JPWO2020054462A1 - 生体膜ホスホイノシタイドの分離方法 - Google Patents

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Abstract

ＰＩＰｓを脱アシル化することなくＰＩＰｓの異性体を分離することが可能な分離方法を提供する。当該分離方法は、β−シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類のＰＩＰｓを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類のＰＩＰｓを互いに分離する分離ステップを少なくとも備えている。

Description

本発明は、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３，４，５位水酸基がリン酸化を受けたリン脂質である生体膜ホスホイノシタイドの分離方法に関するものである。
図１に示されているように、ホスホイノシタイド（以下、ＰＩＰｓ）には、リン酸化を受けた数や位置が互いに異なるＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ３の７種が存在する。
ジアシルグリセロール（ＤＧ）が同一である場合に、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２の３種はそれぞれ異性体であり同一の質量をもつため、７種のＰＩＰｓを個別に定量するためには、上記の異性体をクロマトグラフィーによって分離する必要がある。
しかしながら、ＰＩＰｓの異性体をクロマトグラフィーによって分離するメソッドは確立されていない。そのため、これまでは、ＰＩＰｓの異性体を分離せずに一纏めで定量する方法や、ＰＩＰｓのジアシルグリセロールを切断（脱アシル化）し、イノシトール環部分を使って異性体を分離する方法が採られていた（非特許文献１、２を参照。）。
質量分析計を用いたイノシトールりん脂質の一斉定量分析法の開発 中西広樹、佐々木純子、佐々木雄彦ら 脂質生化学研究 Vol.54, P88-89, 2012 微量脂質成分測定のための質量分析技術の現状 田口良、中西広樹 実験医学 Vol.28, No.20（増刊）, 2010
ＰＩＰｓの異性体を分離せずに一纏めで定量する方法では、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）ＰをＰＩＰ１として、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２をＰＩＰ２として、ジアシルグリセロール（ＤＧ）の種類の違いごとの定量がなされる。そのため、異性体ごとの定量を行なうことができない。
また、ＰＩＰｓを脱アシル化し、イノシトール環部分を使って異性体を分離する方法では、イノシトール環部分ごとの定量を行なうことができる一方で、ＤＧに関する情報を得ることができない。
本発明の目的は、ＰＩＰｓを脱アシル化することなくＰＩＰｓの異性体を分離することが可能な分離方法を提供することにある。
本発明者らは、担体にβ−シクロデキストリンを結合させた分離媒体が充填された分離カラムを用いた超臨界流体クロマトグラフィーによって、脱アシル化を行なうことなくＰＩＰｓの異性体を分離することができることを見出した。これは、液体クロマトグラフィーに比べて分子形状認識能が高い超臨界クロマトグラフィーにおいて、分離媒体としてβ−シクロデキストリンを含むものを用いることで、図４に示されているように、ＰＩＰｓに対して疎水的相互作用、水素結合、包接、静電気的相互作用など複数種の作用が働き、これまで分離の困難であった非脱アシル化状態のＰＩＰｓの異性体が互いに分離されるものと考えられる。なお、図４のＲ１はアルキル基と極性基からなるスペーサである。
すなわち、本発明に係るＰＩＰｓの分離方法は、β−シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類のＰＩＰｓを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類のＰＩＰｓを互いに分離する分離ステップを備えているものである。
したがって、本発明の分離方法は、ＰＩＰｓの複数の異性体を含む試料の分離に適している。
前記複数の異性体とは、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ３のいずれかである。
前記分離ステップの前に、試料中に含まれる前記複数種類のＰＩＰｓのリン酸基をトリメチルシリル−ジアゾメタンによって誘導体化する誘導体化ステップを備え、前記分離ステップの後、前記分離カラムで分離された前記複数種類のＰＩＰｓをそれぞれ質量分析計により検出する検出ステップを備えていることが好ましい。そうすれば、β−シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを経て分離された異性体を含む各ＰＩＰｓを質量分析計によって定量分析することができるので、試料中に含まれる複数種類のＰＩＰｓの個別定量を実現することができる。
前記分離ステップでは、ギ酸メタノール水溶液をモディファイアとして用いることができる。
本発明に係るＰＩＰｓの分離方法は、β−シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類のＰＩＰｓを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類のＰＩＰｓを互いに分離する分離ステップを備えているので、脱アシル化を行なうことなくＰＩＰｓの異性体を分離することができる。
ホスファチジルイノシトール及び各ＰＩＰｓの構造を示す構造式である。 超臨界流体クロマトグラフの構成を示す流路構成図である。 ＰＩＰｓの分離方法の一実施例を示すフローチャートである。 β−シクロデキストリンを含む分離媒体とＰＩＰｓとの間の相互作用を説明するための図である。 同実施例の分離方法によって得られた質量分析計の信号に基づくクロマトグラムの一例である。
以下、図面を参照しながら、本発明に係るＰＩＰｓの分離方法の一実施例について説明する。
この実施例の分離方法は超臨界流体クロマトグラフ（以下、ＳＦＣ）を用いて実施する。この実施例で用いるＳＦＣは、図２に示されているように、分析流路２中において二酸化炭素とモディファイアを送液するための送液ポンプ４、６と、二酸化炭素とモディファイアの混合流体が流れる分析流路２中に試料を注入するための試料注入部８と、試料注入部８により注入された試料を分離するための分離カラム１０と、少なくとも分離カラム１０を流れる二酸化炭素が超臨界状態となるように分析流路２内の圧力を所定圧力に制御する背圧制御器（ＢＰＲ）１２と、感度良く検出するためのメイクアップを送液するポンプ１５と、ＢＰＲ１２の後段側に設けられた質量分析計（ＭＳ）１４と、を備えている。
