JPWO2020071419A1 - ロタウイルスの遺伝子型検出方法と、これに用いる遺伝子増幅用プライマーセット - Google Patents
ロタウイルスの遺伝子型検出方法と、これに用いる遺伝子増幅用プライマーセット Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明の検出方法は、下記の「センスプライマー(A)」と「共通アンチセンスプライマー(B)」を用いるロタウイルスの遺伝子型の検出方法である。
(A) ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の174−834番目を塩基配列カウントの基準として、
(1)ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(2)ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−789番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(3)ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(4)ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−711番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
であり、並びに、
共通アンチセンスプライマー(B)は、
(B) 上記G1型の基準株のプラス鎖の塩基配列の883−1062番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記(1)−(4)において記載されたロタウイルスAの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする共通アンチセンスプライマーから選ばれる1種又は2種以上である。
(5)ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の297−338番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(6)ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の399−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(7)ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−507番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(8)ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。
本発明のプライマーセットは、上述した本発明の検出方法を行うための遺伝子増幅用プライマーセットである。具体的には、下記の態様があるが、それぞれの態様は、上述した本発明の検出方法に用いられる遺伝子増幅用プライマーとして用いることができる。
ロタウイルスの遺伝子型の検出を目的とした、下記(A)(1)−(4)の1−4種から選ばれるセンスプライマーを含む、遺伝子増幅用プライマーセットである。
(A)(1)ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(A)(2)ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−789番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(A)(3)ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(A)(4)ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−711番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。
上記の基本的センスプライマーセットに、さらに下記(A)(5)−(8)から選ばれる1−4種のセンスプライマー(追加のセンスプライマー)が追加されてなる遺伝子増幅用プライマーセットである。
(A)(6)ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の399−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(A)(7)ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−507番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上;
(A)(8)ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。
上記(I)−1の「基本的なセンスプライマーセット」、又は(I)−2の「追加のセンスプライマーを含み得るセンスプライマーセット」と、アンチセンスプライマー(B)を組み合わせたプライマーセットである。
RVAの遺伝子型検出手段としてNested-PCR法を行う場合に用いられるプライマーセットである。
本発明のキットは、本発明のプライマーセットを用いて本発明の検出方法を行うための、本発明のプライマーセットをその構成要素として含む検出用キットである。本発明のキットには、本発明の検出方法の具体的な態様に応じて他の構成要素を組み入れることができる。具体的には、例えば、遺伝子増幅手段がPCR法を基礎とする方法の場合、PCR用の酵素(DNAポリメラーゼ)、逆転写酵素、バッファー(緩衝液)、酵素の補因子となる金属イオン(マグネシウムイオン等)、DNA増幅の基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP(dATP,dCTP,dGTP,TTPの混合物))、希釈用の水等を他の構成要素として組み入れることが可能である。
センスプライマー(A)としては、下記(1)−(8)のマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーが例示される。塩基を示す記号のうち「R」はグアニン又はアデニンであることを示している。
上記の共通アンチセンスプライマー(B)は、ACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号9)の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーであることが好適である。
上述した本発明のプライマーセットは、Nested-PCR法(Semi−nested PCR法を含む)の第2の増幅工程において、ネステッドセンスプライマー及び共通ネステッドアンチセンスプライマーとして用いる。そして、RT−PCR法による第1の増幅工程における共通アウターセンスプライマーとしては、CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC(配列番号10)の一部又は全部を含む共通アウターセンスプライマーが挙げられ、当該共通アウターアンチセンスプライマーとしては、GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号11)の一部又は全部を含む共通アウターアンチセンスプライマーが挙げられる。
(1)サンプルの調製
マルチプレックスPCR法の評価のため、予めシークエンス解析により遺伝子型が判明しているRVA株の中から、以下の11種類の代表的な株を選択して、これらのRVA株がそれぞれ含まれていることが既知の検体を選択して用いた。
Human-wt/JPN-Kyoto/NT036/2013/G1 lineage 2 (Wa様)
Human-wt/JPN-Hokkaido /SP15-06/2015/G1 lineage 1 (DS-1様)
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-04/2016/G2
Human-wt/JPN-Aichi/KN105/2013/G3 (Wa様)
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-01/2016/G3 (equine-like, DS-1様)
Human-wt/JPN-Okayama/OH279/2002/G4
Human-wt/JPN-Hokkaido/TA15-07/2015/G8
