JPWO2019107576A1 - 始原生殖細胞/始原生殖細胞様細胞の維持増幅及び分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、本発明者らは、前記スクリーニングで同定された他の化合物をさらに併用することにより、PGC/PGCLCの増殖効率をより改善し得るかどうかを調べた。その結果、PDE4阻害薬とフォルスコリンに加えて、シクロスポリンAを用いることにより、PGCLC及びPGC(E9.5)の増殖を、平均でそれぞれ約50倍及び約16倍にまで増大させることに成功した。
しかも、いずれの場合においても、増幅中、PGCLCは、親のインプリントを含むすべてのゲノム領域においてDNAメチロームを進行的に消去し、どちらの性でもないPGCとしての特性を維持しつつ、生殖細胞におけるゲノムワイドなDNA脱メチル化を忠実に再現した。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、図15に示すような生殖細胞における雌性への性分化のメカニズムのモデルを構築し、本発明を完成するに至った。
[1]PGC又は単離されたPSC由来のPGCLCの維持増幅方法であって、PGC又はPGCLCをPDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養することを含む、方法。
[2]PGC又はPGCLCを、フォルスコリンをさらに含む条件下で培養することを含む、[1]に記載の方法。
[3]PDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAを含有してなる、PGC又はPGCLCの維持増幅用試薬。
[4]フォルスコリンを組み合わせてなる、[3]に記載の試薬。
[5]PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導する方法であって、PGC又はPGCLCを、BMP及びRAの存在下で培養することを含む、方法。
[6]BMPがBMP2、BMP5及びBMP7から選ばれる1以上である、[5]に記載の方法。
[7]BMP及びRAを組み合わせてなる、PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導するための試薬。
[8]BMPがBMP2、BMP5及びBMP7から選ばれる1以上である、[7]に記載の試薬。
[9]PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導する方法であって、
(a)PGC又はPGCLCをPDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養し、PGC又はPGCLCを維持増幅すること、並びに
(b)工程(a)で得られたPGC又はPGCLCを、BMP及びRAの存在下で培養するBMP及びRAの存在下で培養することを含む、方法。
本発明は、PGC又は単離されたPSC由来のPGCLCのインビトロでの維持増幅方法(「本発明の方法(I)」と略記する場合がある)を提供する。当該方法は、PGC又はPGCLCをPDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養することを特徴とする。
1−1.PGCの製造
本発明で用いられるPGCは、例えばマウスの場合、例えば胎生(E)9.5〜11.5日の胚から、PGC特異的マーカー(例、Blimp1、Stella等)の発現を指標としてFACS等の手法により単離することができるが、これに限定されず、当該技術分野において自体公知のいかなる方法によっても単離することができる。あるいは、より初期のマウス胚から同様に単離したPGCを、下記1−2.に記載の方法により、移動期PGCに相当するステージまで培養して用いることもできる。マウス以外の哺乳動物についても、それぞれ上記マウスの胎齢に対応する胎齢の胚から、同様にして調製することができる。本明細書においては、以下、特にことわらない限り、PGCのステージをマウス胚の胎齢により代表して示すが、他の哺乳動物においては、マウス胚の胎齢にそれぞれ対応する胎齢として理解されるべきである。かかる換算は当該技術分野において周知である。
本発明で用いられるPGCLCは、単離されたPSCからインビトロで誘導され、かつPGCと同等の特性を有するものであればいかなるものであってもよいが、例えば、前記特許文献1及び非特許文献1に記載されるPGCLCが挙げられる。該PGCLCは、単離されたPSCから、以下に示す方法により、エピブラスト様細胞(EpiLC)を経由して製造することができる。
(i)ES細胞
多能性幹細胞は自体公知の方法により取得することができる。例えば、ES細胞の作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法(例えば、Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)を参照)、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法(Wilmut et al.,Nature,385,810(1997);Cibelli et al.,Science,280,1256(1998);入谷明ら,蛋白質核酸酵素,44,892(1999);Baguisi etal.,Nature Biotechnology,17,456(1999);Wakayama et al.,Nature,394,369(1998);Wakayama et al.,Nature Genetics,22,127(1999);Wakayama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999);RideoutIII et al.,Nature Genetics,24,109(2000))などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞株であるH1及びH9は、ウィスコンシン大学のWiCell Instituteより入手可能であり、KhES−1、KhES−2及びKhES−3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ES細胞を体細胞核移植により作製する場合、体細胞の種類や体細胞を採取するソースは下記iPS細胞作製の場合に準ずる。
iPS細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、マウス又はヒト)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよい。例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、脂肪由来間質(幹)細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1)Oct3/4、Klf4、c−Myc
(2)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2(ここで、Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1、Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c−MycはT58A(活性型変異体)、N−Myc又はL−Mycで置換可能である。)
(3)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15−2、TclI、β−catenin(活性型変異体S33Y)
(4)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6
(6)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7
(7)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV6 E6、HPV16 E7
(8)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、Bmil
(上記因子のさらなる情報については、WO2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1若しくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology,26,101−106(2008)を参照)。「Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Cell,126,663−676(2006)、Cell,131,861−872(2007)等も参照。「Oct3/4、Klf2(又はKlf5)、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Nat.Cell Biol.,11,197−203(2009)も参照。「Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、hTERT、SV40LT」の組み合わせについては、Nature,451,141−146(2008)も参照。)
(9)Oct3/4、Klf4、Sox2(Nature Biotechnology,26,101−106(2008)を参照)
(10)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28(Science,318,1917−1920(2007)を参照)
(11)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT(Stem Cells,26,1998−2005(2008)を参照)
(12)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28(Cell Research(2008)600−603を参照)
(13)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、SV40LT(Stem Cells,26,1998−2005(2008)も参照)
(14)Oct3/4、Klf4(Nature 454:646−650(2008)、Cell Stem Cell,2:525−528(2008)を参照)
(15)Oct3/4、c−Myc(Nature 454:646−650(2008)を参照)
(16)Oct3/4、Sox2(Nature,451,141−146(2008)、WO2008/118820を参照)
(17)Oct3/4、Sox2、Nanog(WO2008/118820を参照)
(18)Oct3/4、Sox2、Lin28(WO2008/118820を参照)
(19)Oct3/4、Sox2、c−Myc、Fsrrb(ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat.Cell Biol.,11,197−203(2009)を参照)
(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb(Nat.Cell Biol.,11,197−203(2009)を参照)
(21)Oct3/4、Klf4、L−Myc
(22)Oct3/4、Nanog
(23)Oct3/4
(24)Oct3/4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT(Science,324:797−801(2009)を参照)
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核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。ヒトへの臨床応用を念頭におく場合、その出発材料たるiPS細胞も遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5〜10%CO2/95〜90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、又は5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.9%以上など)、又は1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
胚盤胞期胚から誘導される従来のヒトES細胞は、マウスES細胞と非常に異なる生物学的(形態的、分子的及び機能的)特性を有する。マウス多能性幹細胞は、2つの機能的に区別される状態、即ちLIF依存的なES細胞と、bFGF依存的なエピブラスト幹細胞(EpiSC)とで存在し得る。分子学的解析から、ヒトES細胞の多能性状態は、マウスES細胞のそれではなく、むしろマウスEpiSCのそれに類似していることが示唆されている。最近、LIFの存在下にOct3/4、Sox2、Klf4、c−Myc及びNanogを異所的に誘導するか(Cell Stem Cells,6:535−546,2010参照)、LIF並びにGSK3β及びERK1/2経路阻害薬と組み合わせて、Oct3/4、Klf4及びKlf2を異所的に誘導する(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,オンライン公開doi/10.1073/pnas.1004584107参照)ことにより、マウスES細胞様の多能性状態にあるヒトES及びiPS細胞(ナイーヴヒトES及びiPS細胞とも呼ばれる)が樹立されている。これらのナイーヴヒトES及びiPS細胞は、それらの多能性が従来のヒトES及びiPS細胞に比べてより未熟であるため、本発明のための出発材料として好適であり得る。
