JPWO2019135268A1 - 細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラム - Google Patents

Abstract

細胞画像処理装置（１）は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された画像の内のいずれか２枚の画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各ユニット内における細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出部（４）と、ベクトル算出部（４）において算出された移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索部（５）と、安定領域探索部（５）により探索された安定領域を計数領域として設定し、計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数部（６）とを備える。

Description

本発明は、培養画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムに関するものである。

細胞の増殖の経時変化を定量的に観察するために、細胞の画像を解析して細胞の状況変化を表すパラメータを取得する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。具体的には、画像内の細胞の占める面積の割合であるコンフルエント率に基づいて継代のタイミングを判定している。

また、コロニーの形成など細胞の凝集と細胞分裂との関係を観察するために、細胞の凝集を表すパラメータとして注目画素と周辺画素の位置関係の統計量を取得する技術が知られている（例えば、特許文献２参照。）。

ＷＯ２０１６／０９８２７１号公報 特開２００９−２２９２７４号公報

細胞の培養を精度よく管理するには、細胞が増殖しているか否かを精度よく検出する必要がある。しかしながら、特許文献１のようなコンフルエント率や特許文献２のような注目細胞周辺での細胞の凝集などのパラメータを取得しただけでは細胞の増殖を精度よく検出することはできないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができる細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムを提供することを目的としている。

本発明の一態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各前記ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出部と、該ベクトル算出部において算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索部と、該安定領域探索部により探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数部とを備える細胞画像処理装置である。

本態様によれば、時間間隔をあけて撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されると、入力された画像の内のいずれか２枚の画像がそれぞれベクトル算出部において複数のユニットに分割され、各ユニット内における細胞の移動ベクトルが算出される。算出された移動ベクトルは、安定領域探索部に入力され、移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットによって周縁が構成された安定領域が探索される。そして、探索された安定領域が細胞数計数部において計数領域として設定されて、計数領域内の細胞数が計数される。

すなわち、探索された安定領域は、安定ユニットによって少なくとも周縁が構成されているので、当該安定領域への細胞の流入および安定領域からの細胞の流出は一定以下に限定されている。したがって、探索された安定領域を、細胞数を計数するための計数領域として設定することにより、細胞の遊走性の影響を最小限に抑えて精度よく細胞数を計数することができる。

上記態様においては、前記安定領域探索部が、予め複数の前記ユニットについて前記安定ユニットであるか否かを分類し、前記安定領域を探索してもよい。
このようにすることで、周縁が安定ユニットにより構成された安定領域を簡易に探索することができる。

また、上記態様においては、前記安定領域探索部が、前記ベクトル算出部により算出されたいずれかの前記ユニットにおける前記移動ベクトルのいずれかの直交成分の大きさが所定の閾値以上である非安定ユニットを探索し、該非安定ユニットの該閾値よりも大きい直交成分の方向に隣接する他の前記ユニットにおける前記移動ベクトルを前記ベクトル算出部により算出させ、両方の前記直交成分の大きさがいずれも所定の閾値より小さい前記ユニットを前記安定ユニットとして設定してもよい。
このようにすることで、探索された非安定ユニットの周囲に配置されている安定ユニットが探索されるまで安定領域の探索を行うことができ、計数領域を設定するために移動ベクトルを算出するユニットの数がより少なくて済む。

また、上記態様においては、前記ベクトル算出部は、２枚の前記画像における同一ユニット内の画像間の相関値に基づいて前記移動ベクトルを算出してもよい。
このようにすることで、簡易に移動ベクトルを算出することができる。

また、上記態様においては、前記ユニットが同一形状であってもよい。
このようにすることで、ベクトル算出部における複数のユニットへの分割を容易に行うことができる。

また、上記態様においては、前記安定領域が前記安定ユニットのみにより構成されていてもよい。
このようにすることで、細胞の移動が少ない安定領域を用いて精度よく細胞数を計数することができる。

また、上記態様においては、前記安定領域は、前記移動ベクトルのいずれかの直交成分の大きさが所定の閾値以上である１以上の前記非安定ユニットの周縁を前記安定ユニットによって取り囲んで構成されていてもよい。
このようにすることで、安定領域内に非安定ユニットが含まれていても、全体として細胞の流入や流出の少ない安定領域を用いて精度よく細胞数を計数することができる。

また、上記態様においては、前記安定領域探索部が、前記安定領域に含まれる前記ユニットの前記移動ベクトルを表示する表示装置に、前記安定領域および前記移動ベクトルのデータを出力する機能を備えていてもよい。

また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、該プロセッサが、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各前記ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出し、算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索し、探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞画像処理装置である。

