JP6779981B2 - ミオシン重鎖検定用標準 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞集団におけるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）発現率を測定および／または検定するための標準、該標準を製造するための細胞培養物、ならびに前記標準または細胞培養物を製造する方法などに関する。
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患や拡張型心筋症などにより損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１〜２）。
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
本発明は、シート状細胞培養物の品質を評価するための検定用標準および該標準を製造するための細胞培養物、ならびに前記標準または細胞培養物を製造するための方法などの提供を目的とする。
シート状細胞培養物を臨床応用する場合、その適用可能性や有効性、安全性などを担保するため、製造方法を最適化する指標の設定や、シート状細胞培養物の品質を評価および管理することが必要となる。臨床用のシート状骨格筋芽細胞培養物を製造する際には、製造工程における細胞の品質評価の一環としてミオシン重鎖（ＭＨＣまたはＭｙＨＣ）の発現を確認する。この際に確認用のツールとして抗ＭＨＣ抗体を用いて検査するのが一般的であるが、医療用品の製造においては、品質検査に用いる試薬の性能や方法の精度を確認しておく必要がある。抗ＭＨＣ抗体の性能やＭＨＣの発現状態を試験する方法の精度を確認するためには、ＭＨＣ発現の標準となり得る細胞が必要である。
ここで本発明者らは、簡便かつ大量に得ることができる、ＭＨＣを高度に発現する細胞集団ならびに用時調製が容易なＭＨＣを指標とした検定用標準が存在しないという新たな課題に直面した。かかる課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、増殖および保存が簡単な未分化細胞を所定の条件で所定の期間培養することにより、高効率でＭＨＣ発現細胞を増加させ、所望の細胞集団を調製することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の一側面は下記に掲げるものに関する：
＜１＞ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現陽性の細胞含有率が１％以上である、細胞培養物。
＜２＞細胞が、実質的に骨格筋芽細胞に由来する細胞からなる、上記＜１＞に記載の細胞培養物。
＜３＞上記＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養物および線維芽細胞を含む、ＭＨＣ発現検定用標準。
＜４＞抗ＭＨＣ抗体のバリデーションに用いるものである、上記＜３＞に記載の検定用標準。
＜５＞フローサイトメトリーに用いるものである、上記＜３＞または＜４＞に記載の検定用標準。
＜１＞ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現陽性の細胞含有率が１％以上である、細胞培養物。
＜２＞細胞が、実質的に骨格筋芽細胞に由来する細胞からなる、上記＜１＞に記載の細胞培養物。
＜３＞上記＜１＞または＜２＞に記載の細胞培養物および線維芽細胞を含む、ＭＨＣ発現検定用標準。
＜４＞抗ＭＨＣ抗体のバリデーションに用いるものである、上記＜３＞に記載の検定用標準。
＜５＞フローサイトメトリーに用いるものである、上記＜３＞または＜４＞に記載の検定用標準。
＜６＞骨格筋芽細胞を、低血清の低血清培地で３〜６日間培養することを含む、ＭＨＣ発現陽性細胞を１％以上含有する細胞培養物の製造方法。
＜７＞低血清培地が、無血清培地である、上記＜６＞に記載の方法。
＜８＞低血清培地が、ＤＭＥＭ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．００５〜０．５μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−１を含む無血清培地である、上記＜６＞または＜７＞に記載の方法。
＜９＞培養の前に、増殖培地でプレ培養することを含む、上記、＜６＞〜＜８＞に記載の方法。
＜７＞低血清培地が、無血清培地である、上記＜６＞に記載の方法。
＜８＞低血清培地が、ＤＭＥＭ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．００５〜０．５μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−１を含む無血清培地である、上記＜６＞または＜７＞に記載の方法。
＜９＞培養の前に、増殖培地でプレ培養することを含む、上記、＜６＞〜＜８＞に記載の方法。
本発明の方法により、ＭＨＣ発現陽性細胞率の高い細胞集団を簡便かつ大量に得ることができる。本発明の方法により得られた細胞集団は、高いＭＨＣ発現陽性細胞率を有するため、当該細胞集団を用いて検定用標準を調製することにより、検定可能範囲が広い標準とすることが可能になる。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
