JPWO2019177053A1

JPWO2019177053A1 - 全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤及び膠原病の予防又は治療剤

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Publication number: JPWO2019177053A1
Application number: JP2020506621A
Authority: JP
Inventors: 勝実前仲; 喜美子黒木; 直良前田; 千聖山田; 愛実 ▲高▼橋
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2021-04-22
Also published as: WO2019177053A1

Abstract

全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とする。

Description

本発明は、全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤及び膠原病の予防又は治療剤に関する。

ＨＬＡ−Ｇは、非古典的ＭＨＣＩ分子の１つであり、ＨＬＡ−Ｇ分子は、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＬＲ）などの抑制性受容体への結合により、骨髄系単球細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をはじめとする広範な免疫細胞の免疫応答を阻害し、免疫寛容を誘導する。

ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、ヒト生体内で多様な形態で存在し、天然の抑制性分子として機能している。ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、ペプチド、重鎖、β２ミクログロブリンからなるヘテロ三量体として存在する。一方、ドメイン欠損型のＨＬＡ−Ｇ２アイソフォームは、ドメイン欠損重鎖のみからなるホモ二量体である。ＨＬＡ−Ｇ２については、ＨＬＡ−Ｇ１の機能を補完する活性を持つことが知られていたが、詳細な機能については長期間にわたって不明であった。

近年、ＨＬＡ−Ｇ２について、種々の報告がなされている。非特許文献１には、ＨＬＡ−Ｇ２がホモ二量体として存在すること、受容体として免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ２を介してシグナルを伝達することが開示されている。また、非特許文献２及び特許文献１には、ＨＬＡ−Ｇ２について、ｉｎｖｉｖｏで抗炎症効果を解析した結果、マウス受容体ＰＩＲ−Ｂに強固に結合すること、関節リウマチモデルマウスへの単回投与により長期間の免疫抑制効果が得られたことが開示されている。

全身性エリテマトーデス（全身性紅斑性狼瘡、ＳｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓＥｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。全身性エリテマトーデスの薬物治療においては、一般的に、非ステロイド性抗炎症薬、プレドニゾロン等のステロイド剤などが使われている。

特開２０１５−１４０３２２号公報

ＣｕｔｔｉｎｇＥｄｇｅ：ＣｌａｓｓＩＩ−ｌｉｋｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＦｅａｔｕｒｅｓａｎｄＳｔｒｏｎｇＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅＮｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌＨＬＡ−Ｇ２ＩｓｏｆｏｒｍＨｏｍｏｄｉｍｅｒ．ＫｕｒｏｋｉＫｅｔａｌ，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２０１７Ｍａｙ１；１９８（９）：３３９９−３４０３．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６０１２９６．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄｄｉｍｅｒｏｆＨＬＡ−Ｇ２ｉｓｏｆｏｒｍｉｎｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｍｉｃｅ．ＴａｋａｈａｓｈｉＡｅｔａｌ，ＨｕｍＩｍｍｕｎｏｌ．２０１６Ｓｅｐ；７７（９）：７５４−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｈｕｍｉｍｍ．２０１６．０１．０１０．

しかしながら、全身性エリテマトーデスの予防又は治療効果に関与するＨＬＡ−Ｇ又はその多量体については、今まで報告がなされていなかった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＨＬＡ−Ｇ又はその多量体について新規の医薬用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、ＨＬＡ−Ｇ又はその多量体について、全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患及び膠原病の予防又は治療剤としての新規の医薬用途を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、
ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とする。

例えば、前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体である。

例えば、前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
であって、
前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である。

例えば、前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である。

例えば、前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体からなり、
前記タンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である。

例えば、ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ〜１００ｋＤａである。

例えば、前記タンパク質は、下記（ａ）または（ｂ）に記載するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
前記多量体が、前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体であり、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性を有するものである。

本発明の第２の観点に係る膠原病の予防又は治療剤は、
ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とし、全身投与に用いられる、
ことを特徴とする。

本発明によれば、ＨＬＡ−Ｇ又はその多量体について、全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患及び膠原病の予防又は治療剤としての新規の医薬用途を提供することができる。

（Ａ）はＨＬＡ−Ｇ２をゲルろ過クロマトグラフィーに供した結果を示す図であり、（Ｂ）は（Ａ）のピーク（矢印部分）から分取した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。（Ａ）は、ＬＩＬＲＢ２又はＢＳＡ（ネガティブコントロール）に対するＨＬＡ−Ｇ２の結合を示す図であり（実線：ＬＩＬＲＢ２をセンサーチップに固定化した場合、点線：ＢＳＡをセンサーチップに固定化した場合）、（Ｂ）は、ＬＩＬＲＢ２に対する各種濃度（１３．３ｎＭ、２６．６ｎＭ、５３．１ｎＭ）のＨＬＡ−Ｇ２の反応（結合及び解離）を、表面プラズモン共鳴実験により評価した結果を示す図である。ＰＩＲ−Ｂに対する各種濃度（０．０９５μＭ、０．１９μＭ、０．３８μＭ、０．７６μＭ、１．５２μＭ）のＨＬＡ−Ｇ２の反応（結合及び解離）を、表面プラズモン共鳴実験により評価した結果を示す図である。（Ａ）は、ＰＢＳ投与後のＳＬＥモデルマウスの体重推移を示したグラフ図であり、（Ｂ）は、ＨＬＡ−Ｇ２投与後のＳＬＥモデルマウスの体重推移を示したグラフ図である。ＨＬＡ−Ｇ２投与後のＳＬＥモデルマウスの血中抗核抗体量を測定したグラフ図であり、（Ａ）は投与７２日後の結果を示すグラフ図であり、（Ｂ）は体重が顕著に多いマウス１匹を除いた結果を示すグラフ図である。ＨＬＡ−Ｇ２投与後のＳＬＥモデルマウスの尿蛋白量を測定したグラフ図であり、（Ａ）は投与７６日後の結果を示すグラフ図であり、（Ｂ）は投与８６日後の結果を示すグラフ図である。ＨＬＡ−Ｇ２投与後のＳＬＥモデルマウスの腎臓組織を評価した図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のＩＦＮ−ＤＣにおけるサイトカインについて、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示す図であり、（Ａ）はＩＬ−６産生を示すグラフ図であり、（Ｂ）はＩＬ−１０産生を示すグラフ図である。各組換えタンパク質の一次構造（左）及び分子模式図（右）を表す図であり、（ａ）はＨＬＡ−Ｇ２、（ｂ）はＬＩＬＲＢ２を示す模式図である。（ａ）はＨＬＡ−Ｇ２の調製において封入体巻き戻し後、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラムを用いたＳＥＣ精製のクロマトグラムを示した図であり、（ｂ）は還元剤（ＴＣＥＰ）の添加によって得られたＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２のＣＢＢ染色の結果を示した図である。ＰＥＧ分子量による反応効率の比較を示した図であり、（ａ）はＣＢＢ染色、（ｂ）はＢａＩ２染色の結果を示す図である。各分子量のＰＥＧによるＰＥＧ化反応液のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬを用いたＳＥＣ精製、濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色した結果を示す図であり、（ａ）はＰＥＧ５−ＨＬＡ−Ｇ２、（ｂ）はＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２、（ｃ）はＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２、（ｄ）はＰＥＧ４０−ＨＬＡ−Ｇ２の結果を示す図である。センサーチップＣＡＰ上へのビオチン化タンパク質固定化の原理を表す模式図であり、（ａ）はセンサーチップＣＡＰ上に一本鎖ＤＮＡを固定化した様子を表す模式図であり、（ｂ）はストレプトアビジンをチップ上に固定した様子を表す模式図であり、（ｃ）はビオチン化ＬＩＬＲＢ２及びビオチン化ＢＳＡを固定化した様子を表す模式図である。ＬＩＬＲＢ２受容体との結合実験により得られたセンサグラムを示す図であり、（ａ）はＨＬＡ−Ｇ２、（ｂ）はＰＥＧ５−ＨＬＡ−Ｇ２、（ｃ）はＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２、（ｄ）はＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２の結果を示す図である。ＳＬＥモデルマウスを用いた試験の概要を示す図である。ＳＬＥモデルマウスの体重推移を示したグラフ図である。（ａ）はＳＬＥモデルマウスの血中抗ｄｓＤＮＡ抗体価を測定したグラフ図であり、（ｂ）は投与９０日後の結果を示すグラフ図である。ＳＬＥモデルマウスの尿中アルブミン指数を測定したグラフ図である。ＳＬＥモデルマウスのＢｌｙｓ血中濃度を測定したグラフ図である。（ａ）はＳＬＥモデルマウスの血中抗ｄｓＤＮＡ抗体価を測定したグラフ図であり、（ｂ）はＳＬＥモデルマウスの尿中アルブミン指数を測定したグラフ図である。

