JPWO2020129774A1 - 心毒性評価方法 - Google Patents
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Abstract
心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定する心毒性評価方法を提供する。心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、前記薬剤を添加する前に、前記培養容器内で、播種された前記心筋細胞による細胞塊を形成する、方法。
Description
本発明は、新規薬剤に関して、副作用予測や臨床試験前のヒトへの投与量決定などのために、薬物誘導性の心毒性を評価する方法に関し、特に、薬物との接触に起因して心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定することにより心毒性を評価する方法に関する。
心疾患を診断する方法の１つとして、心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定する方法が挙げられる。特許文献１には、実検体に近いＢＮＰ測定用標準物を用いることにより血中のＢＮＰ量を正確に測定する方法が記載されている。また、特許文献２には、薬剤のスクリーニングのためにｉｎ ｖｉｔｒｏ分化心筋細胞を用い、その薬効評価や毒性評価を行うことが記載されている。
しかしながら、バイオマーカーを測定する細胞の培養容器への接着状態を制御することにより、測定の再現性を高めることについてはこれまで検討されてこなかった。
本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定する心毒性評価方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、培養容器に播種した細胞を細胞塊の状態として、培養容器内面にできるだけ接着させないように維持または培養することにより、その後の薬剤の添加により細胞から分泌されるバイオマーカーについて、測定値のベースラインが低く、かつ、再現性の高い測定が可能となることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の一態様は、心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、前記薬剤を添加する前に、前記培養容器内で、播種された前記心筋細胞による細胞塊を形成する、方法である。播種された心筋細胞を細胞塊の状態とすることにより、その後の薬剤の添加により細胞から分泌されるバイオマーカーについて、ベースラインが低く、かつ、再現性の高い測定を行うことができる。
また、上記態様では、前記心筋細胞を、３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで前記培養容器内に播種することが好ましい。播種する細胞数が前記好ましい範囲よりも多すぎると形成される細胞塊が大きくなりすぎて、細胞塊内部で細胞が死滅しやすくなる。一方、播種する細胞数が前記好ましい範囲よりも少なすぎると形成される細胞塊が小さすぎて、検出が困難なほど少ないバイオマーカー量しか産生されなくなる。
また、上記態様では、前記心筋細胞が多能性幹細胞由来心筋細胞であることが好ましい。とりわけ、人工多能性幹細胞由来心筋細胞であることが好ましい。倫理上の問題がないこと、安定供給が見込めるため、測定が長期間にわたる場合でも精度の高い測定を行うことができるからである。
また、上記態様では、前記心疾患が心不全であり、該心不全のバイオマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドであることが好ましい。
本発明によれば、心疾患のバイオマーカーを高い精度で測定することができる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、心疾患のバイオマーカーを測定するにあたって、所定の薬剤を添加する前に、培養容器内で、播種された細胞による細胞塊（細胞凝集塊）を形成する点に特徴がある。
本発明の方法は、心疾患のバイオマーカーを測定するにあたって、所定の薬剤を添加する前に、培養容器内で、播種された細胞による細胞塊（細胞凝集塊）を形成する点に特徴がある。
ここで、細胞塊を形成するためには、例えば、足場フリーでの三次元細胞培養でスフェロイドを形成するときに使用されるような公知の方法を使用すればよく、特に限定されない。
具体的な細胞塊の形成方法としては、例えば、培養容器の底面を、ロート状、半球状等の形状にすることで、または、培養容器の形状自体をテーパ状にすることで、細胞が培養容器の底面で平面的に培養されるのを抑制し、細胞塊を形成する方法が挙げられる。あるいは、培養容器の底面を上記形状にすることに加えて、容器内面の少なくとも底面に、親水性被覆（コーティング）を施すことによって、細胞が培養容器の底面に接着するのを防止し、細胞塊を形成する方法もある。あるいは、培養容器の底面にハニカム形状等の凹凸のある模様を施すことによって、細胞が培養容器の底面に接着するのを妨げて、細胞塊を形成する方法もある。
具体的な細胞塊の形成方法としては、例えば、培養容器の底面を、ロート状、半球状等の形状にすることで、または、培養容器の形状自体をテーパ状にすることで、細胞が培養容器の底面で平面的に培養されるのを抑制し、細胞塊を形成する方法が挙げられる。あるいは、培養容器の底面を上記形状にすることに加えて、容器内面の少なくとも底面に、親水性被覆（コーティング）を施すことによって、細胞が培養容器の底面に接着するのを防止し、細胞塊を形成する方法もある。あるいは、培養容器の底面にハニカム形状等の凹凸のある模様を施すことによって、細胞が培養容器の底面に接着するのを妨げて、細胞塊を形成する方法もある。