分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS−A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地(MEM)、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
(1)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇、
(2)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下。
従って、EpiLCへの分化の事実は、培養により得られた細胞中、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つ、並びに/又はGata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの発現レベルを測定し、分化誘導前の多能性幹細胞のものと発現レベルを比較することにより確認できる。
(1)Oct3/4の持続的な遺伝子発現;
(2)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Sox2及びNanogの遺伝子発現の低下;
(3)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bの遺伝子発現の上昇;及び
(4)分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1の遺伝子発現の低下。
このようにして得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養することにより、PGC様細胞へと分化誘導することができる(Cell,137,571−584(2009))。従って、本発明の第二の側面は、上記(2)の方法により得られたEpiLCを介して、多能性幹細胞からPGC様細胞を製造する方法に関する。すなわち、該方法は、
I)上記(2)に記載のいずれかの方法に従って多能性幹細胞からEpiLCを製造する工程;及び
II)工程I)で得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程
を含む。
本工程では、例えば、上記の方法により得られたPGC又はPGCLCを、PDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養する。用いるPGCLCが不均一な細胞集団である場合、例えば、FACSを用いて、SSEA−1陽性及びインテグリン−β3陽性の細胞分画を単離して用いることができる。PGCLCとしては、EpiLCからの分化誘導開始日をd0として、d4〜d10、好ましくはd4〜d8、より好ましくはd4〜d6、さらに好ましくは約d4の細胞が用いられ得る。
フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼの強力な活性化薬であり、PDE4阻害薬とは異なる作用機序で細胞内cAMPレベルを上昇させることから、PDE4阻害薬と相乗的に作用して、PGC/PGCLCの増幅効率を顕著に増大させることができる。
本発明の方法(I)により得られる増幅PGC/PGCLCを、BMP及びRAの存在下で培養することにより、生殖巣の体細胞の非存在下で卵母細胞に分化誘導することができる。従って、本発明はまた、PGC又はPGCLCをBMP及びRAの存在下で培養することを含む、該細胞から卵母細胞を誘導する方法(「本発明の方法(II)」と略記する場合がある)を提供する。
以下に引用する文献の詳細情報については、Ohta,H.et al.,EMBO J.,36(13):1888−1907(2017)を参照のこと。
マウス
全ての動物実験は、京都大学の倫理ガイドラインに基づき行った。BVSC(Acc.No.BV,CDB0460T;SC,CDB0465T:http://www.cdb.riken.jp/arg/TG%20mutant%20mice%20list.html)及びStella−EGFPトランスジェニックマウスを、以前報告されたように(Payer et al,2006;Seki et al,2007;Ohinata et al,2008)樹立し、ほとんどC57BL/6のバックグラウンドで維持した。WBB6F1−W/Wv、C57BL/6、DBA/2、C3H、BDF1、及びICRマウスを、SLC(Shizuoka、Japan)から購入した。膣栓を確認した日の正午を胎生期(E)0.5とした。全てのマウスを、14時間の明/10時間の暗のサイクル下で、特定の病原体のない動物施設に収容した。
BVSC R8、H14、及びH18は以前に報告されている(Hayashi et al,2011,2012)。メスのBVSCマウス(ほとんどC57BL/6のバックグラウンド)をオスのDBA/2又はC3Hマウスと交配し、BDF1又はBCF1胚を得た。胚盤胞を、2i(PD0325901,0.4μM:Stemgent、San Diego、CA;CHIR99021,3μM:Stemgent)及びLIF(1,000U/ml;Merck Millipore)を含むN2B27培地中の96ウェルプレートのウェル中で、マウス胎児線維芽細胞(MEF)(Ying et al、2008;Hayashi et al、2011)上に播種し、培養した。増殖したコロニーを、TrypLE(Thermo Fisher Scientific)で解離することにより継代した。2継代まで、ESCをMEF上で維持した。その後、ポリ−L−オルニチン(0.01%;Sigma)及びラミニン(10ng/ml;BD Biosciences)でコーティングしたディッシュ上でオスのESCを培養し、フィーダーフリーで維持した。
EpiLC及びPGCLCの誘導を、以前報告されたように行った(Hayashi et al,2011)。簡潔に述べると、アクチビンA(20ng/ml)、bFGF(12ng/ml)、及びKSR(1%)を含むN2B27培地中で、ヒト血漿フィブロネクチン(16.7mg/ml)でコーティングした12ウェルプレートのウェル上に、1x105個のESCを播種することにより、EpiLCを誘導した。サイトカインBMP4(500ng/ml;R&D Systems)、LIF(1,000U/ml;Merck Millipore)、SCF(100ng/ml;R&D Systems)及びEGF(50ng/ml;R&D Systems)の存在下で、無血清培地[15%KSRを含むGK15;GMEM(Thermo Fisher Scientific)、0.1mM NEAA,1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、及び2mM L−グルタミン]を含む、低細胞結合U底96ウェルプレート(Thermo Scientific)のウェルを用いて、浮遊条件下でd2のEpiLCからPGCLCを誘導した。化合物ライブラリースクリーニング用の多数のPGCLCを調製するために、同じ培地を用いて、AgglreWell400(STEMCELL Technologies)でPGCLCを誘導した。
以前報告されたように(Hayashi et al,2011)、細胞凝集体からのサンプル調製を行った。FACSをFACSAriaIII(BD)セルソーターで行った。BV及びSC蛍光をFITC及びAmCyan Horizon V500チャネルでそれぞれ検出した。データをFACSDiva(BD)ソフトウェアを用いて分析した。
m220細胞株(Majumdar et al,1994)を、10%FCSを含むDMEM中で、ゼラチンをコーティングしたプレート上で培養した。m220細胞はマイトマイシンC(MMC)処理に対して非常に脆弱であったため、MMCに対して耐性のあるm220亜系統株を樹立した。簡潔に述べると、FACSにより、単一のm220細胞を96ウェルプレート(6プレート)のウェル上に播種した。播種1週間後、ウェルの約半分で細胞増殖が観察された。細胞を2つの96ウェルプレートのそれぞれの1つのウェルに継代した後、一方のプレートをレプリカとして凍結し、他方のプレートをMMCで処理した(4μg/ml、2時間)。MMC処理後10日目に、顕微鏡観察によりMMC耐性を評価した。合計で242個のm220亜系統株を樹立し、7個の亜系統株が高いMMC耐性を示した。主にm220−5亜系統株を実験に使用した。
d4 PGCLCを、FACSにより96ウェルプレート中のm220−5フィーダー上に播種し、BV蛍光を細胞分析装置(Cellavista;SynenTec)によりモニターした。BV用の蛍光写真を、以下の設定でCellavista細胞分析装置により撮影した:10×objectives;exposure time:140μsec;gain:4×;binning:4×4;excitation:500/24nm;emission:542/27nm。BV蛍光を、以下のアルゴリズム/属性パラメータを用いて検出した:sensitivity:10;region merging:200;min.granule intensity:50;well edge distance:200;contrast:1;size:3,000;intensity:255;roughness:500;granularity:100;granule intensity:255;granule count:10,000;longishness:100;compactness:1。BV蛍光の検出には「細胞核」の値を用いた。
化合物ライブラリーを、10μM及び1μMの濃度でスクリーニングした。MMCで処理したm220−5細胞を含む96ウェルプレートを使用した。各96ウェルプレートにおいて、陰性(DMSOのみ)及び陽性(LIF)対照を両側に割り当て、化合物を80ウェルに添加した。BDF1−2 ESCから誘導した200個のBV(+)d4 PGCLCを、96ウェルプレートのウェルに播種し、Cellavista細胞分析装置により培養1日目(c1)、c3、c5及びc7でBV蛍光を測定した。BV蛍光の検出には、「細胞核」の値を用いた。d4 PGCLCの増殖速度は実験間でわずかに相違していたので、異なる実験からの値を最初の実験から得られた陰性対照の平均値に基づいて調整した。各化合物について、c1とc7との間のBV蛍光の倍数差(fold difference)を計算し、ネガティブコントロールの平均値の3SDを超える倍数差値を有する化合物を、PGCLCの増殖を増強するものとして同定した。
MMCで処理をしたm220−5フィーダーはフォルスコリンとロリプラムに対して脆弱であったので、m220−5細胞をフォルスコリン及びロリプラムの両方を10μM用いて3継代培養して、MMC処理(1−2μg/ml、2時間)をする前にこれらの化合物に適応させた。d4 PGCLC又はE9.5PGC(BDF1×Stella−EGFP)をFACSで選別し、10%KSR、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、2.5%FCS、100ng/ml SCF、10μMフォルスコリン、及び10μMロリプラムを含有するGMEM培地中で、m220−5細胞上に播種した。培養培地の半分を2日ごとに交換した。
次の抗体を示した希釈液で使用した:ウサギ抗MVH(1/250;Abcam ab13840);ウサギ抗DAZL(1/250;Abcam ab34139);マウス抗OCT4(1/250;BD 611203);マウス抗−5mC(1/500;Abcam ab10805);ウサギ抗H3K27me3(1/500;Millipore 07−449);ウサギ抗H3K9me2(1/500;Millipore 07−441);ウサギ抗DNMT1(1/100;Santa Cruz Biotechnology sc−20701);マウス抗DNMT3A(1/200;Abcam ab13888);マウス抗DNMT3B(1/200;Novus Biologicals NB100−56514);ウサギ抗UHRF1(1/100;Santa Cruz Biotechnology sc−98817);及びニワトリ抗GFP(1/500;Abcam ab13970)。Thermo Fisher Scientificから入手した次の二次抗体を1/500希釈で使用した:Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギIgG;Alexa Fluor 568ヤギ抗マウスIgG;Alexa Fluor 488ヤギ抗ニワトリIgG。F−アクチンを染色するために、Alexa Fluor 568とコンジュゲートしたファロイジン(1/40、Thermo Fisher Scientific A12380)を使用した。
