＰおよびＡＡＶ６を組み合わせて、ｍＣｈｅｒｒｙ ＮＫ細胞を生成する。
実験マニピュレーションの１日前のＮＫ細胞増殖の６日目に、５×１０^５個の細胞／ｍｌで培地交換および再懸濁を行った。次いで、ＮＫ細胞を、上述のように７日目にＡＡＶＳ１を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの３０分後、生細胞を回収し、１ｍｌ当たり１×１０^６個の細胞で、２４ウェルプレート中の１００ＩＵのＩＬ２を含有する培地中に再懸濁した。ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＨＲまたはＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡを送達するｓｓＡＡＶ６またはｓｃＡＡＶ６を用いた各形質導入条件について、３００，０００のエレクトロポレーション細胞を３００，０００のＭＯＩまたは１５０，０００のＭＯＩで形質導入した。あるいは、ＡＡＶ６のより高いＭＯＩの形質導入効率を試験するために、１５０，０００個の細胞を、ＨＲ ８００ｂｐを送達するｓｓＡＡＶ６およびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＰＡＭｇＰＡＭｇを送達するｓｃＡＡＶ６の５００，０００のＭＯＩで形質導入した（図１９）。陰性対照には、エレクトロポレーションしていない、Ｃａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションしたがＡＡＶ形質導入していないか、またはＣａｓ９／ＲＮＰのエレクトロポレーションなしで３００，０００のＭＯＩのＡＡＶ６で形質導入したＮＫ細胞が含まれた。エレクトロポレーションおよび形質導入の翌日、１００ＩＵのＩＬ２を含有する１５０ｕｌの新鮮な培地を、古い培地を変更することなく各ウェルに添加した。細胞をエレクトロポレーション後４８時間培養し、次いでＫ５６２フィーダー細胞で２：１の比率で再刺激し、２４ウェルプレート中で１ｍｌの総体積で維持した。

ｇ）ＣＲＩＳＰＲ改変ヒトＮＫ細胞のフローサイトメトリーは、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の組み込みに成功したことを示す。
エレクトロポレーションおよび形質導入の２日後、および増殖の前に、フローサイトメトリーを行い、ｍＣｈｅｒｒｙ発現および生存率（ＧｈｏｓｔＲｅｄ ７８０色素）を評価した。全体として、ＡＡＶ６送達ＨＲベクターで形質導入されたＮＫ細胞は、ＣＲＩＳＰａｉｎｔよりも高いノックイン効率を有した。さらに、ｓｃＡＡＶ６は、著しく良好な遺伝子挿入を示した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現は、対照ＮＫ細胞において観察されなかった。ＨＲベクターを使用して、８００ｂｐのＨＡを有するｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡを送達するｓｓＡＡＶ６を用いて細胞を形質導入した実験条件では、ＮＫ細胞のほぼ２０％が、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性であった。ＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＰＡＭｇを送達する３００，０００のＭＯＩのｓｃＡＡＶ６または３００，０００のＭＯＩおよび５００，０００のＭＯＩのＰＡＭｇＰＡＭｇで形質導入したＮＫ細胞については、最大８％のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が見出された。重要なことに、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセンテージは、より短い相同アームを含有するｓｃＡＡＶ６ ＨＲベクターで形質導入された細胞において著しく高かった。これらの条件は、３０ｂｐ（１９～２０％）、３００ｂｐ（８０～８５％）、５００ｂｐ（７５～８５％）、および８００ｂｐ（８０～８９％）を有する３００，０００のＭＯＩまたは１５０，０００のＭＯＩのＨＲ ｓｃＡＡＶ６ベクターでの形質導入を含む。より低い形質導入効率を有する細胞（ｓｓＡＡＶ６－ＨＲ－８００ｂｐ、ｓｃＡＡＶ６－ＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＰＡＭｇＰＡＭｇ）について、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性集団を、ＦＡＣＳ選別によって８５％に富化し、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＮＫ細胞のパーセンテージに変化がない照射されたｍｂＩＬ２１発現Ｋ５６２フィーダー細胞を使用して、最大２０日間拡張した（図２０～図２２）。形質導入後最大２０日間増殖されたｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＮＫ細胞についてフロー解析を繰り返し、Ｃａｓ９／ＲＮＰとｓｓＡＡＶ６またはｓｃＡＡＶ６との組み合わせによって生成された細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙのパーセンテージに有意な変化は観察されなかった。ＨＲ指向性遺伝子挿入と比較して、ＣＲＩＳＰａｉｎｔを使用して遺伝子組み込みの効率が低いことが観察されたが、本方法は、研究者が相同アームを設計する必要なしに、目的の遺伝子をユーザ定義の遺伝子座に組み込むことができるため、依然として非常に魅力的である。さらに、ＣＲＩＳＰａｉｎｔベクターで形質導入されたＮＫ細胞におけるより良い増殖が観察された。

ｈ）Ｃａｓ９／ＲＮＰを非ウイルス遺伝子送達と組み合わせることは、初代ヒトＮＫ細胞において細胞死を引き起こす。
ウイルス産生の時間およびコストを最小限に抑えるために、非ウイルス遺伝子組み込みがＴ細胞で使用されている。このアプローチはまた、ＡＡＶＳ１を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰを、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする裸の化学合成ＤＮＡでエレクトロポレーションすることによって、ＮＫ細胞において試験した。導入遺伝子は、Ｃａｓ９標的部位に隣接する領域について８０ｂｐの相同アームを有するＩＤＴからのＭｅｇａｍｅｒ（登録商標）一本鎖ＤＮＡ断片としての形態と、ＡＡＶ骨格にクローニングされたが、任意のＡＡＶキャプシドにパッケージ化されなかった同じＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡを有する別の形態との、２つの形態で生成された。増殖されたＮＫ細胞を、ＡＡＶＳ１を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙをコードする１または２ｕｇのＤＮＡでエレクトロポレーションし、総体積を２６ｕｌとした。２日後、Ｍｅｇａｍｅｒ（登録商標）を有する細胞は１００％死滅し、ＨＲおよびＣＲＩＳＰａｉｎｔ ＤＮＡでエレクトロポレーションした細胞の１０％のみが生存した。これらの細胞は増殖することができるが、ＤＮＡはＤＳＢの部位に組み込まれたが、得られた細胞の１％未満がｍＣｈｅｒｒｙ陽性であった。これは、裸のＤＮＡ送達と比較して、ＡＡＶ媒介性ＮＫ細胞改変がより良好な耐容性であり、より効率的であることを示す。

