JPWO2020072829A5 - - Google Patents
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Description
切断型アダプターおよびインデックス付きＰＣＲプライマーの相対的な機能は、単一のテンプレートから調製されたホールゲノムライブラリーの収率を、限られたＰＣＲサイクルを用いる代替のアダプターストラテジーと比較することによって見積もることができる。この場合、高いホールゲノムライブラリー濃度は、全体的により効率的なプロセスを示唆する、テンプレート分子のより効率的なサンプリングを反映していると推定される。市販のアダプター（ＫＡＰＡ、ＢＩＯＯ）と比べて、切断型アダプターは、上に記載された条件下におけるテンプレートＤＮＡ分子のサンプリングにおいておよそ１．５×～２×より効率的である。ここで観察された値は、＞１０％（ＢＩＯＯアダプター）に対して＞１８％（切断型アダプター）という、テンプレートＤＮＡからライブラリーへの変換効率の改善を示唆する。アダプターの効率を隣り合わせで比較した結果が、図１２に示されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供することであって、ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にすること、および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対の前記プローブ間で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイであって、前記改善された近接伸長アッセイは、
（ａ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；
（ｂ）前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、改善された近接伸長アッセイ。
（項目２）
各タンパク質特異的核酸配列が、アダプター内に含められ、工程（ａ）が、前記アダプターを前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合することを含む、項目１に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目３）
工程（ａ）が、５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、前記キャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程をさらに含む、項目１に記載の改善された近接アッセイ。
（項目４）
前記キャプチャー配列および前記タンパク質識別子バーコードが、前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合された少なくとも１つのアダプター内に含められている、項目３に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目５）
分子バーコードとして供されるために、ランダムな核酸配列を各ｄｓＤＮＡテンプレート分子に組み込む工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、項目１～４のいずれか１項に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目６）
少なくとも１つのタンパク質濃度コントロール組成物を前記ｄｓＤＮＡテンプレート分子と合わせる工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、項目５に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目７）
各タンパク質分析物が、前記生物学的サンプル中に元の濃度で存在し、前記アッセイが、（ｄ）特定のタンパク質分析物を示唆する配列リードを、前記タンパク質濃度コントロール組成物によって生成された配列リードと比較することによって、前記サンプル中の少なくとも１つのタンパク質分析物の元の濃度を決定する工程をさらに含む、項目６に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目８）
複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、項目１～６のいずれかに記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目９）
複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、項目７に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１０）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも３００個の生物学的サンプルを含む、項目９に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１１）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも５００個の生物学的サンプルを含む、項目１０に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１２）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも１０００個の生物学的サンプルを含む、項目１１に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１３）
前記複数の生物学的サンプルが、３８４または１５３６個の生物学的サンプルを含み、前記アッセイが、マイクロプレートの個々のウェルにおける各生物学的サンプルを用いて実施される、項目９に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１４）
ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）それぞれが、特定のタンパク質分析物を標的にし、第１の末端にタンパク質結合ドメイン、反対側の第２の末端に核酸結合ドメインおよびそれらの間に非ハイブリダイズ核酸領域を含む、複数のプローブ対を提供する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１および第２の近接プローブの前記タンパク質結合ドメインは、同じタンパク質分析物上の異なる結合部位に同時に結合することができ、（ｉｉ）前記第１および第２の近接プローブが、両方とも前記タンパク質に結合しており、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分近接しているとき、前記プローブの前記核酸結合ドメインは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして、ｄｓＤＮＡセグメントを形成する、工程；
（ｂ）（ｉ）プローブ対内の各近接プローブの前記タンパク質結合ドメインが対応するタンパク質分析物に結合すること、および（ｉｉ）前記核酸結合ドメインが互いにハイブリダイゼーションして、前記第１の近接プローブを起源とする５’末端および前記第２の近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記生物学的サンプルまたはその一部を前記プローブ対とインキュベートする工程；
（ｃ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記第１の近接プローブの５’末端を前記第２の近接プローブに沿って伸長して、タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列および５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を組み込むｄｓＤＮＡセグメントを前記プローブの間に生成する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、または前記第１のプローブと第２のプローブの両方の前記核酸結合領域が、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコード、または前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み；（ｉｉ）前記ｄＮＴＰ混合物は、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含み；かつ／または（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長後に前記ｄｓＤＮＡセグメントの末端にアダプターがライゲートされ、ここで、少なくとも１つのアダプターが、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコードまたは前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み、それによって、それぞれがキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成される、工程；
（ｄ）キャプチャー配列を含む前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｅ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、方法。
（項目１５）
各タンパク質結合ドメインが、抗原を含み、各結合部位が、エピトープを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記生物学的サンプルが、血液サンプルを含み、工程（ｂ）が、前記血液サンプルの一部に対して実施される、項目１４または項目１５に記載の方法。
（項目１７）
工程（ｂ）が、前記血液サンプルから得られた血漿に対して実施される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記生物学的サンプルから得られた無細胞核酸サンプルに関する情報を取得する工程をさらに含む、項目１～１７のいずれか１つの項目に記載の方法。
（項目１９）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在、同一性または量を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つのＰＴＭが、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、ＳＵＭＯ化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＤＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記情報が、エピジェネティックデータを含む、項目１８に記載の方法。
（項目３１）