＜本発明の細胞培養物およびその製造方法＞
本発明は一側面において、ミオシン重鎖を発現する細胞の含有率が、１％以上であることに特徴を有する細胞培養物に関する。
本発明において、「細胞培養物」とは、細胞をin vitroで培養することにより得られる細胞集団を意味する。培養は増殖培養であっても非増殖培養であってもよく、また初代培養であっても継代培養であってもよいが、生体から採取してきて培地に懸濁した、または培養基材に播種しただけのものは意図されない。すなわち、本発明における「細胞培養物」は、培地に懸濁した、または培養基材に播種した細胞を、所定の条件で所定の時間インキュベートしたものを意味する。かかる条件としては、インキュベートの目的により至適な条件を選択し得るが、例えば３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下などが挙げられる。インキュベート時間としては、インキュベートの目的により至適な時間を選択し得るが、例えば１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、３日以上、５日以上などが挙げられる。
細胞培養物のうち、特に細胞のみを意味する場合は、特に「培養細胞」という。発明における培養細胞は、好ましくは哺乳動物の細胞であり、より好ましくはヒトの細胞である。
本発明は一側面において、ミオシン重鎖を発現する細胞の含有率が、１％以上であることに特徴を有する細胞培養物に関する。
本発明において、「細胞培養物」とは、細胞をin vitroで培養することにより得られる細胞集団を意味する。培養は増殖培養であっても非増殖培養であってもよく、また初代培養であっても継代培養であってもよいが、生体から採取してきて培地に懸濁した、または培養基材に播種しただけのものは意図されない。すなわち、本発明における「細胞培養物」は、培地に懸濁した、または培養基材に播種した細胞を、所定の条件で所定の時間インキュベートしたものを意味する。かかる条件としては、インキュベートの目的により至適な条件を選択し得るが、例えば３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下などが挙げられる。インキュベート時間としては、インキュベートの目的により至適な時間を選択し得るが、例えば１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、３日以上、５日以上などが挙げられる。
細胞培養物のうち、特に細胞のみを意味する場合は、特に「培養細胞」という。発明における培養細胞は、好ましくは哺乳動物の細胞であり、より好ましくはヒトの細胞である。
「ミオシン重鎖」は、ＡＴＰ駆動性のモータータンパク質であるミオシンを構成する線維状のタンパク質であり、ＭＨＣまたはＭｙＨＣとも称される分子である。本明細書においては、「ミオシン重鎖」、「ＭＨＣ」および「ＭｙＨＣ」という語は全て同じものを表しており、これらの語は互換的に用いられる。本発明におけるＭＨＣは、好ましくは哺乳動物のＭＨＣであり、より好ましくはヒトのＭＨＣである。
本発明において、「ミオシン重鎖発現細胞の含有率」とは、ある細胞集団において、全細胞のうちミオシン重鎖を発現している細胞の割合を意味し、「ミオシン重鎖（発現）陽性細胞率」と同義である。
本発明者らは、シート状骨格筋芽細胞培養物を研究する中で、臨床用のシート状骨格筋芽細胞培養物を製造する際には、製造工程における細胞の品質評価の一環として当該シート状細胞培養物を構成する細胞におけるＭＨＣ発現細胞の割合を確認する必要があるところ、かかる確認に用いる抗ＭＨＣ抗体などの試薬の性能や、確認するための方法の精度などは、一定の基準で確認（バリデーション）されなければならないが、この確認試験のための検定用標準がそもそも存在しないという課題に直面し、かかる標準を調製する方法について検討した。しかしながら、かかる標準を作製するにあたり、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有する細胞集団を調製することが非常に困難であるという課題にさらに直面した。
すなわち、生体においてＭＨＣを発現する代表的な細胞としては筋細胞が挙げられるが、当該細胞は増殖能を有さない細胞であるため、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルで含有する細胞集団を大量に得るためには、大量の筋細胞を採取する必要があることになる。しかしながら、ヒトの骨格筋芽細胞を用いたシート状細胞培養物の品質検査の標準としてはヒトの筋細胞を用いることが好ましいところ、ヒト由来の細胞の採取には種々の制約がある。また、ＭＨＣ発現陽性細胞を高い割合で含有する細胞集団は市販されていない。
本発明の細胞培養物は、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有するものである。具体的には、本発明の細胞培養物は、ＭＨＣ発現陽性細胞を１％以上、好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上含有する。
ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有する細胞集団としては、例えば骨格筋などから採取された筋細胞を高レベルに含有する細胞集団が挙げられるが、本発明はこのような天然に存在する細胞集団を意図するものではなく、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有する細胞集団を、培養などにより人工的に作り出すことを目的とするものである。また、本発明の細胞集団は、好ましくはフローサイトメトリー、イムノパニングなどの細胞分離法、特にＭＨＣに対する抗体を用いた細胞分離法によってＭＨＣについて純化されたものではない。本発明の細胞集団はまた、好ましくはＭＨＣ遺伝子を人工的に導入された細胞を含まない。さらに、本発明の細胞集団は、好ましくは、実質的に所定の条件により所定の期間培養することのみによって得られる。
ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有する細胞集団としては、例えば骨格筋などから採取された筋細胞を高レベルに含有する細胞集団が挙げられるが、本発明はこのような天然に存在する細胞集団を意図するものではなく、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに含有する細胞集団を、培養などにより人工的に作り出すことを目的とするものである。また、本発明の細胞集団は、好ましくはフローサイトメトリー、イムノパニングなどの細胞分離法、特にＭＨＣに対する抗体を用いた細胞分離法によってＭＨＣについて純化されたものではない。本発明の細胞集団はまた、好ましくはＭＨＣ遺伝子を人工的に導入された細胞を含まない。さらに、本発明の細胞集団は、好ましくは、実質的に所定の条件により所定の期間培養することのみによって得られる。
本発明は一側面において、骨格筋芽細胞を、低血清培地で３〜６日間培養することを含む、ＭＨＣ発現陽性細胞を高レベルに、例えば４５％以上含有する細胞培養物の製造方法に関するものである。
骨格筋芽細胞用の低血清培地に用いられる基礎培地としては、当該技術分野において通常用いられる基礎培地を用いることができ、かかる基礎培地としてはこれに限定するものではないが、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、イーグル基礎培地などが挙げられる。汎用的に用いられているものとして、好ましくはＤＭＥＭを用いる。
本発明の方法における低血清培地の血清含有量は０〜５％程度が好ましく、無血清培地、すなわち血清を含有しない培地がより好ましい。また、血清の添加に代えて、血清タンパク質を添加してもよい。血清タンパク質としては、これに限定するものではないが、例えば血清アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。本発明の方法に用いられる低血清培地は、好ましくは無血清であり、かつ血清アルブミンが添加されている。血清アルブミンは、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｍｌ程度、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは０．６〜２ｍｇ／ｍｌ程度の濃度となるように添加される。
本発明の方法に用いられる低血清培地は、好ましくはインスリンファミリーペプチドを含む。インスリンファミリーペプチドにはインスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１およびＩＧＦ−２が含まれるが、ＭＨＣ発現誘導能の観点から、より好ましくはＩＧＦ−１が含まれる。本発明の方法に用いられる低血清培地においては、ＩＧＦ−１は、好ましくは０．００１〜５μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは０．００２〜２μｇ／ｍｌ程度、さらに好ましくは０．００５〜０．５μｇ／ｍｌ程度の濃度となるように添加される。
したがって特定のより好ましい態様において、本発明の方法に用いられる低血清培地は、ＤＭＥＭ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．００５〜０．５μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１からなる培地である。
本発明の方法の好ましい一態様において、骨格筋芽細胞を低血清培地で培養する前に、増殖培地でプレ培養する工程を含む。本発明の方法に用いる低血清培地での培養においては、骨格筋芽細胞は培養基材に接着しにくいが、プレ培養を行うことにより、細胞を培養基材に十分接着させることができる。プレ培養の時間は、細胞が培養基材に接着するのに十分な時間であればよく、当業者であれば播種細胞密度に応じて適宜培養時間を選択することができるが、好ましくは約１２〜４８時間、より好ましくは約１４〜２４時間である。
プレ培養に用いる増殖培地としては、骨格筋芽細胞を増殖培養するために用い得る、当該技術分野において公知の任意の培地を用いることができる。増殖培地の例としては、これに限定するものではないが、例えば上記基礎培地に１０〜２０％の血清（ＦＢＳまたはＦＣＳなど）を加えた培地に、必要に応じて成長因子、抗生物質などを適宜加えた培地が挙げられる。