本実施形態による全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤について詳細に説明する。

本実施形態による全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とする（ＨＬＡ：ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ（ヒト白血球型抗原））。

本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体について説明する。

本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇは、好ましくはヒト由来のＨＬＡ−Ｇである。なお、ヒトのＨＬＡ−Ｇ分子の配列情報は、例えばＮＣＢＩ等により既に公知である。具体的には、アイソフォームの一つとして、ＮＣＢＩには、ＮＭ＿００２１２７．５にヒト由来のＨＬＡ−Ｇ全長（＝ＨＬＡ−Ｇ１）の遺伝子配列が記載されており、このうちＨＬＡ−Ｇのα１ドメイン及びα３ドメインの遺伝子領域に相当する塩基配列が、それぞれ下記に示す配列番号２の「１〜２７０番目の塩基配列」及び「２７１〜５４０番目の塩基配列」である。なお、ＨＬＡ−Ｇ分子には種々のアイソフォームが存在しており、アイソフォームによってそれらのアミノ酸配列は若干相違する。

本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇ多量体は、例えば、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体であり、好ましくは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
であって、
前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である。

本明細書において、「ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体」を“ＨＬＡ−Ｇ２”又は“ＨＬＡ−Ｇ２多量体”と称する場合がある。

上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の二量体のうちの一つである。ここでＨＬＡ−Ｇ分子は、好ましくはヒト由来のＨＬＡ−Ｇである。当該配列番号１において「１〜９０番目のアミノ酸領域」がα１ドメインのアミノ酸配列に相当し、「９１〜１８０番目のアミノ酸領域」がα３ドメインのアミノ酸配列に相当する。また、当該アミノ酸配列（配列番号１）をコードする塩基配列を表す配列番号２において「１〜２７０番目の塩基配列」領域がα１ドメインをコードする遺伝子領域に相当し、「２７１〜５４０番目の塩基配列」領域がα３ドメインをコードする遺伝子領域に相当する。

上記の「１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」として、ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体（α１−３連結体）のアミノ酸配列（配列番号１）のＣ端側にさらにＨＬＡ−Ｇ分子のイントロン４によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３）を有するタンパク質が例示され、本明細書においてこれを“ＨＬＡ−Ｇ２”と称する場合がある。また、他の「１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」として、ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体のアミノ酸配列（配列番号１）のＣ端側にさらにＨＬＡ−Ｇ２分子の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）を有するタンパク質を例示することができる。

「１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」のうち、好ましくは上記ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体の多量体の機能（白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性）を備え、かつ当該α１−３連結体のアミノ酸配列（配列番号１）と好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上同一のアミノ酸配列を有することを限度として、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるタンパク質である。より好ましくは上記連結体のアミノ酸配列（配列番号１）と９６％以上同一、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である。

本明細書において、ＨＬＡ−Ｇ多量体のうち、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、であって、前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体を、“ＨＬＡ−Ｇ２多量体”と称する場合がある。

本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇ２多量体は、前述するＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体そのもの（以下これを単に「α１−３連結体」ともいう）に限定されず、ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結構造を有し、かつ当該多量体が白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）に対して結合活性を有するものであればよい。例えば、上記条件を有するものである限り、当該ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体（α１−３連結体）のアミノ酸配列（配列番号１）のうち、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。ここで、「白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）に対する結合活性」とは、ＨＬＡ−Ｇ２多量体がＬＩＬＲＢ２と直接結合する活性であって、これによりＬＩＬＲＢ２を介してシグナルを伝達し、免疫制御効果を発揮することができる活性を意味する。

なお、ＨＬＡ−Ｇ２多量体が、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合活性を有するか否かの確認は、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマを用いたレポーターアッセイなどにより行うことができる。かかるＴ細胞ハイブリドーマとしては、ＬＩＬＲＢ２の細胞外ドメインと活性型受容体ＰＩＬＲβの膜貫通・細胞内ドメインを融合させたキメラ分子を発現したＮＦＡＴ−ＧＦＰ導入レポーター細胞（マウスＴ細胞ハイブリドーマ）を例示することができる。この場合、ＨＬＡ−Ｇ２多量体がＬＩＬＲＢ２受容体に結合すると、ＰＩＬＲβの細胞内ドメインを介したシグナルが伝達され、転写因子ＮＦＡＴが活性化される。レポーターアッセイは、当該ＮＦＡＴの活性化によりＧＦＰの発現が誘導されることを利用したアッセイ系である。ＧＦＰ発現は、ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２多量体とが結合したことを示すが、かかるＧＦＰ発現による蛍光の出現はフローサイトメトリーで確認することができる。

ＨＬＡ−Ｇ２多量体は、前述するＨＬＡ−Ｇ２同士が、ジスルフィド結合するか、またはジスルフィド結合によらないで非共有結合的に結合することにより、多量体化したものである。なお、本実施形態におけるＨＬＡ−Ｇ２多量体において、例えば、自然形成するホモ二量体の場合、ジスルフィド結合によらず多量体化し、システイン残基（Ｃｙｓ４２）は分子表面にフリーのまま存在していてもよく、また、ホモ二量体を１単位とするさらなる二量体（四量体）又はそれらのさらなる多量体の場合、ホモ二量体分子表面に存在するシステイン残基（Ｃｙｓ４２）同士を介したジスルフィド結合により多量体化していてもよい。さらに、自然形成するホモ二量体の場合、ジスルフィド結合によらず多量体化し、また、ホモ二量体を１単位とするさらなる二量体（四量体）又はそれらのさらなる多量体の場合、ホモ二量体分子表面に存在するシステイン残基以外のアミノ酸残基同士を介した結合により多量体化していてもよい。本実施形態において、ホモ二量体の場合、好ましくはジスルフィド結合によらずに二量体化する。また、ＨＬＡ−Ｇ２多量体のタンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されていてもよい。ＰＥＧ化修飾されたＨＬＡ−Ｇ２多量体については、後述する。

ＨＬＡ−Ｇ２多量体は、前述するα１−３連結体同士又は変異型同士からなるホモ多量体であってもよいし、またはα１−３連結体と変異型からなるヘテロ多量体であってもよく、限定はされない。好ましくはα１−３連結体同士からなるホモ多量体である。

また、ＨＬＡ−Ｇ２多量体は、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合部位を表面に露出した構造を有し、これらの受容体との結合が立体障害により妨げられないものである。そのため、ＨＬＡ−Ｇ２多量体は、ＨＬＡ−Ｇ２と同種の機能（白血球Ｉｇ様受容体への結合活性）を保持しうる構造を有する。

なお、本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体には、例えば、ＨＬＡ−Ｇ１（ＮＣＢＩ、ＮＭ＿００２１２７．５）（細胞外ドメイン：配列番号１１）、（全長（ＮＣＢＩ、ＮＭ＿００２１２７．５、シグナル配列、ストークス領域以下も含む）：配列番号１２）及びＨＬＡ−Ｇ１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。

ＨＬＡ−Ｇ２多量体の調製方法について例示して説明する。

まず、公知の遺伝子組換え技術を用いて、ＨＬＡ−Ｇ２多量体のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば、配列番号２）を発現ベクター等に組込んだ組換えベクターを構築し、次いで、公知の各種形質転換法により、構築した組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体を発現させ、回収することにより行うことができる。

ここでＨＬＡ−Ｇ２多量体のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとα３ドメインとの連結体のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）のほか、当該連結体のアミノ酸配列の一部を欠失、置換または付加してなる前述のＨＬＡ−Ｇ２（以下、これを便宜上「変異型ＨＬＡ−Ｇ２」という場合がある）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いることもできる。また、収量増加の観点から、ＨＬＡ−Ｇ２のアミノ酸配列をコードする遺伝子として、例えば配列番号２に示す塩基配列の第１〜１８番目（ＨＬＡ−Ｇ２のアミノ酸配列において１〜６番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相当する）の塩基配列を、配列番号５に示す塩基配列で置換して得られる遺伝子（以下、「改変遺伝子」という）（配列番号６）を用いることもできる。

変異型ＨＬＡ−Ｇ２多量体をコードする遺伝子は、α１−３連結体の遺伝子のＤＮＡ配列に変異を導入して調製すればよく、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変異導入法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異導入法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができる。当該キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。

形質転換体の作成に使用される宿主は、導入された組換えベクター等からＨＬＡ−Ｇ２（α１−３連結体、変異型）を発現し得るものであれば、特に限定はされず、例えば、ヒトやマウス等の各種動物に由来する細胞、各種昆虫に由来する細胞、大腸菌などの原核細胞、酵母などの真核細胞、植物細胞等、宿主となりえる公知の細胞が使用できる。

組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体の製造は、具体的には、上述の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物から組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体を採取する工程とを含む方法により行うことができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。

組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体が細胞外に生産される場合は、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中から組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体を採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。