配列
配列番号１ ３０ｂｐの右相同アーム
ｇａｔｔｇｇｔｇａｃａｇａａａａｇｃｃｃｃａｔｃｃｔｔａｇｇ
配列番号２ ３０ｂｐの左相同アーム
ｔｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｇｃ
配列番号３ ３００ｂｐの右相同アーム
ｇａｔｔｇｇｔｇａｃａｇａａａａｇｃｃｃｃａｔｃｃｔｔａｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔａｇｔｃｔｃｃｔｇａｔａｔｔｇｇｇｔｃｔａａｃｃｃｃｃａｃｃｔｃｃｔｇｔｔａｇｇｃａｇａｔｔｃｃｔｔａｔｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｃｃｃｃｃａｔｔｔｃｃｔｇｇａｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｃｃｔｔｇｃｃａｇａａｃｃｔｃｔａａｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｇａｔｇｇａｇｃｃａｇａｇａｇｇａｔｃｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇａｇｃｔｔｇｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｇｇａｇｇｇａａｇｇｇｇｇｇｇａｔｇｃｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｃａｇｔｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｇｃｔａｃｃｃｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｇｇｃｔｇｔｃ
配列番号４ ３００ｂｐの左相同アーム
ｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇｇａｔｔｃｇｇｇｔｃａｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｔｇｇｇｃａｇｃｔｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｃｃｔｔａｃｃｔｃｔｃｔａｇｔｃｔｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｔｃａｔｇｇｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｔｃｃｇａｇａｇｃｔｃａｇｃｔａｇｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｃａａｃｃｃｇｇｇｃｃｃｃｔａｔｇｔｃｃａｃｔｔｃａｇｇａｃａｇｃａｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｇａｔｃｃｔｇｔｇｔｃｃｃｃｇａｇｃｔｇｇｇａｃｃａｃｃｔｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａａｔｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇｔａｃｔｔｔｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｇｃ
配列番号５ ５００ｂｐの右相同アーム
ｇａｔｔｇｇｔｇａｃａｇａａａａｇｃｃｃｃａｔｃｃｔｔａｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔａｇｔｃｔｃｃｔｇａｔａｔｔｇｇｇｔｃｔａａｃｃｃｃｃａｃｃｔｃｃｔｇｔｔａｇｇｃａｇａｔｔｃｃｔｔａｔｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｃｃｃｃｃａｔｔｔｃｃｔｇｇａｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｃｃｔｔｇｃｃａｇａａｃｃｔｃｔａａｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｇａｔｇｇａｇｃｃａｇａｇａｇｇａｔｃｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇａｇｃｔｔｇｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｇｇａｇｇｇａａｇｇｇｇｇｇｇａｔｇｃｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｃａｇｔｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｇｃｔａｃｃｃｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｇｇｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇｃｇｔｔｔｃａｃｔｇａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｃｔｔａｃａｃｔｔｃｃｃａａｇａｇｇａｇａａｇｃａｇｔｔｔｇｇａａａａａｃａａａａｔｃａｇａａｔａａｇｔｔｇｇｔｃｃｔｇａｇｔｔｃｔａａｃｔｔｔｇｇｃｔｃｔｔｃａｃｃｔｔｔｃｔａｇｔｃｃｃｃａａｔｔｔａｔａｔｔｇｔｔｃｃｔｃｃｇｔｇｃｇｔｃａｇｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇａｔａａｇｇｃｃａｇｔａｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｔｃｃｔｇｇｃａｇ
配列番号６ ５００ｂｐの左相同アーム
ｔｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔｇｇｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｇｔｔｔｃｔｔａｇｇａｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃｃｇａｃｇｇａｔｇｔｃｔｃｃｃｔｔｇｃｇｔｃｃｃｇｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔａｇｇｃｃｔｇｃａｔｃａｔｃａｃｃｇｔｔｔｔｔｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａａｇｔａｃｃｃｃｇｔｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔｔｔａｇｃｃａｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇｃｃｔｇｇａｃａｃｃｃｃｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇｇａｔｔｃｇｇｇｔｃａｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｔｇｇｇｃａｇｃｔｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｃｃｔｔａｃｃｔｃｔｃｔａｇｔｃｔｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｔｃａｔｇｇｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｔｃｃｇａｇａｇｃｔｃａｇｃｔａｇｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｃａａｃｃｃｇｇｇｃｃｃｃｔａｔｇｔｃｃａｃｔｔｃａｇｇａｃａｇｃａｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｇａｔｃｃｔｇｔｇｔｃｃｃｃｇａｇｃｔｇｇｇａｃｃａｃｃｔｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａａｔｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇｔａｃｔｔｔｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｇｃ
配列番号７ ８００ｂｐの右相同アーム
ｇａｔｔｇｇｔｇａｃａｇａａａａｇｃｃｃｃａｔｃｃｔｔａｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔａｇｔｃｔｃｃｔｇａｔａｔｔｇｇｇｔｃｔａａｃｃｃｃｃａｃｃｔｃｃｔｇｔｔａｇｇｃａｇａｔｔｃｃｔｔａｔｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｃｃｃｃｃａｔｔｔｃｃｔｇｇａｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｔｃｃｔｔｇｃｃａｇａａｃｃｔｃｔａａｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｇａｔｇｇａｇｃｃａｇａｇａｇｇａｔｃｃｔｇｇｇａｇｇｇａｇａｇｃｔｔｇｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｇｇａｇｇｇａａｇｇｇｇｇｇｇａｔｇｃｇｔｇａｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｃａｇｔｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｇｃｔａｃｃｃｔｃｔｃｃｃａｇａａｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｇｇｃｔｇｔｃｔｇｇｔｇｃｇｔｔｔｃａｃｔｇａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｃｔｔａｃａｃｔｔｃｃｃａａｇａｇｇａｇａａｇｃａｇｔｔｔｇｇａａａａａｃａａａａｔｃａｇａａｔａａｇｔｔｇｇｔｃｃｔｇａｇｔｔｃｔａａｃｔｔｔｇｇｃｔｃｔｔｃａｃｃｔｔｔｃｔａｇｔｃｃｃｃａａｔｔｔａｔａｔｔｇｔｔｃｃｔｃｃｇｔｇｃｇｔｃａｇｔｔｔｔａｃｃｔｇｔｇａｇａｔａａｇｇｃｃａｇｔａｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｔｃｃｔｇｇｃａｇｇｇｃｔｇｔｇｇｔｇａｇｇａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｔｇｇａａａａｃｔｃｃｃｔｔｔｇｔｇａｇａａｔｇｇｔｇｃｇｔｃｃｔａｇｇｔｇｔｔｃａｃｃａｇｇｔｃｇｔｇｇｃｃｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔｔａａａｇａｇｔｃｃｃｃａｇｔｇｃｔａｔｃｔｇｇｇａｃａｔａｔｔｃｃｔｃｃｇｃｃｃａｇａｇｃａｇｇｇｔｃｃｃｇｃｔｔｃｃｃｔａａｇｇｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｃｔｔｃｔｇｇｇｔｔｔｇａｇｔｃｃｔｔｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇａｇａｇｇｃｇｃｔｃａｇｇｃｔｔｃｃｃｔｇｔｃｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｇｔｃｃａｃｃａｔｃｔｃａｔｇｃｃｃｃｔｇｇｃｔｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｔｃｃｃｔａｃａｇｇｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｃｔｔｃａｇａｃｔｇａｇｃｃｃｃｇｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｔｃｃｃｃｇｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｔｃｃｃｃｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａｔｃｃｃｃｃａｇａｇｇｃｃｃｃａｇｇｃｃａｃｃｔａｃｔｔｇｇｃｃｔｇｇａｃｃｃｃａｃｇａｇａｇｇｃｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃｔｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃｔｇｃｃｔｔｔｔｇｇｇｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｃｃａａｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇａｃｔｇｃｔｔｇｇ
配列番号８ ８００ｂｐの左相同アーム
ｔｇｃｔｔｔｃｔｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃｇｃｔｔｔｃｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇｇｔｃａｃｃｔｃｔａｃｇｇｃｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃｔｃｃｔｔｃａｇｇｔｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｔｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｔｔｇｃｔｃｔｃｔｇｃｔｇｔｇｔｔｇｃｔｇｃｃｃａａｇｇａｔｇｃｔｃｔｔｔｃｃｇｇａｇｃａｃｔｔｃｃｔｔｃｔｃｇｇｃｇｃｔｇｃａｃｃａｃｇｔｇａｔｇｔｃｃｔｃｔｇａｇｃｇｇａｔｃｃｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｇｇｔｃｃｔｃｔｃｃｇｇｇｃａｔｃｔｃｔｃｃｔｃｃｃｔｃａｃｃｃａａｃｃｃｃａｔｇｃｃｇｔｃｔｔｃａｃｔｃｇｃｔｇｇｇｔｔｃｃｃｔｔｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔｃｔｇｇｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｇｔｔｔｃｔｔａｇｇａｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃｃｇａｃｇｇａｔｇｔｃｔｃｃｃｔｔｇｃｇｔｃｃｃｇｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔａｇｇｃｃｔｇｃａｔｃａｔｃａｃｃｇｔｔｔｔｔｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃａａａｇｔａｃｃｃｃｇｔｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔｔｔａｇｃｃａｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇｃｃｔｇｇａｃａｃｃｃｃｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇｇａｔｔｃｇｇｇｔｃａｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｔｇｇｇｃａｇｃｔｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｃｃｔｔａｃｃｔｃｔｃｔａｇｔｃｔｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｔｃａｔｇｇｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｔｃｃｇａｇａｇｃｔｃａｇｃｔａｇｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｃａａｃｃｃｇｇｇｃｃｃｃｔａｔｇｔｃｃａｃｔｔｃａｇｇａｃａｇｃａｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｇｇａｔｃｃｔｇｔｇｔｃｃｃｃｇａｇｃｔｇｇｇａｃｃａｃｃｔｔａｔａｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｇｔｔａａｔｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｔｇｇｇｔａｃｔｔｔｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｃａｇｔｇｇｇｇｃ
配列番号９ ＰＡＭ ｇＲＮＡ

配列番号１０ スプライスアクセプター
ａｔｃｇａｔｃｇｃａｇｇｃｇｃａａｔｃｔｔｃｇｃａｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔｃｃａｇ
配列番号１１ ＢＧＨポリＡターミネーター
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配列番号１２ ｍＣｈｅｒｒｙ
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配列番号１３ 組み込まれたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を有する３０ｂｐのプラスミド。
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配列番号１４ 組み込まれたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を有する３００ｂｐのプラスミド。
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配列番号１５ 組み込まれたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を有する５００ｂｐのプラスミド。
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配列番号１６ 組み込まれたｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を有する８００ｂｐのプラスミド。
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配列番号１７（ｃｒＲＮＡ）
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Claims (35)

1. クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系とともに使用するためのプラスミドであって、前記プラスミドが、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを順に含み、前記左相同アームおよび右相同アームが、各々８００ｂｐ以下の長さである、プラスミド。
2. 前記導入遺伝子と前記右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１に記載のプラスミド。
3. 前記左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さである、請求項１または２に記載のプラスミド。
4. 前記相同アームが、３０ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
5. 前記相同アームが、３００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
6. 前記相同アームが、５００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
7. 前記相同アームが、８００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
8. 前記左相同アームおよび右相同アームが、異なる長さである、請求項１または２に記載のプラスミド。
9. １つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組み込み方法において使用するためのプラスミドであって、コードされた核酸の順序が、ＰＡＭ、ｃｒＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡが使用される場合、前記コードされた核酸のが、第１のＰＡＭ、第１のｃｒＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む、プラスミド。
10. 請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドの前記相同アームおよび請求項９に記載のプラスミドの前記ＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、請求項１～９のいずれか一項に記載のプラスミド。