上記の方法により得られた細胞培養物は、ＭＨＣ発現陽性の細胞を１％以上、好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上含む細胞集団となる。かかる細胞培養物は、上述のとおり骨格筋芽細胞を培養して製造するものであるため、実質的に骨格筋芽細胞に由来する細胞からなる。ここで、「実質的にＡからなる」とは、組成物が構成要素としてＡ以外のものを含み得るが、Ａ以外の成分の含有量が検出誤差程度であったり、本発明の効果に影響を及ぼさない程度の量であったり、Ａ以外の成分が技術的に分離不可能なものであったりなど、Ａ以外のものを含まないとみなせることをいう。本発明の細胞培養物は、好ましくは実質的に骨格筋芽細胞からなる細胞集団を低血清培地で培養して得られる細胞集団であるため、当該得られた細胞集団には、骨格筋芽細胞に由来する細胞以外の細胞は含まれないとみなせる。
本発明はまた、基礎培地と０〜５％の血清とを含む、ＭＨＣ発現誘導培地に関する。本発明のＭＨＣ発現誘導培地は、好ましくは、血清タンパク質およびインスリンファミリーペプチドからなる群から選択される成分をさらに含む。血清タンパク質およびインスリンファミリーペプチドの種類および含有量については、本発明の製造方法について上記したとおりである。
＜本発明の検定用標準および検定方法＞
本発明は、上記本発明の細胞培養物を含む検定用標準にも関する。本発明において「検定」とは、基準を設け、検査対象が当該基準を満たしているか否かを検査して合否や等級などを定めることをいう。したがって本発明における「検定用標準」とは、前記検定における基準を示すものをいう。本発明における「検定」には、医薬品や再生医療等製品などの品質を担保するためのバリデーションのみならず、これらの製造段階における品質確認試験の精度や当該品質確認試験において用いられる試薬の性能を担保するためのバリデーションも含まれる。
本発明は、上記本発明の細胞培養物を含む検定用標準にも関する。本発明において「検定」とは、基準を設け、検査対象が当該基準を満たしているか否かを検査して合否や等級などを定めることをいう。したがって本発明における「検定用標準」とは、前記検定における基準を示すものをいう。本発明における「検定」には、医薬品や再生医療等製品などの品質を担保するためのバリデーションのみならず、これらの製造段階における品質確認試験の精度や当該品質確認試験において用いられる試薬の性能を担保するためのバリデーションも含まれる。
上述のとおり本発明は、臨床用のシート状骨格筋芽細胞培養物を製造する際には、品質や安全性を評価するために、製造工程において当該シート状細胞培養物を構成する細胞におけるＭＨＣの発現を確認する必要があるところ、かかる確認に用いる抗ＭＨＣ抗体などの試薬の性能や、確認するための方法の精度などは、一定の基準で確認（バリデーション）されなければならないが、この確認試験のための検定用標準がそもそも存在しないという新たな課題を解決するものであり、本発明の検定用標準は、これに限定するものではないが、例えばＭＨＣ発現を確認するために用いる抗ＭＨＣ抗体の性能や該抗体を用いた発現確認試験の精度などを検定するために用いるものである。したがって一態様において本発明の検定用標準は、所定のＭＨＣ発現陽性細胞含有率を有する。
ここで所定のＭＨＣ発現陽性細胞含有率を有する細胞集団（すなわち検定用標準）を調製する場合、既知のＭＨＣ発現陽性細胞含有率を有する細胞集団に、ＭＨＣ発現陰性細胞を加えて所定のＭＨＣ発現陽性細胞含有率に調製するのが一般的である。ＭＨＣ発現陰性細胞としては、ＭＨＣを発現しておらず、ＭＨＣ発現陽性細胞に悪影響を与えるものでない限りいかなる細胞を用いてもよい。本発明の検定用標準の調製においては、入手および株の増殖、維持の簡便さから、好ましくはＭＨＣ発現陰性細胞として線維芽細胞、好ましくはヒト線維芽細胞を用いる。
したがって本発明の検定用標準は、好ましい一態様において、上記本発明の細胞培養物におけるＭＨＣ発現陽性細胞含有率を定量的に測定し、当該細胞培養物に適量の線維芽細胞、好ましくはヒト線維芽細胞を混合することにより、所定のＭＨＣ発現陽性細胞含有率となるように調製される。所定のＭＨＣ発現陽性細胞含有率となるように調整された検定用標準は、そのまま凍結保存し、使用前に解凍して検定に利用することも可能である。本発明の検定用標準におけるＭＨＣ発現陽性含有率は、凍結保存後もほとんど変化しないため、解凍後の検定用標準は、ＭＨＣ発現陽性含有率を測定により確認することなく検定に利用することができる。したがって、本発明の検定用標準は、凍結された状態で提供されてもよい。凍結保存および解凍は既知の任意の手法で行ってもよく、凍結保護剤などを使用してもよい。
上記の方法で調製する場合、最初の細胞集団が有するＭＨＣ発現陽性細胞含有率を上回る細胞集団を調製することはできない。したがって最初の細胞集団が有するＭＨＣ発現陽性細胞含有率が高ければ高いほど、本発明の検定用標準を用いて検定可能なＭＨＣ発現陽性細胞含有率の範囲が広くなる。