また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各前記ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出ステップと、該ベクトル算出ステップにおいて算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索ステップと、該安定領域探索ステップにより探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数ステップとを含む細胞画像処理方法である。

また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各前記ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出ステップと、該ベクトル算出ステップにおいて算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索ステップと、該安定領域探索ステップにより探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラムである。

本発明によれば、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置を示す全体構成図である。 図１の細胞画像処理装置に入力された画像と画像内に分割形成されたユニットとを示す図である。 図１の細胞画像処理装置により設定された安定領域の例を示す図である。 図１の細胞画像処理装置による細胞画像処理方法を説明するフローチャートである。 図１の変形例に係る細胞画像処理装置による細胞画像処理方法を説明するフローチャートである。 図５の細胞画像処理方法により、１次元方向に安定領域が探索されていく過程を説明する図である。 図５の細胞画像処理方法により、２次元方向に安定領域が探索されていく過程を説明する図である。 図５の細胞画像処理方法により、２次元方向に安定領域が探索されていく過程を説明する図である。 図５の細胞画像処理方法により、２次元方向に安定領域が探索されていく過程を説明する図である。 図５の細胞画像処理方法により、２次元方向に安定領域が探索されていく過程を説明する図である。 図５の細胞が像処理方法により探索された安定領域の一例を示す図である。

本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置１、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞画像処理装置１は、図１に示されるように、顕微鏡等の撮像部５０により時間間隔をあけた撮影により取得された複数枚の画像（図２参照）Ｇが入力され、計数領域内の細胞数をモニタ等の表示部６０に向けて出力する装置である。

細胞画像処理装置１は、撮像部５０から入力されてきた画像Ｇをその画像Ｇを撮影した時刻情報と対応づけて逐次記憶するメモリ２と、メモリ２に記憶された画像Ｇを処理する処理部３とを備えている。
処理部３は、メモリ２に記憶されている画像Ｇを複数のユニットＰに分割して、各ユニットＰ内における細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出部４と、算出された移動ベクトルに基づいて安定領域を探索する安定領域探索部５と、探索された安定領域を計数領域として設定して計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数部６とを備えている。

ベクトル算出部４は、例えば、メモリ２内から取り出した２枚の画像Ｇを複数のユニットＰ、例えば、図２に示されるように、正方配列された複数の正方形のユニットに分割し、同一ユニット内の２つの画像Ｇの相関値を公知の方法で算出することにより、相関値が高い部分を同一の被写体が撮影されている領域であると評価する方法で、被写体の移動ベクトルを算出するようになっている。

本実施形態においては、各画像Ｇ内に形成された全てのユニットＰあるいは、指定された所定範囲内のユニットＰについてそれぞれ移動ベクトルを算出するようになっている。
安定領域探索部５は、各ユニットＰについて算出された移動ベクトルを所定の閾値と比較することにより、移動ベクトルが閾値以上の非安定ユニットと、移動ベクトルが閾値より小さい安定ユニットに分類するようになっている。

そして、安定領域探索部５は、全周にわたって安定ユニットによって縁部が構成されている安定領域を探索するようになっている。安定領域は画像Ｇ内に１つまたは複数探索されてもよい。
また、安定領域としては、図３に示されるように、安定ユニットのみからなる領域である場合と、非安定ユニットの周囲が全周にわたって安定ユニットで囲まれた領域である場合の２通りが考えられる。いずれの場合にも、当該安定領域は細胞の流入および流出数が少ない領域となっている。

細胞数計数部６は、探索された安定領域を計数領域として設定し、計数領域内の細胞数を画像処理により計数するようになっている。
安定領域探索部５により複数の探索領域が探索された場合には、同一画像Ｇ内に複数の計数領域が設定されるようになっている。これにより、複数箇所において細胞の増殖特性を監視することができる。

時間間隔を空けた２枚の画像Ｇにおいて、設定された計数領域における細胞数が計数されることにより、各画像Ｇの計数領域における細胞数の差分を２枚の画像Ｇ間の時間間隔で除算するだけで、単位時間当たりの細胞数の変化である細胞増殖率を簡易に求めることができる。

このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置１を用いた細胞画像処理方法について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞画像処理方法は、図４に示されるように、まず、入力された画像の内のいずれか２枚の画像Ｇのそれぞれを複数のユニットＰに分割する（ステップＳ１）。

次いで、ステップＳ１において分割されたいずれかのユニットＰを選択する（ステップＳ２）。そして、ステップＳ２において選択されたユニットＰ内における細胞の移動ベクトルを算出する（ベクトル算出ステップＳ３）。