組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体が細胞内に生産される場合は、細胞を破砕することにより組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体を採取することができる。可溶性画分にＨＬＡ−Ｇ２多量体が含まれる場合は、破砕後、遠心分離や濾過などにより、必要に応じて細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除く。残渣除去後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。一方、不溶性画分に封入体としてＨＬＡ−Ｇ２多量体が発現する場合は、破砕後、遠心分離により不溶性画分を単離し、界面活性剤等を含んだバッファーで洗浄、遠心を繰り返すことにより、細胞の破砕残渣を取り除く。得られた封入体はグアニジンや尿素などの変性剤を含むバッファーで可溶化した後、希釈法や透析法を利用した蛋白質の巻き戻しを行う。機能的に巻き戻ったＨＬＡ−Ｇ２多量体の精製は各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。

また、組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体の産生は、形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともでき、産生された組換えＨＬＡ−Ｇ２多量体は、クロマトグラフィー等の手段を適宜選択して精製することができる。

ＨＬＡ−Ｇ２多量体は、どのような方法で得られるものであってもよく、その取得方法に特に限定はされない。

ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、該ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩であってもよい。

また、ＨＬＡ−Ｇ多量体は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体からなり、該タンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩であってもよい。

ＰＥＧ化修飾されるアミノ酸残基は、該タンパク質において受容体との結合に影響しない部位に存在することが好ましい。ＰＥＧ化修飾されるアミノ酸残基として、例えば、リジン残基、システイン残基等を挙げることができる。例えば、システイン残基がＰＥＧ化修飾される場合、該システイン残基は、例えば、ＨＬＡ−Ｇ２の４２番目のフリーのシステイン残基であってもよい。また、任意の部位に存在するアミノ酸残基をシステイン残基に置換し、該システイン残基をＰＥＧ化修飾してもよく、例えば、ＨＬＡ−Ｇの糖鎖修飾部位である８６番目のアスパラギンをシステインに置換し、ＰＥＧ化修飾してもよい。また、任意の部位にシステイン残基を付加し、該システイン残基をＰＥＧ化修飾してもよく、例えば、ＨＬＡ−ＧのＣ末端にシステインを付加し、ＰＥＧ化修飾してもよい。なお、ＰＥＧ化修飾が可能なアミノ酸残基であれば、リジン残基、システイン残基に限らず選択することができる。

本実施形態において、ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの分子量は、例えば、５ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、好ましくは５ｋＤａ〜４０ｋＤａである。ＰＥＧ化修飾の詳細については、後述する。

該タンパク質は、例えば、下記（ａ）または（ｂ）に記載するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
上記多量体が、上記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体であり、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性を有するものであってもよい。該多量体が白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性を有する否かの確認は、前述同様に行うことができる。

次に、本実施形態による改変タンパク質の製造方法について詳細に説明する。

本実施形態による改変タンパク質の製造方法は、例えば、
（Ａ）ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を調製する工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を脱気処理した後、還元処理する工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で還元処理された前記タンパク質をＰＥＧ化修飾する工程と、
を含む。

ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体の詳細については、前述の通りである。任意の方法でＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を調製することができる。

工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られたＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を脱気処理した後、還元処理する工程である。

工程（Ｂ）において、嫌気条件下でＰＥＧ化反応を進行させるために、脱気処理を行う。脱気処理は、例えば、アスピレーターを用いて１時間行ってもよい。脱気処理の前に、例えば、工程（Ａ）で得られたＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質をＰＥＧ化バッファー（例えば、１×Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ），５ｍＭＥＤＴＡ）への置換を行ってもよい。脱気処理の方法として、他の公知の方法を用いてもよい。

工程（Ｂ）において、還元剤は、還元処理によってジスルフィド結合を切断し、ＰＥＧ化ターゲットとなる残基のチオール基を再度露出させ、反応効率を向上させるために、添加される。還元剤は、還元作用を有する任意の還元剤を用いることができ、例えば、マレイミドとシステインを用いた反応時に多用されるｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）を用いてもよい。還元剤としてＴＣＥＰを用いる場合、例えば、ＴＣＥＰを終濃度０．１ｍＭ以上となるように加えてもよい。

工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で還元処理された該タンパク質をＰＥＧ化修飾する工程である。

工程（Ｃ）において、具体的には、ＰＥＧの末端にマレイミド基、スクシンイミド基などの反応性官能基を有するＰＥＧ化試薬と本実施形態のタンパク質を溶液中で反応させることによりＰＥＧ化された改変タンパク質を得ることができる。使用されるＰＥＧ化試薬としては、例えば、システインのＳＨ基とチオエーテル結合を形成する直鎖型メチルＰＥＧｎ（ｎはＰＥＧのリピート数）マレイミド、分岐型（メチル−ＰＥＧｎ）ｎ−ＰＥＧｎマレイミド等が挙げられる。ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの分子量は、例えば、５ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、好ましくは５ｋＤａ〜４０ｋＤａである。ＰＥＧ化試薬として、例えば、反応基としてマレイミド基を持ち、チオール基を認識して反応する高純度直鎖ＰＥＧであるＭＥ−４００ＭＡ（ＭＷ：４２，６５３Ｄａ）（ＰＥＧ４０）、ＭＥ−２００ＭＡＯＢ（ＭＷ：２０，８４１Ｄａ）（ＰＥＧ２０）、ＭＥ−１００ＭＡ（ＭＷ：１０，３０３Ｄａ）（ＰＥＧ１０）、ＭＥ−０５０ＭＡ（ＭＷ：５，３９３Ｄａ）（ＰＥＧ５）（いずれも日油株式会社）等を用いることができる。

工程（Ｃ）において、ＰＥＧが該タンパク質に対して過剰量となるように、例えば、ＰＥＧ：タンパク質＝５：１、１０：１、２０：１、３０：１（モル比）等でＰＥＧ化試薬を混合してもよい。ＰＥＧ化試薬を加え、例えば、４℃で一晩反応させることでＰＥＧ化修飾することができる。前述の通り、該タンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、システイン残基）が、ＰＥＧでＰＥＧ化修飾される。

ＰＥＧ化修飾されたタンパク質は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）による精製を行ってもよい。

他の実施形態による改変タンパク質の製造方法は、例えば、
（Ａ’）ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体を調製する工程と、
（Ｂ’）工程（Ａ）で得られた前記タンパク質の多量体を脱気処理した後、還元処理する工程と、
（Ｃ’）工程（Ｂ）で還元処理された前記タンパク質の多量体をＰＥＧ化修飾する工程と、
を含む。

ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体（ＨＬＡ−Ｇ２又はＨＬＡ−Ｇ２多量体）の詳細については、前述の通りである。

本実施形態が対象とするＨＬＡ−Ｇ２多量体は、前述同様、例えば、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体であり、好ましくは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
であって、
前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である。

工程（Ａ’）において、ＨＬＡ−Ｇ２多量体の調製方法の詳細については、前述の通りである。

改変タンパク質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

本実施形態による予防又は治療剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はＳＬＥに起因して生じる疾患の予防又は治療に用いられる。

全身性エリテマトーデス（全身性紅斑性狼瘡、ＳｙｓｔｅｍｉｃＬｕｐｕｓＥｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。診断基準としては、以下１１項目があり、これらのうち４項目以上を満たす場合、ＳＬＥと診断される（難病情報センターホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｂｙｏｕ．ｏｒ．ｊｐ／）参照）。
（１）顔面紅斑
（２）円板状皮疹
（３）光線過敏症
（４）口腔内潰瘍（無痛性で口腔あるいは鼻咽腔に出現）
（５）関節炎（２関節以上で非破壊性）
（６）漿膜炎（胸膜炎あるいは心膜炎）
（７）腎病変（０．５ｇ／日以上の持続的蛋白尿か細胞性円柱の出現）
（８）神経学的病変（痙攣発作あるいは精神障害）
（９）血液学的異常（溶血性貧血、４，０００／ｍｍ^３以下の白血球減少、１，５００／ｍｍ^３以下のリンパ球減少又は１０万／ｍｍ^３以下の血小板減少）
（１０）免疫学的異常（抗２本鎖ＤＮＡ抗体陽性、抗Ｓｍ抗体陽性又は抗リン脂質抗体陽性（抗カルジオリピン抗体、ループスアンチコアグラント、梅毒反応偽陽性））
（１１）抗核抗体陽性

本実施形態による予防又は治療剤は、ＳＬＥに対して予防又は治療効果を奏する。本実施形態による予防又は治療剤を、ＳＬＥと診断された対象に投与した場合、例えば、該対象の血中抗核抗体量を低減させることができる。また、本実施形態による予防又は治療剤を、ＳＬＥと診断された対象に投与した場合、例えば、該対象の尿蛋白量を低減させることができる。