本発明の別の側面は、本発明の検定用標準を用いて、抗ＭＨＣ抗体の性能を検定する方法（以下、「抗ＭＨＣ抗体検定方法」と称することがある）に関する。当該検定方法は、既知のＭＨＣ細胞陽性率を有する細胞集団に、検定対象の抗ＭＨＣ抗体を作用させる工程、前記細胞集団に含まれる細胞に結合した抗ＭＨＣ抗体を定量する工程、前記細胞集団のＭＨＣ細胞陽性率と、定量された抗ＭＨＣ抗体の量とを比較する工程を含む。前記検定方法は、例えば、細胞集団のＭＨＣ細胞陽性率と定量された抗ＭＨＣ抗体の量との相関係数が所定の値より高い場合に、検定対象の抗ＭＨＣ抗体が検定に合格したと判定する工程を含んでいてもよい。前記検定方法には、１または２以上の細胞集団を用いることができる。異なるＭＨＣ細胞陽性率を有する複数の細胞集団を用いることで、より正確な検定が可能となる。また、ＭＨＣ細胞陽性率が高い細胞集団を用いることにより、抗ＭＨＣ抗体により適正に検出できるＭＨＣ発現の範囲（例えば、ＭＨＣ細胞陽性率の範囲）をより広くすることができる。検定に合格した抗ＭＨＣ抗体は、臨床用のシート状骨格筋芽細胞培養物の品質管理に用いることができる。細胞集団に含まれる細胞に結合した抗ＭＨＣ抗体の定量は、既知の任意の定量手法、例えば、フローサイトメトリーなどにより行うことができる。
本発明の別の側面は、本発明の検定用標準を用いて、シート状細胞培養物を構成する細胞におけるＭＨＣの発現を確認するための方法の精度を検定する方法（以下、「精度検定方法」と称することがある）に関する。当該検定方法は、既知のＭＨＣ細胞陽性率を有する細胞集団を、検定対象のＭＨＣ発現確認方法に供する工程、前記細胞集団のＭＨＣ細胞陽性率と、前記ＭＨＣ発現確認方法により確認されたＭＨＣの発現量とを比較する工程を含む。前記検定方法は、例えば、細胞集団のＭＨＣ細胞陽性率とＭＨＣ発現確認方法により確認されたＭＨＣの発現量との相関係数が所定の値より高い場合に、検定対象のＭＨＣ発現確認方法が検定に合格したと判定する工程を含んでいてもよい。検定に合格したＭＨＣ発現確認方法は、臨床用のシート状骨格筋芽細胞培養物の品質管理に用いることができる。ＭＨＣ発現確認方法は、既知の任意のＭＨＣ発現確認手法、例えば、抗ＭＨＣ抗体を用いた免疫染色法、特にフローサイトメトリーなどに基づくものであってよい。
本発明の一側面において、上記本発明の検定用標準を用いて、シート状細胞培養物の製造に用いる骨格筋芽細胞を検定する方法も提供される。かかる検定方法により、シート状骨格筋芽細胞培養物の製造に用いられる骨格筋芽細胞の品質を検査することができる。かかる検定方法は以下の工程を含む：
（ａ）増殖培養した骨格筋芽細胞の一部を採取し、ＭＨＣの発現量を測定する工程；
（ｂ）所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する本発明の検定用標準のＭＨＣ発現量を（ａ）と同様に測定する工程；および
（ｃ）（ａ）で得られた結果と（ｂ）で得られた結果とを比較する工程。
（ａ）増殖培養した骨格筋芽細胞の一部を採取し、ＭＨＣの発現量を測定する工程；
（ｂ）所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する本発明の検定用標準のＭＨＣ発現量を（ａ）と同様に測定する工程；および
（ｃ）（ａ）で得られた結果と（ｂ）で得られた結果とを比較する工程。
工程（ａ）において、「増殖培養した骨格筋芽細胞」とは、移植対象から採取し、シート状骨格筋芽細胞培養物の製造のために増殖培養に供した骨格筋芽細胞を意味する。工程（ａ）においては、シート状細胞培養物の製造に供する前に、前記骨格筋芽細胞培養物のＭＨＣ発現量を測定する。
工程（ｂ）において、「所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する検定用標準」とは、本検定方法における閾値となる値を有する検定用標準を意味する。例えば、検定対象の骨格筋芽細胞におけるＭＨＣの発現量が検定用標準におけるＭＨＣの発現量より低ければ、検定に合格したと判定することができる。
工程（ｂ）において、「所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する検定用標準」とは、本検定方法における閾値となる値を有する検定用標準を意味する。例えば、検定対象の骨格筋芽細胞におけるＭＨＣの発現量が検定用標準におけるＭＨＣの発現量より低ければ、検定に合格したと判定することができる。
工程（ａ）および（ｂ）における測定には、当該技術分野において既知の任意の測定手法を用いることができ、これに限定するものではないが、例えば免疫染色を用いた定量法、具体的には例えばフローサイトメトリー法などが挙げられる。作業の簡便さなどの観点から、好ましくはフローサイトメトリー法で計測を行う。また、工程（ａ）および（ｂ）の計測手法は、それぞれの計測値（実測値）が直接的または間接的に比較可能であれば同一の計測手法でなくてもよいが、工程（ｃ）における比較の容易さなどの観点から、好ましくは同一の手法で行う。また必ずしも定量的な手法である必要はなく、例えば抗ＭＨＣ抗体による免疫染色の後、蛍光強度を測定するなど、半定量的な手法であってもよい。
工程（ｃ）においては、工程（ａ）により得られた結果と工程（ｂ）により得られた結果とを比較する。例えば抗ＭＨＣ抗体による免疫染色の後、蛍光強度を測定する手法によりＭＨＣ発現量を測定した場合、工程（ａ）で得られた蛍光強度と工程（ｂ）で得られた蛍光強度とを比較することにより、例えば工程（ｂ）の蛍光強度がより強ければ、工程（ａ）の骨格筋芽細胞培養物のＭＨＣ陽性細胞率は、所定のＭＨＣ陽性細胞率未満であることがわかる。本側面の一態様において、工程（ｃ）における比較の結果、所定のＭＨＣ陽性細胞率以下のＭＨＣ陽性細胞率を有する骨格筋芽細胞培養物を、シート状細胞培養物の製造に供するための骨格筋芽細胞として選択する。