免疫蛍光染色のプロトコルは以前報告されている(Hayashi et al,2011;Nakaki et al,2013)。MVH、DAZL及びOCT4染色のため、d4c7 PGCLC(BDF1−2)をFACSで選別し、E13.5のオスのPGCと1:1の割合で混合し、Cyto Spin 4(Thermo Fisher Scientific)を用いて、MASでコーティングしたガラススライド上に広げた。Alexa Fluor647とコンジュゲートしたSSEA1抗体を用いて、FACSによりE13.5の雄性生殖細胞(ICR)を選別した。5mC、H3K27me3及びH3K9me2染色のために、d4c7 PGCLC(BDF1−2)をFACSで選別し、1:1の割合でd2 EpiLCと混合し、Cyto Spin 4(Thermo Fisher Scientific)を用いて、MASでコーティングしたガラススライド上に広げた。画像を共焦点顕微鏡(Zeiss,LSM780)でキャプチャーし、シグナル強度をImageJ(NIH)によって解析した。
細胞内のcAMP濃度を、cAMPGlo Max assay kit(Promega)を用いて、メーカーの説明書に従い測定した。精製されたcAMPを用いた標準曲線を、Δ相対的な光量(ΔRLU)(RLU[O nM]−RLU[X nM])を計算することにより作成した。各サンプルについて、1x104 d4 PGCLCをフォルスコリン及び/又はロリプラムで30分間室温で前処理し、ΔRLU(RLU[未処理サンプル]−RLU[処理済みサンプル])を計算した。化学的処理による細胞内のcAMPレベルの増加は、cAMP標準曲線から推量した。3つの生物学的複製物(biological replicate)を各サンプルについて分析した。
E13.5、E14.5及びE15.5におけるESC、EpiLC、d4、d4c3、d4c5及びd4c7 PGCLC(BDF1−2)及び雄性生殖細胞の細胞周期状態を既報(Kagiwada et al,2013)と同様にして調べた。培養細胞を標識するために、細胞をBrdU(10μM)と共に30分間インキュベートした。生殖細胞を標識するために、メスのマウス(ICR)をStella−EGFPオスと交配させ、妊娠したメスに1mgのBrdUを腹腔内注射し、30分後に胚を回収した。培養細胞又は雄性生殖腺をTrypLE処理により単一細胞に分散させた。BrdUの取り込みを検出するため、メーカーの説明書に従い、APC−BrdU Flow Kit(BD Biosciences)を使用した。染色されたサンプルを、FACSDiva(BD)softwareと共にBD FACSAriaIII(BD)を用いて分析し、PGCLC又は雄性生殖細胞をそれぞれBV又はStella−EGFPの蛍光により同定した。3つの生物学的複製物を各サンプルについて分析した。
PGCLCをFACSで精製した後、無作為に選択した新生仔(出生後7日)又は成体のW/Wvマウスの精巣に、以前報告されたように(Chuma et al、2005)、精巣当たり1×104〜1×105個の細胞を注入した。必要に応じて、免疫抑制のために抗マウスCD4抗体(用量当たり50mg、クローンGK1.5;Biolegend)を0、2又は4日目に腹腔内注射した(Kanatsu−Shinohara et al,2003)。妊娠を評価するため、移植後10週のレシピエントをBDF1のメスと交配させた。以前報告されたように(Ohinata et al,2008)、BVSCトランスジーンの子孫の遺伝子型決定を行った。HE染色のために、精巣又は精巣上体をブアン溶液で固定し、パラフィンに包埋し、切片を作成した。
精子を精巣上体尾部から回収し、HTF培地(Kyudo Co.,Ltd.)中で37℃、1時間プレインキュベートした。PMSG及びhCGを注入することにより過排卵させたBDF1のメスから卵子を回収し、HTF培地中の精子と受精させた。得られた2細胞胚を、妊娠後(dpc)0.5日目に偽妊娠ICRメスの卵管に移した。仔を18.5dpcで帝王切開により分娩させた。
精細管をPBS中の2%パラホルムアルデヒド及び0.2%グルタルアルデヒドで4℃、1時間固定した。PBSで3回洗浄した後、精細管をX−gal溶液(0.1%X−gal、0.1%Triton X−100、1mM MgCl2、3mM K4[Fe(CN)6]及び3mM K3[Fe(CN)6]を含むPBS)で37℃、2〜3時間インキュベートした。
ESC、EpiLCs、及びメスのMEFをTrypLEで解離し、d4、d4c3及びd4c7 PGCLCを、FACSを用いて精製した。細胞サンプルをポリ−L−リシン(Sigma)でコーティングしたガラスカバースリップ上に、少量のPBS中で移し、固定前に過剰の培地を吸引することにより、カバースリップに接着させた。DNA FISHのため、カバースリップ上の細胞サンプルを、3%パラホルムアルデヒド(PFA)(pH7.4)中で10分間固定し、0.5%Triton X−100/PBS中で3分間、氷上で透過処理し、−20℃で70%エタノール中に保存した。エタノールの希釈系列で脱水した後、70%ホルムアミド/2×SSC(pH7.4)中で80℃、30分間変性させ、再度氷冷エタノール系列で脱水した。次に、Huwel用の蛍光BACプローブ(RP24−157H12)と37℃で一晩ハイブリダイズさせた。カバースリップをDAPI(1μg/ml)で対比染色し、Vectashield(Vector Laboratories)にマウントした。
免疫蛍光とそれに続くDNA FISHを、既報(Chaumeil et al,2004,2008)と同様に行った。カバースリップ上の細胞サンプルを3%PFA(pH7.4)中で、室温で10分間固定した。0.5%Triton X−100/PBS中で、3分間氷上で細胞の透過処理を行った。PBSで洗浄した後、調製物を1%BSA(Sigma)/PBS中で30分間ブロッキングし、抗H3K27me3(1/200;Millipore)と共に4℃で一晩インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 488抗ウサギの二次抗体(1/500;Thermo Fisher Scientific)で、30分間室温でインキュベートした。PBS中で洗浄した後、調製物を室温で10分間、4%PFA中で固定した後、PBSで洗浄した。調製物を0.7%Triton X−100、0.1M HCl中で、10分間氷上でインキュベートした。次いでそれらを2×SSC中で、10分間、室温で2回洗浄した。最後に、調製物を80℃で30分間、70%ホルムアミド/2×SSC(pH7.4)中で変性させ、氷冷2×SSC中に浸漬し、上記のHuwel用の蛍光BACプローブとハイブリダイズさせた。
RNAeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、ESC、EpiLC及びBV及びSC二重陽性(本明細書において「BVSC(+)」と略記する場合がある)のd4、d6、d4c3、d4c5、及びd4c7 PGCLC(各2つの生物学的複製物)から全RNAを精製した。以前報告されたように(Kurimoto et al,2006)、10ng RNA(1,000細胞に当たる)をcDNA複製法に供し、以前報告されたように(Nakamura et al,2015)、3’末端をSOLiD 5500xl systemでディープシーケンシングした。以前の研究(Kagiwada et al,2013)で調製した、E10.5PGC、E12.5及びE13.5のオス/メスの生殖細胞由来の1ng RNA、並びにE9.5PGCから増幅したcDNA(各2つの生物学的複製)もまた、RNA−seqに供した。
ChIP−seqを、既報(Kurimoto et al,2015)と同様に実施した。簡潔に述べると、1×105〜1×106BV(+)d4c7 PGCLCをFACSで精製し、10分間室温で、1%ホルマリン(Sigma)で固定し、続いて150mMグリシンでクエンチした。固定した細胞をPBSで洗浄し、1%SDSを含む溶解緩衝液に溶解し、Bioruptor UCD250を用いて高出力で30秒間の10サイクルで超音波処理した。可溶化したクロマチン画分を、M280 Dynabeadsヒツジ抗マウスIgG(Life Technologies)と複合体中の、ヒストンH3K4me3、H3K27ac、又はH3K27me3に対するマウスモノクローナル抗体(Hayashi−Takanakaら、2011)と共に4℃で一晩回転させながらインキュベートした(各2つの生物学的複製物)。洗浄後、1%SDS及び10mM DTTを含有する緩衝液中でクロマチンを溶出させた。溶離液を65℃、一晩で逆架橋させ、4μgのプロテイナーゼKで45℃、1時間処理し、Qiaquick PCR purification column(Qiagen)で精製した。次いで、ChIP処理したDNA及び入力DNAを、超音波処理(Covaris、Woburn、MA)により約150bpの平均サイズにせん断し、既報(Kurimoto et al,2015)のSOLiD5500xl systemでのディープシーケンシングのためのライブラリー調製方法に供した(Kurimotoら、2015)。
以前報告されたように(Shirane et al,2016)WGBSを実施した。簡潔に述べると、150mM NaCl、10mM EDTA、0.5%SDS及び1mg/mLプロテイナーゼKを含有する10mMトリス−Cl(pH8.0)で、精製したBV陽性のd4c3及びd4c7 PGCLC(各2つの生物学的複製物)を、55℃で一晩振盪しながら溶解した。この溶解物を1.32μg/mlのRNase Aと共に37℃で1時間インキュベートし、TEで飽和したフェノールで1回、フェノール−クロロホルムで2回、クロロホルムで1回抽出した。ゲノムDNAを等容量のイソプロパノールで沈殿させ、70%エタノールで2回洗浄し、風乾した後、10mMトリス−Cl(pH8.0)に溶解した。精製したゲノムDNA(50ng)を0.5ngの非メチル化ラムダファージDNA(Promega)でスパイクし、以前報告されたような(Shirane et al,2016)Illumina HiSeq 1500/2500システム上でのディープシーケンシングのため、post−bisulfite adaptor tagging(PBAT)法(Miura et al,2012)を用いてバイサルファイト変換及びライブラリー構築に供した。
以前に記載されたように(Nakamura et al,2015)、cutadapt v1.3(Martin,2011)、tophat v1.4.1/bowtie v1.0.1(Kim et al,2013)、及びcufflinks v2.2.0(Trapnell et al,2012)を用いて、RNA−seqリードデータをマウスmm10ゲノム上にマッピングし、伸長した転写物の末端部位を有する参照遺伝子にアノテートした。発現レベルをreads per million−mapped reads(RPM)に対して正規化した。有意な発現レベルは、log2(RPM+1)>3として定義した。発現レベルの倍数変化(fold changes)が2より大きい場合(即ち、log2(RPM+1)の差が1より大きい場合)、遺伝子は差次的に発現されるとみなした。少なくとも1つの試料において有意に発現し、少なくとも1対の比較(10,437遺伝子)で差次的に発現された遺伝子を、主成分分析(PCA)及びunsupervised hierarchical clustering(UHC)に使用した。差次的に発現される遺伝子のGeneontology(GO)(Ashburner et al,2000)を、DAVIDプログラム(Huang da et al,2009)を用いて分析した。
以前報告されたように(Kurimoto et al,2015)、bowtie v1.1.2(Langmead et al,2009),picard−tools v2.1.0(http://broadinstitute.github.io/picard/)、IGVtools v2.3.52(Robinson et al,2011)、samtools v1.3(Li et al,2009)、及びMACS v2.1.0(Zhang et al,2008)を用いて、ESC、EpiLC、d6 PGCLC(Kurimoto et al,2015)、及びd4c7 PGCLCのリードデータを、マウスmm10ゲノム上にマッピングし、分析した。リードパターンをIGVにより可視化した(Robinson et al、2011)。
近接(1kb以内)で検出されたP値が10−5未満のH3K4me3ピークを単一のピークとして結合し、中心からの500bp内のピークのリード密度をInputのもので正規化した(それらの500bp以上及び5kb以内)(IP/入力レベル)。TSSから2kb以内に位置するIP/入力レベルの最も高いH3K4me3ピークをTSSに関連したピークとみなした。TSSに関連したH3K4me3ピークのIP/入力レベルは、有意な発現レベルの95パーセンタイルを有する遺伝子に関連するものに対してさらに正規化し、H3K4me3レベルとして定義した。
近接(1kb以内)で検出されたP値が10−20より小さいH3K27acピークを単一のピークとして結合した。中央から500bp以内のピークのリード密度を、log2 IP/入力レベルの平均値に対して正規化し、H3K27acレベルとして定義した。H3K27acレベルの倍数変化が2より大きい場合、H3K27acピークはd6−又はd4c7に偏っていると考えた。