前記情報が、ＤＮＡヒドロキシメチル化に関する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記情報が、ＤＮＡメチル化に関する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記情報が、さらにＤＮＡメチル化に関する、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、前記無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒストンコアの周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）末端ハイブリダイズ領域を含むアダプターを前記ｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートし、それによって、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｃ）第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；第２の末端に、末端ハイブリダイズ領域に相補的な核酸結合ドメイン；およびそれらの間に、前記目的のヒストン修飾に対応し、それによって、ヒストン修飾バーコードとして供される、核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域、を含む近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記目的のヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｄ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつ前記ヒストン修飾バーコードを含むｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｅ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記ｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、増幅用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程
を含む、方法。
（項目３５）
工程（ｃ）が、それぞれが異なるヒストン修飾を標的にする複数の近接プローブを提供することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記増幅されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子をシーケンシングする工程、および生成された配列リードにおいて観察されるヒストン修飾バーコードからヒストン修飾のタイプおよび位置に関する情報を決定する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
無細胞核酸サンプルから抽出するためにｃｆＤＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；および
（ｂ）タグ付けされたｃｆＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記５ｈｍＣ残基を官能化する工程
を含む、方法。
（項目３９）
前記アフィニティータグが、ビオチンから構成され、工程（ｂ）が、前記少なくとも１つの５ｈｍＣ残基をビオチン化して、ビオチン化されたアダプター結合ｃｆＤＮＡを形成することを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記５ｈｍＣ残基が、化学選択的基を前記５ｈｍＣ残基に共有結合させ、次いで前記化学選択的基を官能化ビオチン部分と反応させることによってビオチン化される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記化学選択的基がクリックケミストリー反応において前記官能化ビオチンと反応するように、前記化学選択的基が、ＵＤＰグルコース－６－アジドであり、前記官能化ビオチン部分が、アルキン官能化ビオチンである、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記アダプターが、固有特性識別子（ＵＦＩ）配列をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記アダプターが、少なくとも２つのＵＦＩ配列を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記少なくとも２つのＵＦＩ配列が、ソース識別子バーコード、ならびに分子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヒストン修飾バーコードから選択される少なくとも１つの追加のＵＦＩ配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
シーケンシングベースの同時識別のために単一の無細胞核酸サンプル中のＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡを精製して、アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡの無細胞混和物を提供する工程；
（ｃ）前記ＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｄ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｅ）前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む第２のアダプター配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程
を含む、方法。
（項目４６）
前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目４８）
前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
工程（ｅ）において提供された前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、増幅の前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目４７または項目４８に記載のプロセス。
（項目５０）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていない５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていない未修飾のＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｅ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｇ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｈ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｉ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｊ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５１）
前記少なくとも１つの分子バーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、項目５０に記載のプロセス。
（項目５２）
前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目５０または項目５１に記載のプロセス。
（項目５３）
単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つの分子バーコードを含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、５ｈｍＣ残基、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；および
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡのプールされた混和物を増幅し、かつシーケンシングして、ＤＮＡヒドロキシメチル化および同じサンプル中のｃｆＲＮＡに関するデータを提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５４）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、
（ａ）ハイブリダイズ核酸領域を含むアダプターをヌクレオソーム会合ＤＮＡの各末端にライゲートし、それによって、アダプター結合ＤＮＡと会合したヌクレオソームを含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）第１の末端に、ヒストン修飾結合ドメイン、反対側の第２の末端に、前記ハイブリダイズ核酸領域に相補的な核酸結合ドメイン、およびそれらの間に、特定のヒストン修飾に対応し、それによってヒストン修飾バーコードとして供されるように選択された核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域を含む、近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｃ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｄ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記セグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、さらなる処理用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程；
（ｅ）前記サンプル中の核酸を精製して、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡおよびＤＮＡを含む組成物を提供する工程；
（ｆ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｇ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｈ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む核酸組成物を提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５５）
（ｉ）前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子および前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目５４に記載のプロセス。
（項目５６）
工程（ｄ）の後に、追加のバーコードを含むアダプターを、前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡにライゲートする、項目５５に記載のプロセス。
（項目５７）
前記追加のバーコードが、ソース識別子配列を含む、項目５６に記載のプロセス。
（項目５８）
前記追加のバーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、項目５７に記載のプロセス。
（項目５９）
（ｉ）５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで、前記核酸組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｊ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記組成物から取り出す工程；および
（ｋ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程
をさらに含む、項目５４、５６、５７および５８のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目６０）
（ｌ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目５９に記載のプロセス。
（項目６１）
工程（ｋ）において提供された前記バーコード化５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目６０に記載のプロセス。
（項目６２）
（ｌ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｍ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｎ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；および
（ｏ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程をさらに含む、項目５９に記載のプロセス。
（項目６３）