本発明の別の側面において、上記本発明の検定用標準を用いてシート状細胞培養物を検定する方法も提供される。かかる検定方法により、製造されたシート状細胞培養物の品質を検査することができる。かかる検定方法は以下の工程を含む：
（ａ）シート状細胞培養物の一部を採取し、細胞間接着を解離させて細胞懸濁液とする工程；
（ｂ）上記細胞懸濁液に含まれる細胞集団のＭＨＣ発現量を測定する工程；
（ｃ）所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する本発明の検定用標準のＭＨＣ発現量を測定する工程；および
（ｄ）（ｂ）で得られた結果と（ｃ）で得られた結果とを比較する工程。
（ａ）シート状細胞培養物の一部を採取し、細胞間接着を解離させて細胞懸濁液とする工程；
（ｂ）上記細胞懸濁液に含まれる細胞集団のＭＨＣ発現量を測定する工程；
（ｃ）所定のＭＨＣ陽性細胞率を有する本発明の検定用標準のＭＨＣ発現量を測定する工程；および
（ｄ）（ｂ）で得られた結果と（ｃ）で得られた結果とを比較する工程。
工程（ａ）において、「シート状細胞培養物の一部」とは、シートの一部分を切り出したものであってもよいし、１つの製造ロットにより製造された複数のシートのうちの１つであってもよい。前者の場合は本発明の検定方法により、元のシートの品質についての検査をすることができ、後者の場合は１つのシートを検定することにより、同一製造ロットにより製造された全てのシートの品質を検査することができる。
細胞間接着の解離は、細胞に悪影響を及ぼすダメージを与えるものでない限り、いかなる処置を行ってもよい。解離の方法としては、これに限定するものではないが、例えばトリプシンなど、細胞間接着を解離させるような酵素で処理する方法、例えばピペットなどにより物理的に力を加えて解離させる方法などが挙げられる。
工程（ｂ）および（ｃ）における測定については、上記シート状細胞培養物の製造に用いる骨格筋芽細胞を検定する方法の工程（ａ）および（ｂ）における測定と同様の手法を用いることができる。
工程（ｄ）においては、工程（ｂ）により得られた結果と工程（ｃ）により得られた結果とを比較する。これにより、製造されたシート状細胞培養物におけるＭＨＣ発現陽性細胞率が所定のＭＨＣ発現陽性細胞率よりも高いか低いかを判断できる。本側面の一態様において、工程（ｄ）における比較の結果、所定のＭＨＣ陽性細胞率以下のＭＨＣ陽性細胞率を有するシート状骨格筋芽細胞培養物を合格とする。
また、複数の検定用標準を用いることにより、品質のランク付けを行うこともできる。例えば、３種類のＭＨＣ発現陽性細胞率が異なる検定用標準を用いることで、シート状細胞培養物の品質を４つのランクに分類することができる。すなわち、例えば３つの検定用標準をＭＨＣ発現陽性細胞率の高い順にＡ標準、Ｂ標準およびＣ標準とした場合、Ａ標準よりも高いＭＨＣ発現陽性細胞率を有する場合にはランクＡとし、Ｂ標準以上Ａ標準未満の場合にはランクＢ、Ｃ標準以上Ｂ標準未満の場合にはランクＣ、Ｃ標準未満の場合はランクＤとすることができる。
以下に本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
例１．ＭＨＣ発現陽性細胞率の高い細胞培養物の調製
（１）ＭＨＣ発現細胞の調製
ヒト骨格筋芽細胞を１２ｍＬの増殖培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後８．０×１０４個／ｃｍ２の密度で培養皿に播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件でプレ培養した。プレ培養開始から１２〜２４時間後に低血清培地（ＤＭＥＭ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍＬ＋インスリン様成長因子０．０５μｇ／ｍＬ）に培地交換し、６日間培養した。培養後、培地を廃棄し、形成されたシート状細胞培養物の表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄後、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific社製）を６ｍＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、ＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物を得た。
（１）ＭＨＣ発現細胞の調製
ヒト骨格筋芽細胞を１２ｍＬの増殖培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後８．０×１０４個／ｃｍ２の密度で培養皿に播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件でプレ培養した。プレ培養開始から１２〜２４時間後に低血清培地（ＤＭＥＭ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍＬ＋インスリン様成長因子０．０５μｇ／ｍＬ）に培地交換し、６日間培養した。培養後、培地を廃棄し、形成されたシート状細胞培養物の表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄後、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific社製）を６ｍＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、ＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物を得た。
