JPWO2020095927A1 - 粒子含有水溶液の製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Ｃを得ることを含む方法に関する。希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路を有する希釈用流路構造体を用い、Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤ２導入路に水溶液Ｂ１をそれぞれ供給し、かつＤｎ導入路から水溶液Ｂｎを希釈流路中の水溶液に追加して、希釈流路の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む。本発明は、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子を、その粒子径を極力維持し得るナノ粒子含有水溶液の製造方法及びそれに用いるデバイスを提供する。

Description

本発明は、粒子含有水溶液の製造方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月９日出願の日本特願２０１８−２１１８４１号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
脂質ナノ粒子やポリマーミセルなどの、自己組織化分子を粒子構成成分として含むナノ粒子は、ドラッグデリバリーシステム（DDS）のためのナノキャリアとして最も実用化が進んでおり、すでに臨床応用されている。最近になって、ナノキャリアの粒径によってがん組織への薬剤の送達効率が異なることが明らかになった。そこで、ナノ粒子の粒径を精密に制御するために、マイクロ流体デバイスを用いた粒径制御法が開発されている[非特許文献2-4]。さらに本発明者らは、作製ないし加工が容易であり、かつ粒子径制御性が高いマイクロ流体デバイス及びそれを用いたナノ粒子の製造方法を開発した[非特許文献1及び特許文献1]。
特許文献１：ＷＯ２０１８／１９０４２３
特許文献２：特開２００９−５０５９５７号公報
特許文献３：特表２０１３−５１００９６号公報（ＷＯ２０１１／００１７６６）
非特許文献１：“Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery”, N. Kimura, M. Maeki, Y. Sato, T. Note, A. Ishida, H. Tani, H. Harashima, and M. Tokeshi, ACS Omega, 3, 5044, (2018).
非特許文献２：“Understanding the Formation Mechanism of Lipid Nanoparticles in Microfluidic Devices with Chaotic Micromixers”, M. Maeki, Y. Fujishima, Y. Sato, T. Yasui, N. Kaji, A. Ishida, H. Tani, Y. Baba, H. Harashima, and M. Tokeshi, PLOS ONE, 12, e0187962, (2017).
非特許文献３：“Bottom-Up Design and Synthesis of Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride Cores Using Millisecond Microfluidic Mixing”, I. V. Zhigaltsev, N. Belliveau, I. Hafez, A. K. K. Leung, C. Hansen, and P. R. Cullis, Langmuir, 38, 3633, (2012).
非特許文献４：“Rapid Discovery of Protein siRNA-Containing Lipid Nanoparticles Enabled by Controlled Microfluidic Formation”, D. Chen, K. T. Love, Y. Chen, A. A. Eltoukhy, C. Kastrup, G. Sahay, A. Jeon, Y. Dong, K. A. Whitehead, and D. G. Anderson, Journal of the American Chemical Society, 134, 6948, (2012).
特許文献１〜３および非特許文献１〜４の全記載は、ここに特に開示として援用される。
非特許文献１及び特許文献１に記載のナノ粒子の製造方法では、マイクロ流路中で脂質ナノ粒子を作る際の原料である脂質/アルコール溶液を緩衝液などによって迅速に希釈することで、精密な粒径制御を可能としている。但し、調製直後の脂質ナノ粒子溶液中には高濃度のエタノールが残存していることから、通常は透析（一晩）などの後処理によって残存アルコールを希釈している。
ところが、透析などでは、後処理中に粒子同士の融合が生じ、精密な粒径制御をして調製したにも関わらず、所望の粒子径の脂質ナノ粒子懸濁液が得られないことがある。これは、上記方法では脂質/アルコール溶液を緩衝液などで希釈して脂質ナノ粒子を形成しているが、希釈後の水溶液中のアルコール濃度は依然として高く、希釈により形成した粒子同士の融合を促進するためであると推察した。
そこで本発明が解決しようとする課題は、形成したナノ粒子同士の融合を回避できる手段・方法を提供することであり、本発明の目的は、調製したナノ粒子を、その粒子径を極力維持し得るナノ粒子含有水溶液の製造方法及びそれに用いるデバイスを提供することにある。
本発明は以下の通りである。
［１］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Cを得ることを含む方法であって、
前記希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する希釈用流路構造体を用い、
Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤ２導入路に水溶液Ｂ１をそれぞれ供給し、かつＤｎ導入路から水溶液Ｂｎ（例えば、ｎ＝２〜６）を希釈流路中の水溶液に追加して、希釈流路の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む、粒子含有水溶液の製造方法。
［２］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Ｃを得ることを含む方法であって、
前記希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤｎ（例えば、ｎ＝２〜７）導入路を有し、Ｄｎ導入路はすべての導入路が地点ｐにおいてＤ１導入路を挟み込むように配置され、地点ｐから下流側には希釈流路を有する希釈用流路構造体を用い、
Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤｎ導入路に水溶液Ｂｎ（例えば、ｎ＝１〜６）をそれぞれ供給し、希釈流路の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む、粒子含有水溶液の製造方法。
［３］
自己組織分子がＡ）脂質、Ｂ）両親媒性物質のいずれか一方、又はＡ）とＢ）の両方からなる、［１］または［２］記載の製造方法。
［４］
