JPWO2020073016A5

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Publication number: JPWO2020073016A5
Application number: JP2021518514A
Authority: JP
Publication date: 2022-10-13

Description

本開示は、感染症の検出、感染性微生物病原体の同定、および感染症のための有効な抗微生物処置の決定に関する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成金番号Ｒ４３ＡＩ０８００１６、Ｒ０１ＡＩ１１７０５８、およびＲ４４ＡＩ０８００１６と、アメリカ生物医学先端研究開発局により与えられた契約番号ＨＨＳＯ１００２０１５０００２２Ｃとの政府の支援により為された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の様々な修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書において引用された科学文献および特許文献への参照を含む、この文書の全内容から当業者に対して明らかとなるであろう。本明細書における主題は、本発明の様々な実施形態およびその均等物において、本発明の実践のために採用され得る重要な情報、例証およびガイダンスを含有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
抗微生物薬感受性試験のための方法であって、
多微生物検体を得るステップ；
前記検体をウェル中に分割するステップであって、少なくとも一部の前記ウェルが、異なる薬剤または異なる濃度の１種もしくは複数の薬剤を含む、ステップ；
前記ウェル中の前記検体をインキュベートして、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に応答した差次的成長を可能にするステップ；および
各ウェル中の特定の種の個々の細胞を計数して、前記特定の種の成長を阻害する薬剤または薬剤の濃度を同定するステップ
を含む、方法。
(項目２)
対照ウェルのインキュベーション後に抗微生物剤を含有しない前記対照ウェル中の細胞を計数するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
各ウェル中で計数された細胞の数を前記対照ウェルからの計数と比較して、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に曝露された場合の微生物の生存率を決定するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記インキュベートするステップが、種特異的な様式で微生物を蛍光標識するステップを含み、前記計数するステップが、各ウェルをイメージングするステップ、およびイメージ中の蛍光スポットを計数するステップを含む、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記標識するステップが、標的特異的なフルオロフォアで標識された核酸または核酸アナログプローブを使用し、前記計数するステップが、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する、項目４に記載の方法。
(項目６)
前記ステップが、核酸増幅を含まない、項目１に記載の方法。
(項目７)
前記インキュベートするステップが、約１時間未満続き、成長培地中で約４０℃より低い温度で行われる、項目１に記載の方法。
(項目８)
前記分割するステップ、インキュベートするステップおよび計数するステップが、前記ウェルを含むカートリッジを使用して行われる、項目１に記載の方法。
(項目９)
前記検体の一部を前記カートリッジ中に移入するステップであって、前記カートリッジが、微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；および
前記カートリッジを分析器にロードするステップであって、前記分析器が、磁石を使用して、前記微生物を前記検体の他の部分から分離し、イメージングサブシステムを使用して、前記計数するステップを行う、ステップ
をさらに含む、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記分析器が、空気式サブシステムを使用して、前記カートリッジ内で前記分割するステップを行い、
前記ウェルが、前記カートリッジ内にあり、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤を予めロードされ、
前記分割するステップおよび前記インキュベートするステップの後、前記分析器が、前記ウェルの内容物を対応する試薬ウェルに移入して、そこでインキュベートされた検体を前記磁気結合性磁気ビーズおよび種特異的な検出可能な標識に曝露させる、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記分析器が、磁石を使用して、前記微生物結合性磁気ビーズおよび結合した個々の微生物を、前記カートリッジ内の検出表面に引き寄せる、項目９に記載の方法。
(項目１２)
前記磁石が、未結合の検出可能な標識を前記検出表面から排除する色素クッションを介して前記微生物結合性磁気ビーズを引き寄せる、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記分析器が、カルーセルおよび／または機械式カートリッジ運搬体を使用して、前記カートリッジをイメージングサブシステムに移動させて、前記計数するステップを行う、項目１１に記載の方法。