このように、播種した細胞を培養容器の内面（底面）に接着させずに細胞塊を形成することで、ストレスが大幅に軽減された状態で、細胞を維持または培養できる。これにより、ストレスに起因するバイオマーカーの分泌が低減されて、測定値のベースラインが低く、かつ、バラツキを最小限に抑えることができると考えられる。
本発明において使用される細胞は、心筋細胞であり、例えば、多能性幹細胞由来心筋細胞（なかでも人工多能性幹細胞由来心筋細胞）、胚性幹細胞由来心筋細胞、ヒト由来心筋細胞などが挙げられる。
上記細胞を培養するための培地は、心筋細胞を培養し、維持することができれば、特に限定されるものではなく、市販の心筋細胞培養用培地を用いることができる。
上記培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
上記培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
上記培地に、薬剤を添加して細胞と接触させ、バイオマーカーの分泌の有無を評価する。
この方法が有効であることは、例えば、ドキソルビシン、エンドセリン、トラスツズマブなどの心毒性が知られた薬剤での心疾患のバイオマーカーの分泌で確認できる。
この方法が有効であることは、例えば、ドキソルビシン、エンドセリン、トラスツズマブなどの心毒性が知られた薬剤での心疾患のバイオマーカーの分泌で確認できる。
上記細胞を培養容器に播種する方法に格別な制限はなく、培養容器の中で、薬剤添加前に細胞を細胞塊の状態にできれば、どのような方法を用いてもよい。例えば、培地に懸濁した細胞をピペット等で培養容器内に播種する。培養容器の内面を予めコーティングしておくかどうか、および、どのようにコーティングするのかについては、使用する培養容器の通常の使用方法に従うこととする。
本発明において測定される心疾患のバイオマーカーとしては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）（以下、「ＢＮＰ」という）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、これらの前駆体や分解物などのナトリウム利尿ペプチド類のような心不全のバイオマーカー；トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢなどの心筋梗塞のバイオマーカー；などが挙げられる。
これらの中でも、特に心不全のバイオマーカーを測定する場合に、測定値のバラツキ低減の顕著な効果が得られる。このような観点から、特に、ＢＮＰやＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）などの脳性ナトリウム利尿ペプチド類が好ましく、とりわけＢＮＰが好ましい。
これらの中でも、特に心不全のバイオマーカーを測定する場合に、測定値のバラツキ低減の顕著な効果が得られる。このような観点から、特に、ＢＮＰやＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）などの脳性ナトリウム利尿ペプチド類が好ましく、とりわけＢＮＰが好ましい。
本発明の培養容器としては、その内部で細胞塊を形成することが可能であれば、任意の形状のものを使用することができる。培養容器としては、例えば、ディッシュ、プレート、マイクロ流路チップ、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどが挙げられる。
培養容器の成形方法は、所望される培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
本発明で使用される培養容器は、滅菌処理を行うことが好ましい。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。
上記心疾患のバイオマーカーの測定は、市販の測定キットなど、公知の方法を使用すればよく、特に限定されない。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
市販のＶ底形状を有する９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ（住友ベークライト社製）、型番ＭＳ−９０９６Ｖ）を培養容器として用い、付属の心筋細胞用解凍培地を使用して、ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ2（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、型番ＣＭＣ−１００−０１２−００１）を、３.７５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、各ウェルに２００μＬずつ播種し、遠心機（Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）、型番ＣＲ２１Ｎ）を用いて回転速度９１０ｒｐｍで３分間遠心して細胞塊を作製し、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で４時間培養を行った。
その後、上記９６ウェルプレートの各ウェルより心筋細胞用解凍培地を取り除き、新たに心筋細胞用維持培地を各ウェルに２００μＬ加え、前記と同様の遠心条件で遠心を行い、培地交換の影響で浮遊した細胞を再度沈降させた後、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で培養を行った。
細胞を播種してから２日後に上記９６ウェルプレートの各ウェル内の心筋細胞用維持培地を半量交換した。細胞を播種してから３日後に上記９６ウェルプレートの各ウェルから培養上清を２０μＬずつ採取した（添加前上清サンプル）。