水混和性有機溶媒がアルカノールである、［１］〜［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］
粒子Ｚがリポソーム、脂質ミセル、またはポリマーミセルである、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］
Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路ｍからなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
Ｄｎ導入路は複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
Ｄ１導入路が２以上に分岐しており、かつ各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されている、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
希釈流路は途中で２以上に分岐しており、かつ各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されている、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
希釈流路における水溶液の滞留時間は1000ミリ秒以下である、［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］
水溶液Ｃに含まれる水混和性有機溶媒濃度が3vol%以下である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
水溶液Ａは、自己組織化分子を含有する水混和性有機溶媒と粒子調製用水溶液を混合して粒子含有水溶液を調製するための粒子調製用流路構造体を用いて調製され、調製直後に、希釈用流路構造体のＤ１導入路に供給される、［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
粒子調製用流路構造体は、上流側に少なくとも２以上からなるＳｑ導入路を有し、各導入路の合流部から下流側に粒子調製流路を有し、粒子調製流路の出口から水溶液Ａを排出し、排出した水溶液ＡはＤ１導入路に供給される［１２］に記載の製造方法。
［１４］
粒子調製流路及び希釈流路は、それぞれ又は一方の流路内にマイクロミキサーを有する、［１３］に記載の製造方法。
［１５］
水溶液Ｃ中の脂質粒子の個数平均の粒子径は100nm以下または60nm以下である、［１］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
水溶液Ａ中の脂質粒子の濃度は20mg/mL以下であり、水溶液Ｃ中の脂質粒子の濃度は5mg/mL以下である、［１］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
希釈流路の出口から排出された水溶液Ｃは、さらに透析に付され水混和性有機溶媒を除去した水溶液を得る［１］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
粒子Ｚに内封物が含まれる、［１］〜［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有しかつ水混和性有機溶媒を含む水溶液を別の水溶液で希釈するための流路構造体であって、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する、希釈用流路構造体。
［２０］
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有しかつ水混和性有機溶媒を含む水溶液を別の水溶液で希釈するための流路構造体であって、上流側にＤ１導入路及びＤｎ（例えば、ｎ＝２〜７）導入路を有し、Ｄｎ導入路はすべての導入路が地点ｐにおいてＤ１導入路を挟み込むように配置され、地点ｐから下流側には希釈流路を有する希釈用流路構造体を有する、希釈用流路構造体。
［２１］
粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体を有する粒子製造用流路構造体であって、
粒子調製用流路構造体は、上流側に少なくとも２以上からなるＳｑ導入路を有し、各導入路の合流部から下流側に粒子調製流路を有し、
希釈用流路構造体は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有し、
調製流路の出口とＤ１導入路が直結する、粒子製造用流路構造体。
［２２］
Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路からなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、［１９］〜［２１］のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
［２３］
Ｄｎ導入路は複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、［１９］〜［２２］のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
［２４］
Ｄ１導入路が２以上に分岐しており、かつ各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されている、［１９］〜［２３］のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
［２５］
希釈流路は途中で２以上に分岐しており、かつ各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されている、［１９］〜［２４］のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
本発明によれば、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子を、その粒子径を極力維持し得る粒子含有水溶液の製造方法及びそれに用いるデバイスを提供することができる。
図１は、本願発明で用いる希釈用流路構造体（ミキサーあり）の一態様の模式図である。 図２は、本願発明で用いる希釈用流路構造体（ミキサーあり）の一態様の模式図である。 図３は、（Ａ）本願発明で用いる粒子調製用流路構造体の一態様の模式図であり、（Ｂ）希釈用流路構造体（ミキサーあり）の一態様の模式図である。 図４は、本願発明で用いる希釈用流路構造体（ミキサーなし）の一態様の模式図である。 図５は、流路構造体に設けるミキサーの具体例の模式図である。 図６は、流路構造体の合流部の具体例の模式図である。 図７は、本願発明で用いる粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体を直結したデバイスの一態様の模式図である。 図８は、Ａ〜Ｄは何れも本願発明で用いる希釈用流路構造体の一態様の模式図である。 図９は、実施例１、比較例１及び２の結果を示す。 図１０は、実施例２、比較例３及び４の結果を示す。 図１１は、実施例３、比較例５及び６の結果を示す。 図１２は、実施例４の結果を示す。 図１３は、実施例４の結果を示す。 図１４は、実施例５の結果を示す。 図１５は、実施例６の結果を示す。
＜脂質粒子含有水溶液の製造方法＞
本発明の第一の態様は、粒子含有水溶液の製造方法である。