（２）ヒト線維芽細胞の調製
ヒト線維芽細胞を７５ｍＬの培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後、１０００個／ｃｍ２の密度で播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件で７日間培養した。培養後、培地を廃棄し、細胞培養表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄した。細胞解離剤を５０ｍＬ添加し、３７℃で１５分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、培養ヒト線維芽細胞を得た。
ヒト線維芽細胞を７５ｍＬの培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後、１０００個／ｃｍ２の密度で播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件で７日間培養した。培養後、培地を廃棄し、細胞培養表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄した。細胞解離剤を５０ｍＬ添加し、３７℃で１５分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、培養ヒト線維芽細胞を得た。
（３）培養細胞集団におけるＭＨＣ発現陽性細胞率の計測
上記（１）で得られたＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物について、フローサイトメーターを用いてＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。また、ネガティブコントロールとして、上記（２）で調製したヒト線維芽細胞を用いた。
結果を下表１に示す。
（１）で得られた骨格筋芽細胞培養物は、約７５％という高いＭＨＣ陽性細胞率を示した。
上記（１）で得られたＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物について、フローサイトメーターを用いてＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。また、ネガティブコントロールとして、上記（２）で調製したヒト線維芽細胞を用いた。
結果を下表１に示す。
例２．検定用標準の調製
（１）ＭＨＣ発現細胞の調製
骨格筋芽細胞を１２ｍＬの増殖培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後８．０×１０４個／ｃｍ２の密度で培養皿に播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件でプレ培養した。プレ培養開始から２６時間後に低血清培地（ＤＭＥＭ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍＬ＋インスリン様成長因子０．０５μｇ／ｍＬ）に培地交換し、５日間培養した。培養後、培地を廃棄し、形成されたシート状細胞培養物の表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄後、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific社製）を６ｍＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、ＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物を得た。この骨格筋芽細胞培養物は、上記例１と同様にしてフローサイトメーターを用いてＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。
（１）ＭＨＣ発現細胞の調製
骨格筋芽細胞を１２ｍＬの増殖培地（ＭＣＤＢ１３１＋２０％ＦＢＳ）に懸濁した後８．０×１０４個／ｃｍ２の密度で培養皿に播種し、３７±１℃、５±１％ＣＯ２の条件でプレ培養した。プレ培養開始から２６時間後に低血清培地（ＤＭＥＭ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍＬ＋インスリン様成長因子０．０５μｇ／ｍＬ）に培地交換し、５日間培養した。培養後、培地を廃棄し、形成されたシート状細胞培養物の表面をＨＢＳＳ（−）で洗浄後、TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific社製）を６ｍＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし細胞を解離した。解離した細胞を遠沈管に回収後、ＨＢＳＳ（−）で洗浄し、遠心処理、上清廃棄を行い、ＭＨＣ発現細胞を含む骨格筋芽細胞培養物を得た。この骨格筋芽細胞培養物は、上記例１と同様にしてフローサイトメーターを用いてＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。