この後に、ベクトル算出ステップＳ３において算出された移動ベクトルの大きさと所定の閾値とが比較され（ステップＳ４）、ステップＳ４において比較された結果、移動ベクトルが所定の閾値より小さい場合には安定ユニットとして設定し（ステップＳ５）、移動ベクトルが所定の閾値以上の場合には非安定ステップとして設定する（ステップＳ６）。そして、全てのユニットＰについて分類が終了したか否かが判定され（ステップＳ７）、終了していない場合にはステップＳ２からの工程が繰り返さる。

全てのユニットＰについて分類が終了した場合は、少なくとも周縁が安定ユニットにより構成された安定領域が探索され（安定領域探索ステップＳ８）と、安定領域探索ステップＳ８により探索された安定領域を計数領域として、計数領域内の細胞数が計数される（細胞数計数ステップＳ９）。

ステップＳ１により分割された複数のユニットＰをステップＳ４からステップＳ６において安定ユニットと非安定ユニットとに分類するので、安定領域探索ステップＳ８において、安定ユニットによって囲まれた安定領域を簡易に探索することができる。そして、探索された安定領域に対してのみ細胞数の計数を行うので、非安定ユニットが縁部に配置されている領域の細胞数を計数する場合と比較して、細胞の流入および流出が少ない領域について細胞数を計数できる。
すなわち、本実施形態に係る細胞画像処理装置１および細胞が像処理方法によれば、細胞の流入や流出が少ない安定領域内の細胞数を計数することで、細胞の増殖を算出するための細胞数を少ないノイズで精度よく求めることができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、ユニットＰ毎に２つの画像Ｇ間の相関値を求めて移動ベクトルを算出することとしたが、これに代えて、２つの画像Ｇ全体あるいは複数ユニットＰの集合からなるユニット群間で相関値を求めて画像全体で移動ベクトルを算出することにしてもよい。

また、本実施形態においては、各画像Ｇは、正方配列された複数の正方形のユニットＰに分割したが、これに限定されるものではなく、他の形状のユニットに分割されてもよいし、異なる大きさのユニットに分割されてもよい。例えば、詳細に観察する画像Ｇの中央部分については小さいユニットとし、画像Ｇの周辺については大きなユニットに分割することにしてもよい。

また、本実施形態においては、画像Ｇ内に生成された全てのユニットＰについて、予め安定ユニットか非安定ユニットかの分類を行ってから、周縁が安定ユニットによって構成された安定領域を探索することとしたが、これに代えて、図５に示す手法により安定領域を探索することにしてもよい。

すなわち、まず、図６（ａ）に示されるように、画像Ｇを複数のユニットＰに分割し（ステップＳ１）、画像Ｇ内の観察すべき要観察ユニットを選択する（ステップＳ１１）。次いで、選択された要観察ユニットについて取得された時間間隔をあけた２枚の画像Ｇに基づいて要観察ユニット内の細胞の移動ベクトルが算出される（ベクトル算出ステップＳ３）。そして、算出された移動ベクトルの大きさ、または、該移動ベクトルの２つの直交成分の大きさのいずれかが所定の閾値以上か否かが判定される（ステップＳ１２）。図６に示す例においては、一方向に向かう移動ベクトル自体の大きさが閾値以上か否かを図示している。

図６（ｂ）に示されるように、ステップＳ１２において、移動ベクトルの大きさまたはいずれかの直交成分の大きさが所定の閾値以上であると判定された場合には、当該要観察ユニットは非安定ユニットであると判定され（ステップＳ６）、移動ベクトルおよび２つの直交成分のいずれもが所定の閾値より小さい場合には安定ユニットであると判定される（ステップＳ５）。

図６（ｃ）に示されるように、ステップＳ６において、非安定ユニットであると判定された場合には、閾値以上であると判定された移動ベクトルあるいは直交成分の方向の両側に隣接するユニットが要観察ユニットとして新設される（ステップＳ１３）。
ステップＳ１３において要観察ユニットが新設された場合およびステップＳ５において安定ユニットであると判定された場合には、他の要観察ユニットが存在するか否かが判定され（ステップＳ１４）、存在する場合には、図６（ｄ）、（ｅ）に示されるように、ステップＳ１１からの工程が繰り返され、存在しない場合には計数領域内の細胞数を計数して（細胞数計数ステップＳ９）、処理を終了する。

図６（ｄ）の上段は、図６（ｃ）において新設された要観察ユニットがいずれも非安定ユニットである場合、中段は、新設された上側の要観察ユニットが安定ユニット、下側の要観察ユニットが非安定ユニットである場合、下段は、新設された要観察ユニットがいずれも安定ユニットとなって安定領域が設定された場合をそれぞれ示している。
また、図６（ｅ）は、図６（ｄ）の上段および中段で非安定ユニットと判定された要観察ユニットの隣接位置に新たに要観察ユニットが新設された状態をそれぞれ示している。