TSS(1kb以内)及びTSSに関連したH3K4me3ピーク周辺の領域のH3K27me3のリード密度を、Inputによって正規化し、H3K27me3を定義するため、log2(RPM+1)が2.5より大きく3.5より小さい発現レベルを有する遺伝子のTSSの周辺のH3K27me3のIP/入力レベルの平均に対して正規化した。
アダプタートリミング、マウスmm10ゲノムへのマッピング、及びWGBSデータの分析を、Trim Galore! v0.4.1(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)、cutadapt v1.9.1、及びBismark v0.15.0(Krueger & Andrews,2011)、bowtie v1.1.2及びRプログラムを使用して、既報(Shirane et al,2016)と同様に実施した。バイサルファイト変換率は、陽性対照としてのラムダファージゲノムを使用して、>99.5%と見積もった。
以前報告したように(HCP、ICP及びLCP)(Borgel et al、2010)、プロモーターを、転写開始部位から0.9kb上流及び0.4kb下流の領域として定義し、GC含量及びCpG密度に応じて3つのカテゴリーに分類した。少なくとも5個のCpGを有するプロモーターを、メチル化分析に使用した。E12.5胚で定義されたICRの座標を、従前の刊行物(Tomizawa et al、2011)から得た。反復因子のメチル化分析のために、処理されたリードを反復コンセンサス配列(Shirane et al、2016)にマッピングし、そして少なくとも4リードをカバーするCpG部位を使用した。RepeatMasker(Smit、AFA、Hubley、R&Green、P.Repeat−Masker Open−4.0。2013−2015 http://www.repeatmasker.org)を使用して、リピートと重複しているユニークにマッピングされた領域を定義した。ユニークにマッピングされた全ゲノム領域の分析のために、1kbの重複を有する2kbのスライドウィンドウにおける5mCレベルを計算した。
ユニークにマッピングされた領域のメチル化分析のために、4未満のリードと200以上のリードをカバーしたCpG部位を除外した。従って、メチル化/非メチル化シトシンをコールするための最少配列深度は、4であった。反復因子のメチル化分析のために、処理されたリードを反復コンセンサス配列(RepBase19.0.4)にマッピングし、そして少なくとも5リードをカバーするCpG部位を使用した。
d4c3/d4c5/d4c PGCLC及びE9.5/E12.5生殖細胞のRNA配列データに関するアクセッション番号は、GSE87644(GEOデータベース)である。ESC/EpiLC/d4/d6 PGCLC[BVSC(+)](GSE67259)及びE10.5/E11.5/E13.5生殖細胞(GSE74094)のRNA配列データを、GEOデータベースからダウンロードした。d4c7 PGCLCのH3K4me3、H3K27ac、及びH3K27me3のChIP配列データに関するアクセッション番号は、GSE87645(GEOデータベース)である。
ESC/EpiLC/d2/d4/d6 PGCLC(GSE60204)のH3K4me3、H3K27ac、H3K27me3のChIP配列データを、GEOデータベースからダウンロードした。d4c3/d4c7 PGCLCのWGBS配列データのアクセッション番号は、DRA005166(DDBJデータベース)である。ESC/EpiLC/d2/d4/d6 PGCLC(DRA003471)及びE10.5/E13.5 PGC(DRA000607)のWGBS配列データを、DDBJデータベースからダウンロードした。
PGCLCを増幅する化合物のスクリーニング
Blimp1−mVenus及びStella−ECFP(以下、Blimp1−mVenusをBV、Stella−ECFPをSCともいう)トランスジーン(Ohinata et al、2008)を有するいくつかの新規なマウス胚性幹細胞(ESC)の雄性幹細胞株を得て、PGCLCの誘導および増殖に対するそれらの効率を評価した。すべてのESC株は、アクチビンA(ActA)及び塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)によりEpiLCに誘導され、骨形成タンパク質4(BMP4)、白血病抑制因子(LIF)、幹細胞因子(SCF)、及び上皮成長因子(EGF)によりBV陽性もしくはBV及びSC二重陽性(本明細書において「BV/BVSC(+)」と略記する場合がある)のPGCLCに誘導された。浮遊凝集体中のBV(+)PGCLCの数は、誘導の6日目(d6)または8日目(d8)まで増加し、その後減少した。これは、本発明者らの以前の報告(Hayashi et al、2011)と一致する。評価した株の中で、BVSC BDF1−2は、浮遊凝集体中で最も強固な誘導および増殖を示した。この株をその後のスクリーニングに用いた。
浮遊凝集物中で増殖期にあると思われるd4 PGCLCを、PGCの生存を支持することが知られている膜結合型のSCFを発現するm220フィーダー(Dolci et al,1991;Majumdar et al,1994)とともに、96ウェルプレート上に播種することとした。また、細胞分析装置を用いて、BV(+)PGCLCの増殖を増強する化合物をスクリーニングすることとした(図1A)。ESCやEGCはBlimp1もしくはBVを発現しないか低くしか発現しないため(Durcova−Hills et al,2008;Ohinata et al,2008;Hayashi et al,2011)、BV陽性は、PGCLCの増殖を、胚性生殖細胞(EGC)へのPGCLC脱分化と区別すると推論された(Matsui et al,1992)。m220細胞は、フィーダーとしてそれらの調製に必要とされるマイトマイシンC(MMC)処理に対して非常に脆弱であったので、MMC処理に耐性を有するm220亜系統株(subline)をクローン化して用いた。選択された条件下で、PGCの増殖を刺激することが知られている古典的な因子であるLIF(Matsui et al,1991)を用いて、7日間の培養後に、BV蛍光の対応する増加として、PGCLCの増殖を細胞分析装置により首尾よくモニタリングした。この単純な陽性対照条件下で、PGCLCのEGCへの脱分化は、ほとんど又は全くないことが確認された。従って、7日間の培養後にBV(+)d4 PGCLCを増幅する能力について、細胞内シグナル伝達分子/経路の多様なセットを標的とする、合計約2,000の化合物のスクリーニングを行った。その結果、10μMの濃度で、陰性対照培養と比較してBV(+)細胞を有意に増幅した63の化合物を同定した。培養1日目と7日目との間のBV蛍光の倍数差(fold difference)は、陰性対照の平均値の3SD(標準偏差)よりも大きかった(図1B及びC)。特に、上位25のヒットした化合物のうち、5つ(20%)はホスホジエステラーゼ4(PDE4)に対する選択的阻害薬[イブジラスト、S−(+)−ロリプラム、ロリプラム、GSK256066、シロミラスト]、3つ(12%)はレチノイン酸(RA)シグナル伝達に対するアゴニスト(アシトレチン、TTNPB、レチノイン酸)であり、1つはフォルスコリンであった(図1D)。PDE4はサイクリックAMP(cAMP)のAMPへの加水分解を触媒し、したがってPDE4阻害薬は細胞内cAMPレベルを増加させる(Pierreら、2009;Keravis&Lugnier、2012)。フォルスコリンはアデニレートシクラーゼの強力な活性化因子であり、したがって細胞内cAMPレベルも上昇させる(Pierre et al、2009)。RAシグナル伝達およびフォルスコリンは、PGCの増殖を刺激することが知られている(De Felici et al,1993;Koshimizu et al,1995)。他のPDEに対する選択的阻害薬又はPDEに対する非選択的阻害薬は、PGCLCの増殖に対して正の効果を示さなかった。図1Cは、培養7日目の、PDE4阻害薬、GSK256066の存在下でのBV(+)細胞の増殖を示し、独特の平坦な形態を有する複数のコロニーの形成を明らかにするものである。同じ化合物ライブラリーのいくつかを用いて、1μMの濃度で同様のスクリーニングを行ったところ、同じクラスの化合物(PDE4の選択的阻害薬、RAシグナル伝達のアゴニスト、及びフォルスコリン)をPGCLC増殖の強力な刺激物質として同定した。
また、10および1μMスクリーニングからそれぞれ、BV(+)細胞の増殖または生存に負の影響を及ぼす426および178の化合物を同定した(培養1日目と7日目との間のBV蛍光の倍数減少(fold reductions)は、陰性対照の平均値の3SDよりも大きかった:図1BおよびE)。そのような化合物は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)シグナル伝達、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)シグナル伝達、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)シグナル伝達、Janusキナーゼ(JAK)シグナル伝達、およびAKTシグナル伝達に対する経路[reviewed in(Saitou & Yamaji,2012)]のような、PGC増殖/生存に正の影響を及ぼすことが知られているものを含む、主要なシグナル伝達経路の阻害薬、ならびに細胞周期/細胞分裂およびDNA複製/修復のための阻害薬を含む。まとめると、これらの知見は、スクリーニングがPGCの増殖/生存に関連する主要な経路に影響を与える化合物を首尾よく同定したことを強く示している。
ヒットした化合物の中で、PDE4阻害薬が最も濃縮された化合物であったため(図1D)、その後の研究において、PDE4阻害薬の1つであるロリプラムの効果に焦点を当てることにした。ロリプラムは、効率的なPDE4阻害薬として、多様な実験において再現性よく使用されている(Keravis&Lugnier、2012)。m220フィーダー上のSCFの存在下でGMEM/10%KSR/2.5%FCS中のBVSC BDF1−2 ESCから誘導されたd4 PGCLCの増殖について、ロリプラム、フォルスコリン及びそれらの併用(異なるメカニズムにより、両方とも細胞内cAMP濃度を増加させる)(Pierre et al、2009)の効果を評価した。LIFはPGC増殖の他の刺激因子とともに適用した場合、PGCLCのEGCへの脱分化を高める可能性があるので(Matsui et al,1992)、この培養物に含めないこととした。ロリプラム単独(10μM)の効果は、比較的軽度であり、フォルスコリン単独(10μM)の効果と同様であった(図2A)。しかし、ロリプラムとフォルスコリンを併用すると、d4 PGCLCの増殖を効果的に刺激した:ロリプラムとフォルスコリンの両方を10μMとすると(FR10)、d4 PGCLCは培養7日目(d4c7)まで少なくとも強く安定した増殖を示し、4から5回の倍加に相当する20倍以上増加した(図2A−C)。重要なことに、増幅された細胞は平らなコロニーを形成し、BVSCを強く発現し続け、顕著な糸状仮足および鞭毛腺腫を伴う運動細胞の特徴を示したことから(図2B及びD)、FR10による増幅後に移動期PGCの特性を維持していることが示唆される。
フォルスコリン及びロリプラムが実際にPGCLC中のcAMP濃度を上昇させるかどうかを調べるために、フォルスコリン、ロリプラム、またはその両方に応答するPGCLCのcAMP濃度の増加を測定した。図2Eに示すように、フォルスコリンとロリプラムとは、独立して、PGCLC中のcAMP濃度を約4nM/1x104 d4 PGCLCに増加させた。より顕著には、フォルスコリンとロリプラムを同時に添加すると(FR10)、PGCLC中のcAMP濃度が約40nM/1×104 d4 PGCLC超に上昇した。
FR10は、他の雄性及び雌性のESC株から誘導されたPGCLCを、培養7日目で約20倍の平均増幅率(average expansion rate)で増幅するのに有効であった。場合によっては、PGCLCを約50倍に増幅し、これは5−6回の倍加に相当した(図2C)。FR10はまた、E9.5でのPGCの増幅にも有効であったが、幾分限定された程度までであり(最大約8倍の増幅、図2C)、これは、胚から直接単離されたE9.5PGCとインビトロでPSCから誘導されたd4 PGCとの間の現在の条件下での生存性の差によるものであろう。細胞周期分析は、培養7日目でSおよびG2/M期のわずかな減少、及び明らかな対応する増加を伴って、培養されたPGCLCの大部分(>約60%)がS期にあることを明らかにした(図2F及びH)。これは、E13.5後のG0/G1期に増殖が停止し、阻止された胚生殖腺における雄生殖細胞の細胞周期特性(Western et al,2008)とは著しく対照的である(図2G及びH)。これらの知見は、ロリプラムとフォルスコリンがPGCLCの細胞周期を進行させるために相乗的に作用することを示すものであり、おそらくcAMPシグナル伝達の強固な活性化を介して起こるものである。