（２）細胞の混合
上記（１）の結果に基づいて、ＭＨＣ発現陽性細胞の含有率が４５％、２５％、１０％、５％もしくは１％となるように、下表２のように上記（１）で得た骨格筋芽細胞培養物と例１（２）と同様にして調製したヒト線維芽細胞とを混合して、検定用標準を調製した。混合した細胞を遠心分離し、上清を廃棄後、保存液（ＭＣＤＢ１３１培地に、Ｌ−グルタミン、ＤＭＳＯおよびヒト血清アルブミンを、それぞれ終濃度８．７ｍｍｏｌ／Ｌ、１０％ｖ／ｖおよび７ｍｇ／ｍＬとなるように加えたもの）を加えて懸濁し凍結保存を行った。
上記（１）の結果に基づいて、ＭＨＣ発現陽性細胞の含有率が４５％、２５％、１０％、５％もしくは１％となるように、下表２のように上記（１）で得た骨格筋芽細胞培養物と例１（２）と同様にして調製したヒト線維芽細胞とを混合して、検定用標準を調製した。混合した細胞を遠心分離し、上清を廃棄後、保存液（ＭＣＤＢ１３１培地に、Ｌ−グルタミン、ＤＭＳＯおよびヒト血清アルブミンを、それぞれ終濃度８．７ｍｍｏｌ／Ｌ、１０％ｖ／ｖおよび７ｍｇ／ｍＬとなるように加えたもの）を加えて懸濁し凍結保存を行った。
（３）検定用標準の性能確認
上記（２）で凍結保存した細胞を、３７℃に設定したウォーターバスに３分間浸して融解した。融解した細胞を遠沈管に入れて遠心分離し、ＨＢＳＳ（−）で洗浄、懸濁した。その後フローサイトメーターによってＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。
上記（２）で凍結保存した細胞を、３７℃に設定したウォーターバスに３分間浸して融解した。融解した細胞を遠沈管に入れて遠心分離し、ＨＢＳＳ（−）で洗浄、懸濁した。その後フローサイトメーターによってＭＨＣの発現細胞数および全細胞数を測定した。
結果を下表３に示す。ＭＨＣ発現陽性細胞率は凍結保存後もほとんど変化がなく、検定用標準として有用に用いることができることが示された。
本発明の方法により製造されるＭＨＣ発現陽性細胞集団は、高いＭＨＣ発現陽性細胞率を有するため、これを用いて製造される検定用標準も、広範囲にわたる濃度で検定可能なものとなる。
Claims (9)
- ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞率を検定するためのＭＨＣ発現検定用標準を製造するための、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現陽性の細胞含有率が４５％以上である、細胞培養物を製造する方法であって、骨格筋芽細胞を、培養皿上で、低血清の低血清培地で３〜６日間培養すること、および、培養の前に、増殖培地でプレ培養することを含む、前記方法。
- 低血清培地が、無血清培地である、請求項１に記載の方法。
- 低血清培地が、ＤＭＥＭ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．００５〜０．５μｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−１を含む無血清培地である、請求項１または２に記載の方法。
- ＭＨＣ発現検定用標準を製造する方法であって、
（ａ）骨格筋芽細胞を培養皿上で、低血清培地で３〜６日間培養する工程；および
（ｂ）所定のＭＨＣ陽性細胞率となるよう、（ａ）で得られた細胞培養物を線維芽細胞で希釈する工程、ならびに
培養の前に、増殖培地でプレ培養することを含む、前記方法。 - 細胞集団のＭＨＣ陽性細胞率を検定する方法であって、
（ａ）細胞集団のＭＨＣ発現量を測定する工程；および
（ｂ）（ａ）で測定されたＭＨＣ発現量と、請求項４に記載の方法により製造されたＭＨＣ発現検定用標準の測定されたＭＨＣ発現量とを比較する工程
を含む、前記方法。 - 細胞集団のＭＨＣ陽性細胞率を検定する方法をバリデーションする方法であって、
（ａ）請求項４に記載の方法により製造されたＭＨＣ発現検定用標準を製造する工程、
（ｂ）（ａ）で作製されたＭＨＣ発現検定用標準のＭＨＣ発現量を測定する工程、および
（ｃ）（ｂ）で測定されたＭＨＣ発現量が、一定の基準にあることを確認する工程
を含む、前記方法。 - ＭＨＣ発現検定用標準が、凍結保存され、使用の前に融解されたものである、請求項５に記載の方法。
- 細胞集団が、シート状細胞培養物の製造に用いる骨格筋芽細胞培養物である、請求項５に記載の方法。
- シート状細胞培養物のＭＨＣ陽性細胞率を検定する方法であって、
（ａ）シート状細胞培養物の一部を採取し、細胞間接着を解離させて細胞懸濁液とする工程；
（ｂ）上記細胞懸濁液に含まれる細胞集団のＭＨＣ発現量を測定する工程；および
（ｃ）（ｂ）で測定されたＭＨＣ発現量と、請求項４に記載の方法により製造されたＭＨＣ発現検定用標準の測定されたＭＨＣ発現量とを比較する工程
を含む、前記方法。
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