(項目１４)
前記種特異的な検出可能な標識が、特定の種の微生物の核酸を標的化するようにハイブリダイズする蛍光核酸プローブを含む、項目１０に記載の方法。
(項目１５)
前記インキュベートするステップおよび計数するステップが、前記分析器内で生理学的温度で実質的に蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を達成する、項目１４に記載の方法。
(項目１６)
前記微生物の成長を阻害する抗微生物剤を同定するステップが、前記インキュベートされた検体中の複合体の数を、インキュベートされていない検体中の複合体の数と比較するステップを含む、項目２３に記載の方法。
(項目１７)
前記分析器が、前記カートリッジを使用して、差次的成長後の前記個々の微生物の種特異的な計数を行う、項目９に記載の方法。
(項目１８)
ウェルが、カートリッジ内にあり、前記方法が、
前記検体の一部を前記カートリッジ中に移入するステップ、および前記カートリッジを前記分析器にロードするステップを含む、項目１に記載の方法。
(項目１９)
前記分析器が、前記カートリッジをマニピュレートして、分割するステップ、インキュベートするステップ、および計数するステップを行う、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
前記検体が、前記移入するステップの前に、ユーザーによる任意の化学試料または分子試料の調製技術を必要としない、項目１８に記載の方法。
(項目２１)
前記移入するステップが、前記検体の一部を収集容器から前記カートリッジ上の試料ウェル中にピペッティングするステップを含む、項目１８に記載の方法。
(項目２２)
前記検体が、全血、陽性血液培養物、血漿、血清、尿、痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、糞便、直腸脳脊髄液、創傷、腹水、膿汁、リンパ、膣分泌物、鼻分泌物、および体組織検体からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
(項目２３)
微生物の分析方法であって、
微生物を含む検体を得るステップ；
任意のコロニーもしくは細胞の精製または培養のステップを伴わずに、前記検体の一部をウェル中に移入するステップであって、前記ウェルが、種特異的な検出可能な標識および微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；
磁石を使用して、イメージング表面上の前記ビーズを収集するステップ；ならびに
前記イメージング表面上の前記検出可能な標識をイメージングして、それにより前記検体の前記一部中の前記種の細胞の存在を決定するステップ
を含む、方法。
(項目２４)
前記検体が、前記移入するステップの前に、ユーザーによる任意の化学試料または分子試料の調製技術を必要としない、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
標的微生物を、前記ウェル中で前記種特異的な検出可能な標識で標識するステップ；および
微生物を、前記微生物結合性磁気ビーズに結合させるステップ
をさらに含み、観察するステップが、未結合の検出可能な標識を洗い流すことなく、標識された磁石結合細胞をイメージングするステップを含む、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
前記標識された磁石結合細胞の個々の細胞を計数するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
前記ウェルが、カートリッジ内に提供され、前記収集するステップおよびイメージングするステップが、前記ビーズおよび前記細胞が前記カートリッジ内にある間に起こる、項目２３に記載の方法。
(項目２８)
前記カートリッジを、前記収集するステップおよびイメージングするステップを行う分析器にロードするステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記分析器が、前記標識された微生物をイメージングするための少なくとも１つのイメージングサブシステムを含む、複数のサブシステム；およびサブシステム間の試験カートリッジを輸送するために動作可能なカルーセルを含む、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記移入するステップが、前記検体を前記カートリッジの受け入れウェル中に移入するステップを含み、前記分析器が、前記検体を前記カートリッジ内の複数の分割ウェルに分割し、前記ウェルが、前記分割ウェルの１つである、項目２８に記載の方法。
(項目３１)
前記種特異的な検出可能な標識が、前記種の前記細胞の核酸と特異的にハイブリダイズする蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、項目２７に記載の方法。
(項目３２)
前記イメージングするステップが、前記カートリッジ内で一定の生理学的温度での蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を含む、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記イメージング表面上の前記ビーズを収集するステップが、色素クッションが未結合の検出可能な標識を前記イメージング表面から排除しながら、前記ウェル中の前記色素クッションを介して前記ビーズを磁気的に引き寄せるステップを含む、項目２７に記載の方法。
(項目３４)
前記種の前記細胞が、移入するステップの約３０分以内に、前記検体中に存在すると決定される、項目２３に記載の方法。