次に、培養中にFR10により増幅されたPGCLCがPGC/PGCLCとしての機能を維持するかどうかを評価した。この目的のために、BVSC BDF1−2、BCF1−2、又はR8(主にC57BL/6)ESCsから誘発されたd4c7及びd4 PGCLCを、内因性生殖細胞を欠く新生児W/Wvマウスの精巣に移植した。BVSC BDF1−2又はBCF1−2 ESCから誘導されたd4c7 PGCLC及びd4 PGCLCを移植した精巣は、移植7ヶ月後に顕著な大きさの増大を示し(図3A)、精子形成の証拠を伴う多数の精細管を含み、実際に豊富な精子を産生した(図3B−F)。注目すべきことに、BVSC BDF1−2又はBCF1−2ESC由来のd4c7及びd4 PGCLCの両方による精子形成の回復は、精子が精巣上体に輸送されるほど顕著になり、そのような精子は、明らかに正常な子孫を産生するために体外受精(IVF)に使用される頑強な運動性を獲得した(図3G−K)。したがって、BVSC BDF1−2またはBCF1−2 ESC由来のd4c7及びd4 PGCLCのレシピエントの雄は、自然交配によって実質的に同腹仔の大きさの子孫を産生することができ、得られた子孫は明らかに正常な成長を示した(図3L−N)。
対照的に、BVSC R8 ESC由来のd4c7又はd4 PGCLCを移植した精巣は、サイズのおだやかな増加しか示さず、精子形成を伴う精細管の数が少なくなり、得られた精子は精巣上体に達しなかった。それにもかかわらず、以前に報告したように(Hayashi et al、2011)、得られた精子の細胞質内注入(ICSI)で明らかに正常な子孫を得ることができた。重要なことに、d4/d6 PGCLC又はPGC(Ohtaら、2004)の場合のように、いずれのESC株から誘導されたd4c7 PGCLCも成体精巣に定着できなかった。移植のいずれにおいても奇形腫の形成は認められなかった。まとめると、これらの知見は、培養中にFR10により増幅されたPGCLCが本来の機能特性を忠実に維持し、ハイブリッドな遺伝的バックグラウンドを有するPGCLCが不妊マウスの精子形成を再構成するのに十分強力であるため、レシピエントマウスが自然交配により子孫を産生することを示す。
次に、増幅培養中のPGCLCの詳細な転写特性(transcriptional properties)を決定した。第1に、免疫蛍光(IF)分析により、d4c7 PGCLCは、E13.5の雄性生殖細胞と比較して、より高いレベルのOCT4を発現する一方で、PGCが胚性腺のコロニー形成後に徐々にアップレギュレートする主要な翻訳調節因子であるDDX4およびDAZL(Fujiwaraら、1994;Cookeら、1996)をより低いレベルで発現することが明らかになった(いくつかのd4c7 PGCLCはDAZLを完全に発現するようであった)(図4A)。第2に、RNAシーケンシング(RNA−seq)法(Nakamura et al、2015、2016)により、培養したPGCLC[BVC R8 ESCから誘導されたd4c3、d4c5及びd4c7 PGCLC]の転写物を決定し、それらをESC、EpiLC、d4/6 PGCLC、及び生殖細胞[E9.5、E10.5及びE11.5のPGC;E12.5及びE13.5の雄性/雌性生殖細胞(Kagiwada et al,2013)]の転写物と比較した。注目すべきことに、主成分分析(PCA)は、培養したPGCLCをd4/6PGCLCと、次いでE9.5、E10.5及びE11.5PGCと、近くでクラスター化したが、E12.5及びE13.5雌雄/雌性生殖細胞とは遠く離れており(図4B)、これは、PGCLCは、その増幅培養中にトランスクリプトームを完全に維持することを示す。一方、unsupervised hierarchical clustering(UHC)及びPGCLC間のPCAは、d4からd6へ、次いでd4c3、d4c5、およびd4c7 PGCLCへのPGCLCsの特性の漸進的な移行を明らかにした。したがって、増幅培養中、PGCLCは指向性の転写変化(directional transcriptional change)を起こすようであり、その初期段階は浮動集合体でも現れる。d4c7及びd6 PGCLCの間、ならびにE13.5及びd6 PGCLC雄性/雌性生殖細胞の間に差次的に発現される遺伝子(DEG)を同定した。d4c7 PGCLCは、478および409遺伝子をそれぞれアップ/ダウンレギュレートし、アップレギュレートされた遺伝子は、「細胞内シグナル伝達カスケード」及び「パターン特定プロセス」などのgene ontology(GO)機能的タームを有するものでエンリッチされていた。PCAと一致して、E13.5及びd6 PGCLC雄性/雌性生殖細胞間のDEGは、数がはるかに大きかった(図4C及びD)。E13.5雄性/雌性生殖細胞は、2,381及び1,705の遺伝子をそれぞれアップ/ダウンレギュレートし、これらのDEGは、生殖細胞発生中の主要な発生進行を反映するGOタームのエンリッチメントを示した。例えば、雄性で特異的にアップレギュレートされる遺伝子は、「転写」(Foxo1、Utf1、Pou6f1)および「クロマチン構成」(Ezh1、Prmt5、Kdm2a)でエンリッチされ、雌性で特異的にアップレギュレートされる遺伝子は、「転写の調節」(Gata2、Msx1、Cdx2)および「配偶子世代」(Figla、Nr6a1、Rec8)でエンリッチされ、特に、雄性及び雌性の両方において一般にアップレギュレートされる遺伝子は、「減数分裂」(Spo11、Mael、Sycp1)、「染色体編成」(Ehmt1、Suv39h1、Smarcc1)、および「メチル化」(Piwil4、Satb1)したがって、減数分裂およびトランスポゾン抑制のような生殖系列機能に関与する遺伝子として以前に同定され、主にDNAメチル化によって体細胞で抑制されている、いわゆる「生殖系列遺伝子」に対してエンリッチされた。
PGCLC間のUHCおよびPCAと一致して、d4c7及びd6 PGCLC間のDEGは、培養中にこのような状態を漸進的に獲得し(図4E)、特にin vivoでの胚細胞発生中に進行性のアップ/ダウンレギュレーションも示した(図4E)。それらは少数部分を構成し、その大部分はE13.5およびd6 PGCLCにおける雄性/雌性生殖細胞間のDEGに含まれていた(図4CおよびD)。重要なことに、これらは、性特異的制御のバイアスを示さなかった(図4C及びD)。d4c7 PGCLC及びd6 PGCLCの間のDEG、ならびにE13.5及びd6 PGCLCでの雄性/雌性生殖細胞間のDEGの間の関係のより詳細な洞察を得るために、E13.5及びd4 PGCLCにおける雄性/雌性生殖細胞間の発現レベル差を、E13.5及びd6 PGCLCでの雌性/雌性生殖細胞間の発現レベル差に対してプロットした(図4F)。この分析により、d6 PGCLCと比較して、E13.5およびd4c7 PGCLCでの雄性/雌性生殖細胞において一般にアップレギュレートされる306の遺伝子のうち、104の遺伝子が部分的にのみ活性化され(E13.5−d4c7>2倍)、197個の遺伝子が完全にd4c7 PGCLCにおいて活性化された(−2倍<E13.5−d4c7<2倍)(図4F)ことが明らかになった。前者はDdx4、Dazl、Brdt、Asz1、Dmrt1、Stra8、Sycp3、Syce1及びSmc1bなどの遺伝子を含み、「生殖系列遺伝子」でエンリッチされ、後者はPiwil2、Rpl10l、Rpl36及びRhox遺伝子を含んだ(図4F)。一方、d6 PGCLCと比較して、E13.5およびd4c7 PGCLCでの雄性/雌性生殖細胞において一般にダウンレギュレートされる252の遺伝子のうち、68の遺伝子は部分的にのみダウンレギュレートされ(E13.5−d4c7<−2倍)、180の遺伝子はd4c7 PGCLCにおいて完全にダウンレギュレートされた(−2倍<E13.5−d4c7<2倍)。これらの知見は、増幅中に、PGCLCは、移動期PGCの特性を本質的に維持しながら、性分化の前に胚性腺で現れる生殖細胞成熟プログラムの一部を徐々に獲得することを実証している。
培養されたPGCLCの特性を支配するメカニズムを探索するために、それらのエピジェネティックプロファイルを決定した。IF分析により、d4c7 PGCLCは、EpiLCと比較して、5メチルシトロン(5mC)レベルが低いことが明らかになった(図5A)。トランスクリプトーム解析の結果と一致して、d4c7 PGCLCは、EpiLCと比較して、同様のレベルのDNMT1を発現したが、DNMT3A/3B及びUHRF1のレベルがはるかに低かった(図5B)。さらに、d4c7 PGCLCは、EpiLCと比較して、ヒストンH3リジン27三メチル化[H3K27me3:ポリコーム複合体2(PRC2)による抑制を表す]レベル及びH3K9ジメチル化[H3K9me2:G9A/GLPによる抑制を表す]レベルが、それぞれ高く及び低かった(図5A)。したがって、d4c7 PGCLCのエピジェネティック特性は、d4c7 PGCLCがd6PGCLCよりも5mCレベルがはるかに低いと思われる点を除き、d6 PGCLCのエピジェネティック特性(Hayashi et al、2011;Kurimoto et al、2015)と著しく類似しているようであった。
そこで、全ゲノムのバイサルファイトシーケンシング(WGBS)により、(BVSC R8 ESCから誘導された)d4c3及びd4c7 PGCLCにおけるDNAメチル化のゲノムワイドレベルおよび分布を定量し、また、クロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP−seq)に続いて大規模なパラレルシーケンスにより、(BVSC R8またはBDF1−2ESCから誘導される)d4c7 PGCLCにおけるH3K4me3(プロモーター活性を示す)、H3K27アセチル化(ac)(活性エンハンサーを示す)、及びH3K27me3のゲノムワイドレベルおよび分布を定量し、さらに、最近報告されたPGCLCの誘導の間の主要な細胞型(ESCs、EpiLCs、ならびにd2、d4及びd6 PGCLC)のデータ(Kurimotoら、2015;Shiraneら、2016)と比較して、これらのデータを分析した。バイサルファイトシーケンシングは5mC及び5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)を区別せず(Hayatsu&Shiragami、1979)、また、PGCLCの誘導の間の5hmCレベルはほとんど無視できるので(Shirane et al、2016)、以下、5mCと5hmCを総称して5mCとする。図5Cは、Prdm14遺伝子座およびHoxbクラスター周辺のWGBSおよびChIP−seqトラック遷移を示す。活性型(H3K4me3およびH3K27ac)および抑制型(H3K27me3)ヒストン修飾の両方が、d6およびd4c7 PGCLC間で比較的類似の分布を示した(図5C)一方で、IF分析と一致して、著しく、PGCLCの培養中に両座において5mCがほぼ完全に消去された。これは、PGCLCの増幅が、ヒストン修飾を維持しながら、徐々に5mCを消去するプロセスであることを示唆している。
次に、PGCLC培養中の5mCレベルの動態に関するより詳細な分析を行った。CpH(H=A、C、又はT)メチル化は、PGCLCの誘導の間制限され(Shirane et al、2016)、哺乳類細胞では明確な生物学的役割を示さないことが分かっているため(Schubeler、2015)、CpGの5mCsに焦点を当てた。ゲノムワイドDNAメチル化状態の主要なパラメータとして、ユニークな配列領域全体の5mCレベルの平均を決定した(ユニークな領域:1kbの重複を伴う2kbのスライドウィンドウ)。プロモーター(高、中、及び低CpG密度プロモーター:それぞれHCP、ICP、及びLCP)(Weberら、2007)、反復因子のコンセンサス配列[長鎖散在反復配列1(LINE1);嚢内A粒子(IAP);IAP以外の内因性レトロウイルス配列(ERV);メジャーおよびマイナーサテライト]、およびインプリンティングされた遺伝子の刷り込み制御領域(ICR)を別々に決定した。また、非プロモーターCpGアイランド(CGI)、エキソン、イントロン、遺伝子間領域、細胞型特異的エンハンサー(Kurimotoら、2015)、および「生殖系列遺伝子」のCGI(Weber et al,2007;Borgel et al,2010;Kurimoto et al,2015)の5mCレベルを決定した。
既報のとおり、PGCLCsは、胚盤葉と非常に類似したDNAメチロームを有するEpiLCsで確立された5mCsの連続希釈を示し、その結果、d6 PGCLCsは、平均約37%の5mCレベル(約E9.0−9.5での移動期PGCと類似していると考えられる状態)を獲得する。驚くべきことに、Prdm14遺伝子座およびHoxb遺伝子座の分析と一致して、培養したPGCLCにおいて、ユニークな領域、繰り返し、および別個の調節要素について異なるキネティクスで、d4/d6細胞の5mCレベルの連続希釈が存在した。その結果、d4c7細胞には約6%の平均5mCレベルしかなく(図6A)、生殖系列サイクル全体を通じて最低の5mCレベルを有するE13.5生殖細胞(Seisenbergerら、2012;Kobayashiら、2013)と同等のレベルであった。重要なことに、リピート、脱メチル化に耐性のある「生殖系列遺伝子」のプロモーター、及びインプリンティングされた遺伝子のICRを含む、実質的に全てのゲノムエレメントにおける5mC分布パターンは、d4c3 PGCLCとE10.5PGCとの間、及びd4c7 PGCLCとE13.5生殖細胞の間で著しく類似していたが、一方で、類似の5mCレベルを示す、d4c3 PGCLCと、2つのキナーゼ阻害剤(2i)を用いて培養したESC(Habibi et al,2013;Shirane et al,2016)との間の5mC分布パターンは、異なっていた。これは、培養したPGCLCにおけるDNAの脱メチル化は、in vivoのPGCにおけるメカニズムと、同じではないにしても類似したメカニズムを有しているが、インビトロで2iによって誘発されるメカニズムとは類似しないことを示唆している。DNAの脱メチル化を回避する「escapee」(5mC>20%)(Sepisenberger et al,2012)を分析し、escapeeがd4c7 PGCLCとE13.5生殖細胞との間でも大きく重なっており、それらの大部分はIAPの近くに存在することを見出した。従って、m220フィーダー上でのPGCLCの誘導及びFR10を用いたそれらの培養は、包括的にPGCにおけるDNAのメチル化リプログラミングを再構成した。それにもかかわらず、前記で実証したように、培養したPGCLCは、基本的に遊走性のPGCの転写状態を維持した(図4B)。