次に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ナカライテスク社製、型番１３４３５−３５）を用いてドキソルビシン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、型番Ｄ５５８０００）溶液を希釈し、上記９６ウェルプレートのウェルに２０μＬ加え、ウェル内におけるドキソルビシンの終濃度が１０-7Ｍとなるように調製した。さらに段階希釈を行って、各ウェルにおけるドキソルビシンの終濃度が１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、１０-12Ｍ、１０-13Ｍおよび１０-14Ｍとなるように調製して各ウェルに２０μＬ加え、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で１６時間インキュベーションを行った。その後、ドキソルビシン溶液を加えた各ウェルから上清を２０μＬ回収した（添加後上清サンプル）。
ドキソルビシン添加前後で回収した上清サンプルについて、Ｈｕｍａｎ ＢＮＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、型番ＥＬＨ−ＢＮＰ）を用いて、上清サンプル中に含まれるＢＮＰ濃度を測定した。
ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分を図１のグラフに示す。上記の各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。
市販のＶ底形状を有する９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ（住友ベークライト社製）、型番ＭＳ−９０９６Ｖ）を培養容器として用い、付属の心筋細胞用解凍培地を使用して、ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ2（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、型番ＣＭＣ−１００−０１２−００１）を、３.７５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、各ウェルに２００μＬずつ播種し、遠心機（Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）、型番ＣＲ２１Ｎ）を用いて回転速度９１０ｒｐｍで３分間遠心して細胞塊を作製し、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で４時間培養を行った。
その後、上記９６ウェルプレートの各ウェルより心筋細胞用解凍培地を取り除き、新たに心筋細胞用維持培地を各ウェルに２００μＬ加え、前記と同様の遠心条件で遠心を行い、培地交換の影響で浮遊した細胞を再度沈降させた後、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で培養を行った。
細胞を播種してから２日後に上記９６ウェルプレートの各ウェル内の心筋細胞用維持培地を半量交換した。細胞を播種してから３日後に上記９６ウェルプレートの各ウェルから培養上清を２０μＬずつ採取した（添加前上清サンプル）。
次に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ナカライテスク社製、型番１３４３５−３５）を用いてドキソルビシン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、型番Ｄ５５８０００）溶液を希釈し、上記９６ウェルプレートのウェルに２０μＬ加え、ウェル内におけるドキソルビシンの終濃度が１０-7Ｍとなるように調製した。さらに段階希釈を行って、各ウェルにおけるドキソルビシンの終濃度が１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、１０-12Ｍ、１０-13Ｍおよび１０-14Ｍとなるように調製して各ウェルに２０μＬ加え、５％ＣＯ2雰囲気下３７℃の条件で１６時間インキュベーションを行った。その後、ドキソルビシン溶液を加えた各ウェルから上清を２０μＬ回収した（添加後上清サンプル）。
ドキソルビシン添加前後で回収した上清サンプルについて、Ｈｕｍａｎ ＢＮＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、型番ＥＬＨ−ＢＮＰ）を用いて、上清サンプル中に含まれるＢＮＰ濃度を測定した。
ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分を図１のグラフに示す。上記の各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。
図１の結果から、ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分のバラツキが小さく、かつ、ベースラインがきわめて低く抑えられていることがわかる。また、図１のグラフから、ドキソルビシン終濃度が高くなるにつれて、ＢＮＰの濃度の差分も大きくなるという相関関係を読み取ることができる。さらに、ドキソルビシン終濃度が１０-13Ｍ以下である場合には、ＢＮＰの濃度の差分が０に近い状態まで抑えられているのに対し、ドキソルビシン終濃度が１０-12Ｍである場合には、ＢＮＰの濃度の差分が１０００ｐｇ／ｍＬ付近まで上昇する。このような測定結果は、ドキソルビシンの濃度を変化させたことに起因する既知のＢＮＰ産出量の変化と整合していることから、ＢＮＰの濃度が高精度で測定できていることがわかる。
（比較例１）