Human-wt/JPN-Hokkaido/To14-25/2014/G9 lineage 3
Human-wt/JPN-Hokkaido/To16-02/2016/G9 lineage 6
Human-wt/JPN-Hokkaido/NS17-5/2017/G12
下記のGouveaのプライマーセット(比較例):
1st Beg 9 : GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG(配列番号19)
End 9 : GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG(配列番号20)
2nd RVG 9 : GGTCACATCATACAATTCT (配列番号18)
aAT8(G8) : GTCACACCATTTGTAAATTCG(配列番号12)
aBT1(G1) : CAAGTACTCAAATCAATGATGG(配列番号13)
aCT2(G2) : CAATGATATTAACACATTTTCTGTG(配列番号14)
aDT4(G4) : CGTTTCTGGTGAGGAGTTG(配列番号15)
aET3(G3) : CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG(配列番号16)
aFT9(G9) : CTAGATGTAACTACAACTAC(配列番号17)
及び、下記の実施例のプライマーセット:
1st VP7 C-040F : CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC(配列番号10)
VP7 C-941R : GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号11)
2nd VP7 C-932R : ACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号9)
G1-297F :GTATTATCCAACTGAAGCAAGTAC (配列番号1)
G2-401F : TTAAAGACTACAATGATATTACTACATT(配列番号2)
G3-809F : CAAGGGAAAACGTRGCAGTTA(配列番号3)
G3e-757F : CTAGATGTTACTACGGCTAC(配列番号4)
G4-478F : TTCGCTTCTGGTGAGGAGTTG(配列番号5)
G8-179F : TTACRCCATTTGTAAATTCACAG(配列番号6)
G9-606F : GATGGGACARTCTTGTACCATA(配列番号7)
G12-669F : TACRACAACCGACGTCACA(配列番号8)
を用いて、上記の「1st」として示したアウタープライマーを用いたRT−PCR(1次PCR)、及び、「2nd」として示したネステッドプライマーを用いたマルチプレックスPCR(2次PCR)を行った。なお、「G3e」は、ウマ様(Equine-like)であることを示しており、ウマ様G3に関するプライマーを示している。
RVA基準株のVP7ヌクレオチド配列をGenBankから入手し、MEGAソフトウェアパッケージバージョン7.0.18に含まれる、CLUSTAL W、及び、MAFFT多重配列アラインメントソフトウェアプログラム バージョン7.0(Katoh et al.,2009)を用いてアライメントを行った。最終的な編集は、Microsoft Excel 2010ソフトウェア(Microsoft、Redmond、WA、USA)によって行った。
(1)Gouveaのプライマーセットの評価(比較例)
日本国内で採取されたRVAの10株(G1lineage 1(Wa様)、G1lineage 2(Wa様)、G1lineage 1(DS−1様)、G2、G3(Wa様)、ウマ様(Equine-like)G3(DS−1様)、G4、G8、G9 lineage 3及びG9 lineage 6)を用いて、上記のGouveaのプライマーセットによるマルチプレックスPCR法を、基本の増幅反応系において評価した。
上記(1)の比較例に対して、実施例のプライマーセット(上記;G12対応のプライマーを含む)を用いた場合に、G1、G2、ヒトG3、ウマ様G3、G4、G8及びG9、これにG12を加えた全ての株で、遺伝子型を正確に判定できることが基本の増幅反応系において確認された(図1B)。すなわち、ウマ様G3とG1のバンドは明確に異なっており、G8とG3のバンドも明確に異なっていた。また、G9 lineage 3のバンドが明確に検出された。更にG9 lineage 6において認められた非特異的なバンドは認められなかった。このように比較例では検出が困難であった部分が明確に検出されると共に、さらに新たに加えたG12のバンドも、区別可能な明確な形で認められた。この結果は、2検体以上を用いた場合も同様であり、さらに、各検体において上記の基本の増幅反応系を用いた場合も、代替の試薬キットに付属している増幅反応系を用いた場合も同様であった。
(1)試験系2の内容
試験系2では、特にRVA株である、ヒトG3、ウマ様G3、G9、及びG12について、それぞれの株に割り当てられている遺伝子対応領域の両端近傍での当該遺伝子型の検出性能を、試験系1と同様のセミネステッドマルチプレックスPCRを用いて検討した。
用いた検体は、G1、G2、ヒトG3、ウマ様G3、G4,G8、G9、及びG12のそれぞれについて、試験系1で用いたものと同一の糞便検体である。
下記のプライマーセット:
1st VP7 C-040F : CTCCTTTTAATGTATGGTATTGAATATACC(配列番号10)
VP7 C-941R : GTATAAAANACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号11)
2nd VP7 C-932R : ACTTGCCACCATTTTTTCCA(配列番号9)
G1-297F :GTATTATCCAACTGAAGCAAGTAC (配列番号1)
G2-401F : TTAAAGACTACAATGATATTACTACATT(配列番号2)
G3-beg-802F(19) : TTAGGACCAAGGGAAAACG(配列番号21)
G3-end-812F(23) : GGGAAAACGTAGCAGTTATACAG(配列番号22)
G3e-beg-747F(21) : CAATCATAAACTAGATGTTAC(配列番号23)
G3e-end-771F(19) : GGCTACTTGTACGATCAGA(配列番号24)
G4-478F : TTCGCTTCTGGTGAGGAGTTG(配列番号5)
G8-179F : TTACRCCATTTGTAAATTCACAG(配列番号6)
G9-beg-603F(23) : ATCGATGGGACARTCTTGTACCA(配列番号25)
G9-end-613F(24) : CAATCTTGTACCATAAAAGTGTGC(配列番号26)
G12-beg-666F(19) : ATGTACGACAACCGACGTC(配列番号27)
G12-end-689F(23) : CATTTGAAGAGGTAGCAAATGCG(配列番号28)
を用いて、上記の「1st」として示したアウタープライマーを用いたRT−PCR(1次PCR)、及び、「2nd」として示したネステッドプライマーを用いたマルチプレックスPCR(2次PCR)を行った。なお、「G3e」は、ウマ様(Equine-like)であることを示しており、ウマ様G3に関するプライマーを示していることは、試験系1と同様である。
RVA基準株のVP7ヌクレオチド配列をGenBankから入手し、MEGAソフトウェアパッケージバージョン7.0.18に含まれる、CLUSTAL W、及び、MAFFT多重配列アラインメントソフトウェアプログラム バージョン7.0(Katoh et al.,2009)を用いてアライメントを行った。最終的な編集は、Microsoft Excel 2010ソフトウェア(Microsoft、Redmond、WA、USA)によって行った。