（ｐ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目６２に記載のプロセス。
（項目６４）
前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目６３に記載のプロセス。
（項目６５）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目５４に記載のプロセス。
（項目６６）
前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目６５に記載のプロセス。
（項目６７）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目６６に記載のプロセス。
（項目６８）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目６７に記載のプロセス。
（項目６９）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、シーケンシングの前にプールされる、項目６８に記載のプロセス。
（項目７０）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目５９に記載のプロセス。
（項目７１）
前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目７０に記載のプロセス。
（項目７２）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目７１に記載のプロセス。
（項目７３）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目７２に記載のプロセス。
（項目７４）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、項目７３に記載のプロセス。
（項目７５）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目６２に記載のプロセス。
（項目７６）
前記血液サンプルに対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目７５に記載のプロセス。
（項目７７）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目７６に記載のプロセス。
（項目７８）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目７７に記載のプロセス。
（項目７９）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、項目７８に記載のプロセス。
（項目８０）
核酸テンプレート分子の非古典的な配列特徴を決定するためのシーケンシングベースの方法であって、
前記テンプレート分子の特定の非配列特徴を指定する固有特性識別子配列を前記核酸テンプレート分子に付加する工程；
前記核酸テンプレート分子および前記付加された識別子配列を増幅して、前記付加された識別子配列をそれぞれが含む複数のアンプリコンを得る工程；および
前記アンプリコンをシーケンシングし、得られた配列リードから前記非配列特徴を決定する工程
を含む、シーケンシングベースの方法。
（項目８１）
前記核酸テンプレート分子が、複数の異なる核酸テンプレート分子を含む組成物に含まれており、各テンプレート分子の特定の非古典的な配列特徴を指定する少なくとも１つの識別子配列が、前記核酸テンプレート分子に付加されている、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子と会合したタンパク質の一態様を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記タンパク質が、ヒストンである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記態様が、ヒストン修飾を含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記少なくとも１つのＰＴＣ修飾が、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記非古典的な配列特徴が、近接伸長法において前記核酸テンプレートが由来したタンパク質分析物を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９０）
前記非古典的な配列特徴が、エピジェネティック修飾を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９１）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子をゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとして識別することを含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９２）
前記組成物が、無細胞核酸サンプルを含む、項目８１に記載の方法。
（項目９３）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子を無細胞ＤＮＡフラグメントまたは無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡとして識別することを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
近接伸長法における既知のタンパク質分析物に由来する核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子。
（項目９５）
前記分子の末端にライゲートされたアダプターをさらに含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９６）
それぞれが前記分子の末端にライゲートされた２つのアダプターを含む、項目９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９７）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９８）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９９）
前記５ｈｍＣ残基が、前記アダプター内に含まれている、項目９８に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１００）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９６に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０１）
前記アダプターのうちの少なくとも１つが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１００に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０２）
前記近接プローブが、同じタンパク質分析物に結合されたとき、タンパク質分析物に由来する前記核酸配列が、２つの近接プローブの間に形成するハイブリダイズした核酸領域内に核酸配列を含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０３）
無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、およびそれに付加された５ｈｍＣ残基を含む核酸配列を含む、無細胞核酸組成物。
（項目１０４）
前記核酸配列が、アダプターを含む、項目１０３に記載の組成物。
（項目１０５）
前記核酸配列が、ソース識別子バーコードをさらに含む、項目１０３または１０４に記載の組成物。
（項目１０６）
前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、項目１０２～１０４のいずれかに記載の組成物。
（項目１０７）
前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、項目１０５に記載の組成物。
（項目１０８）
単一の血液サンプルに由来するアダプター結合バーコード化二本鎖ＤＮＡテンプレート分子をそれぞれが含む、サンプル画分の組み合わせであって、前記組み合わせは、
（ａ）少なくとも１つのタンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む血漿由来サンプル画分であって、前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子のそれぞれが、特定のタンパク質分析物に対応するタンパク質特異的核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、血漿由来サンプル画分；および
（ｂ）前記血液サンプルから抽出された無細胞核酸サンプルから得られた二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含む少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分であって、ここで、前記ｃｆＤＮＡテンプレート分子は、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコード、ランダムバーコードおよびそれらの組み合わせから選択される固有特性識別子を含むアダプターのセットに末端結合されている、少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分
を含む、組み合わせ。
（項目１０９）
前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０８に記載の組み合わせ。
（項目１１０）
前記アダプターの第１のセットにおける少なくとも１つのアダプターが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０９に記載の組み合わせ。
（項目１１１）
前記５ｈｍＣ残基が、結合対の第１のメンバーに共有結合されている、項目１０９または１１０に記載の組み合わせ。
（項目１１２）
前記結合対の第１のメンバーが、前記結合対の第２のメンバーに結合されている、項目１１１に記載の組み合わせ。
（項目１１３）
前記結合対の第２のメンバーが、固体支持体表面に付着されている、項目１１２に記載の組み合わせ。
（項目１１４）
前記結合対の第１のメンバーが、ビオチンであり、前記結合対の第２のメンバーが、アビジンまたはストレプトアビジンである、項目１１２または項目１１３に記載の組み合わせ。
（項目１１５）
（ａ）において、ｃｆＤＮＡテンプレートのセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０８～１１４のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１６）
少なくとも２つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分を含み、各画分は、アダプター結合バーコード化二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含み、少なくとも１つの画分は、５ｍＣ、５ｈｍＣおよびそれらの組み合わせから選択される修飾されたシトシン残基を含む、項目１０８～１１５のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１７）
（ａ）第１のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｈｍＣ残基を含む第１のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；
（ｂ）第２のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｍＣ残基を含むが５ｈｍＣ残基を実質的に含まない第２のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；必要に応じて、