この製造方法は、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Ｃを得ることを含む方法であって、
前記希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する希釈用流路構造体を用い、
Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤ２導入路に水溶液Ｂ１をそれぞれ供給し、かつＤｎ導入路から水溶液Ｂｎ（例えば、ｎ＝２〜６）を希釈流路中の水溶液に追加して、希釈流路の出口から、粒子Ｚが安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む。
＜水溶液Ａ＞
自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａは、本発明の製造方法における原料である。水溶液Ａは、自己組織化分子、水混和性有機溶媒及び任意の水溶液を用いて、任意の方法で調製される物であり、例えば、特許文献１に記載の方法で調製された自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚ含有水溶液であることができる。例えば、特許文献１に記載の流路構造体を用い、自己組織化分子含有水混和性有機溶媒溶液と任意の水溶液である希釈溶媒を導入することで調製することができる。あるいは、流路構造体を用いずに、任意の水溶液である希釈溶媒を必要により攪拌しつつ自己組織化分子含有水混和性有機溶媒を添加（例えば、滴下）することで調製することもできる。自己組織化分子含有水混和性有機溶媒を任意の水溶液である希釈溶媒を導入又は滴下することで、自己組織化分子は粒子を形成し、水混和性有機溶媒は任意の水溶液である希釈溶媒と混和して、水混和性有機溶媒水溶液を形成し、自己組織化分子粒子は水混和性有機溶媒水溶液中に分散する。本発明においては、水溶液Ａは水混和性有機溶媒濃度が20vol%以上であり、好ましくは例えば、20〜60 vol%の範囲である。水溶液Ａの水混和性有機溶媒濃度は、高ければ高いほど自己組織化分子粒子の安定性は低くなり、本発明の方法での希釈による粒子安定化効果は大きく好ましい。水溶液Ａに含まれる粒子Ｚの粒子径は、水溶液Ｃ中の粒子Ｚの個数平均の粒子径を200nm以下とする観点から、好ましくは、180nm以下、160 nm以下、140 nm以下、120 nm以下、100 nm以下である。
本発明の製造方法において用いられる水溶液Ａの原料である自己組織化分子溶液および希釈媒体の組成、およびこれらによる希釈比率については、特に限定されるものではない。自己組織化分子がＡ）脂質、Ｂ）両親媒性物質のいずれか一方、又はＡ）とＢ）の両方からなる粒子Ｚの形成方法は、原理的には、自己組織化分子を水混和性有機溶媒に溶解した溶液を、必要に応じて加温条件下で、水溶液（希釈媒体）に添加希釈することで行われ、このような手法において従来公知の組成等を用いることができるものである。自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚは、単層又は多層リポソーム、脂質ミセル、ポリマーミセル、単層又は多層リポソームとポリマーミセルの複合体（例えばリポソーム粒子をコアに持つポリマーミセルが例示されるがこれに限定されない）、および脂質ミセルとポリマーミセルの合一体（例えば脂質ミセル粒子をコアに持つポリマーミセルが例示されるがこれに限定されない）であることができる。
自己組織化分子の一例である脂質としては、特に限定されるわけではないが、例えば、大豆レシチン、水添大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファスフィンゴミエリン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、ステロール類等の天然由来脂質のほか、核酸送達用リポソームの構成成分として適するとされるカチオン性の非天然由来脂質であるＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）、トランスフェクタム（登録商標）、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ−Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ−Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）および２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、などを用いることができる。
自己組織化分子の他の一例である両親媒性物質としては、特に限定されるわけではないが、両親媒性高分子化合物、例えばポリスチレン−ポリエチレンオキシドブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、ポリ乳酸ポリエチレングリコール共重合体、ポリカプロラクトン−ポリエチレングリコール共重合体等のような両親媒性ブロック共重合体などが例示できる。
上記したような自己組織化分子を溶解してナノ粒子溶液を調製するのに用いられる水混和性有機溶媒としては、特に限定されるわけではないが、例えば、アルコール類、エーテル類、エステル類、ケトン類、アセタール類などの水に混合可能な有機溶媒、特にエタノール、t-ブタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、及び2-ブトキシエタノール等のアルコール類、特に炭素数１〜６のアルカノールを用いることが好ましい。また、両親媒性物質溶液を調製するのに用いられる水混和性有機溶媒としても同様のものが用いられ得るが、好ましい例としてはテトラヒドロフランなどのエーテル類、クロロホルム等が挙げられる。
希釈媒体としては、水、または基本的に水を主成分とする、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、クエン酸緩衝液等水溶液が、形成しようとする粒子の用途等に応じて適宜使用される。
水溶液Ａに含まれる粒子Ｚは、内封物をさらに含有することができる。得られる粒子の用途等に応じては、公知のように、粒子中に、生理活性物質等を配合することが可能である。内封物は特に限定されるものではないが、例えば、金属イオン、低分子又は中分子有機化合物、有機金属錯体、核酸、ペプチド、タンパク質、糖鎖などの生体高分子、金属粒子などの物質が挙げられ、また用途別の観点では抗癌剤、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、ビタミン剤、人工血液（ヘモグロビン）、ワクチン、発毛剤、保湿剤、色素類、美白剤、顔料などといった薬剤、生理活性物質、化粧料等を例示できる。これらの内封物は、水溶性のものであれば、形成される粒子の水相中に包含させることができる。また、油溶性のものであれば粒子の脂質膜中など親油相中に取り込ませることができる。また、粒子表面との間で静電相互作用など何らかの相互作用を持つものであれば粒子表面に取り込ませることができる。さらに、内封物は、例えば、本発明により形成される粒子内に、薬剤（例えば、医薬品、検査薬）、生理活性物質、化粧料等を水相中に分散した不溶性粒子（コア粒子）の形態で、取り込ませることができる。
＜水溶液Ｂ１、Ｂｎ＞