また、図７Ａから図７Ｄに、移動ベクトルの大きさおよび移動ベクトルの２つの直交成分の大きさのいずれかが所定の閾値以上の大きさを有する場合の要観察ユニットの新設の一例を説明する。これによれば、単一の要観察ユニットの複数方向に隣接するユニットが新たな要観察ユニットとして新設されるので、安定領域が２次元的に広がるように探索されていくことになる。その結果、安定領域は、例えば、図８に示されるように探索される。図８中、矢印は、安定ユニットまたは非安定ユニットにおける移動ベクトルを示している。

このような手法によれば、予め全てのユニットＰについて安定ユニットと非安定ユニットとの分類を行う必要がなく、選択された要観察ユニットを基準として、安定ユニットによって周縁が取り囲まれるまでの限定された数のユニットＰについて分類を行えば足りる。その結果、演算量を減らして、より簡易に、要観察ユニットを含む計数領域を設定することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、時間間隔をあけた２枚の画像Ｇを用いて移動ベクトルを算出して安定領域を探索する場合について説明した。実際には、時々刻々と変化する画像Ｇが逐次入力されてメモリ２に記憶されるので、異なる２枚の画像Ｇを用いて逐次移動ベクトルが算出され、その都度、探索された安定領域が更新されていく。したがって、図３または図８に示されるように探索された安定領域が、時々刻々と変化するように表示部６０に表示されることとしてもよい。

また、本実施形態においては、処理部３がベクトル算出部４、安定領域探索部５、細胞数計数部６を備えることとした、処理部３は、電気回路によって構成してもよいし、１以上のプロセッサによって構成してもよい。
プロセッサにより構成する場合、本発明は、ベクトル算出ステップＳ３、安定領域探索ステップＳ８および細胞数計数ステップＳ９をコンピュータにより実行可能な細胞画像処理プログラムにより構成してもよい。

１ 細胞画像処理装置
４ ベクトル算出部
５ 安定領域探索部
６ 細胞数計数部
Ｇ 画像
Ｐ ユニット
Ｓ３ ベクトル算出ステップ
Ｓ８ 安定領域探索ステップ
Ｓ９ 細胞数計数ステップ

Claims (11)

1. 時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
   入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各該ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出部と、
   該ベクトル算出部において算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索部と、
   該安定領域探索部により探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数部とを備える細胞画像処理装置。
2. 前記安定領域探索部が、予め複数の前記ユニットについて前記安定ユニットであるか否かを分類し、前記安定領域を探索する請求項１に記載の細胞画像処理装置。
3. 前記安定領域探索部が、前記ベクトル算出部により算出されたいずれかの前記ユニットにおける前記移動ベクトルのいずれかの直交成分の大きさが所定の閾値以上である非安定ユニットを探索し、該非安定ユニットの該閾値よりも大きい直交成分の方向に隣接する他の前記ユニットが前記安定ユニットとなるまで前記安定領域の探索を行う請求項１に記載の細胞画像処理装置。
4. 前記ベクトル算出部は、２枚の前記画像における同一ユニット内の画像間の相関値に基づいて前記移動ベクトルを算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
5. 前記ユニットが同一形状である請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
6. 前記安定領域が前記安定ユニットのみにより構成されている請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
7. 前記安定領域は、前記移動ベクトルのいずれかの直交成分の大きさが所定の閾値以上である１以上の前記非安定ユニットの周縁を前記安定ユニットによって取り囲んで構成されている請求項３に記載の細胞画像処理装置。
8. 前記安定領域探索部が、前記安定領域に含まれる前記ユニットの前記移動ベクトルを表示する表示装置に、前記安定領域および前記移動ベクトルのデータを出力する機能を備える請求項１に記載の細胞画像処理装置。
9. 時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、
   該プロセッサが、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各該ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出し、算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索し、探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞画像処理装置。
10. 時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
    入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各該ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出ステップと、
    該ベクトル算出ステップにおいて算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索ステップと、
    該安定領域探索ステップにより探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数ステップとを含む細胞画像処理方法。
11. 時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
    入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像のそれぞれを複数のユニットに分割して、各該ユニット内における前記細胞の移動ベクトルを算出するベクトル算出ステップと、
    該ベクトル算出ステップにおいて算出された前記移動ベクトルの大きさが所定の閾値より小さい安定ユニットにより、少なくとも周縁が構成された安定領域を探索する安定領域探索ステップと、
    該安定領域探索ステップにより探索された前記安定領域を計数領域として設定し、該計数領域内の細胞数を計数する細胞数計数ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラム。

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