（ｃ）第３のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、修飾されたシトシン残基を実質的に含まない第３のｃｆＤＮＡテンプレートを含む、
項目１１６に記載の組み合わせ。
（項目１１８）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、ならびにフラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヌクレオソーム位置識別子バーコードから選択される少なくとも１つの追加の識別子バーコードを含む、項目１０８～１１７のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１９）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコードおよび鎖識別子バーコードを含む、項目１１８に記載の組み合わせ。
（項目１２０）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ヒストン修飾バーコードをさらに含む、項目１１９に記載の組み合わせ。
（項目１２１）
前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡに由来するアダプター結合ｃＤＮＡ分子をさらに含む、項目１０８に記載の組み合わせ。
（項目１２２）
項目１０８～１２１のいずれかに記載の組み合わせを合わせ、増幅し、かつシーケンシングすることによって調製された、ＤＮＡシーケンシングの準備が整っている、プールされた混合物。
（項目１２３）
識別子バーコードをｄｓＤＮＡ分子に付加するための方法であって、
（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプターを提供する工程；
（ｂ）前記シーケンシングアダプターをＡテール化平滑末端ｄｓＤＮＡテンプレート分子にライゲートする工程；
（ｃ）少なくとも１つのバーコード化プライマーを用いるＰＣＲプロセスにおいて前記アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程であって、ここで、前記バーコード化プライマーは、（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする第２の領域を含み、その結果、ポリメラーゼの存在下における前記バーコード化プライマーの伸長によって、前記プライマーの第２の領域と前記アダプターの一本鎖セグメントとの二本鎖複合体が生じ、ここで、前記識別子バーコードを含む前記第１の領域は、前記二本鎖複合体の末端を超えて一本鎖オリゴヌクレオチドテールとして伸長する、工程
を含む、方法。
（項目１２４）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記ＤＮＡアダプターが、２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態である、項目３８、４５、４７、５０および５３に記載の方法。
（項目１２７）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングするためのキットであって、（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプター；
（ｂ）（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする、第２の領域を含む、バーコード化プライマー；および（ｃ）ポリメラーゼ
を備える、キット。
（項目１３０）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２９に記載のキット。
（項目１３１）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
標的化配列に対してシーケンスベースの富化工程を実施する工程をさらに含む、項目３８、４５、４７、５０および５３のいずれか１項に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
第１の近接プローブおよび第２の近接プローブをそれぞれが含む複数のプローブ対を提供することであって、ここで、各プローブ対は、特定のタンパク質分析物を標的にすること、および対応するタンパク質分析物の存在下において各プローブ対の前記プローブ間で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントを生成することによって、生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための改善された近接伸長アッセイであって、前記改善された近接伸長アッセイは、
（ａ）タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程；
（ｂ）前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、改善された近接伸長アッセイ。
（項目２）
各タンパク質特異的核酸配列が、アダプター内に含められ、工程（ａ）が、前記アダプターを前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合することを含む、項目１に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目３）
工程（ａ）が、５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を前記ｄｓＤＮＡセグメントに組み込み、それによって、前記キャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を形成する工程をさらに含む、項目１に記載の改善された近接アッセイ。
（項目４）
前記キャプチャー配列および前記タンパク質識別子バーコードが、前記ｄｓＤＮＡセグメントに末端結合された少なくとも１つのアダプター内に含められている、項目３に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目５）
分子バーコードとして供されるために、ランダムな核酸配列を各ｄｓＤＮＡテンプレート分子に組み込む工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、項目１～４のいずれか１項に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目６）
少なくとも１つのタンパク質濃度コントロール組成物を前記ｄｓＤＮＡテンプレート分子と合わせる工程を工程（ｂ）の前にさらに含む、項目５に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目７）
各タンパク質分析物が、前記生物学的サンプル中に元の濃度で存在し、前記アッセイが、（ｄ）特定のタンパク質分析物を示唆する配列リードを、前記タンパク質濃度コントロール組成物によって生成された配列リードと比較することによって、前記サンプル中の少なくとも１つのタンパク質分析物の元の濃度を決定する工程をさらに含む、項目６に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目８）
複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、項目１～６のいずれかに記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目９）
複数の生物学的サンプルの各々における前記複数のタンパク質分析物を並行して検出する工程をさらに含む、項目７に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１０）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも３００個の生物学的サンプルを含む、項目９に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１１）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも５００個の生物学的サンプルを含む、項目１０に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１２）
前記複数の生物学的サンプルが、少なくとも１０００個の生物学的サンプルを含む、項目１１に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１３）
前記複数の生物学的サンプルが、３８４または１５３６個の生物学的サンプルを含み、前記アッセイが、マイクロプレートの個々のウェルにおける各生物学的サンプルを用いて実施される、項目９に記載の改善された近接伸長アッセイ。
（項目１４）
ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて生物学的サンプル中の複数のタンパク質分析物を識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）それぞれが、特定のタンパク質分析物を標的にし、第１の末端にタンパク質結合ドメイン、反対側の第２の末端に核酸結合ドメインおよびそれらの間に非ハイブリダイズ核酸領域を含む、複数のプローブ対を提供する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１および第２の近接プローブの前記タンパク質結合ドメインは、同じタンパク質分析物上の異なる結合部位に同時に結合することができ、（ｉｉ）前記第１および第２の近接プローブが、両方とも前記タンパク質に結合しており、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分近接しているとき、前記プローブの前記核酸結合ドメインは、互いに相補的であり、ハイブリダイズして、ｄｓＤＮＡセグメントを形成する、工程；
（ｂ）（ｉ）プローブ対内の各近接プローブの前記タンパク質結合ドメインが対応するタンパク質分析物に結合すること、および（ｉｉ）前記核酸結合ドメインが互いにハイブリダイゼーションして、前記第１の近接プローブを起源とする５’末端および前記第２の近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記生物学的サンプルまたはその一部を前記プローブ対とインキュベートする工程；
（ｃ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記第１の近接プローブの５’末端を前記第２の近接プローブに沿って伸長して、タンパク質識別子バーコードとして供されるタンパク質特異的核酸配列および５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を組み込むｄｓＤＮＡセグメントを前記プローブの間に生成する工程であって、ここで、（ｉ）前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、または前記第１のプローブと第２のプローブの両方の前記核酸結合領域が、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコード、または前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み；（ｉｉ）前記ｄＮＴＰ混合物は、少なくとも１つの５ｈｍＣ残基を含み；かつ／または（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長後に前記ｄｓＤＮＡセグメントの末端にアダプターがライゲートされ、ここで、少なくとも１つのアダプターが、前記キャプチャー配列、前記タンパク質識別子バーコードまたは前記キャプチャー配列と前記タンパク質識別子バーコードの両方を含み、それによって、それぞれがキャプチャー配列を含むタンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が形成される、工程；
（ｄ）キャプチャー配列を含む前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程；および