本実施形態による予防又は治療剤は、ＳＬＥに起因して生じる疾患に対しても予防又は治療効果を奏する。ＳＬＥに起因して生じる疾患は、蛋白尿、腎炎、リンパ節腫大等のいわゆるＳＬＥ予備群と称される病態も含まれる概念であり、例えば、ＳＬＥの確定診断がなされていなくても、蛋白尿、腎炎、リンパ節腫大等の症状を呈する対象に本実施形態による予防又は治療剤を投与することで、予防又は治療効果が得られる。

本実施形態による予防又は治療剤の投与方法は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与、局所投与等、適宜選択され得る。投与剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。

本実施形態による予防又は治療剤の投与量及び投与間隔は、患者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１週間に３〜４回投与又は２〜３回投与であってもよいが、これに制限されるものではない。なお、本実施形態による予防又は治療剤は、局所的ではなく全身におけるサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生を誘導することで、ＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患に対して効果を奏するものである。後述する自己寛容性獲得の観点から、本実施形態による予防又は治療剤の投与量は、好ましくは、０．３５ｍｇ／体重１ｋｇ以上、０．４ｍｇ／体重１ｋｇ以上、０．４５ｍｇ／体重１ｋｇ以上、０．５ｍｇ／体重１ｋｇ以上、１ｍｇ／体重１ｋｇ以上であり、投与間隔については、好ましくは、１週間に少なくとも１回以上である。また、作用機序の異なる既存薬との併用により、本実施形態による予防又は治療剤の投与量及び投与回数を低減できる可能性がある。なお、本実施形態による治療剤の投与は、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。

本実施形態によるＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とする。ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよく、また、保存安定性（特に活性維持）を考慮して適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、さらには、結晶化状態で用いられてもよく、溶解状態で用いられてもよい。

本実施形態によるＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、有効成分としてＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を含む以外、他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該予防又は治療剤の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。これらの他の成分は、本発明の有効成分により発揮されるＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患に対する予防又は治療効果が損なわれない範囲で適宜含有させることができる。

また、有効成分としてのＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、より高純度となるように精製されたものであることが好ましい。具体的には、例えば５０％以上の純度が好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。

次に、本実施形態による膠原病の予防又は治療剤について詳細に説明する。

本実施形態による膠原病の予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とし、全身投与に用いられる、ことを特徴とする。好ましくは、ＨＬＡ−Ｇ多量体は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体である。好ましくは、ＨＬＡ−Ｇ多量体は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、であって、前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である。各用語の詳細については、前述同様である。

本実施形態による膠原病の予防又は治療剤は、例えば、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、アレルギー性肉芽腫性血管炎（チャーグ・ストラウス症候群）、成人スティル病、好酸球性筋膜炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎・顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、ウェゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、悪性関節リウマチ等を含む膠原病に、全身投与することで用いられる。本実施形態による予防又は治療剤の投与方法は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対する全身投与に用いるために、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等の投与方法が選択される。投与剤型、投与量、投与間隔、有効成分等については、前述同様である。

以上説明したように、本実施形態によるＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患の予防又は治療剤は、有効成分としてＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を含み、ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体の機能は主に抗原提示細胞に発現する抑制性受容体ＬＩＬＲＢ２を介するものであるため、エフェクター細胞機能への影響が低減され、抗原提示細胞を介するマイルドで長期的な免疫抑制効果が期待される。また、ＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患の他の製剤との併用薬として用いることが可能である。治療法が確立していないＳＬＥ又はＳＬＥに起因して生じる疾患の予防又は治療剤として、既存生物製剤とは作用機序の異なる新規製剤としての発展が期待される。また、本実施形態による膠原病の予防又は治療剤は、後述するように、単球、マクロファージ、樹状細胞などの末梢血由来ミエロイド系細胞において自己寛容性獲得に関与するサイトカインである１Ｌ−６及び１Ｌ−１０の産生誘導作用を有し、全身投与されることで、膠原病に対して予防又は治療効果を奏する。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
（ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質の調製）
（１）α１−３連結体を大腸菌で封入体として発現
ｐＧＭＴ７ベクターを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体（α１−３連結体）をコードする遺伝子の改変体（配列番号６）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し、改変型ＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７を構築した。

なお、改変型ＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７は、下記の方法で行った。まずＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７プラスミドを鋳型にして、ＰＣＲ用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｄｅｏｘｙＮＴＰ混合液（ＴＯＹＯＢＯ社製）、５’側プライマー（ａｔｇｇｇｔａｇｔｃａｔａｇｔａｔｇｃｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃｇｃｇｇｃｃｇｔｇａｇ：配列番号９）、３’側プライマー（ｃｔｃａｃｇｇｃｃｇｃｇｃｔａａａａｔａａｃｇｃａｔａｃｔａｔｇａｃｔａｃｃｃａｔ：配列番号１０）（それぞれ最終濃度０．２μＭ）及びＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、ＰＣＲを行った。その際、反応は変性３０秒（９５℃）、アニール１分（６０℃）、エクステンション８分（６８℃）にて２５サイクル行った。次に、ＰＣＲ産物にＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）を加え、３７℃で１時間反応させ、鋳型を除去し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の存在を確認した。そして、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列を確かめ、改変型ＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７プラスミドを得た。

次に、この改変型ＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７プラスミドで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（０．５％塩化ナトリウム、１．６％トリプトン、１％乾燥酵母エキス（以上、ナカライテスク社製））中で、３７℃で培養した。次に、培養懸濁液がＯＤ６００＝０．４〜０．６に達した時点で、１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４〜６時間発現誘導した。

（２）大腸菌封入体の巻き戻し
ＩＰＴＧを添加して発現誘導した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０，１００ｍＭ塩化ナトリウム）を加え、懸濁し、超音波破砕で菌体を破砕した後、遠心分離して封入体を得た。この封入体をＴｒｉｔｏｎｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）及びＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）で十分洗浄した後に、６．０ＭＧｕａｎｉｄｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（６．０Ｍグアニジン、５０ｍＭメスｐＨ６．５、１０ｍＭＭＥＤＴＡ）で可溶化した。この時点で、ＨＬＡ−Ｇ２溶液を紫外吸光法により測定したところ、Ａ２８０値が約７０であり、ＨＬＡ−Ｇ２の発現量はおよそ１００ｍｇ／Ｌであると考えられる。Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．１ＭトリスｐＨ８．０、０．４ＭＬ−アルギニン、５ｍＭＥＤＴＡ、３．７ｍＭシスタミン、６．４ｍＭシステアミン）を用いて一般的な希釈法で４℃、７２時間撹件しながら巻き戻した。そして、これを濃縮した後、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供して精製した。
＜ゲルろ過クロマトグラフィー条件＞
カラム：ＨｉＬｏａｄ２６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（６０ｃｍ、ｉｄ２６ｍｍ）
移動相：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）
流速：２．５ｍｌ／ｍｉｎ

ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを図１（Ａ）に示す。目的のピーク画分（矢印部分）を分取し、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲル）に供した。その結果を図１（Ｂ）に示す。ＨＬＡ−Ｇ２二量体の分子量（４２ｋＤａ）から、当該ピークがＨＬＡ−Ｇ２の溶出画分であることを確認し、当該画分を回収濃縮してＨＬＡ−Ｇ２（被験試料）とした。

（３）活性測定
Ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＤ−ｂｉｏｔｉｎ、ｌ００ｍＭＡＴＰ、１５μＭＢｉｒＡ）にＣ末端にビオチン化配列を付加したＬＩＬＲＢ２のＮ末側２ドメイン（Ｄ１Ｄ２）を溶解し、Ｃ末端をビオチン化した。ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）によりｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒからビオチン化ＬＩＬＲＢ２を分離し精製した。

ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅ）を使用し、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との結合性を表面プラズモン共鳴実験により評価した。まず、研究用センサーチップ上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化ＬＩＬＲＢ２とネガティブコントロールであるＢＳＡを固定化した。次に、ランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭへペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３．４ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）に溶解したＨＬＡ−Ｇ２を１０μＬ／分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによって計算した。

図２は、ＬＩＬＲＢ２又はネガティブコントロールであるＢＳＡに対するＨＬＡ−Ｇ２の反応を示す図である。実線はＬＩＬＲＢ２をセンサーチップに固定化した場合を示し、点線はＢＳＡをセンサーチップに固定化した場合を示す。図２（Ａ）によれば、ＢＳＡと比較して、ＬＩＬＲＢ２はＨＬＡ−Ｇ２に結合している。図２（Ｂ）は、ＨＬＡ−Ｇ２二量体とＬＩＬＲＢ２の見かけ上のＫｄ値を示す図である。図２（Ｂ）によれば、見かけ上のＫｄ値は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトにより、１：１結合モデルを用いて解析した結果、１．５ｎＭである。この結果から、ＨＬＡ−Ｇ２はＬＩＬＲＢ２に結合することが確認された。