水溶液Ｂ１及び水溶液Ｂｎは、水溶液Ａの水混和性有機溶媒濃度を低下させるために用いる希釈溶媒であり、最初に用いられる希釈溶媒が水溶液Ｂ１であり、ｎ番目に用いられる希釈溶媒が水溶液Ｂｎである。水溶液Ｂ１及び水溶液Ｂｎは、好ましくは水混和性有機溶媒を含まない任意の水溶液である。水溶液としては、任意の緩衝液であることができる。緩衝液は、粒子あるいは粒子に内包される内封物またはコア粒子の種類などによって適宜選択できる。
＜希釈用流路構造体＞
本発明の製造方法における水溶液Ａの希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する希釈用流路構造体を用いて実施される。
希釈用流路構造体の例を図１に示す。図１は、Ｄｎ導入路はＤ３導入路１つだけが設けられている例である。左側（上流）側から、Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤ２導入路に水溶液Ｂ１をそれぞれ供給し、水溶液Ａ及び水溶液Ｂ１は合流部１で合流して、上流側の希釈流路ＤＦ１にて水溶液Ａ及び水溶液Ｂ１の混合が進み、水溶液Ａは希釈される。次にＤｎ導入路であるＤ３導入路から水溶液Ｂ２が希釈流路中の水溶液に追加され、合流部２で希釈流路ＤＦ１からの水溶液に水溶液Ｂ２が合流して、希釈流路ＤＦ２でさらに混合が進み、希釈が進む。希釈流路ＤＦ２の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得る。
本願発明で用いる希釈用流路構造体は、上流側にＤ１導入路及びＤｎ（例えば、ｎ＝２〜７）導入路を有し、Ｄｎ導入路はすべての導入路が地点ｐにおいてＤ１導入路を挟み込むように配置され、地点ｐから下流側には希釈流路を有する希釈用流路構造体であることができる。この希釈用流路構造体は、例えば、図４に示すように、Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路ｍ（ｍは例えば、１〜５、図４ではｍは１と２であり、Ｄ２導入路１とＤ２導入路２）からなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されていることができる。このような構造とすることにより、Ｄ１導入路から流れてくる水溶液と希釈流路から流れてくる希釈液の界面を増やすことができ、希釈速度を早くすることができる。さらに、図４に示す例では、Ｄ１導入路の流路幅が200μmであるのに対してＤ２導入路１とＤ２導入路２の流路幅は500μｍ、合流後の希釈流路の流路幅は1mmである。このような構造とすることにより、大量の希釈液を流すことができ、希釈倍率を上げることができる。図４に示す希釈用流路構造体において、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の地点ｐでの合流後に、Ｄ３導入路が合流した例を図８Ａに示す。
本願発明で用いる希釈用流路構造体は、Ｄｎ導入路が複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍ（ｍは例えば、１〜５）が希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されていることができる。図３のＢに示す例では、Ｄ５導入路１とＤ５導入路２が希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている。このような構造とすることにより、Ｄｎ（図３ではＤ５）導入路から流れてくる希釈液と希釈流路から流れてくる水溶液の界面を増やすことができ、希釈速度を早くすることができる。また、図８Ｂに示す例は、図４の態様の希釈用流路構造体であるが、Ｄ３導入路１とＤ３導入路２が希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている。
本願発明で用いる希釈用流路構造体は、希釈流路は途中で２以上に分岐している場合があり、この場合においては、各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されていることもできる。図２に示す例では、希釈流路はＤ３導入路の下流で２つに分岐し、かつ分枝した希釈流路のそれぞれに分岐したＤ４導入路が配置されている。このような構造とすることにより、大量の希釈液を流すことができ、希釈倍率を上げることができる。図８Ｄに示す例では、希釈流路は下流で２つに分岐し、かつ分枝した希釈流路のそれぞれの希釈流路にＤ３導入路が配置されている。
本願発明で用いる希釈用流路構造体は、Ｄ１導入路が２以上に分岐している場合があり、この場合においては、各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されていることもできる。さらに図８Ｃに示す例のように、Ｄ１導入路が２以上に分岐しており、かつ各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されていることもできる。
＜水溶液Ｃ＞
水溶液Ｃは、水溶液Ａを希釈することにより得られる水溶液であり、希釈用流路構造体における希釈は、水混和性有機溶媒を水溶液中の粒子Ｚが安定に存在し得る濃度以下にすることで行われる。水溶液中の粒子が安定に存在し得る水混和性有機溶媒濃度は、粒子を構成する成分、粒子の粒子径、水溶液Ｃにおける粒子の濃度、温度などにより変化するが、水溶液Ｃの水混和性有機溶媒濃度が3vol%以下、好ましくは2vol%以下、より好ましくは1.5vol%以下、さらに好ましくは1vol%以下の範囲になるように実施される。
水溶液Ａに含有される粒子は、その粒子が形成された直後は、水溶液中に個々の粒子が孤立した状態で分散状態を呈している。しかし、水溶液Ａは粒子の構成成分である自己組織化分子と混ざりやすい水混和性有機溶媒を含有し、かつその濃度が20vol%以上と高いために、そのまま放置しておくと、経時的に粒子の不安定化が起こりひいては粒子同士の融合や粒子の分裂が発生して、結果、粒子同士が融合する場合は粒子径が増大し、単位体積当たりの粒子数は減少する。これまで、粒子を含有する水溶液Ａは、さらに水混和性有機溶媒濃度を低下するために希釈され、あるいは水混和性有機溶媒を除去するための透析に付されたりしていた。例えば、特許文献２に記載の方法では、流通系で調製された水溶液Ａに相当する粒子含有水混和性有機溶媒溶液は、特許文献２の図３Ａに記載されているように、調製後に希釈溶液のバッチ３６０に添加して希釈され、あるいは図３Ｂに記載されているように、調製後の水溶液Ａに相当する粒子含有水混和性有機溶媒溶液に流通系でさらに同量（流速）の希釈液を３４０で合流させた後に、希釈溶液のバッチ３５０に添加して希釈されていた。しかし、特許文献２に記載の方法では、希釈後の粒子含有水混和性有機溶媒溶液の水混和性有機溶媒濃度は１０〜４０ｖｏｌ％であり、粒子同士の融合を抑制するには高すぎる。また、希釈後の溶液中の水混和性有機溶媒濃度が均一にこの濃度になるにはある程度の時間が必要であり、局所的に水混和性有機溶媒濃度が高い箇所がある場合、そこでの粒子同士の融合抑制は限定的である。
それに対して本発明の製造方法では、希釈流路での希釈後の水溶液Ｃの水混和性有機溶媒濃度は水溶液中の粒子が安定に存在し得る濃度以下の、例えば、3vol%以下とし、さらに、希釈流路での希釈は、１段階の希釈ではなく、２段階以上の多段で、順次行う。当業者の常識に照らせば、一刻も早く水混和性有機溶媒濃度を下げて粒子を安定化させるために、例えば特許文献２にあるように、過剰量の希釈液を用いて１段階で希釈を行うことが当然と考えられていたが、実際には本発明にあるように、２段階以上の多段で、各段において順次少しずつ濃度を下げるように希釈を行うことで、１段階で同率の希釈を行った場合に比べて、希釈中の粒子の融合による粒子径の増大を有効に防止できる。