（ｅ）工程（ｂ）において生成された配列リードにおいて観察される前記タンパク質識別子バーコードから前記生物学的サンプル中の前記タンパク質分析物を識別する工程
を含む、方法。
（項目１５）
各タンパク質結合ドメインが、抗原を含み、各結合部位が、エピトープを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記生物学的サンプルが、血液サンプルを含み、工程（ｂ）が、前記血液サンプルの一部に対して実施される、項目１４または項目１５に記載の方法。
（項目１７）
工程（ｂ）が、前記血液サンプルから得られた血漿に対して実施される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記生物学的サンプルから得られた無細胞核酸サンプルに関する情報を取得する工程をさらに含む、項目１～１７のいずれか１つの項目に記載の方法。
（項目１９）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のヌクレオソーム内の１またはそれを超えるヒストン修飾の存在、同一性または量を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つのＰＴＭが、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、ＳＵＭＯ化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＤＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の少なくとも１つの配列を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記情報が、前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡの少なくとも１つの配列をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記情報が、エピジェネティックデータを含む、項目１８に記載の方法。
（項目３１）
前記情報が、ＤＮＡヒドロキシメチル化に関する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記情報が、ＤＮＡメチル化に関する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記情報が、さらにＤＮＡメチル化に関する、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、前記無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒストンコアの周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）末端ハイブリダイズ領域を含むアダプターを前記ｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートし、それによって、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｃ）第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；第２の末端に、末端ハイブリダイズ領域に相補的な核酸結合ドメイン；およびそれらの間に、前記目的のヒストン修飾に対応し、それによって、ヒストン修飾バーコードとして供される、核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域、を含む近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記目的のヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｄ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつ前記ヒストン修飾バーコードを含むｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｅ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記ｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、増幅用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程
を含む、方法。
（項目３５）
工程（ｃ）が、それぞれが異なるヒストン修飾を標的にする複数の近接プローブを提供することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記増幅されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子をシーケンシングする工程、および生成された配列リードにおいて観察されるヒストン修飾バーコードからヒストン修飾のタイプおよび位置に関する情報を決定する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
無細胞核酸サンプルから抽出するためにｃｆＤＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）５ｈｍＣ残基を含むキャプチャー配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞核酸サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；および
（ｂ）タグ付けされたｃｆＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記５ｈｍＣ残基を官能化する工程
を含む、方法。
（項目３９）
前記アフィニティータグが、ビオチンから構成され、工程（ｂ）が、前記少なくとも１つの５ｈｍＣ残基をビオチン化して、ビオチン化されたアダプター結合ｃｆＤＮＡを形成することを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記５ｈｍＣ残基が、化学選択的基を前記５ｈｍＣ残基に共有結合させ、次いで前記化学選択的基を官能化ビオチン部分と反応させることによってビオチン化される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記化学選択的基がクリックケミストリー反応において前記官能化ビオチンと反応するように、前記化学選択的基が、ＵＤＰグルコース－６－アジドであり、前記官能化ビオチン部分が、アルキン官能化ビオチンである、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記アダプターが、固有特性識別子（ＵＦＩ）配列をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記アダプターが、少なくとも２つのＵＦＩ配列を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記少なくとも２つのＵＦＩ配列が、ソース識別子バーコード、ならびに分子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヒストン修飾バーコードから選択される少なくとも１つの追加のＵＦＩ配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
シーケンシングベースの同時識別のために単一の無細胞核酸サンプル中のＤＮＡおよびＲＮＡを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記無細胞サンプル中の平滑末端ＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡを精製して、アダプター結合ＤＮＡおよびＲＮＡの無細胞混和物を提供する工程；
（ｃ）前記ＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｄ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｅ）前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む第２のアダプター配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程
を含む、方法。
（項目４６）
前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目４８）
前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
工程（ｅ）において提供された前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、増幅の前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目４７または項目４８に記載のプロセス。
（項目５０）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていない５ｍＣ含有ＤＮＡ、タグ付けされていない未修飾のＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｅ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｇ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｈ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｉ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｊ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５１）
前記少なくとも１つの分子バーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、項目５０に記載のプロセス。
（項目５２）
前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目５０または項目５１に記載のプロセス。
（項目５３）
単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つの分子バーコードを含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、５ｈｍＣ残基、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；および
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡのプールされた混和物を増幅し、かつシーケンシングして、ＤＮＡヒドロキシメチル化および同じサンプル中のｃｆＲＮＡに関するデータを提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５４）
単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、
（ａ）ハイブリダイズ核酸領域を含むアダプターをヌクレオソーム会合ＤＮＡの各末端にライゲートし、それによって、アダプター結合ＤＮＡと会合したヌクレオソームを含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）第１の末端に、ヒストン修飾結合ドメイン、反対側の第２の末端に、前記ハイブリダイズ核酸領域に相補的な核酸結合ドメイン、およびそれらの間に、特定のヒストン修飾に対応し、それによってヒストン修飾バーコードとして供されるように選択された核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域を含む、近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｃ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｄ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記セグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、さらなる処理用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程；