本発明の検出方法における、より基本的な要素であるヒトG3、ウマ様G3、G9、及びG12の基準株に対応する遺伝子領域の両端に対応するプライマー、すなわち、ヒトG3については、G3−beg−802F(5'側:図2のG3h-begに対応)とG3−end−812F(5'側:図2のG3h-endに対応); ウマ様G3については、G3e−beg−747F(5'側:図2のG3e-begに対応)とG3e−end−771F(5'側:図2のG3e-endに対応); G9については、G9−beg−603F(5'側:図2のG9-begに対応)とG9−end−613F(5'側:図2のG9-endに対応);G12については、G12−beg−666F(5'側:図2のG12-begに対応)とG12−end−689F(5'側:図2のG12-endに対応);それぞれについて、本発明において追加可能なG1、G2、G4、及びG8の基準株に対応するプライマーとマルチプレックスPCRを行った結果、バンドの濃淡の差は認められるものの、各々の基本的な基準株に対応する遺伝子領域の両端のプライマーの組について、他と明確に区別が可能な明確なバンドが認められた。従って、本発明においてそれぞれの基準株について規定された遺伝子領域全体について、本発明の検出方法を行うことが可能であることが明らかになった。また、この結果から、追加可能なプライマーについても同様に、規定された遺伝子領域全体において本発明の検出方法に適用可能と考えられる。
Claims (18)
- (A) ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の174−834番目を塩基配列カウントの基準として:
(1)ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(2)ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−789番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(3)ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(4)ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−711番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
における上記(1)−(4)の1−4種から選ばれるセンスプライマー;並びに、
(B) 上記G1型の基準株のプラス鎖の塩基配列の883−1062番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記(1)−(4)において記載されたロタウイルスAの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする共通アンチセンスプライマーから選ばれる1種又は2種以上;
上記(A)のセンスプライマー及び(B)共通アンチセンスプライマー、を含めて遺伝子増幅用プライマーとして用いた遺伝子増幅手段を、検体から得られる遺伝子に対して施して得られる遺伝子増幅産物を用いてロタウイルスの遺伝子型を検出する、検出方法。 - 前記(A)(1)の、ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号3で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(2)の、ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−786番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号4で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(3)の、ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号7で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(4)の、ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−710番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号8で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項1に記載の検出方法。 - 前記(A)のセンスプライマーとして、さらに下記(5)−(8)から選ばれる1−4種を追加して用いる、請求項1又は2に記載の検出方法:
(5)ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の297−338番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(6)ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の399−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(7)ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−507番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(8)ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。 - 前記(A)(5)の、ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の297−338番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号1で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(6)の、ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の401−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号2で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(7)の、ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−501番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号5で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(A)(8)の、ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号6で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項3に記載の検出方法。 - 前記(B)の共通アンチセンスプライマーは、配列番号9で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項1−4のいずれか1項に記載の検出方法。
- 前記遺伝子増幅手段は、Nested-PCR法の第2の増幅工程であり、RT−PCR法による第1の増幅工程において、(1)ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の1−72番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスAの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、(2)上記G1型の基準株のプラス鎖の塩基配列の883−1062番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスAの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、を遺伝子増幅用プライマーとして用いて得られた第1の増幅工程による遺伝子増幅産物を、上記第2の増幅工程における鋳型として用いる、請求項1−5のいずれか1項に記載の検出方法。
- ロタウイルスの遺伝子型の検出を目的とした、下記(1)−(4)の1−4種から選ばれるセンスプライマーを含む、遺伝子増幅用プライマーセット:
ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の174−834番目を塩基配列カウントの基準として:
(1)ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(2)ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−789番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(3)ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(4)ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−711番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。 - 前記(1)の、ロタウイルスAのG3型(ヒトロタウイルス)の基準株(AU−1/D86271)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の802−834番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号3で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(2)の、ロタウイルスAのウマ様G3型(ウマ様ロタウイルス)の基準株(S13−30/KJ639017)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の747−786番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号4で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(3)の、ロタウイルスAのG9型の基準株(B3458/EF990708)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の603−636番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号7で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(4)の、ロタウイルスAのG12型の基準株(Dhaka25/DQ146654)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の666−710番目の塩基配列(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号8で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項7に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。 - 前記センスプライマーとして、さらに下記(5)−(8)から選ばれる1−4種が追加されてなる、請求項7又は8に記載の遺伝子増幅用プライマーセット:
(5)ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の297−338番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(6)ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の399−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(7)ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−507番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上、
(8)ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーの1種又は2種以上。 - 前記(5)の、ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の297−338番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号1で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(6)の、ロタウイルスAのG2型の基準株(KUN/D50124)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の401−438番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号2で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(7)の、ロタウイルスAのG4型の基準株(BrB−9/GU565090)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の468−501番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号5で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーであり、
前記(8)の、ロタウイルスAのG8型の基準株(NP−130/LC169923)のVP7遺伝子分節の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列の174−210番目(プラス鎖の番号)に対するマイナス鎖にハイブリダイズするセンスプライマーは、配列番号6で表される塩基配列の一部又は全部を含むセンスプライマーである、請求項9に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。 - 前記センスプライマーに関する(1)−(4)の全て、及び、(5)−(8)の1種又は2種以上、を含む、請求項7−10のいずれか1項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 前記センスプライマーと共に、ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の883−1062番目をカウントの基準として、当該塩基配列の領域に対してそれぞれに整合している上記ロタウイルスAの基準株のプラス鎖、にハイブリダイズする1種又は2種以上の共通アンチセンスプライマー、を含む、請求項7−11のいずれか1項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 前記共通アンチセンスプライマーは、配列番号9で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項12に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 前記遺伝子増幅用プライマーセットが、Nested-PCR法の第2の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれ、かつ、(1)ロタウイルスAのG1型の基準株(Wa株/K02033)のVP7遺伝子分節(セグメント9)の二本鎖RNA又はその相補的なDNAの塩基配列におけるプラス鎖の塩基配列の1−72番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部のそれぞれに整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスAの基準株のプラス鎖の塩基配列に対応するマイナス鎖、にハイブリダイズする共通アウターセンスプライマー、並びに、(2)上記G1型の基準株のプラス鎖の塩基配列の883−1062番目を塩基配列カウントの基準として、当該塩基配列の全部又は一部に整合している、検出対象である遺伝子型が異なるロタウイルスAの基準株のプラス鎖の塩基配列に対してハイブリダイズする共通アウターアンチセンスプライマー、をRT−PCR法によるNested−PCR法の第1の増幅工程に用いるプライマーセットとして含まれる、請求項7−13のいずれか1項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 前記(1)の共通アウターセンスプライマーは、配列番号10で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通センスプライマーである、請求項14に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 前記(2)の共通アウターアンチセンスプライマーは、配列番号11で表される塩基配列の一部又は全部を含む共通アンチセンスプライマーである、請求項14又は15に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 全ての遺伝子増幅用プライマーは、10−40塩基長である、請求項7−16のいずれか1項に記載の遺伝子増幅用プライマーセット。
- 請求項7−17のいずれか1項に記載の遺伝子増幅用プライマーセットを含む、ロタウイルスの遺伝子型検出用キット。
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