従って、プロモーターの脱メチル化がd4c7 PGCLCにおける転写活性化に及ぼす影響を調べた。培養したPGCLCにおける全体的なDNAの脱メチル化を反映して、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間で7,737個ものプロモーターが脱メチル化された(d6で5mC>20%、d4c7で<20%)(図6C)。d6 PGCLCと比較してd4c7 PGCLCでアップレギュレートされた478個の遺伝子のうち、96個の遺伝子がプロモーターの脱メチル化がされており、27個は、104個の部分的にアップレギュレートされた遺伝子(E13.5−d4c7>2倍)(Ddx4、Dazl、Brdt、Asz1、Dmrt1、Stra8、Sycp3、Syce1、Smc1bなど)に含まれており、34個は、完全にアップレギュレートされた197個の遺伝子(−2倍<E13.5−d4c7<2倍)(Piwil2、Rpl10l、Rpl36、Rhox遺伝子など)に含まれていた(図6D)。部分的に/完全にアップレギュレートされた遺伝子の中で、プロモーターが脱メチル化された遺伝子の割合は、部分的に/完全にダウンレギュレートされた遺伝子の中で、プロモーターが脱メチル化された遺伝子の割合より高かった(図6D)。プロモーターの脱メチル化自体が、培養したPGCLCにおける限られた数だけの特異的遺伝子の活性化に部分的に寄与すると結論づける。
次に、PGCLCの誘導及び拡大中のH3K4me3、H3K27ac及びH3K27me3の分布の動態を解析した。PGCLC誘発中の主要な細胞型の場合と同様に、高レベルのH3K4me3は、d4c7 PGCLCにおいてHCPと主に結合し、転写開始点(TSS)の周辺のH3K4me3レベルは、関連遺伝子の発現レベルと正の相関関係があった(Ohta et el.,2017.図EV5A及びB)。このことは、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間の転写類似性を反映しており、ゲノムにわたるH3K4me3プロファイルは、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間で類似していた。重要なことに、エンハンサーの使用を示し、かつ異なる細胞型間(Calo & Wysocka,2013)、及びPGCLC誘発中(Kurimoto et al,2015)における、高度に動的な変化を示すH3K27acの分布も、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間で類似していた(図7A及びB)。これは、遺伝子発現自体だけでなく、遺伝子発現の調節もPGCLC培養の間大いに保存されていることを示している。それにもかかわらず、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間の潜在的な調節性の差異を示すであろう、d6 PGCLC又はd4c7 PGCLCのいずれかに特異的なH3K27acのピーク(TSS及び遺伝子体から15kb未満)を同定した。
H3K27me3の分布パターンもまた、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCとの間で非常に類似しているようであった(図7C及びD)。しかし重要なことに、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCの間で実質的な脱メチル化を有するプロモーター(d6では5mC>20%、d4c7で<20%、7737プロモーター)は、d4c7 PGCLCにおいてd6 PGCLCよりも高いH3K27me3の濃縮レベルを有する一般的な傾向を示したが、5mCレベルに変化がないプロモーターはそのような傾向を示さなかった(図7C及びD)。EpiLCとd6 PGCLCとの間で実質的な脱メチル化を示したにもかかわらず、前記プロモーターはEpiLCとd6PGCLCとの間のH3K27me3濃縮レベルの全体的な変化を示さなかった。これらの知見は、培養したPGC中の広範かつほとんど完全なプロモーターの脱メチル化が、H3K27me3濃縮レベルの付随的なアップレギュレーションにより少なくとも部分的に代償されることを示し、これが培養したPGCLCにおける遊走性のPGCの転写状態の維持に寄与するのであろう。
適切な発生のきっかけの活性化を支える状態である(Voigt et al,2013)、H3K4me3を活性化し、H3K27me3を抑制する二価の(bivalent)プロモーターを評価した(二価の定義については、材料及び方法を参照のこと)。以前の報告(Kurimoto et al,2015)と一致して、二価の遺伝子の数は主要な培養細胞型間において、EpiLCで最大であり、d6及びd4c7 PGCLCは同様の数の二価の遺伝子を示した(図7E)。しかし、d6 PGCLCとd4c7 PGCLCの間の二価の遺伝子の重複は、比較的中程度であった(〜519/1,058(〜49%))。これは、2つの異なる試料における2つのヒストン修飾の組合せのレベルを正確に比較すること対する内在する技術的な困難性に一部起因する。それにもかかわらず、d4c7 PGCLCの二価の遺伝子は、d6 PGCLCのものと比較して、「パターン特定プロセス(pattern specification process)」及び「胚の形態形成(embryonic morphogenesis)」などのGOタームにおいてより高い濃縮度を示した(図7F)。例えば、d4c7 PGCLCは、H3K27me3の高レベルによってクラスターが抑制されていても、Hoxcクラスターの周りで上昇したH3K4me3レベルを獲得した。d4c7 PGCLCが、エピジェネティックな「白紙状態」を示す、ゲノムワイドな5mC及びH3K9me2レベル(図5A及び6)(Kurimoto et al,2015)の非常にレベルが低い発生の調節因子に対して、高度にバランスのとれたエピゲノムを有すると結論づける。
雌性PGCLC及び雌性ESCにおけるX染色体の動態は、2つの活性化したX染色体(XaXa)を有し、雄性ESCと比較して低いゲノムワイドな5mCレベルを示す(Zvetkova et al,2005;Shirane et al,2016)。雌性EpiLCの大部分はXaXaを有し、浮遊凝集体形成の際に、Xの不活性化を受け、雌性mPGCLCは1つのXaと1つの不活性なX染色体(XaXi)を示す(Hayashi et al,2012;Shirane et al,2016)。次に、培養での雌性PGCLC増殖中のX染色体動態を評価した。雌性ESCは1つのX染色体を失ってXOになることがあるので(Robertson et al,1983;Zvetkova et al,2005)、最初に、X連鎖遺伝子のHuwe1のDNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析によって2系統(BVSC H14及びH18(129sv/C57BL/6バックグラウンド)のメスのESCからのPGCLC誘導及び増殖中において、2つのX染色体の維持の程度を調べた。図8Aに示すように、2つのXは、ESCからEpiLCへの分化中に比較的良好に維持されたが、PGCLCの誘導時には、1つのXが失われる傾向があり(XO:H14 d4 PGCLC及びH18 d4 PGCLCに関して、それぞれ〜60%及び〜40%)、培養でのPGCLCの増殖中では、XX/XO比は良好に保存されていた(XO:H14 d4c7 PGCLC及びH18 d4c7 PGCLCに関して、それぞれ〜60%及び〜40%)。
次に、本発明者らは、X染色体上のH3K27me3陽性度を評価することにより、PGCLCの増幅中のXa/Xi状態を調べた。図8Bに示すとおり、雌性マウス胎仔フィーダー(MEF)の約95%が2つのXsを有しており、当該細胞の約90%が1つのX上に単一のH3K27me3スポットを示し、それらがXaXi状態であることが示された。本発明者らは、XX d4 PGCLCの約50%がXaXi状態を示すのに対し、XX d4 PGCLCの約30%はX染色体上にH3K27me3スポットを示さないことを見出した(図8B)。意外なことに、少数(<5%)のXX d4c3及びd4c7 PGCLのみがXaXi状態を示し、それらの約70%はX染色体上にH3K27me3スポットを示さなかった(図8B)。このことは、PGCLCの増幅培養の間に1つのXiが再活性化するか、あるいは、再活性化のプロセスにあることを示しており、d4c7 PGCLCがエピジェネティックな「白紙状態」を獲得するという見解とよく一致している。
以下に引用する文献の詳細情報については、Miyauchi,H.et al.,EMBO J.,36(21):3100−3119(2017)を参照のこと。
動物
すべての動物実験は、京都大学の倫理ガイドラインの下で行った。BVSC(Acc.No.BV、CDB0460T;SC CDB0465T:http://www.cdb.riken.jp/arg/TG%20mutant%20mice%20list.html)、Stella−EGFP(SG)およびmVH−RFP(VR)トランスジェニックマウスは、以前(Payer et al,2006;Seki et al,2007;Ohinata et al,2008;Imamura et al,2010)報告されたように樹立し、主にC57BL/6のバックグラウンドで維持した。BVSCDT ESC(XY)を胚盤胞(ICR)に注入し、その後仮親に移入することによりDazl−tdTomato(DT)マウスを作製した。ICRマウスは、SLC(Shizuoka、Japan)から購入した。膣栓が同定された日の正午を胎生期(E)0.5日とした。
妊娠した雌(ICR)にLDN−193189を投与するために、LDN−193189(sm10559;Sigma−Aldrich)を滅菌水に溶解し、2.5mgのLDN−193189を体重1kgあたりE11からE14まで12時間ごとに腹腔内注射した。
H8 BVSC ESC(XX)(Hayashi et al,2012)、R8 BVSC ESC(XY)(Hayashi et al,2011)、L9 BVSCVR ESC(XX)、L5 BVSCVR ESC(XY)、BVSCDT ESC(XY;R8のサブライン)、BDF1−2−1 BVSC ESC(XY)(Ohta et al,2017)、およびStra8ノックアウトBVSC ESC(SK1,2,3;XY;BDF1−2−1のサブライン)を本研究に使用した。L5およびL9BVSCVR ESCは、VR雌(Imamura et al,2010)と、BVSC雄(Ohinata et al,2008)との交配によって得られた胚盤胞から、以前に記載された手順に従って樹立され、フィーダーフリー条件に適合させた(Hayashi et al,2011)。BVSCDTおよびStra8ノックアウトESCの樹立手順は、それぞれ、以下の「BVSCDT ESCの確立」および「Stra8ノックアウトESCの確立」の節に記載されている。
ESC培養およびPGCLC誘導は、いくつかの変更を加えて、以前(Hayashi et al、2011;Hayashi&Saitou、2013)に記載されたように行った。ESCは、ポリ−L−オルニチン(0.01%;Sigma)およびラミニン(300ng/ml;BD Biosciences)でコーティングしたディッシュ上またはマウス胚線維芽細胞(MEF)上で、2i+LIF条件下で維持した。アクチビンA(20ng/ml;PeproTech)、bFGF(12ng/ml;Life Technology)およびKSR(1%;Thermo Fisherを含有するN2B27培地中、ヒト血漿フィブロネクチン(16.7μg/ml;Millipore)でコーティングした12ウェルプレートのウェル上に1.0×105個のESCをプレーティングすることにより、EpiLCを誘導した。EpiLC誘導の42〜46時間後、PGCLCを、低細胞結合性96ウェルリピジュア−コーティングプレート(Thermo Fisher)のウェル中、BMP4(500ng/ml;R&D Systems)、LIF(1,000U/ml;Merck Millipore)、SCF(100ng/ml;R&D Systems)およびEGF(50ng/ml;R&D Systems)を含む200μlのGK15培地中に、2.0×103個のEpiLCをプレーティングすることにより、浮遊条件下で誘導した。GK15培地は、15%KSR、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシンおよび2mM L−グルタミンを含むGMEM(Thermo Fisher)で構成した。PGC/PGCLC培養は以前(Ohta et al,2017)に記載されたように行った。簡単に述べると、d4 PGCLC凝集体を回収し、PBSで洗浄し、TrypLE Express(Thermo Fisher)で解離させた。次いで、それらをDMEM/F12+0.1%BSA(Gibco)で洗浄し、細胞ストレーナー(BD Bioscience)で濾過して大きな細胞塊を除去した。次に、サンプルを遠心分離し、0.1%BSA−PBSに再懸濁し、FACS(Aria III;BD Bioscience)で選別した。BV(+)細胞を、PGC/PGCLC増幅培地中のマイトマイシンC(MMC)処理m220フィーダー細胞上に播種した。