Claims

抗微生物薬感受性試験のための方法であって、
得られた多微生物検体をウェル中に分割するステップであって、少なくとも一部の前記ウェルが、異なる薬剤または異なる濃度の１種もしくは複数の薬剤を含む、ステップ；
前記ウェル中の前記検体をインキュベートして、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に応答した差次的成長を可能にするステップ；および
各ウェル中の特定の種の個々の細胞を計数して、前記特定の種の成長を阻害する薬剤または薬剤の濃度を同定するステップ
を含む、方法。
対照ウェルのインキュベーション後に抗微生物剤を含有しない前記対照ウェル中の細胞を計数するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
各ウェル中で計数された細胞の数を前記対照ウェルからの計数と比較して、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に曝露された場合の微生物の生存率を決定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記インキュベートするステップが、種特異的な様式で微生物を蛍光標識するステップを含み、前記計数するステップが、各ウェルをイメージングするステップ、およびイメージ中の蛍光スポットを計数するステップを含む、請求項１に記載の方法。
前記標識するステップが、標的特異的なフルオロフォアで標識された核酸または核酸アナログプローブを使用し、前記計数するステップが、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する、請求項４に記載の方法。
前記ステップが、核酸増幅を含まない、請求項１に記載の方法。
前記インキュベートするステップが、約１時間未満続き、成長培地中で約４０℃より低い温度で行われる、請求項１に記載の方法。
前記分割するステップ、インキュベートするステップおよび計数するステップが、前記ウェルを含むカートリッジを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
前記検体の一部を前記カートリッジ中に移入するステップであって、前記カートリッジが、微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；および
前記カートリッジを分析器にロードするステップであって、前記分析器が、磁石を使用して、前記微生物を前記検体の他の部分から分離し、イメージングサブシステムを使用して、前記計数するステップを行う、ステップ
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
前記分析器が、空気式サブシステムを使用して、前記カートリッジ内で前記分割するステップを行い、
前記ウェルが、前記カートリッジ内にあり、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤を予めロードされ、
前記分割するステップおよび前記インキュベートするステップの後、前記分析器が、前記ウェルの内容物を対応する試薬ウェルに移入して、そこでインキュベートされた前記検体を前記磁気結合性磁気ビーズおよび種特異的な検出可能な標識に曝露させる、請求項９に記載の方法。
前記分析器が、磁石を使用して、前記微生物結合性磁気ビーズおよび結合した個々の微生物を、前記カートリッジ内の検出表面に引き寄せる、請求項９に記載の方法。
前記磁石が、未結合の検出可能な標識を前記検出表面から排除する色素クッションを介して前記微生物結合性磁気ビーズを引き寄せる、請求項１１に記載の方法。
前記分析器が、カルーセルおよび／または機械式カートリッジ運搬体を使用して、前記カートリッジをイメージングサブシステムに移動させて、前記計数するステップを行う、請求項１１に記載の方法。
前記種特異的な検出可能な標識が、特定の種の微生物の核酸を標的化するようにハイブリダイズする蛍光核酸プローブを含む、請求項１０に記載の方法。
前記インキュベートするステップおよび計数するステップが、前記分析器内で生理学的温度で実質的に蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を達成する、請求項１４に記載の方法。
前記微生物の成長を阻害する抗微生物剤を同定するステップが、前記インキュベートされた検体中の複合体の数を、インキュベートされていない検体中の複合体の数と比較するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
前記分析器が、前記カートリッジを使用して、差次的成長後の前記個々の微生物の種特異的な計数を行う、請求項９に記載の方法。
ウェルが、カートリッジ内にあり、前記方法が、
前記検体の一部を前記カートリッジ中に移入するステップ、および前記カートリッジを前記分析器にロードするステップを含む、請求項１に記載の方法。
前記分析器が、前記カートリッジをマニピュレートして、前記分割するステップ、インキュベートするステップ、および計数するステップを行う、請求項１８に記載の方法。
前記検体が、前記移入するステップの前に、ユーザーによるあらゆる化学試料または分子試料の調製技術を必要としない、請求項１８に記載の方法。
前記移入するステップが、前記検体の一部を収集容器から前記カートリッジ上の試料ウェル中にピペッティングするステップを含む、請求項１８に記載の方法。
前記検体が、全血、陽性血液培養物、血漿、血清、尿、痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、糞便、直腸脳脊髄液、創傷、腹水、膿汁、リンパ、膣分泌物、鼻分泌物、および体組織検体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
微生物の分析方法であって、
あらゆるのコロニーもしくは細胞の精製または培養のステップを伴わずに、微生物を含む得られた検体の一部をウェル中に移入するステップであって、前記ウェルが、種特異的な検出可能な標識および微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；
磁石を使用して、イメージング表面上の前記ビーズを収集するステップ；ならびに
前記イメージング表面上の前記検出可能な標識をイメージングして、それにより前記検体の前記一部中の前記種の細胞の存在を決定するステップ
を含む、方法。
前記検体が、前記移入するステップの前に、ユーザーによるあらゆる化学試料または分子試料の調製技術を必要としない、請求項２３に記載の方法。
標的微生物を、前記ウェル中で前記種特異的な検出可能な標識で標識するステップ；および
微生物を、前記微生物結合性磁気ビーズに結合させるステップ
をさらに含み、前記観察するステップが、未結合の検出可能な標識を洗い流すことなく、標識された磁石結合細胞をイメージングするステップを含む、請求項２３に記載の方法。
前記標識された磁石結合細胞の個々の細胞を計数するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
前記ウェルが、カートリッジ内に提供され、前記収集するステップおよびイメージングするステップが、前記ビーズおよび前記細胞が前記カートリッジ内にある間に起こる、請求項２３に記載の方法。
前記カートリッジを、前記収集するステップおよびイメージングするステップを行う分析器にロードするステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
前記分析器が、前記標識された微生物をイメージングするための少なくとも１つのイメージングサブシステムを含む、複数のサブシステム；およびサブシステム間の試験カートリッジを輸送するために動作可能なカルーセルを含む、請求項２８に記載の方法。
前記移入するステップが、前記検体を前記カートリッジの受け入れウェル中に移入するステップを含み、前記分析器が、前記検体を前記カートリッジ内の複数の分割ウェルに分割し、前記ウェルが、前記分割ウェルの１つである、請求項２８に記載の方法。
前記種特異的な検出可能な標識が、前記種の前記細胞の核酸と特異的にハイブリダイズする蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項２７に記載の方法。
前記イメージングするステップが、前記カートリッジ内で一定の生理学的温度での蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を含む、請求項３１に記載の方法。
前記イメージング表面上の前記ビーズを収集するステップが、色素クッションが未結合の検出可能な標識を前記イメージング表面から排除しながら、前記ウェル中の前記色素クッションを介して前記ビーズを磁気的に引き寄せるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
前記種の前記細胞が、移入するステップの約３０分以内に、前記検体中に存在すると決定される、請求項２３に記載の方法。