11. 前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプラスミド。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
13. 前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ６を含む、請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
14. 前記ベクターが、ｃｒＲＮＡ、トレーサーＲＮＡ（ｔｒｃｒＲＮＡ）、およびＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドをさらに含む、請求項１２または１３に記載のＡＡＶベクター。
15. 前記ベクターが、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
16. 前記ベクターが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
17. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項１２～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、改変細胞。
18. 前記改変細胞が、ＣＡＲ ＮＫ細胞である、請求項１７に記載の改変細胞。
19. 対象におけるがんを治療する方法であって、がんを有する対象に、請求項１７または１８に記載の改変細胞を投与することを含む、方法。
20. 相同性指向修復によって、細胞を遺伝子改変する方法であって、
    ａ）対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、および導入遺伝子（例えば、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体など）を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを得ることであって、前記導入遺伝子が、相同アームと隣接しており、前記相同アームが、８００ｂｐ以下の長さである、得ることと、
    ｂ）前記細胞に、前記導入遺伝子および前記ＲＮＰ複合体を導入することと、を含み、前記導入遺伝子が、前記細胞への前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染を介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、前記細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズし、前記細胞のＤＮＡ修復酵素が、前記導入遺伝子を、前記細胞の前記ゲノムＤＮＡ内の前記標的配列で宿主ゲノムに挿入し、それによって、改変細胞を生成する、方法。
21. 前記細胞が、初代細胞または増殖細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記初代細胞が、感染の前に、ＩＬ－２の存在下で、４日間インキュベートされる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記初代細胞が、感染の前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、４日間増殖される、請求項２２に記載の方法。
24. 感染の後に、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに前記改変細胞を増殖することをさらに含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記細胞が、ＮＫ細胞である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体である、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ＲＮＰ複合体が、エレクトロポレーションを介して前記細胞に導入される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ＲＮＰ複合体が、トランスフェクションを介して前記細胞に導入され、前記ＲＮＰ複合体が、同じまたは異なるＡＡＶ上にコードされる、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 相同性指向修復（ＨＤＲ）によって、少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、
    （ａ）前記細胞内に、（ｉ）前記細胞のゲノム内の標的配列をコードするＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ならびに（ｉｉ）各々８００ｂｐ以下の長さを有する第１および第２の相同アームに隣接する導入遺伝子を含むプラスミドを含むＡＡＶベクターを導入することであって、前記導入遺伝子が、キメラ抗原受容体をコードする、導入することと、
    （ｂ）前記細胞を、（ｉ）前記ＲＮＰ複合体が、前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、かつ（ｉｉ）前記細胞が、前記標的配列で前記細胞のゲノムに前記導入遺伝子を挿入し、ＨＤＲによって前記切断を修復し、それによって、前記導入遺伝子を前記ＤＳＢの部位で前記細胞のゲノムに組み込むのに十分な時間および条件下で、維持することと、を含む、方法。
30. 細胞が、初代細胞または増殖細胞である、請求項２８に記載の方法。
31. 前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２８または２９に記載の方法。
32. 前記クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項２８または２９に記載の方法。
33. 前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ａ）の前に、前記細胞をＩＬ－２の存在下で少なくとも約４日間インキュベートすることをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
34. 前記細胞が初代細胞であり、前記方法が、ステップ（ｂ）の後に、前記細胞をｍｂＩＬ－２１の存在下で少なくとも約４日間増殖させることをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
35. 前記ｍｂＩＬ－２１が、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エクソソーム、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
    

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