（マウス免疫抑制性レセプターＰＩＲ−Ｂに対する結合性確認）
ヒト免疫抑制性レセプター（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒＢ）であるＬＩＬＲＢのマウスホモログであるＰＩＲ−Ｂ（ｐｒｉｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒＢ）に対するＨＬＡ−Ｇ２の結合性を、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて評価した。

（１）ＰＩＲ−Ｂの調製
ＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、これを１％ＦＣＳ−ＤＭＥＭで７２時間培養した。ＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号７及び８に示す。なお、ＰＩＲ−Ｂの全長のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＮＭ＿０１１０９５において公表されており、ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインはこのうちドメイン１〜６にあたる部分である。

次いで、培養物から上清を回収し、ＮｉアフィニティクロマトグラフィーによりＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを精製し、ウエスタンブロッティング（１２．５％アクリルアミドゲル）に供して、推定分子量７５ｋＤａから精製取得したタンパク質がＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインであることを確認した。

精製したＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを、Ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＤ−ｂｉｏｔｉｎ、ｌ００ｍＭＡＴＰ、１５μＭＢｉｒＡ）に１５μＭとなるように溶解し、ビオチン化した。ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）によりｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒからビオチン化ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを分離し精製した。

（２）ＨＬＡ−Ｇ２のＰＩＲ−Ｂ（細胞外ドメイン）への結合性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅ）を使用し、ＨＬＡ−Ｇ２と上記で調製したＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインとの結合性を表面プラズモン共鳴実験により評価した。まず、研究用センサーチップ上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインとネガティブコントロールであるＢＳＡを固定化した。次に、ランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭへペスｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３．４ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）に溶解したＨＬＡ−Ｇ２ダイマーを５μＬ／分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによって計算した。みかけの結合定数（Ｋｄ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトにより、１：１結合モデルを用いて解析して得た。

図３は、各濃度ＨＬＡ−Ｇ２（０．０９５μＭ、０．１９μＭ、０．３８μＭ、０．７６μＭ、１．５２μＭ）に対するＰＩＲ−Ｂの反応を示す図である。図３の結果から、１：１結合モデルを用いた解析によるみかけの解離定数（Ｋｄ値）は１４２ｎＭであった。この結果から、ＨＬＡ−Ｇ２は、免疫抑制性レセプターであるヒトＬＩＬＲＢ２に結合するのと同様に（図２参照）、ヒトＬＩＬＲＢ２に相当するマウスのＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインに結合することが確認された。

（実施例２）
（ＳＬＥモデルマウス実験）
ＨＬＡ−Ｇ２をＳＬＥモデルマウスに投与して、ＨＬＡ−Ｇ２のＳＬＥに対する治療効果を検証した。

実施例１で調製したＨＬＡ−Ｇ２又はネガティブコントロールとしてＰＢＳをＳＬＥモデルマウスに下記の通り投与した（“ＨＬＡ−Ｇ２投与群”又は“ＰＢＳ投与群”）。ＳＬＥモデルマウスとして、ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓＳｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）を用い、各投与群１２匹ずつから試験を開始した。なお、ＨＬＡ−Ｇ２については、約３週間ごとに新しいロット（新たに巻き戻し〜精製し直したもの）を投与した。
・投与経路：腹腔内投与
・投与量：１５μｇ／匹（ＨＬＡ−Ｇ２０．０７５ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ投与）
・投与間隔：週２回投与
・投与期間：計１２週

サンプリングを、４週ごとに４匹ずつ行った。投与２０回目まで終了したのは、ＨＬＡ−Ｇ２投与群でｎ＝１０、ＰＢＳ投与群でｎ＝１０であった。また、投与２８回目まで終了したのは、ＨＬＡ−Ｇ２投与群でｎ＝６、ＰＢＳ投与群でｎ＝４であり、この時点で投与終了とした。

副作用発生の指標として、マウスの体重測定を行った。図４に、マウスの体重推移を示す。ＰＢＳ投与群（図４（Ａ））及びＨＬＡ−Ｇ２投与群（図４（Ｂ））の両群において、体重に顕著な変化は見られなかった。

（抗ｄｓＤＮＡ抗体ＥＬＩＳＡ）
レビス抗ｄｓＤＮＡ−マウスＥＬＩＳＡＫＩＴ、シバヤギ社を用いて、血中抗核抗体量を測定した。緩衝液を用いて希釈したマウス血漿検体、および検量線作成用の標準溶液を抗原固相化マイクロプレートに添加した。２時間のインキュベートおよびウェル洗浄後、標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体）を添加した。さらに２時間のインキュベート及びウェル洗浄後、発色液（ＴＭＢ）と２０分間反応させ、酸性溶液（１ＭＨ_２ＳＯ_４）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４５０ｎｍ（副波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各血漿サンプルの抗ｄｓＤＮＡ抗体価を算出した。

図５に、投与７２日後のマウスの血中抗核抗体量を示す。ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群では、血中抗核抗体量の低下が確認された（図５（Ａ））。他のマウスに比して体重が顕著に多いマウス１匹を除いて検証した結果、ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群では、血中抗核抗体量の有意な低下が確認された（図５（Ｂ））。

（尿蛋白量）
尿中アルブミンを、ＥＬＩＳＡキット（レビスアルブミン−マウス、シバヤギ社）を用いて測定した。緩衝液を用いて希釈したマウス尿検体、および検量線作成用の標準溶液を抗アルブミン抗体固相化マイクロプレートに添加した。１時間のインキュベートおよびウェル洗浄後、標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体）を添加した。さらに１時間のインキュベートおよびウェル洗浄後、発色液（ＴＭＢ）と２０分間反応させ、酸性溶液（１ＭＨ_２ＳＯ_４）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４５０ｎｍ（副波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各尿サンプルの尿中アルブミン値を算出した。

また、尿中クレアチニンを、ＥＬＩＳＡキット（尿中クレアチニン測定用ＥＬＩＳＡキット、トランスジェニック社）を用いて測定した。緩衝液を用いて希釈したマウス尿検体、および検量線作成用の標準溶液とＨＲＰ標識抗クレアチニン抗体を混合し、３０分間インキュベートさせた。インキュベート後、混合液を抗原固相化マイクロプレートに添加した。２時間のインキュベート及びウェル洗浄後、発色液（オルトフェニレンジアミン溶液）と１０分間反応させ、酸性溶液（１ＭＨ_２ＳＯ_４）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各尿サンプルの尿中クレアチニン値を算出した。

図６に、投与７６日後及び８６日後のマウスの尿蛋白量（アルブミン（μｇ）／クレアチニン（ｍｇ））を示す。投与７６日後及び８６日後の両方において、ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群では、尿蛋白量の低下が確認された（図６（Ａ）、（Ｂ））。

（免疫組織染色）
投与７９日後のマウスより腎臓を採取しホルマリン固定後、パラフィン包埋、薄切の後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎｓｔａｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色、過ヨウ素酸メセナミン銀染色（Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄ−ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ−ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎ；ＰＡＭ）、過ヨウ素酸シッフ染色（Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆｓｔａｉｎ；ＰＡＳ）により病理組織標本を作製した。

図７に、投与７９日後のマウスの腎臓組織標本を示す。ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群で、Ｈ＆Ｅ染色標本では単核球浸潤及び血管炎の軽減化が、またＰＡＭ染色／ＰＡＳ染色標本では糸球体内の細胞増殖及びメサンギウム領域拡大の軽減化が認められた。

以上より、ＳＬＥモデルマウス（ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓＳｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス）において、週２回のＨＬＡ−Ｇ２の腹腔内投与によって血中抗核抗体量及び尿蛋白質の低下が認められたことから、ＨＬＡ−Ｇ２はＳＬＥに対して治療効果を奏することが明らかとなった。

（実施例３）
（サイトカイン産生誘導）
次に、ヒト単球由来の樹状細胞であるＩＦＮ−ＤＣを用いて、ＬＩＬＲＢ２へのＨＬＡ−Ｇ２結合によってサイトカイン産生誘導が引き起こされるか否か検討した。

ＥｘｐＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１５Ｊａｎ；２４（１）：３５−４１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｅｘｄ．１２５８１．Ｅｐｕｂ２０１４Ｄｅｃ８．ＮｉｅｄａＭｅｔａｌに基づきＩＦＮ−ＤＣを培養し、培養開始２日後に、ＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＬ）又はコントロールとしてのＰＢＳとともに、３７℃、５％ＣＯ_２で、培地（１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質添加）＋１０００Ｕ／ｍＬＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α）中で培養した。培養開始４日後に、培地を交換し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡでは、キットとしてＯｐｔＥＩＡＥＬＩＳＡｈｕｍａｎＩＬ−６ａｎｄＩＬ−１０（ＢＤ）を用いた。

ＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。ＩＦＮ−ＤＣにおいて、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生誘導が確認された。

以上より、ＨＬＡ−Ｇ２はサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生を誘導することから、ＨＬＡ−Ｇ２を全身投与することで、膠原病に対して予防又は治療効果を奏することが示唆された。

（実施例４）
（ＰＥＧ化修飾されたＨＬＡ−Ｇ２によるＳＬＥモデルマウス実験）
ＰＥＧ化修飾されたＨＬＡ−Ｇ２をＳＬＥモデルマウスに投与して、ＳＬＥに対する治療効果を検証した。

（各種組換えタンパク質の調製）
検討に先立ち、以下の通り、各種組換えタンパク質を以下の通り調製及び精製した。

（ＨＬＡ−Ｇ２組換えタンパク質発現プラスミド）
シグナル配列を除去し、Ｎ末端に翻訳開始コドンであるメチオニン残基を付加したＨＬＡ−Ｇ２（ＷＴ）の細胞外領域（Ｇｌｙ１−Ｔｒｐ１８２）を大腸菌発現用ベクターｐＧＭ７に組み込み、さらに発現量増強のためＮ末端近傍５残基分の塩基配列を同義置換した、本願の発明者ら保有の発現用プラスミド（ＨＬＡ−Ｇ２−ｐＧＭＴ７）を用いた（図９（ａ）、塩基配列：配列番号１３、アミノ酸配列：配列番号１４）。

（ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ組換えタンパク質発現プラスミド）
シグナル配列を除去し、開始コドンであるメチオニンを付加したＬＩＬＲＢ２のリガンド結合に関与する細胞外領域Ｎ末端側の２つのＩｇ−ｌｉｋｅドメイン（Ｇｒｙ１−Ｐｒｏ１９７）をｐＧＭ７ベクターに組み込み、さらにＣ末端に１７アミノ酸残基からなるビオチン化酵素認識配列（ＧＳＬＨＨＩＬＤＡＱＫＭＶＷＮＨＲ（配列番号１５））を付加した、本願の発明者ら保有の大腸菌発現用プラスミド（ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ−ｐＧＭ７）を使用した（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，Ａｍａｎｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｒａｋｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，Ｂｒａｕｄ，Ｖ．Ｍ．，Ａｌｌａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｊ．，Ｍａｋａｄｚａｎｇｅ，Ａ．，Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｗｉｌｌｃｏｘ，Ｂ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．，ｖａｎｄｅｒＭｅｒｗｅ，Ｐ．Ａ．，Ｋｕｍａｇａｉ，Ｉ．，ａｎｄＭａｅｎａｋａ，Ｋ．（２００３）ＨｕｍａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｓＩｇ−ｌｉｋｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ２（ＩＬＴ２）ａｎｄＩＬＴ４ｃｏｍｐｅｔｅｗｉｔｈＣＤ８ｆｏｒＭＨＣｃｌａｓｓＩｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｂｉｎｄｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｔｏＨＬＡ−Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，８８５６−６１）（図９（ｂ）、塩基配列：配列番号１６、アミノ酸配列：配列番号１７）。

（大腸菌発現系を用いた各種組換えタンパク質の封入体調製）
本研究で用いた組換えタンパク質はすべて大腸菌を用いて封入体として発現させた。ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ組換えタンパク質は、前述のプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換することにより封入体として発現させた。また、ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質は、前述のプラスミドを用いて大腸菌ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ（ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を本願の発明者らによりｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌに作り替えたもの）を形質転換することにより封入体として発現させた。具体的には、形質転換後、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種後、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２×ＹＴ培地１Ｌに前培養した１０ｍＬの菌液を植菌し、３７℃で振盪培養した。対数増殖前期であるＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）６００＝０．６に達したところで、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて組換えタンパク質の発現を誘導し、その後ＩＮＮＯＶＡ（エッペンドルフ）で１５０ｒｐｍ、３７℃で５時間振盪培養した。培養後の菌液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して得た菌体を懸濁バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ［Ｔｒｉｓ］−ＨＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ）で懸濁し、氷上で超音波破砕を行った。破砕後、８０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、得られた沈殿を封入体として、さらに洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁、８０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する洗浄操作を４回繰り返した。その後、封入体から界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去するために、懸濁バッファーを用いて同様の操作を４回繰り返し、封入体を得た。得られた封入体は可溶化バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１００ｍＭＮａＣｌ，６Ｍｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，１０ｍＭＥｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ［ＥＤＴＡ］）で一晩４℃静置することによって、完全に溶解させた。可溶化後、５０００×ｇ、４℃で５分間遠心して得られた上清を封入体として−８０℃で保存した。タンパク質発現誘導以降の遠心操作はすべてユニバーサル冷却遠心機を用いて行った（ＫＵＢＯＴＡ）。

（巻き戻し法による組換えタンパク質の調製）
ＨＬＡ−Ｇ２及びＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ組換えタンパク質は、大腸菌封入体の希釈法による巻き戻しにより調製した。希釈時の最終濃度が１〜２μＭ程度になるように、ＨＬＡ−Ｇ２（８ｍｇ）、ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ（４ｍｇ）の各可溶化済み封入体にＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）を終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で１時間インキュベートした。ＤＴＴによる還元処理した封入体変性溶液に、タンパク質の凝集抑制効果を持つアルギニンを含むリフォールディングバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１ＭＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ＨＣｌ，２ｍＭＥＤＴＡ，３．７３ｍＭｃｙｓｔａｍｉｎｅ，６．７３ｍＭｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を１滴ずつグアニジン濃度が１．５Ｍ（ジスルフィド結合を組んで、２次構造を取ると考えられている濃度）になるまで加えた。さらに、その希釈溶液を２００ｍＬのリフォールディングバッファーに１滴ずつ加えることによってさらに希釈し、４℃で７２時間攪拌した。

（巻き戻した組換えタンパク質の精製）
希釈法により巻き戻した各組換えタンパク質は、希釈により容量が増えるため、ＶＩＶＡＦＬＯＷｓｙｓｔｅｍ（ＭＷＣＯ：１００００Ｄａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた限外ろ過法、必要に応じてその後ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１００００Ｄａ、ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過法を行ったのちに、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタを用いて、凝集体などの微粒子を取り除き、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）による精製を行った。ＳＥＣは、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒもしくはＡＫＴＡｐｕｒｅシステム（いずれもＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ランニングバッファーとして２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１００ｍＭＮａＣｌを使用した。

具体的には、ＨＬＡ−Ｇ２は、ＶＩＶＡＦＬＯＷｓｙｓｔｅｍで１５ｍＬ以下まで濃縮した後、フィルタ処理を行い、Ｈｉｌｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いて精製した。ＳＥＣで得られた目的のピークフラクションをＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１００００Ｄａ、ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５ｍＬ以下まで濃縮した後、透析法を用いて２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０に置換した。フィルタ処理後、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ１ｍＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに注入した。ＩＥＸは、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，０−０．５ＭＮａＣｌ／２０Ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅ（ＣＶ）の条件で行った。

ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ組換えタンパク質はＶＩＶＡＦＬＯＷｓｙｓｔｅｍ及びＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａを用いて０．５ｍＬ以下まで濃縮した後、フィルタ処理を行ない、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで精製した。ランニングバッファーは２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，２００ｍＭＮａＣｌを使用した。

（ビオチン化ＬＩＬＲＢ２の調製）
ＳＥＣ法により精製したＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡを、体積比でＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡ：５×ＢｉｏｍｉｘＡｂｕｆｆｅｒ（０．２５ＭｂｉｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒｐＨ８．３）：５×ＢｉｏｍｉｘＢｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＡｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ＡＴＰ］，５０ｍＭＭｇＯＡｃ，２５０μＭｄ−ｂｉｏｔｉｎ）＝３：１：１になるように混合して、ＢｉｒＡ酵素１μＬ（本願の発明者らで調製したもの）を加え、３０℃で１時間インキュベートした。その後未反応のビオチンを取り除くために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムでＳＥＣ精製を行った。ランニングバッファーは２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，４００ｍＭＮａＣｌを用いた。

上記の通り調製したＨＬＡ−Ｇ２タンパク質をＳＥＣ精製した結果、これまでの知見と一致して、目的の分子量（ＨＬＡ−Ｇ２：２２ｋＤａ）の約２倍の分子量（４４ｋＤａ）相当の位置に溶出ピークが得られた（図１０（ａ））。