図示は省略されているが、分離カラム１０はカラムオーブン内に収容されており、設定された温度に一定に制御される。分離カラム１０は、有機物を包接し得るシクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填されたものであり、例えば、信和化工株式会社製のＵＬＴＲＯＮ ＡＦ−ＨＩＬＩＣ−ＣＤを用いることができる。
上記のＳＦＣで複数種類のＰＩＰｓを含む試料の分離分析を可能にするために、試料中のＰＩＰｓのリン酸基を誘導体化し、ＭＳ１４によって各ＰＩＰｓを検出可能な状態にする。
誘導体化の処理は、例えば以下の（１）〜（５）の手順により行なうことができる。
（１）ＰＩＰｓを含む試料溶液に２Ｍ トリメチルシリル−ジアゾメタンヘキサン溶液を添加する。
（２）２Ｍ トリメチルシリル−ジアゾメタンヘキサン溶液の添加された試料溶液を室温で一定時間（例えば１０分間）放置し、誘導体化反応を行なう。
（３）窒素雰囲気下で試料溶液に氷酢酸を添加し、誘導体化反応を停止させる。
（４）所定の洗浄液（例えば、クロロホルム：メタノール：水＝８：４：３の混合液）を試料溶液に添加して混合した後、遠心分離して下層を回収する。同様の洗浄を複数回繰り返してもよい。最後に試料溶液にメタノール：水＝９：１の溶液を添加する。
（５）窒素雰囲気下で試料溶液を乾固する。その後、試料に所定量のメタノールを添加し、超音波で溶解させる。さらに所定量の水を試料に添加する。
上記のようなＰＩＰｓの誘導体化は、論文「Quantification of PtdInsP3 molecular species in cells and tissues by mass spectrometry Jonathan Clark, Karen E Anderson, Veronique Juvin, Trevor S Smith, Fredrik Karpe, Michael J O Wakelam, Len R Stephens & Phillip T Hawkins」に開示されている。
超臨界流体クロマトグラフィーのモディファイアとしては、０．１％ギ酸メタノールと水の混合液（例えば、ギ酸メタノール：水＝９７．５：２．５）を用いることができる。また、モディファイアとしてギ酸又はギ酸アンモニウムを含むメタノール（例えば、０．１％ギ酸メタノール）を用いることができる。
すなわち、この実施例のＰＩＰｓの分離方法は、図３のフローチャートに示されているように、上述の誘導体化処理を実施した後（ステップＳ１）、試料注入部８によって試料をＳＦＣの分析流路２中に注入し（ステップＳ２）、シクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填された分離カラム１０によってＰＩＰｓの異性体を分離する（ステップＳ３）。さらに、分離カラム１０で分離された各ＰＩＰｓを順次、ＭＳ１４に導入して検出する（ステップＳ４）。
図５は、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ３の７種のＰＩＰｓを含む試料を、上記実施例の方法を用いて分析して得られたクロマトグラムであり、横軸は時間、縦軸は信号強度である。この分析では、分離カラム１０として信和化工株式会社製のＵＬＴＲＯＮ ＡＦ−ＨＩＬＩＣ−ＣＤ（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を用い、分離カラム１０の設定温度を４℃とした。また、モディファイアとして０．１％ギ酸メタノールと水の混合液（例えば、ギ酸メタノール：水＝９７．５：２．５）を用い、移動相中におけるモディファイア濃度を、０−７分の時間帯で５％、７．０１−１０分の時間帯で３０％、１０．０１−１６分までの時間帯で５％と時間ごとに変化させた。移動相の流量を３ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップの流量を０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、ＢＰＲ１２の設定圧力を１０ＭＰａとした。
図５のクロマトグラムから、互いに異性体であるＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２の３種がそれぞれ分離していることがわかる。ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２の３種はそれぞれ同じ質量をもっているが、ＳＦＣによって分離されているため、各異性体をＭＳ１４によって個別に検出して定量することが可能である。
以上のことから、シクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填された分離カラムをもつＳＦＣとＭＳとの組合せにより、７種のＰＩＰｓの個別定量が可能であることがわかる。
２ 分析流路
４，６，１５ 送液ポンプ
８ 試料注入部
１０ 分離カラム
１２ 背圧制御器（ＢＰＲ）
１４ 質量分析計（ＭＳ）

Claims (5)

  1. β−シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類の生体膜ホスホイノシタイドを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドを互いに分離する分離ステップを備える生体膜ホスホイノシタイドの分離方法。
  2. 前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドが、生体膜ホスホイノシタイドの複数の異性体を含む、請求項１に記載の分離方法。
  3. 前記複数の異性体が、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ２、ＰＩ（３,５）Ｐ２、ＰＩ（４,５）Ｐ２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ３のいずれかである、請求項２に記載の分離方法。
  4. 前記分離ステップの前に、前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドのリン酸基をトリメチルシリル−ジアゾメタンによって誘導体化する誘導体化ステップを備え、
    前記分離ステップの後、前記分離カラムで分離された前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドをそれぞれ質量分析計により検出する検出ステップを備えている、請求項１に記載の分離方法。
  5. 前記分離ステップでは、ギ酸メタノール水溶液をモディファイアとして用いる、請求項１に記載の分離方法。
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