PGC/PGCLC増幅培地は、10%KSR、2.5%FBS、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L−グルタミン、0.1mM 2−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlのGMEMストレプトマイシン、10μMフォルスコリン、および10μMロリプラムで構成した。培地全体をc3から2日ごとに交換した。雌の運命の誘導のためのサイトカイン/化合物は、c3から培養の最後まで提供した。別段の指定がない限り、用いたRAおよびBMPの濃度はそれぞれ100nMおよび300ng/mlであった。IX73倒立顕微鏡(Olympus)を用いて、明視野および蛍光画像を取り込んだ。
Dazl−tdTomato(DT)ノックインESCの作製のためのドナーベクターを構築するために、Dazlの相同性アーム(それぞれ終止コドンの上流1,048bpから及び下流1,247bpまでの断片)を、PCR(Primers)によるR8 BVSC ESCのゲノムDNAから増幅し、pCR2.1ベクター(TOPO TA Cloning;Life Technologies)にサブクローニングした。LoxP部位に隣接するPgk−Puroカセットを有するP2A−tdTomato断片を、以前報告されたベクター(Sasaki et al,2015)からPCRによって増幅し、相同性アームを含有する、サブクローニングしたベクターのDazlコード配列の3’末端に、GeneArt Seamless Cloning&Assembly Kit(Life Technologies)を用いて、インフレームで挿入した。ストップコドンは、インフレーム融合タンパク質の発現のために除去した。
Dazlの終止コドンに隣接する配列を標的とするTALENコンストラクトは、以前に記載されたようにGoldenGate TALEN and TAL Effector kit(Addgene#1000000016)を用いて作製した(Sakuma et al,2013;Sasaki et al,2015)。TALENの活性は、一本鎖アニーリング(SSA)アッセイによって評価した。
ドナーベクター(5μg)およびTALENプラスミド(それぞれ10μg)を、NEPA21 type II electroporator(Nepagene)を用いたエレクトロポレーションによってR8 BVSC ESCに導入した。ピューロマイシン選択後に単一のコロニーを拾い、ランダムまたは標的化された組み込みをPCR(Primers)によって評価し、続いてサザンブロット解析によって検証した。正確なターゲティングを有する株を、Creリコンビナーゼを発現するプラスミドでトランスフェクションして、Pgk−Puroカセットを除去した。
レポーター遺伝子GSG−p2A−mCherryとインフレームで融合したCas9ニッカーゼ(Addgene#42335)を発現させるベクターを作製した(用いたmCherryはサイレント変異、432G>Aを含んでいた)。報告されたプロトコル(Ran et al,2013a,b)に従って、Stra8のエキソン6を標的化するための2対のオリゴヌクレオチド(Primers)をアニールし、リン酸化し、Bbs1(NEB)で消化した上記ベクターに別々に連結した。ニッカーゼ活性をSSAアッセイによって評価した。1対のニッカーゼプラスミド(各200ng)を、NEPA21 type II electroporatorを用いたエレクトロポレーションによってBDF1−2−1 BVSC ESCに導入した。ESCをトランスフェクションの2日後に解離させ、高レベルのCas9ニッカーゼも発現することが予想される高レベルのmCherryを発現する単一細胞をFACSで選別し、各ウェルが単一クローンを含有するように、96ウェルプレートの単一ウェル中のMEF上に播種した。クローンを培養し、増殖させ、クローン中のStra8遺伝子座の破壊を、関連領域のPCR産物のサンガー配列決定(Primers)によって評価した。Stra8ノックアウトは、ウェスタンブロットおよびIF解析によって確認した。
PGC培養のために、E11.5でのSGマウスの胎児性腺(性の識別なし)を切断しおよび解離させた。SG(+)PGCをFACSで選別し、m220フィーダー細胞上にプレーティングし、PGC/PGCLC増幅培地で培養した。雌の運命の誘導のための試薬はc0から提供した。胎児性腺の培養のために、E11.5[PCR(Primers)により性が識別された]の中腎を含む胚期の卵巣を摘出し、培養液インサート(353095;BD Falcon)上の気液界面条件下で培養した。使用した培地は、10%FBS、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシンおよび2mM L−グルタミンを含むDMEMであった。低分子阻害薬は、c0からの培地とともに提供した。
FACSのためのd4/c0 PGCLCの調製は、「ESC培養/誘導およびPGCLC誘導/培養」に記載されている。in vivoで生殖細胞を単離するために、BVSC、VRまたはSGマウスの胎児性腺を切断し、d4/c0 PGCLCについて記載した手順に従ってFACS用に処理した。解離後、それらを100μg/mlのDNアーゼ(Sigma−Aldrich)を含有する0.1%BSA−DMEMで洗浄して、死細胞から溶解したDNAを消化し、細胞/残渣の塊の形成を防止した以外は同様の方法で培養PGCLCも調製した。BV/SG、SC、またはDT/VRの蛍光活性は、それぞれFITC、Horizon V500またはPE−Texas Redチャネルで検出した。FACSデータは、FlowJoまたはFACS Divaソフトウェアパッケージを用いて解析した。
細胞周期解析は、Click−iT EdU Flow Cytometry Assay Kit(C10424;Thermo Fischer Scientific)を製造者の指示に従って使用して行った。培養したPGCLCを10μg/mlのEdUで30分〜2時間処理し、FACSにより分析した。
培養したPGCLCをニワトリ抗GFP抗体、続いてAlexa Fluor 633−ヤギ抗ニワトリ抗体で染色し、Cellavista instrument(SynenTec)(Ohta et al,2017)を用いて解析した。
雌の運命の誘導に関与する活性をスクリーニングするために使用されたサイトカイン/化合物は以下の通りであった(図9):100nMオールトランスレチノイン酸、500ng/ml WNT4(R&D Systems)、500ng/mlのRSPO1(R&D Systems)、100ng/ml FGF9(R&D Systems),500ng/ml PgD2(Cayman),25ng/ml アクチビンA,100ng/ml NODAL(R&D Systems),500ng/ml SDF1(R&D Systems),50ng/ml bFGF,500ng/ml BMP2(R&D Systems),500ng/ml BMP4(R&D Systems),500ng/ml BMP5(R&D Systems),500ng/ml BMP7(R&D Systems),250ng/ml WNT5a(R&D Systems)及び1,000U/ml LIF。シグナル阻害実験においては、DMSOに溶解したLDN193189(#04−0074;Stemgent)およびBMS493(B6688;Sigma−Aldrich)をALK2/3阻害薬およびRAR阻害薬としてそれぞれ使用した。
Immunofluorescence(IF)分析は以前に記載されているように行った(Hayashi et al、2012)。以下の一次抗体を用いた:ニワトリ抗GFP(ab13970;Abcam)、ウサギ抗DDX4(ab13840;Abcam)、マウス抗DDX4(ab27591;Abcam)、ウサギ抗DAZL(ab34129;Abcam)、ヤギ抗DAZL(sc−27333;Santa Cruz)、ウサギ抗STRA8(ab49602;Abcam)、マウス抗SYCP3(ab97672;Abcam)およびウサギ抗TEX14(ab41733;Abcam)IgG。以下の二次抗体を使用した:Alexa Fluor 488−ヤギ抗マウスまたはニワトリIgG;Alexa Fluor 568−ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 633−ヤギ抗マウス、抗ニワトリIgG;Alexa Fluor 488−ロバ抗マウスIgG;Alexa Fluor 568−ロバ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 633−ロバ抗ヤギIgG。IF画像を共焦点顕微鏡[FV1000(オリンパス)またはLSM780(Zeiss)]を用いて取り込んだ。
スプレッド調製およびIF分析は、わずかな改変を伴い、以前に記載されたように、(Yamashiro et al、2016)行った。c9 RAB2細胞をFACSで選別し、選別した細胞をPBSで洗浄し、低張抽出溶液で25℃で1時間処理した。使用した一次抗体は、以下の通りである:ヤギ抗SCP3(1:250;sc−20845;Santa Cruz)、マウス抗γH2AX(1:1,000;05−636;Millipore)およびウサギ抗SCP1抗体(1:250;NB300−229;Novus)。使用した二次抗体は、以下の通りであった:Alexa Fluor 488−ロバ抗ヤギIgG(A11055;Thermo Fisher)、Alexa Fluor 568−ロバ抗ウサギIgG(A10042;Thermo Fisher)、およびAlexa 647−ロバ抗マウスIgG(A31571;Thermoフィッシャー)。本発明者らは、SYCP3(+)細胞を計数した。減数分裂段階の定義は以下の通りであった:染色体の少なくとも80%で、細糸期:−γH2AX(+)およびSYCP1(−);接合期:−γH2AX(+)およびSYCP1(+)。太糸期:SYCP1(++)。
サザンブロット解析は以前に記載されたように行った(Nakaki et al,2013)。簡単に述べると、10μgのゲノムDNAを制限酵素で消化し、得られたDNA断片を0.9%アガロースゲルで電気泳動し、Hybond N+膜(RPN303B;GE Healthcare)に転写し、架橋のためにベーキングした。tdTomato用のDIG標識プローブ、およびDazlの関連領域の5つおよび3つのプライムサイド(prime side)を、PCR(PCR DIG Labeling Mix;Sigma−Aldrich)(Primers)によって生成した。画像はLAS4000(Fujifilm)を用いて取り込んだ。
ウエスタンブロット分析のために、90℃で5分間、SDSサンプル緩衝液[62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、2%SDS、10%グリセロール、0.025%ブロモフェノールブルーおよび0.14M−メルカプトエタノール]で5×104個の細胞を溶解した。リン酸化された(p)SMAD1/5/8の検出のために、細胞を溶解前にPhosSTOP(Roche)および完全プロテアーゼ阻害薬カクテル(Roche)で処理した。抽出したタンパク質をSuperSep Ace 10−20%ゲル(Wako)で分離し、iBlot2 dry blotting system(Thermo Fisher)によりiBlot2 PVDF transfer membrane(Thermo Fisher)上にブロットし、一次抗体:ウサギ抗STRA8 IgG(ab49405;Abcam)、マウス抗αチューブリン(T9026;Sigma−Aldrich)、ウサギ抗−pSMAD1/5/8 IgG(#9511;CST)、またはウサギ抗SMAD1 IgG(#9743S CST)とインキュベーションした。一次抗体は、HRP(A0545、M8642;Sigma−Aldrich)と結合したヤギ抗ウサギIgGまたはヒツジ抗マウスIgGで検出し、続いてChemi−Lumi One Super(Nacalai)を用いて検出した。化学発光画像の取り込みおよび分析は、Fusion Solo systemおよびFusion−Capt software(M&S Instruments)を用いて行った。