（ｅ）前記サンプル中の核酸を精製して、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡおよびＤＮＡを含む組成物を提供する工程；
（ｆ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｇ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｈ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む核酸組成物を提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。
（項目５５）
（ｉ）前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子および前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目５４に記載のプロセス。
（項目５６）
工程（ｄ）の後に、追加のバーコードを含むアダプターを、前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡにライゲートする、項目５５に記載のプロセス。
（項目５７）
前記追加のバーコードが、ソース識別子配列を含む、項目５６に記載のプロセス。
（項目５８）
前記追加のバーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、項目５７に記載のプロセス。
（項目５９）
（ｉ）５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで、前記核酸組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｊ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記組成物から取り出す工程；および
（ｋ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程
をさらに含む、項目５４、５６、５７および５８のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目６０）
（ｌ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目５９に記載のプロセス。
（項目６１）
工程（ｋ）において提供された前記バーコード化５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目６０に記載のプロセス。
（項目６２）
（ｌ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｍ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｎ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；および
（ｏ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程をさらに含む、項目５９に記載のプロセス。
（項目６３）
（ｐ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、項目６２に記載のプロセス。
（項目６４）
前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、項目６３に記載のプロセス。
（項目６５）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目５４に記載のプロセス。
（項目６６）
前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目６５に記載のプロセス。
（項目６７）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目６６に記載のプロセス。
（項目６８）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目６７に記載のプロセス。
（項目６９）
前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、シーケンシングの前にプールされる、項目６８に記載のプロセス。
（項目７０）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目５９に記載のプロセス。
（項目７１）
前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目７０に記載のプロセス。
（項目７２）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目７１に記載のプロセス。
（項目７３）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目７２に記載のプロセス。
（項目７４）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、項目７３に記載のプロセス。
（項目７５）
前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、項目６２に記載のプロセス。
（項目７６）
前記血液サンプルに対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、項目７５に記載のプロセス。
（項目７７）
血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、項目７６に記載のプロセス。
（項目７８）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、項目７７に記載のプロセス。
（項目７９）
前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、項目７８に記載のプロセス。
（項目８０）
核酸テンプレート分子の非古典的な配列特徴を決定するためのシーケンシングベースの方法であって、
前記テンプレート分子の特定の非配列特徴を指定する固有特性識別子配列を前記核酸テンプレート分子に付加する工程；
前記核酸テンプレート分子および前記付加された識別子配列を増幅して、前記付加された識別子配列をそれぞれが含む複数のアンプリコンを得る工程；および
前記アンプリコンをシーケンシングし、得られた配列リードから前記非配列特徴を決定する工程
を含む、シーケンシングベースの方法。
（項目８１）
前記核酸テンプレート分子が、複数の異なる核酸テンプレート分子を含む組成物に含まれており、各テンプレート分子の特定の非古典的な配列特徴を指定する少なくとも１つの識別子配列が、前記核酸テンプレート分子に付加されている、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子と会合したタンパク質の一態様を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記タンパク質が、ヒストンである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記態様が、ヒストン修飾を含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ヒストン修飾が、共有結合による翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ＰＴＭが、遺伝子発現に影響を与えるヒストン構造の変化を含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記少なくとも１つのＰＴＣ修飾が、アセチル化、メチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、２－ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、スクシニル化、ホルミル化、ユビキチン化、シトルリン化、リン酸化、ヒドロキシル化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化、ＡＤＰリボシル化またはそれらの組み合わせを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記１またはそれを超えるヒストン修飾が、被験体における病状を評価するためのヒストン修飾バイオマーカーを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記非古典的な配列特徴が、近接伸長法において前記核酸テンプレートが由来したタンパク質分析物を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９０）
前記非古典的な配列特徴が、エピジェネティック修飾を含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９１）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子をゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとして識別することを含む、項目８０または項目８１に記載の方法。
（項目９２）
前記組成物が、無細胞核酸サンプルを含む、項目８１に記載の方法。
（項目９３）
前記非古典的な配列特徴が、前記核酸テンプレート分子を無細胞ＤＮＡフラグメントまたは無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡとして識別することを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
近接伸長法における既知のタンパク質分析物に由来する核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、二本鎖ＤＮＡテンプレート分子。
（項目９５）
前記分子の末端にライゲートされたアダプターをさらに含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９６）
それぞれが前記分子の末端にライゲートされた２つのアダプターを含む、項目９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９７）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９８）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９５に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目９９）
前記５ｈｍＣ残基が、前記アダプター内に含まれている、項目９８に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１００）
５ｈｍＣ残基をさらに含む、項目９６に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０１）
前記アダプターのうちの少なくとも１つが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１００に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０２）
前記近接プローブが、同じタンパク質分析物に結合されたとき、タンパク質分析物に由来する前記核酸配列が、２つの近接プローブの間に形成するハイブリダイズした核酸領域内に核酸配列を含む、項目９４に記載のＤＮＡテンプレート分子。
（項目１０３）
無細胞ＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、およびそれに付加された５ｈｍＣ残基を含む核酸配列を含む、無細胞核酸組成物。