実施例１で使用したＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖの代わりに、組織培養用ポリスチレン製９６ウェルプレート（ファルコン（登録商標）、コーニング社製、型番３５１１７２）を用いたこと、細胞を３.７５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、各ウェルに２００μＬずつ播種し、細胞塊を形成させずにウェルの底面に接着させて二次元的に培養・維持したこと以外は、実施例１と同様に、細胞培養、ドキソルビシンの添加、および上清の回収を行い、ドキソルビシン添加前後のＢＮＰ濃度を測定した。
ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰ濃度の差分を図２のグラフに示す。各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図２の結果から、ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分のバラツキが大きく、実施例１と比較して、測定精度が非常に低いことがわかる。
実施例１で使用したＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖの代わりに、組織培養用ポリスチレン製９６ウェルプレート（ファルコン（登録商標）、コーニング社製、型番３５１１７２）を用いたこと、細胞を３.７５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で、各ウェルに２００μＬずつ播種し、細胞塊を形成させずにウェルの底面に接着させて二次元的に培養・維持したこと以外は、実施例１と同様に、細胞培養、ドキソルビシンの添加、および上清の回収を行い、ドキソルビシン添加前後のＢＮＰ濃度を測定した。
ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰ濃度の差分を図２のグラフに示す。各ドキソルビシン濃度あたりｎ＝３のサンプル数の平均からの標準偏差を表すエラーバーとともにＢＮＰの濃度の差分をプロットした。図２の結果から、ドキソルビシンの添加前後における、細胞から分泌されたＢＮＰの濃度の差分のバラツキが大きく、実施例１と比較して、測定精度が非常に低いことがわかる。
図１〜２の結果から、ドキソルビシンを添加する前に、培養容器内に播種された細胞による細胞塊を形成することにより、ＢＮＰ濃度の測定値のバラツキが顕著に低減されることに加えて、差分のベースラインが顕著に低くなっている。このことから、所定の薬剤を添加する前に細胞塊を形成することにより、再現性の高い測定が可能となることがわかる。これは、細胞が平面的に培養されるのを回避することで、細胞にかかるストレスが大幅に軽減されるためであると考えられる。
また、ＢＮＰ以外のバイオマーカーであっても、上述のようなストレス性のバイオマーカーであれば、上記ＢＮＰの測定結果と同様に、ストレスフリーの状態で細胞を培養または維持することができるため、測定値のバラツキを顕著に低減することが可能となる。
また、ＢＮＰ以外のバイオマーカーであっても、上述のようなストレス性のバイオマーカーであれば、上記ＢＮＰの測定結果と同様に、ストレスフリーの状態で細胞を培養または維持することができるため、測定値のバラツキを顕著に低減することが可能となる。
本発明の心毒性評価方法によれば、高精度で心疾患のバイオマーカーを測定することができるため、正確な心毒性評価を行うことができる。
これにより、既に心毒性を有することが分かっている化合物、例えばドキソルビシンについて、その毒性を正確に測定できることが確認された。そのため、本発明の評価方法を利用して、新規薬剤の毒性を評価することが可能となり、ひいては、毒性を低減しつつ薬効を最大限に引き出すための当該薬剤の投与量を決定することも可能となる。
これにより、既に心毒性を有することが分かっている化合物、例えばドキソルビシンについて、その毒性を正確に測定できることが確認された。そのため、本発明の評価方法を利用して、新規薬剤の毒性を評価することが可能となり、ひいては、毒性を低減しつつ薬効を最大限に引き出すための当該薬剤の投与量を決定することも可能となる。
Claims (4)
- 心筋細胞を培地とともに培養容器に播種し、
前記培養容器内の培地に薬剤を添加して、該薬剤を前記心筋細胞に接触させ、その後、
前記心筋細胞から分泌される心疾患のバイオマーカーを測定して前記薬剤の心毒性を評価する、心毒性評価方法であって、
前記薬剤を添加する前に、前記培養容器内で、播種された前記心筋細胞による細胞塊を形成する、方法。 - 前記心筋細胞を、３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで前記培養容器内に播種する、請求項１に記載の心毒性評価方法。
- 前記心筋細胞が多能性幹細胞由来心筋細胞である、請求項１または２に記載の心毒性評価方法。
- 前記心疾患が心不全であり、該心不全のバイオマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の心毒性評価方法。
Applications Claiming Priority (3)
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| JP2018238171 | 2018-12-20 | ||
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| JP6608281B2 (ja) * | 2013-08-23 | 2019-11-20 | 国立大学法人大阪大学 | 薬剤候補化合物のスクリーニングに用いる心筋組織チップの製造方法 |
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