（ＨＬＡ−Ｇ２のＣｙｓ４２残基特異的なＰＥＧ化反応）
上記の通り調製したＨＬＡ−Ｇ２タンパク質を用いて、ＰＥＧ化反応を行った。ＰＥＧ化試薬は、高純度直鎖ＰＥＧであるＭＥ−４００ＭＡ（ＭＷ：４２，６５３Ｄａ）（ＰＥＧ４０）、ＭＥ−２００ＭＡＯＢ（ＭＷ：２０，８４１Ｄａ）（ＰＥＧ２０）、ＭＥ−１００ＭＡ（ＭＷ：１０，３０３Ｄａ）（ＰＥＧ１０）、ＭＥ−０５０ＭＡ（ＭＷ：５，３９３Ｄａ）（ＰＥＧ５）（いずれも日油株式会社）を用いた。これらの試薬は反応基としてマレイミド基を持ち、チオール基を認識して反応する。

（還元剤）
ＰＥＧ化反応前に、還元処理によってジスルフィド結合を切断し、ＰＥＧ化ターゲットとなるＣｙｓ４２残基のチオール基を再度露出させ、反応効率を向上させるために、還元剤を添加した。

精製したＨＬＡ−Ｇ２タンパク質について、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１００００Ｄａ、ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過による濃縮、及びＰＥＧ化バッファー（１×Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＢｕｆｆｅｒｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ），５ｍＭＥＤＴＡ）への置換を行い０．５ｍＬに調製した溶液を、嫌気条件下でＰＥＧ化反応を進行させるために、アスピレーターを用いて１時間脱気処理を行った。続いて、還元剤ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）を終濃度０．１、０．５、１、５、１０ｍＭとなるように加えたあと、ＰＥＧ２０を加え、４℃で一晩反応させた。還元剤として、無臭で使いやすく、マレイミドとシステインを用いた反応時に多用されるｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）を用いた。

ＰＥＧ化反応の進行は、反応液を非還元条件でＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ−ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％アクリルアミドゲル、３０ｍＡ／枚、７０分間泳動）し、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ（ＣＢＢ）染色、及び、ＰＥＧ分子を検出するＢａｒｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（ＢａＩ_２）染色により確認した。ＢａＩ２染色は、泳動後のアクリルアミドゲルを５％ＢａＩ_２溶液（１５分間）、イオン交換水（３０分間）、０．１Ｍヨウ素溶液（５分間）の順に浸して振盪する、という手順で行った。

ＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２の精製はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、あるいはＳｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いたＳＥＣにより行った。ＰＥＧ化反応液を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１００００Ｄａ、ＭｅｒｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＳＥＣランニングバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１００ｍＭＮａＣｌ）へ置換し、０．５ｍＬまで濃縮してカラムへ打ち込んだ。ＳＥＣには、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。精製度は、各フラクションサンプルを非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、銀染色（２Ｄ−ＳＩＬＶＥＲＳＴＡＩＮＲＥＡＧＥＮＴＩＩ、コスモ・バイオ株式会社）で検出して確認した。

反応液を上記の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＣＢＢ染色したところ、目的のＰＥＧ化タンパク質のバンドを確認することができた（図１０（ｂ））。以上の結果からＴＣＥＰを加えることにより反応効率は大きく向上すること、さらに、ＴＣＥＰ終濃度が０．１ｍＭの条件で最も高い反応効率が得られることがわかった。そのため、以後の実験において、ＰＥＧ化反応は０．１ｍＭＴＣＥＰ処理をした条件下で行うこととした。

（ＰＥＧ分子量の検討）
続いて、結合させるＰＥＧの分子量によって、ＰＥＧ化反応効率、ＰＥＧ化タンパク質の精製度が異なるかどうかを検証するため、反応基としてマレイミドを持つ４種類の分子量（５、１０、２０、４０ｋＤａ）の分子量のＰＥＧ化試薬（ＰＥＧ５、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ２０、ＰＥＧ４０）（前述）を用いてＨＬＡ−Ｇ２のＰＥＧ化を行った。得られたＰＥＧ化体は以下の通りである。
・ＰＥＧ５−ＨＬＡ−Ｇ２（ＨＬＡ−Ｇ２をＰＥＧ５でＰＥＧ化したもの）
・ＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２（ＨＬＡ−Ｇ２をＰＥＧ１０でＰＥＧ化したもの）
・ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２（ＨＬＡ−Ｇ２をＰＥＧ２０でＰＥＧ化したもの）
・ＰＥＧ４０−ＨＬＡ−Ｇ２（ＨＬＡ−Ｇ２をＰＥＧ４０でＰＥＧ化したもの）

ＰＥＧ化した反応液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、ＣＢＢ染色及びＢａＩ_２染色し反応の進行を確認したところ、４種類のＰＥＧ化タンパク質すべてを確認できた（図１１（ａ）、（ｂ））。また、ＰＥＧ化タンパク質のバンドの濃さから、ＰＥＧ化反応率については低分子量のＰＥＧ（ＰＥＧ５、ＰＥＧ１０）のほうが高いことが明らかとなった。

これらのＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２を精製する方法として、ＰＥＧ化前後の分子量差を利用して分離するＳＥＣを選択した。４種類のＰＥＧ化反応液についてＳＥＣ精製を行ない、得られたピークフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色によって精製度の確認を行ったところ、ＳＥＣによって、ＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２については目的のＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２を未反応のＨＬＡ−Ｇ２タンパク質と分離して精製することができた（図１２（ｂ）、（ｃ））。

（受容体ＬＩＬＲＢ２との結合実験）
続いて、ＰＥＧ化タンパク質として精製できたＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２及びＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２、並びにＰＥＧ化タンパク質をメインに含むＳＥＣピークとして得られたＰＥＧ５−ＨＬＡ−Ｇ２のＳＥＣ精製後サンプルを用いて、ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）による受容体ＬＩＬＲＢ２との相互作用解析を行い、各分子量のＰＥＧが結合したＨＬＡ−Ｇ２が受容体結合能を維持しているかを確認した。比較対照として、前述の方法により調製されたＰＥＧ化していないＨＬＡ−Ｇ２を用いた。

ＬＩＬＲＢ２は、上述の通り、Ｃ末端側にビオチン化タグが付加されている精製ＬＩＬＲＢ２ｂｉｒＡタンパク質を用いて、酵素による部位特異的ビオチン化後、ＳＥＣ精製によりビオチン化ＬＩＬＲＢ２として調製した。

アナライトとして、２倍ずつ連続希釈したＨＬＡ−Ｇ２（０．２〜０．７μＭ）、ＰＥＧ５−ＨＬＡ−Ｇ２（０．４〜１．６μＭ）、ＰＥＧ１０−ＨＬＡ−Ｇ２（０．３〜１．１μＭ）、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２（０．３〜１．１μＭ）を流した。

（ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）による相互作用解析）
ＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２のＬＩＬＲＢ２結合への影響を確認するために、ＳＰＲ法による相互作用解析をＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。センサーチップ上にはビオチン化ＬＩＬＲＢ２及びコントロールとしてビオチン化ＢＳＡをＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅＫｉｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロトコル通りにセンサーチップＣＡＰに固定化した。センサーチップＣＡＰ上には一本鎖ＤＮＡが固定化されており（図１３（ａ））、そこへストレプトアビジンが付加した相補鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることによってストレプトアビジンをチップ上に固定（図１３（ｂ））、さらにストレプトアビジンとビオチンの相互作用を利用してビオチン化ＬＩＬＲＢ２及びビオチン化ＢＳＡを２００ＲＵ〜５００ＲＵの固定化量で固定化した（図１３（ｃ））。

アナライトとしては、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外ろ過によりランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭＮａ−ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に置換したＨＬＡ−Ｇ２、ＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２各タンパク質溶液について、３段階に２倍ずつ段階希釈したサンプルを、低濃度のものから順番に流速１０μＬ／ｍｉｎで流した。測定温度は２５℃、結合時間及び解離時間はそれぞれ１２０秒でカイネティクス測定を行った。解析にはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：４．１．１（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。

結合解析の結果、３種類すべてのＰＥＧ化体についてＬＩＬＲＢ２との結合を確認することができた（図１４（ｂ）−（ｄ））。

以上の結果から、３種類の分子量でＰＥＧ化効率及び受容体との結合能に大きな差は見られないことから、ＰＥＧ化タンパク質の精製度が高く、さらにＰＥＧ化タンパク質の安定性に寄与すると考えられるＰＥＧ分子量が３つのうちで最も大きい２０ｋＤａのＰＥＧで修飾した「ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２」を用いてＳＬＥモデルマウス実験を行うこととした。

（各投与タンパク質（ＨＬＡ−Ｇ２、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２）の調製）
続いて、マウスへの各投与タンパク質を調製した。前述の通りＳＥＣ精製により得られたＨＬＡ−Ｇ２及びＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２を、透析法によりＰＢＳバッファーに置換し、投与タンパク質溶液とした。