（項目１０４）
前記核酸配列が、アダプターを含む、項目１０３に記載の組成物。
（項目１０５）
前記核酸配列が、ソース識別子バーコードをさらに含む、項目１０３または１０４に記載の組成物。
（項目１０６）
前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、項目１０２～１０４のいずれかに記載の組成物。
（項目１０７）
前記核酸配列が、ＲＮＡインジケーターバーコードをさらに含む、項目１０５に記載の組成物。
（項目１０８）
単一の血液サンプルに由来するアダプター結合バーコード化二本鎖ＤＮＡテンプレート分子をそれぞれが含む、サンプル画分の組み合わせであって、前記組み合わせは、
（ａ）少なくとも１つのタンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む血漿由来サンプル画分であって、前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡテンプレート分子のそれぞれが、特定のタンパク質分析物に対応するタンパク質特異的核酸配列を含み、それによって、タンパク質識別子バーコードとして供される、血漿由来サンプル画分；および
（ｂ）前記血液サンプルから抽出された無細胞核酸サンプルから得られた二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含む少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分であって、ここで、前記ｃｆＤＮＡテンプレート分子は、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコード、ランダムバーコードおよびそれらの組み合わせから選択される固有特性識別子を含むアダプターのセットに末端結合されている、少なくとも１つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分
を含む、組み合わせ。
（項目１０９）
前記タンパク質関連ｄｓＤＮＡセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０８に記載の組み合わせ。
（項目１１０）
前記アダプターの第１のセットにおける少なくとも１つのアダプターが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０９に記載の組み合わせ。
（項目１１１）
前記５ｈｍＣ残基が、結合対の第１のメンバーに共有結合されている、項目１０９または１１０に記載の組み合わせ。
（項目１１２）
前記結合対の第１のメンバーが、前記結合対の第２のメンバーに結合されている、項目１１１に記載の組み合わせ。
（項目１１３）
前記結合対の第２のメンバーが、固体支持体表面に付着されている、項目１１２に記載の組み合わせ。
（項目１１４）
前記結合対の第１のメンバーが、ビオチンであり、前記結合対の第２のメンバーが、アビジンまたはストレプトアビジンである、項目１１２または項目１１３に記載の組み合わせ。
（項目１１５）
（ａ）において、ｃｆＤＮＡテンプレートのセグメントが、５ｈｍＣ残基を含む、項目１０８～１１４のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１６）
少なくとも２つのｃｆＤＮＡ由来サンプル画分を含み、各画分は、アダプター結合バーコード化二本鎖ｃｆＤＮＡテンプレート分子を含み、少なくとも１つの画分は、５ｍＣ、５ｈｍＣおよびそれらの組み合わせから選択される修飾されたシトシン残基を含む、項目１０８～１１５のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１７）
（ａ）第１のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｈｍＣ残基を含む第１のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；
（ｂ）第２のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、アフィニティータグ付けされた５ｍＣ残基を含むが５ｈｍＣ残基を実質的に含まない第２のｃｆＤＮＡテンプレートセグメントを含み；必要に応じて、
（ｃ）第３のｃｆＤＮＡ由来サンプル画分が、修飾されたシトシン残基を実質的に含まない第３のｃｆＤＮＡテンプレートを含む、
項目１１６に記載の組み合わせ。
（項目１１８）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、ならびにフラグメント識別子バーコード、鎖識別子バーコードおよびヌクレオソーム位置識別子バーコードから選択される少なくとも１つの追加の識別子バーコードを含む、項目１０８～１１７のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１１９）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ソース識別子バーコード、フラグメント識別子バーコードおよび鎖識別子バーコードを含む、項目１１８に記載の組み合わせ。
（項目１２０）
各ｃｆＤＮＡテンプレートセグメントが、ヒストン修飾バーコードをさらに含む、項目１１９に記載の組み合わせ。
（項目１２１）
前記無細胞核酸サンプル中のｃｆＲＮＡに由来するアダプター結合ｃＤＮＡ分子をさらに含む、項目１０８に記載の組み合わせ。
（項目１２２）
項目１０８～１２１のいずれかに記載の組み合わせを合わせ、増幅し、かつシーケンシングすることによって調製された、ＤＮＡシーケンシングの準備が整っている、プールされた混合物。
（項目１２３）
識別子バーコードをｄｓＤＮＡ分子に付加するための方法であって、
（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプターを提供する工程；
（ｂ）前記シーケンシングアダプターをＡテール化平滑末端ｄｓＤＮＡテンプレート分子にライゲートする工程；
（ｃ）少なくとも１つのバーコード化プライマーを用いるＰＣＲプロセスにおいて前記アダプター結合ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程であって、ここで、前記バーコード化プライマーは、（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする第２の領域を含み、その結果、ポリメラーゼの存在下における前記バーコード化プライマーの伸長によって、前記プライマーの第２の領域と前記アダプターの一本鎖セグメントとの二本鎖複合体が生じ、ここで、前記識別子バーコードを含む前記第１の領域は、前記二本鎖複合体の末端を超えて一本鎖オリゴヌクレオチドテールとして伸長する、工程
を含む、方法。
（項目１２４）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記ＤＮＡアダプターが、２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態である、項目３８、４５、４７、５０および５３に記載の方法。
（項目１２７）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングするためのキットであって、（ａ）２塩基対～５０塩基対の範囲である二本鎖セグメントおよびそれぞれが２塩基～２５塩基の範囲である２つの一本鎖セグメントを有するＹ構築物の形態のシーケンシングアダプター；
（ｂ）（ｉ）前記アダプターの中のいずれの配列にも相補的でなく、識別子バーコードを含む、第１の領域；および（ｉｉ）前記アダプターの一本鎖セグメントに十分に相補的であり、それにハイブリダイズする、第２の領域を含む、バーコード化プライマー；および（ｃ）ポリメラーゼ
を備える、キット。
（項目１３０）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～３５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２５塩基の範囲である、項目１２９に記載のキット。
（項目１３１）
前記二本鎖セグメントが、５塩基対～２５塩基対の範囲であり、前記２つの一本鎖セグメントがそれぞれ、約５塩基～２０塩基の範囲である、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
標的化配列に対してシーケンスベースの富化工程を実施する工程をさらに含む、項目３８、４５、４７、５０および５３のいずれか１項に記載の方法。
Claims (37)
- 無細胞核酸サンプルを調製して、ＤＮＡシーケンシングベースの技術を用いて、前記無細胞核酸サンプルに含まれているヌクレオソームにおける少なくとも１つのヒストン修飾の識別を可能にするための方法であって、前記方法は、
（ａ）ヒストンコアの周囲に巻き付いたｃｆＤＮＡ分子をそれぞれが含む複数のヌクレオソームを含む無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）末端ハイブリダイズ領域を含むアダプターを前記ｃｆＤＮＡ分子の末端にライゲートし、それによって、それぞれがヒストンコアの周囲に巻き付いたアダプター結合ｃｆＤＮＡ分子を含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｃ）第１の末端に、目的のヒストン修飾に特異的に結合するヒストン修飾結合ドメイン；第２の末端に、末端ハイブリダイズ領域に相補的な核酸結合ドメイン；およびそれらの間に、前記目的のヒストン修飾に対応し、それによって、ヒストン修飾バーコードとして供される、核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域、を含む近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記目的のヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｄ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有し、かつ前記ヒストン修飾バーコードを含むｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｅ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記ｄｓＤＮＡセグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、増幅用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程
を含む、方法。 - 工程（ｃ）が、それぞれが異なるヒストン修飾を標的にする複数の近接プローブを提供することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
- 前記増幅されたヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子をシーケンシングする工程、および生成された配列リードにおいて観察されるヒストン修飾バーコードからヒストン修飾のタイプおよび位置に関する情報を決定する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
- 単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのＵＦＩ配列は、ソース識別子バーコードを含む、工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、前記アダプター結合ＤＮＡも含む無細胞混和物中にアダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。 - 前記少なくとも１つのＵＦＩ配列が、分子バーコード、鎖識別子バーコード、ヒストン修飾バーコードまたはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 工程（ｅ）において提供された前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、増幅の前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項５に記載のプロセス。