多段希釈は、希釈流路の入口〜出口の間に設けられた１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）それぞれからの水溶液Ｂｎ（Ｂ２〜Ｂ６）を合流させることにより実施できる。水溶液Ｂｎは水溶液Ｂ１と同一組成の水溶液であっても異なる組成の水溶液であってもよい。多段の数は、多くなりすぎても、希釈中の粒子の融合による粒子径の増大防止に大差はなくなるので、ｎ＝３〜６の範囲、好ましくはｎ＝３〜５の範囲、より好ましくはｎ＝３〜４の範囲であることができる。例えば、ｎ＝６の場合には、希釈流路の途中に設けられる導入路は、Ｄ３〜Ｄ６導入路となリ、Ｄ２導入路との合計で５段である。４段の場合には、希釈流路の途中に設けられる導入路は、Ｄ３〜Ｄ５導入路となる。図２に３段の場合の例を示す。Ｄ２〜Ｄ４導入路が設けられている。
１段目のＤ２導入路と合流後の水溶液中の水混和性有機溶媒濃度、２段目以降のＤ３導入路以降からの水溶液の合流後の水溶液中の水混和性有機溶媒濃度は、特に制限はなく、最終の濃度が水溶液中の粒子が安定に存在し得る濃度以下になるように、希釈の段数も考慮して適宜決定できる。例えば、水溶液Ａの水混和性有機溶媒濃度が25vol% であり、水溶液Ｃの水混和性有機溶媒濃度が1vol%であり、３段階で希釈する場合、例えば、25vol%から10vol%(希釈率2.5倍)から4vol%(希釈率2.5倍)から1vol%(希釈率4倍)であることができる。
希釈流路中での水溶液の滞留時間は短いほど、即ち、流速は早いほど、迅速に希釈が行われ、水溶液中の粒子が安定に存在し得る濃度以下を有する水溶液Ｃをより迅速に得られ、得られる水溶液中の粒子の粒子径は小さくなる傾向がある。本発明においては、希釈流路における水溶液の滞留時間は、例えば、1000ミリ秒以下の範囲であることが、上記観点から好ましい。希釈流路における水溶液の滞留時間は、各導入路の容積及希釈流路の容積、さらには、各導入路から導入される水溶液の単位当たりの液量により変化するが、例えば、1000ミリ秒以下、好ましくは800ミリ秒以下、より好ましくは700ミリ秒以下とすることができる。
本発明に用いる希釈用流路構造体においては、Ｄ１導入路、Ｄ２導入路、希釈用流路及びＤｎ導入路は、流路の深さ方向（図１における紙厚方向）のサイズとしては、特に限定されるものではないが、例えば１０〜１０００μｍ程度、より好ましくは５０〜２００μｍ程度とし、かつ流路幅は、５０〜４００μｍ程度、より好ましくは５０〜２００μｍ程度に設定される。但し、これらはあくまでも例示であり、限定する意図ではない。
Ｄ１導入路、Ｄ２導入路、希釈用流路及びＤｎ導入路における各溶液の流速は、水溶液Ａの粒子含有量及び水混和性有機溶媒濃度、目的とする水溶液Ｃの水混和性有機溶媒濃度及び希釈流路における水溶液の滞留時間等を考慮して適宜決定できる。
水溶液Ａ中の粒子の濃度は特に制限はないが、例えば、20mg/mL以下の範囲であることができ、好ましくは1〜15mg/mLの範囲であることができる。
水溶液Ｃ中の粒子の濃度も特に制限はないが、例えば、5mg/mL以下の範囲であることができ、好ましくは0.1〜4mg/mLの範囲であることができる。
水溶液Ｃ中の粒子の個数平均の粒子径は200nm以下であるが、好ましくは180nm以下、160nm以下、140nm以下、120nm以下、100nm以下であることができる。水溶液Ｃ中の粒子の個数平均の粒子径の下限は特にないが、例えば、10nmであり、あるいは20nmであることができる。
本発明に用いる希釈用流路構造体においては、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部及び合流後の希釈流路の構造、さらに、Ｄｎ導入路以降の各希釈流路は、水溶液Ａの水溶液Ｂ１及びＢｎによる希釈が、より均一かつ迅速に実施できる構造であることが好ましい。そのため希釈流路は、特許文献１に記載の少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有するマイクロミキサーであることができる。二次元的に屈曲した流路部位を有することで、流入する水溶液Ａ及び水溶液Ｂ１とは、希釈流路中において流れに伴って混合される。その例を図１に示す。図１においては、希釈流路ＤＦ１及びＤＦ２においてそれぞれ２０個のバッフルを有し、バッフルによって二次元的に屈曲した流路部位が形成される。但し、各希釈流路に設けられるバッフルの数は適宜決定でき、図１はあくまでも例示である。さらに、三次元的に屈曲又は凹凸を配した流路部位の例を図５に示す。図５中の矢印は、各導入路である。
希釈流路は二次元的に屈曲又は三次元的に屈曲若しくは凹凸を配した流路部位を有することなく、直管状または滑らかな曲管状であることもできる。希釈流路の形状が、直管状または滑らかな曲管状であっても、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部１においては、水溶液Ａ及び水溶液Ｂ１の流速の違いなどにより、合流部１においては、混合状態が生じる。また水溶液Ａと水溶液Ｂ１が合流後に生じる液-液界面においても分子拡散等により混合が生じる。同様に、希釈流路ＤＦ１とＤ３導入路の合流部２においても希釈流路ＤＦ１からの水溶液と水溶液Ｂ２の流速の違いなどにより、混合状態が生じる。
本発明に用いる希釈用流路構造体におけるＤ１導入路及びＤ２導入路の合流部、及び希釈流路内におけるＤｎとの合流部の構造は、合流する各水溶液の迅速かつ均一な混合を促進する構造であることが好ましい。そのような構造の例を図６に示す。図６に示す合流部前後の構造は、各合流部に適宜適用できる。
希釈流路の出口から排出された水溶液Ｃは、さらに透析に付され水混和性有機溶媒を除去することができる。
水溶液Ａは、自己組織化分子含有水混和性有機溶媒と粒子調製用水溶液を混合して粒子含有水混和性有機溶媒水溶液を調製するための粒子調製用流路構造体を用いて調製することができる。さらに、粒子調製用流路構造体を用いた調製直後に、本発明の希釈用流路構造体のＤ１導入路に供給されることが好ましい。例えば、図２に示すような、粒子調製用流路構造体を用いて粒子含有水混和性有機溶媒水溶液Ａを調製し、調製後引き続き、本発明の希釈用流路構造体のＤ１導入路に供給されることが、粒子同士の融合等の時間を与えることなく、即座に本発明の方法で希釈でき、所望の粒子径を有する粒子含有溶液を得ることができることから好ましい。
＜粒子製造用流路構造体＞
本発明の別の態様は、希釈用流路構造体並びに粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体を有する粒子製造用流路構造体である。粒子製造用流路構造体は、本発明の製造方法で説明したものと基本的に同様であり、上記説明も参照できる。
本願発明の希釈用流路構造体は、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有しかつ水混和性有機溶媒を含む水溶液を別の水溶液で希釈するための流路構造体であって、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する、希釈用流路構造体である。
本願発明の粒子製造用流路構造体は、上流側に少なくとも２以上からなるＳｑ導入路（例えば、ｑ＝１〜５）を有し、各導入路の合流部から下流側に粒子調製流路を有し、希釈用流路構造体は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有し、調製流路の出口とＤ１導入路が直結する。