（投与試験）
前述の通り調製したＨＬＡ−Ｇ２、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２又はネガティブコントロールとしてＰＢＳをＳＬＥモデルマウスに下記の通り投与した（“ＨＬＡ−Ｇ２投与群”、“ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群”又は“ＰＢＳ投与群”）。ＳＬＥモデルマウスとして、ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓＳｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）を用い、各投与群８匹ずつから試験を開始した。なお、ＨＬＡ−Ｇ２及びＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２については、約３週間ごとに新しいロット（新たに巻き戻し〜精製し直したもの）を投与した。試験の概要を図１５に示す。
・投与経路：腹腔内投与
・投与量：
ＨＬＡ−Ｇ２投与群：１５μｇ／匹（２００μＬのＰＢＳに溶解）
ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群：１５μｇ／匹（２００μＬのＰＢＳに溶解）
ＰＢＳ投与群：ＰＢＳ２００μＬ
・投与間隔：週２回投与
・投与期間：９５日間

初回投与の８日前から、投与終了から２３日後まで、３週間又は２週間に一度、矢印（図１３）で示した日に血漿及び尿を採取し、ＳＬＥの診断及びモニタリングに用いられる血漿中抗ｄｓＤＮＡ抗体価及び尿中アルブミン指数を測定した。

副作用発生の指標として、投与のタイミングにあわせてマウスの体重測定を行った。図１６に、マウスの体重推移を示す。ＨＬＡ−Ｇ２投与群、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群及びＰＢＳ投与群において、各投与群間で体重推移に有意な差は見られなかった。

図１７（ａ）に、各群の抗ｄｓＤＮＡ抗体価を示す。ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群及びＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群では、抗ｄｓＤＮＡ抗体価の低下が確認された（図１７（ａ））。また、図１７（ｂ）に、投与９０日後のマウスの抗ｄｓＤＮＡ抗体価を示す。ＰＢＳ投与群に比してＨＬＡ−Ｇ２投与群及びＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群では、抗ｄｓＤＮＡ抗体価の有意な低下が確認された（図１７（ｂ））。

（尿蛋白量）
尿中アルブミンを、ＥＬＩＳＡキット（レビスアルブミン−マウス、シバヤギ社）を用いて測定した。緩衝液を用いて希釈したマウス尿検体、および検量線作成用の標準溶液を抗アルブミン抗体固相化マイクロプレートに添加した。１時間のインキュベートおよびウェル洗浄後、標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体）を添加した。さらに１時間のインキュベートおよびウェル洗浄後、発色液（ＴＭＢ）と２０分間反応させ、酸性溶液（１ＭＨ_２ＳＯ_４）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４５０ｎｍ（副波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各尿サンプルの尿中アルブミン指数を算出した。さらに尿中クレアチニンをＥＬＩＳＡキット（尿中クレアチニン測定用ＥＬＩＳＡキット、トランスジェニック社）を用いて測定した。超純水を用いて希釈したマウス尿検体、及び検量線作成用の標準溶液に標識抗体（ＨＲＰ標識−抗クレアチニン抗体）を添加し３０分インキュベートさせ、抗原固相化マイクロプレートに添加した。１時間のインキュベート及びウェル洗浄後、発色液（オルトフェニレンジアミン）と１０分間反応させ、酸性溶液（５．４％Ｈ_２ＳＯ_４）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各尿サンプルの尿中クレアチニン濃度を算出した。以上から得られた尿中アルブミン濃度（単位：ｍｇ／ｍＬ）の値を尿中クレアチニン濃度（単位：ｇ／ｍＬ）の値で割ることで尿中アルブミン指数（単位：ｍｇアルブミン／ｇクレアチニン）を算出した。

図１８に、各群の尿中アルブミン指数を示す。各群間で尿中アルブミン指数の有意な差は見られなかったが、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群では、ＰＢＳ投与群及びＨＬＡ−Ｇ２投与群に比して、尿中アルブミン指数の低下効果が持続する傾向にあった（図１８）。

（Ｂｌｙｓ血中濃度）
また、投与開始後９０日目に、可溶型Ｂリンパ球刺激因子（Ｂｌｙｓ）血中濃度を測定した。より具体的には、ＭｏｕｓｅＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３ＢＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、プロトコルに従い血漿中ＢＬｙｓ濃度を測定した。緩衝液を用いて希釈したマウス血漿検体、及び検量線作成用の標準溶液をマウスＢＬｙｓ特異的モノクローナル抗体固相化マイクロプレートに添加した。２時間のインキュベート及びウェル洗浄後、標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗マウスＢＬｙｓポリクローナル抗体）を添加した。さらに２時間のインキュベート及びウェル洗浄後、発色液（ＴＭＢ）と３０分間反応させ、酸性溶液（希塩酸）を添加することで反応を停止させた。分光光度計を用いて４５０ｎｍ（副波長５４０ｎｍ）の吸光度を測定し、標準液濃度に対する吸光度をプロットすることにより得られた標準曲線から各血漿中ＢＬｙｓ濃度を算出した。

図１９に、各群のＢｌｙｓ血中濃度を示す。ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与群では、ＰＢＳ投与群及びＨＬＡ−Ｇ２投与群に比して、Ｂｌｙｓ血中濃度の有意な低下が認められた（図１９）。

（延長試験）
次に、ＰＢＳ投与群を用いて延長試験を行い、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２のＳＬＥに対する治療効果を検証した。

上記のＰＢＳ投与群のマウスについて、初回投与から１１８日及び１３２日目に血漿及び尿を採取し、前述同様に、血漿中抗ｄｓＤＮＡ抗体価及び尿中アルブミン指数を測定した。１３２日目の血漿中抗ｄｓＤＮＡ抗体価及び尿中アルブミン指数の値が、１１８日目のそれらの値よりも上昇している（すなわち、ＳＬＥを発症している）マウスに対して、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２又はＰＢＳを投与し、治療効果を検証した（ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与：ｎ＝１、ＰＢＳ投与：ｎ＝１）。１３２日目から投与を開始し（投与間隔：週２回投与、２週間で計４回投与）、投与経路及び投与量については、前述同様とした。１３８日目及び１４５日目に血漿及び尿を採取し、前述同様に、血漿中抗ｄｓＤＮＡ抗体価及び尿中アルブミン指数を測定した。

図２０（ａ）に、抗ｄｓＤＮＡ抗体価の変化を示す。ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与のマウスでは、ＰＢＳ投与のそれに比して抗ｄｓＤＮＡ抗体価の低下が見られ、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２による治療効果が確認された。

図２０（ｂ）に、尿中アルブミン指数の変化を示す。ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２投与のマウスでは、ＰＢＳ投与のそれに比して尿中アルブミン指数の低下が見られ、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２による治療効果が確認された。

以上より、ＳＬＥモデルマウス（ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓＳｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス）において、週２回のＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２の腹腔内投与によって血中抗核抗体量及び尿蛋白質の低下が認められたことから、ＰＥＧ２０−ＨＬＡ−Ｇ２はＳＬＥに対して治療効果を奏することが明らかとなった。ＰＥＧ化ＨＬＡ−Ｇ２を用いることで、投与量や投与回数の低減が期待でき、他剤との併用を想定する上でも、患者への金銭的、身体的負担を軽減できるものと期待される。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１８年３月１３日に出願された、日本国特許出願特願２０１８−０４６０２３号に基づく。本明細書に日本国特許出願特願２０１８−０４６０２３号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明は、全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤及び膠原病の予防又は治療剤に利用可能である。

Claims

ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とする全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体である、
ことを特徴とする請求項１に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
であって、
前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である、
ことを特徴とする請求項１に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体からなり、
前記タンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である、
ことを特徴とする請求項４に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ〜１００ｋＤａである、
ことを特徴とする請求項４又は５に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
前記タンパク質は、下記（ａ）または（ｂ）に記載するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
前記多量体が、前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体であり、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性を有するものである、
ことを特徴とする請求項４乃至６のいずれか１項に記載の全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤。
ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体を有効成分とし、全身投与に用いられる、
ことを特徴とする膠原病の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体である、
ことを特徴とする請求項８に記載の膠原病の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
であって、
前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体である、
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の膠原病の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体は、
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨＬＡ−Ｇ多量体のタンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である、
ことを特徴とする請求項８に記載の膠原病の予防又は治療剤。
前記ＨＬＡ−Ｇ多量体は、
ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインとＨＬＡ−Ｇのα３ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の多量体からなり、
前記タンパク質を構成するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＧ化修飾されている改変タンパク質又はその塩である、
ことを特徴とする請求項１１に記載の膠原病の予防又は治療剤。
ＰＥＧ化修飾に用いるＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ〜１００ｋＤａである、
ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の膠原病の予防又は治療剤。
前記タンパク質は、下記（ａ）または（ｂ）に記載するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
前記多量体が、前記（ａ）同士若しくは（ｂ）同士のホモ多量体又は（ａ）と（ｂ）とのヘテロ多量体であり、白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２との結合活性を有するものである、
ことを特徴とする請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の膠原病の予防又は治療剤。