- 単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つのＵＦＩ配列を含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有ＤＮＡを選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていない５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｍＣ）含有ＤＮＡ、タグ付けされていない未修飾のＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｅ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｆ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｇ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｈ）前記サンプル中に残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；
（ｉ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程；および
（ｊ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。 - 前記少なくとも１つの分子バーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、請求項８に記載のプロセス。
- 前記前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項８に記載のプロセス。
- 単一の無細胞核酸サンプルから少なくとも２種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、前記プロセスは、
（ａ）ソース識別子バーコードを含む少なくとも１つの分子バーコードを含む第１のアダプター配列を含むＤＮＡアダプターを前記サンプル中の平滑末端ｃｆＤＮＡの末端にライゲートして、アダプター結合ＤＮＡを提供する工程；
（ｂ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、５ｈｍＣ残基、前記ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含むｃＤＮＡアダプターを前記ｃＤＮＡの少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを提供する工程；
（ｃ）前記無細胞サンプルから５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にするアフィニティータグで前記サンプル中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｄ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡを前記無細胞サンプルから取り出す工程；および
（ｅ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記バーコード化アダプター結合ｃＤＮＡのプールされた混和物を増幅し、かつシーケンシングして、ＤＮＡヒドロキシメチル化および同じサンプル中のｃｆＲＮＡに関するデータを提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。 - 単一の無細胞核酸サンプルから複数の種類のデータを抽出するための組み合わせワークフロープロセスであって、
（ａ）ハイブリダイズ核酸領域を含むアダプターをヌクレオソーム会合ＤＮＡの各末端にライゲートし、それによって、アダプター結合ＤＮＡと会合したヌクレオソームを含む修飾された無細胞核酸サンプルを提供する工程；
（ｂ）第１の末端に、ヒストン修飾結合ドメイン、反対側の第２の末端に、前記ハイブリダイズ核酸領域に相補的な核酸結合ドメイン、およびそれらの間に、特定のヒストン修飾に対応し、それによってヒストン修飾バーコードとして供されるように選択された核酸配列を含む非ハイブリダイズ領域を含む、近接プローブを提供する工程であって、ここで、前記近接プローブは、前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合することと、前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションすることとが同時に起きることを可能にするような寸法である、工程；
（ｃ）（ｉ）前記ヒストン修飾結合ドメインが前記ヒストン修飾に結合すること、および（ｉｉ）前記相補的な核酸結合ドメインが前記ハイブリダイズ核酸領域とハイブリダイゼーションして、前記無細胞ＤＮＡを起源とする５’末端および前記近接プローブを起源とする３’末端を有するｄｓＤＮＡセグメントを形成すること、を促進するのに効果的な条件下において前記修飾された無細胞核酸サンプルを前記近接プローブとインキュベートする工程；および
（ｄ）ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ混合物を添加することによって、前記セグメントの５’末端を前記近接プローブの前記非ハイブリダイズ領域および前記ヒストン修飾バーコードに沿って伸長し、それによって、さらなる処理用およびシーケンシング用の、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を提供する工程；
（ｅ）前記サンプル中の核酸を精製して、ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡおよびＤＮＡを含む組成物を提供する工程；
（ｆ）前記サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成する工程；
（ｇ）前記第１鎖に相補的なｃＤＮＡの第２鎖を合成して、ｃＤＮＡ二重鎖を提供する工程；および
（ｈ）ソース識別子バーコードおよびＲＮＡインジケーターバーコードを含む配列を含むｃＤＮＡアダプターをリガーゼの非存在下において前記ｃＤＮＡ二重鎖の少なくとも１つの末端に共有結合させ、それによって、アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を含む核酸組成物を提供する工程
を含む、組み合わせワークフロープロセス。 - （ａ）前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子および前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項１２に記載のプロセス。 - 工程（ｄ）の後に、追加のバーコードを含むアダプターを、前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡにライゲートする、請求項１３に記載のプロセス。
- 前記追加のバーコードが、ソース識別子配列を含む、請求項１４に記載のプロセス。
- 前記追加のバーコードが、フラグメント識別子配列、鎖識別子配列、またはフラグメント識別子配列と鎖識別子配列との両方をさらに含む、請求項１５に記載のプロセス。
- （ｉ）５ｈｍＣ含有種を選択的に取り出すことを可能にする第１のアフィニティータグで、前記核酸組成物中の５ｈｍＣ残基を官能化する工程；
（ｊ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡを前記組成物から取り出す工程；および
（ｋ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡに５ｈｍＣプロセスバーコードを付加する工程
をさらに含む、請求項１３に記載のプロセス。 - （ｌ）前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項１７に記載のプロセス。 - 工程（ｋ）において提供された前記バーコード化５ｈｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項１８に記載のプロセス。
- （ｌ）前記残りのサンプル中のメチルシトシン残基を酸化されたメチルシトシン残基に変換する工程；
（ｍ）前記サンプルから前記官能化種を選択的に取り出すことを可能にする第２のアフィニティータグで前記酸化されたメチルシトシン残基を官能化する工程；
（ｎ）残っているタグ付けされていないＤＮＡおよびアダプター結合ｃＤＮＡとともに、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡを取り出す工程；および
（ｏ）前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡに５ｍＣプロセスバーコードを付加する工程をさらに含む、請求項１７に記載のプロセス。 - （ｐ）前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程
をさらに含む、請求項２０に記載のプロセス。 - 前記タグ付けされた５ｈｍＣ含有ＤＮＡおよび前記タグ付けされた５ｍＣ含有ＤＮＡが、シーケンシングの前に、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡとともにプールされる、請求項２１に記載のプロセス。
- 前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項１２に記載のプロセス。
- 前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項２３に記載のプロセス。
- 血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項２４に記載のプロセス。
- 前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子を増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項２５に記載のプロセス。
- 前記ヒストン修飾バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子、前記アダプター結合ｃＤＮＡおよび前記タンパク質バーコード化ｄｓＤＮＡテンプレート分子が、シーケンシングの前にプールされる、請求項２６に記載のプロセス。
- 前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項１７に記載のプロセス。
- 前記血液サンプルの一部に対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項２８に記載のプロセス。
- 血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項２９に記載のプロセス。
- 前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項３０に記載のプロセス。
- 前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、請求項３１に記載のプロセス。
- 前記無細胞核酸サンプルが、血液サンプルから得られる、請求項２０に記載のプロセス。
- 前記血液サンプルに対して血漿タンパク質分析を実施する工程をさらに含む、請求項３３に記載のプロセス。
- 血漿タンパク質が、タンパク質分析物に対応するタンパク質識別子バーコードを含むｄｓＤＮＡテンプレート分子を生成することによって分析される、請求項３４に記載のプロセス。
- 前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡを増幅し、かつシーケンシングする工程をさらに含む、請求項３５に記載のプロセス。
- 前記５ｈｍＣ含有ＤＮＡ、前記５ｍＣ含有ＤＮＡ、前記タグ付けされていないＤＮＡおよび前記アダプター結合ｃＤＮＡが、シーケンシングの前にプールされる、請求項３６に記載のプロセス。
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