２のＳｑ導入路を有する粒子調製用流路構造体の一例は、上流側にＳ１導入路及びＳ２導入路を有し、Ｓ１導入路及びＳ２導入路の合流部から下流側に粒子形成流路を有する物であることができる。この例は、図３のＡに示す。希釈用流路構造体は、前述のような上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する。Ｄ２導入路〜Ｄ６導入路を有する希釈用流路構造体の例を図３のＢに示す。そして、粒子調製用流路構造体の粒子形成流路の出口とＤ１導入路が直結する。粒子形成流路の出口とＤ１導入路が直結することで、粒子調製用流路構造体で調製された水溶液Ａは合成後、速やかに希釈用流路構造体に導入され、水混和性有機溶媒濃度が段階的に希釈されて、極めて速やかに、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることができる。粒子調製用流路構造体の粒子形成流路の出口とＤ１導入路が直結した粒子製造用流路構造体の一態様は、図７に示す。
本発明の希釈用流路構造体及び粒子製造用流路構造体を構成する希釈用流路構造体は、図４に示すように、Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路ｍ（ｍは例えば、１〜５、図４ではｍは１と２であり、Ｄ２導入路１とＤ２導入路２）からなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されていることができる。このような構造とすることにより、Ｄ１導入路から流れてくる水溶液と希釈流路から流れてくる希釈液の界面を増やすことができ、希釈速度を早くすることができる。図４に示す例では、Ｄ１導入路の流路幅が200μmであるのに対してＤ２導入路１とＤ２導入路２の流路幅は500μｍ、合流後の希釈流路の流路幅は1mmである。このような構造とすることにより、大量の希釈液を流すことができ、希釈倍率を上げることができる。
本発明の希釈用流路構造体及び粒子製造用流路構造体を構成する希釈用流路構造体は、Ｄｎ導入路は複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍ（ｍは例えば、１〜５）が希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されていることができる。図３のＢに示す例では、Ｄ５導入路１とＤ５導入路２が希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている。このような構造とすることにより、Ｄｎ導入路から流れてくる希釈液と希釈流路から流れてくる希釈液の界面を増やすことができ、希釈速度を早くすることができる。
本願発明で用いる希釈用流路構造体及び粒子製造用流路構造体を構成する希釈用流路構造体は、希釈流路は途中で２以上に分岐しており、かつ各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されていることもできる。図２に示す例では、希釈流路はＤ３導入路の下流で２つに分岐し、かつ分岐した希釈流路のそれぞれに分岐したＤ４導入路が配置されている。
本願発明で用いる希釈用流路構造体及び粒子製造用流路構造体を構成する希釈用流路構造体は、Ｄ１導入路が２以上に分岐している場合があり、この場合においては、各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されていることもできる。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例１
下記の粒子作製条件により調製した脂質粒子含有水溶液Ａを図２に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体を用いて、３段階の多段希釈により25→5→2.5→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。調製後に水溶液Ｃ中の粒子の粒度分布をゼータサイザーナノZS（マルバーン社）を用いて測定した。結果を図９に示す。
粒子作製条件：10 mg/mL POPC + 生理食塩水
iLiNPデバイス, 50μL/min FRR3
比較例１
実施例１と同様の粒子作製条件で調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製用流路構造体に１段の希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体（図７参照）を用いて、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液を調製した。調製後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図９に示す。
比較例２
実施例１と同様の粒子作製条件で、実施例１と同様の粒子調製用流路構造体（希釈用流路構造体なし）を用いて調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製後に、透析、ピペッティングによる希釈（１段または３段）を行い、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液をそれぞれ調製した。調製後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図９に示す。
個数平均±10%内の粒子割合は、実施例１の3段階希釈が30%であったのに対して、比較例１の1段階希釈では20%と低かった。また、比較例２の透析、ピペッティングによる希釈（１段または３段）で得られた脂質粒子は、平均粒子径自体が実施例１に比べて格段に大きかった。
実施例２
下記の粒子作製条件により調製した脂質粒子含有水溶液Ａを図２に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体を用いて、３段階の多段希釈により25→10→4→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。調製後に水溶液Ｃ中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図１０に示す。
粒子作製条件：脂質：YSK05/エタノール
水系：MES buffer
比較例３
実施例２と同様の粒子作製条件で調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製用流路構造体に１段の希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体（図７参照）を用いて、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液を調製した。調製後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図１０に示す。
比較例４
実施例２と同様の粒子作製条件で、実施例２と同様の粒子調製用流路構造体（希釈用流路構造体なし）を用いて調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製後に、ピペッティングによる希釈（１段）を行い、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液をそれぞれ調製した。調製後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図１０に示す。
実施例１においては、個数平均±10%内の粒子割合が比較例１に比べて高かったが、平均粒子径は、比較例１の方が小さかった。それに対して、実施例２（３段階希釈）においては、比較例２（１段階希釈）に比べて、個数平均±10%内の粒子割合は高く、かつ平均粒子径は小さかった。この結果は、希釈の段階を25→10→4→1%としたことで、最適な希釈速度（エタノール%/s）が得られ、それにより、粒径のより精密な制御が可能になった。
実施例３
下記の粒子作製条件により調製した脂質粒子含有水溶液Ａを図４に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（但し、バッフルなし）を直結した粒子製造用流路構造体を用いて、以下の操作により３段階の多段希釈により25→10→4→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。調製後に下記後処理方法に付した後に水溶液Ｃ中の粒子の粒度分布を 実施例１と同様に測定した。結果を図１１に示す。
(1)図4のミキサーなし集積化デバイスの緩衝液、または核酸/緩衝液送液口から、核酸/緩衝液を導入し、脂質送液口からYSK05/エタノールを導入した。また、D2導入路1、2からMES緩衝液を導入した。
粒子作製：50μL/min (FRR3) D1導入路で地点pより上流部においては、粒子が生成し、粒子懸濁液中のエタノール濃度は25%となっている。D2導入路1、2から以下の流量で流入するMES緩衝液によって粒子懸濁液中のエタノールは10%まで希釈される。希釈溶液1：75μL/min（D2導入路1、2から導入）→回収（10% EtOH）
(2)ミキサーなし集積化デバイスの核酸・脂質溶液入口の両方から先ほど希釈した粒子懸濁液を導入した。D2導入路1、2からMES緩衝液（希釈溶液2）を下記の条件で導入した。
粒子懸濁液：125μL/min , 希釈溶液2：187.5μL/min→回収（4% EtOH）
(3)ミキサーなし集積化デバイスの核酸・脂質溶液入口の両方から先ほど希釈した粒子懸濁液を導入した。D2導入路1、2からMES緩衝液（希釈溶液2）を下記の条件で導入した。
粒子懸濁液：312.5μL/min , 希釈溶液2：937.5μL/min→回収（1% EtOH）
後処理方法（MES緩衝液で希釈直後）
2. PBS（pH 7.4）で透析（overnight, 4℃） ・・・PBSへの置換
比較例５
下記粒子作製条件で調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製用流路構造体に１段の希釈用流路構造体（バッフルなし）を直結した粒子製造用流路構造体（図４参照）を用いて、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液を調製した。調製後に実施例３と同様の後処理方法に付した後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図１１に示す。
粒子作製：50μL/min (FRR3), 希釈溶液：1200μL/min
比較例６
実施例３と同様の粒子作製条件で、実施例３と同様の粒子調製用流路構造体（希釈用流路構造体なし）を用いて調製した脂質粒子含有水溶液Ａを、粒子調製後に、ピペッティングによる希釈（１段）を行い、脂質粒子含有水溶液の希釈溶液をそれぞれ調製した。調製後に実施例３と同様の後処理方法に付した後に水溶液中の粒子の粒度分布を実施例１と同様に測定した。結果を図１１に示す。
図１１に示す結果から、実施例３の多段階希釈で調製した水溶液中の脂質粒子は、MES置換後及びPBS置換後の粒径の変化が最も少なかった。
実施例４
pH応答性カチオン性脂質（YSK05）、コレステロール、PEG脂質、siRNAで構成されている脂質ナノ粒子を図２に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体を用いて、３段階の多段希釈により25→10→4→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。水溶液を用いてマウスを用いた粒子の性能評価を行った、その結果を図１２及び１３に示す。標的遺伝子をノックダウンすることに成功し、粒径によって送達効率が異なることを確認した。
実施例５
下記の粒子作製条件により調製した脂質粒子含有水溶液Ａを図１に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体(iLiNPデバイス)を用いて、２段階の多段希釈により25→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。調製後に水溶液Ｃ中の粒子の粒度分布をゼータサイザーナノZS（マルバーン社）を用いて測定した。結果を図１４に示す（図中のデバイスが本実施例の結果である。）。比較のため希釈用流路構造体を用いる代りに透析を行った場合およびピペットで希釈した場合の結果も併記する。
粒子作製条件：
脂質溶液65 mM POPC/エタノール
水系溶液 生理食塩水(154mM NaCl水溶液)
一次希釈 総流量 100μL/min (FRR3)
二次希釈 総流量 2500μL/min (FRR24)
脂質溶液が高濃度脂質溶液であるために従来の後処理（透析およびピペット）では粒径が不均一になった（個数平均とZ平均の差が大きい）。それに対して本実施例（デバイス）における、粒子製造および希釈の連続処理によって、粒子の均一性が改善され、かつばらつき（標準偏差）も改善された。
実施例６
下記の粒子作製条件により調製した脂質粒子含有水溶液Ａを図１に示す粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体（２０バッフル）を直結した粒子製造用流路構造体(iLiNPデバイス)を用いて、２段階の多段希釈により25→1%の順で希釈して水溶液Ｃを調製した。調製後に水溶液Ｃ中の粒子の粒度分布をゼータサイザーナノZS（マルバーン社）を用いて測定した。結果を図１５に示す。（図中のデバイスが本実施例の結果である。）。比較のため希釈用流路構造体を用いる代りに透析を行った場合およびピペットで希釈した場合の結果も併記する。
粒子作製条件：
脂質溶液15 mM DPPC/コレステロール/DSPE-PEG2K/エタノール(67/33/5 mol%)
水系溶液 PBS
一次希釈 総流量 100μL/min (FRR3)
二次希釈 総流量 2500μL/min (FRR24)
本実施例（デバイス）では、ばらつき（標準偏差）が改善された。さらに、本実施例（デバイス）では、 個数平均・Z平均粒径ともに100 nm以下の粒子を作製可能であった。
本発明は、自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子を、粒子径を制御しながら調製する技術に関する分野において有用である。

Claims (25)

  1. 自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Cを得ることを含む方法であって、
    前記希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する希釈用流路構造体を用い、
    Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤ２導入路に水溶液Ｂ１をそれぞれ供給し、かつＤｎ導入路から水溶液Ｂｎ（例えば、ｎ＝２〜６）を希釈流路中の水溶液に追加して、希釈流路の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む、粒子含有水溶液の製造方法。
  2. 自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有し、かつ水混和性有機溶媒を20vol%以上の濃度で含む水溶液Ａを水溶液Ｂ１で希釈して、個数平均の粒子径が200nm以下の粒子Ｚを含有する水溶液Cを得ることを含む方法であって、
    前記希釈は、上流側にＤ１導入路及びＤｎ（例えば、ｎ＝２〜７）導入路を有し、Ｄｎ導入路はすべての導入路が地点ｐにおいてＤ１導入路を挟み込むように配置され、地点ｐから下流側には希釈流路を有する希釈用流路構造体を用い、
    Ｄ１導入路に水溶液Ａ及びＤｎ導入路に水溶液Ｂｎ（例えば、ｎ＝１〜６）をそれぞれ供給し、希釈流路の出口から、粒子が安定に存在し得る濃度以下に水混和性有機溶媒濃度を希釈した水溶液Ｃを得ることを含む、粒子含有水溶液の製造方法。
  3. 自己組織分子がＡ）脂質、Ｂ）両親媒性物質のいずれか一方、又はＡ）とＢ）の両方からなる、請求項１または２記載の製造方法。
  4. 水混和性有機溶媒がアルカノールである、請求項１〜３のいずれか記載の製造方法。
  5. 粒子Ｚがリポソーム、脂質ミセル、またはポリマーミセルである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
  6. Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路ｍからなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
  7. Ｄｎ導入路は複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、請求項１〜６のいずれかに記載ｘの製造方法。
  8. Ｄ１導入路が２以上に分岐しており、かつ各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されている、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
  9. 希釈流路は途中で２以上に分岐しており、かつ各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されている、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
  10. 希釈流路における水溶液の滞留時間は1000ミリ秒以下である、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
  11. 水溶液Ｃに含まれる水混和性有機溶媒濃度が3vol%以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
  12. 水溶液Ａは、自己組織化分子を含有する水混和性有機溶媒と粒子調製用水溶液を混合して粒子含有水溶液を調製するための粒子調製用流路構造体を用いて調製され、調製直後に、希釈用流路構造体のＤ１導入路に供給される、請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
  13. 粒子調製用流路構造体は、上流側に少なくとも２以上からなるＳｑ導入路を有し、各導入路の合流部から下流側に粒子調製流路を有し、粒子調製流路の出口から水溶液Ａを排出し、排出した水溶液ＡはＤ１導入路に供給される請求項１２に記載の製造方法。
  14. 粒子調製流路及び希釈流路は、それぞれ又は一方の流路内にマイクロミキサーを有する、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 水溶液Ｃ中の脂質粒子の個数平均の粒子径は100nm以下または60nm以下である、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
  16. 水溶液Ａ中の脂質粒子の濃度は20mg/mL以下であり、水溶液Ｃ中の脂質粒子の濃度は5mg/mL以下である、請求項１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
  17. 希釈流路の出口から排出された水溶液Ｃは、さらに透析に付され水混和性有機溶媒を除去した水溶液を得る請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法。
  18. 粒子Ｚに内封物が含まれる、請求項１〜１７のいずれかに記載の製造方法。
  19. 自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有しかつ水混和性有機溶媒を含む水溶液を別の水溶液で希釈するための流路構造体であって、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有する、希釈用流路構造体。
  20. 自己組織化分子を粒子構成成分として含む粒子Ｚを含有しかつ水混和性有機溶媒を含む水溶液を別の水溶液で希釈するための流路構造体であって、上流側にＤ１導入路及びＤｎ（例えば、ｎ＝２〜７）導入路を有し、Ｄｎ導入路はすべての導入路が地点ｐにおいてＤ１導入路を挟み込むように配置され、地点ｐから下流側には希釈流路を有する希釈用流路構造体を有する、希釈用流路構造体。
  21. 粒子調製用流路構造体及び希釈用流路構造体を有する粒子製造用流路構造体であって、
    粒子調製用流路構造体は、上流側に少なくとも２以上からなるＳｑ導入路を有し、各導入路の合流部から下流側に粒子調製流路を有し、
    希釈用流路構造体は、上流側にＤ１導入路及びＤ２導入路を有し、Ｄ１導入路及びＤ２導入路の合流部から下流側に希釈流路を有し、かつ希釈流路の途中に１つ以上のＤｎ導入路（例えば、ｎ＝３〜７）を有し、
    調製流路の出口とＤ１導入路が直結する、粒子製造用流路構造体。
  22. Ｄ２導入路は複数のＤ２導入路からなり、当該複数のＤ２導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、請求項１９〜２１のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
  23. Ｄｎ導入路は複数のＤｎ導入路ｍからなり、当該複数のＤｎ導入路ｍが希釈流路の同一地点ｐにおいて希釈流路を挟み込むように配置されている、請求項１９〜２２のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
  24. Ｄ１導入路が２以上に分岐しており、かつ各分岐したＤ１流路に対してＤ２導入路が配置されている、請求項１９〜２３のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
  25. 希釈流路は途中で２以上に分岐しており、かつ各分岐した希釈流路に対してＤｎ導入路が配置されている、請求項１９〜２４のいずれかに記載の希釈流路構造体または粒子製造用流路構造体。
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