E14.5およびE15.5の雄性及び雌性の生殖細胞をVR(+)細胞として、培養PGCLCをSC(+)細胞として、FACSにより採取し、試料の全RNAを、RNeasy Micro Kit(74004;QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って抽出及び精製した。cDNA合成、ライブラリー構築、および各試料からの1ngの全RNAからのNextseq500(Illumina)による解析を、以前に記載された方法(Nakamura et al,2015;Ishikura et al,2016)に従って行った。以前の研究(Kagiwada et al,2013;Ohta et al,2017)で調製したE9.5からE13.5までの生殖細胞のcDNAを、Nextseq500シーケンサーシステムによっても解析した。以前に記載されたように(Nakamura et al,2015)、すべての読み取りデータを発現レベルに変換した。簡単に述べると、すべての読み取りをcutadapt−1.3(Martin、2011)で処理して、V1およびV3アダプター配列およびポリA配列を除去した。その結果得られた30bp以上の読み取りは、「−no−coverage−search」オプション(Kim et al、2013)を用いて、TopHat1.4.1/Bowtie1.0.1を用いてmm10ゲノムにマッピングした。マップした読み取りは、次いで、cufflinks−2.2.0を、「−compatible−hits−norm」、「no−length−correction」、「−max−mle−iterations 50000」、および「library″−type fr−secondstrand」オプション、並びに30エンドでの最大10−kbのmm1−参照遺伝子アノテーションと共に使用して、発現レベル(RPM)に変換した。解析された全遺伝子セットは、以前の研究(Ishikura et al、2016)と同じであった(Ishikura et al,2016)。トランスクリプトーム解析は、Rソフトウェアパッケージバージョン3.2.1をgplotsパッケージとMicrosoft Excelと共に用いて行った。最初に、未処理の発現データをlog2(RPM+1)値に変換し、特記しない限り、少なくとも1つのサンプルにおいて発現値>2を有する遺伝子を発現と定義した。ヒートマップ、クラスタリングおよびPCAの構築を除いて、生物学的複製の平均値を用いることにより、データ処理(例えば、DEGの同定)を行った。ヒートマップを作成するために、gplotsパッケージ(heatmap.2)を用いた。Gene Ontology(GO)解析は、DAVID 6.7ウェブサイト(https://david.ncifcrf.gov)を用いて行った(Huang da et al,2009)。
qPCRは、CFX384(Bio−Rad)およびPower SYBR Green(ABI、Foster City、CA)を製造者の指示に従って用いて行った。鋳型cDNAは「トランスクリプトーム解析」の節に記載されているように調製し、使用したプライマーはPrimersに列記した。
ESC、EpiLC、およびPGCLCの全ゲノム重亜硫酸塩配列決定(WGBS)データは、本発明者らの以前の研究(Shirane et al,2016;Ohta et al,2017)から得られ、KIT(−)およびKIT(+)精原細胞のそれらは、以前の研究(Kubo et al,2015)から得られた。ここでは、本発明者らは転写開始点(TSS)の900bp上流から400bp下流の領域としてプロモーターを定義し、CpGの平均値からすべてのパーセント5メチルシトシン値(%5mC)を算出した。読み深度(read depth)は、以前(Ishikura et al、2016)に記載されているように、4〜200であった。この研究における解析では、本発明者らは少なくとも1つのCpG部位を有するプロモーターを用いた。
この研究で使用されたプライマー配列は以下の通りであった:
性タイピング:
本研究で用いたデータのアクセッション番号は、以下の通りである:図12のE10.5およびE11.5PGCおよびE13.5雌性生殖細胞のRNA−seqデータ(GEO:GSE74094)(Yamashiro et al,2016)、図12のE9.5 PGCおよびE12.5雌生殖細胞のRNAseqデータ(GEO:GSE87644)(Ohta et al,2017)、図12のd4PGCLCのRNA−seqデータ(GEO:GSE67259)(Sasaki et al,2015)、RNAseqデータ、E11.5、E12.5およびE13.5の雄性及び雌性支持細胞のマイクロアレイデータ(GEO:GSE27715)(Jameson et al,2012)、ESC、EpiLCおよびd4 PGCLCのWGBSデータ(DDBJ:DRA003471)(Shirane et al、2016)、c7 PGCLC(DDBJ:DRA005166)のWGBSデータ(Ohta et al,2017)およびP7 KIT− SGおよびKIT+ SG(DDBJ:DRA002477)のWGBSデータ(Kubo et al,2015)。E9.5、E10.5およびE11.5のPGC、E12.5、E13.5、E14.5およびE15.5の雌性および雌性生殖細胞並びに記載された条件下で培養したPGCLCのRNA−seqデータのアクセッション番号はGSE94136(GEOデータベース)である。
生殖細胞の性決定機構を解析するシステム
上記[I]にて詳述したとおり、本発明者ら幹細胞因子(SCF)およびcAMPシグナリングのフォルスコリンおよびロリプラムの刺激因子の存在下で、m220フィーダー細胞上で7日間の培養中に最大50倍までPGCLCを増殖させる系を開発した(図9A)。この条件下で、PGCLCは、性にコミットしていない移動期/早期性腺PGCのトランスクリプトームを維持しながらDNAメチロームを徐々に消去し、雄または雌の運命のいずれかにコミットしている、E13.5の生殖細胞のパターンと同等の、ゲノム全般のDNAメチル化レベル(約5%)/パターンを獲得する(Spiller&Bowles、2015)。したがって、生殖細胞におけるDNAメチル化の再プログラミングおよび性分化は遺伝的に分離可能であり、この条件下で培養したPGCLCは、性分化のメカニズムを探索するためのシステムとして役立つ可能性がある。
本発明者らは、減数分裂前期への進入を特徴とする雌経路への分化に焦点を当てて、この可能性を検討した。雌経路へのPGCLCの分化の1つの前提条件は、DazlおよびDdx4[マウスvasaホモログ(mVH)としても知られている]のような遺伝子の発現を特徴とする後期PGC特性の獲得であり、両方とも、PGCLC/移動期PGC中で低レベルで発現し、E13.5までの生殖細胞において進行性の上方制御を示す(図9A右)(Fujiwara et al,1994;Cooke et al,1996;Ohta et al,2017)。さらに、Dazlは生殖細胞の性分化のための「ライセンス供与」因子として機能することが提案されている(Lin et al、2008;Gill et al、2011)。したがって、本発明者らは、Blimp1(Prdm1としても知られる)、Stella(Dppa3としても知られる)、およびDazlもしくはDdx4(mVH)の制御下で、それぞれmVenus、ECFP、およびtdTomatoもしくはRFPを発現する(Blimp1−mVenusをBV、Stella−ECFPをSC、dazl−tdTomatoをDT、mVH−RFPをVRとそれぞれ略記する場合がある)ESC株(BVSCDT ESCおよびBVSCVR ESC)をそれぞれ生成した(材料および方法)。Blimp1はPGCの運命決定(Ohinata et al、2005)を表し、Stellaは確立したPGCにおける発現を示す(Saitou et al、2002)一方、BVおよびSCはそれぞれBlimp1およびStellaの発現を反復する(Ohinata et al、2008)。本発明者らはまた、DTおよびVRが、PGC後期からDazlおよびDdx4の発現をそれぞれ反復することを確認した(Imamura et al、2010)。本発明者らは、培養したPGCLCにおけるDTまたはVRの発現(雌の運命への進入およびBVSC発現の下方制御が続く/組み合わされる)を引き起こす条件を確立しようと試みた。XY生殖細胞とXX生殖細胞の両方が雌の運命をとることができるので(Evans et al、1977;Taketo、2015)、同様の結果(以下を参照されたい)を示す出発材料として、XY ESCとXX ESCの両方を使用した。
本発明者らは、最初に、BVSCDT ESC(XY)をPGCLCに誘導し、増殖培養のために蛍光活性化細胞選別(FACS)によりBV陽性(+)の4日目(d4)PGCLCを単離した。PGCLCが指数関数的に増殖していた培養3日目(c3)において、培養物にRAの存在下もしくは非存在下で性決定に影響を及ぼす可能性のあるサイトカインパネルを与え、c7に、FACSによりBVもしくはDT発現に及ぼすそれらの効果を評価した(培養を通してフォルスコリン、ロリプラム及びSCFを与えた)(図9AおよびB)。コントロール条件(サイトカイン及びRA非添加)下で、BV(+)c7 PGCLCは平均して、比較的低いDT発現を示した(図9B)。興味深いことに、RAの添加は、BV(+)細胞集団におけるDTレベルを上昇させた(図9B)。特に、RAとBMP(BMP2,4,5、または7)の1つを組み合わせが、他のサイトカインは試験しなかったが、DTを強く活性化し、同時にBVを下方制御した(図9B)。このことは、RAおよびBMPはPGCLCを後期生殖細胞表現型に誘導することを示唆した。
Bmp2は、雌の生殖細胞の運命を導き得る前顆粒膜細胞において重要な雌化因子Wnt4に応答して強く発現する(Yao et al、2004;Jamesonet al、2012)。従って、本発明者らは次に、BVSCVR ESC(XX)から誘導された培養PGCLCにおいても、RAおよびBMP2がVRを上昇させるか否かを調べた。本発明者らは、c3でRAおよびBMP2の濃度を変化させて、BV(+)d4 PGCLCを培養し、c9でのBVSCVR発現に対するそれらの効果を調べた(図9CおよびD)。RA単独ではBVSC発現を有意に変化させず、VRを活性化しなかった(図9C)。これは、DazlおよびDdx4発現が異なって調節されることを示唆している。注目すべきことに、RAとBMP2の組み合わせ添加は、BVSC下方制御および確固としたVR上方制御を誘導し、VR(+)細胞誘導の割合は、BMP用量依存的に増加した(図9C)。興味深いことに、BMP2単独ではBVが下方制御されてVRが活性化され、BVSC下方制御およびVR活性化の程度はRA用量依存的に増加した(図9D)(下記参照)。
免疫蛍光(IF)分析により、本発明者らは、RAおよびBMP2を有する培養PGCLCにおいて、c9で、シナプトネム複合体の重要な成分および減数分裂前期のマーカーであるDDX4およびSCP3(SYCP3としても知られる)(Yuan et al、2000)の発現を解析した[BVSC ESC(XX)から誘導して1つの蛍光チャネルを確保した]。BVもしくはSC陽性(本明細書において「BV/SC(+)」と略記する場合がある)細胞は、E15.5原卵母細胞と非常によく似た様式でDDX4およびSCP3を発現した:DDX4は細胞質に特異的に局在し、SCP3はシナプトネム複合体形成を示す局在化の明確なパターンを示した。さらに、DDX4/SCP3(+)細胞は、卵母細胞嚢胞の形成を連想させるように相互連結しているようであった(図9E)(Pepling&Spradling、1998)。実際、嚢胞様構造は、細胞間接触部位(図9F)において特異的に、細胞質架橋マーカーであるTEX14(Greenbaumら、2009;Lei&Spradling、2016)の発現および局在を示した。RAと組み合わせた場合、BMP4,5および7はまた、VR/DDX4およびSCP3(+)細胞を誘導することができた。従って、RAおよびBMPシグナル伝達の組み合わせ作用は、培養PGCLCを雌の運命に導く可能性がある。
本発明者らはさらに、VRがRAおよびBMPに対してより特異的な応答を示すので(図9CおよびD)、BVSCVR ESC(XX)から誘導されたPGCLCに対するRAおよびBMPシグナル伝達の影響を調べた。c3以降のRAおよびBMP2を用いた培養は、c7でのBVSCの下方制御をもたらし、c9でBVSCを有意に低下させたが、RA単独ではそうならなかった(図10A)。逆に、この条件下では、VRはc7までに活性化され始め、SC(+)細胞の大部分(約70%)はc9でVRを示した(図10A)。本発明者らは、RAおよびBMP2で刺激されたPGCLCが、BMPシグナリングの直接的な下流標的である、リン酸化(p)SMAD1/5/8を上昇させ、およびId1およびId2の発現を上昇させることを確認した(Hollnagelet al、1999;Korchynskyi&ten Dijke、2002;Lopez−Rovira et al、2002)。そしてALK2/3受容体の選択的阻害薬であるLDN193189(Cuny et al、2008)の投与がかかる効果をブロックした。このことは、PGCLCがBMPシグナル伝達経路を活性化する能力があることを示す(下記も参照)。
IF解析により、RAおよびBMP2と培養されたPGCLCは、重要な減数分裂誘導因子であるSTRA8(Baltus at al、2006;Anderson et al、2008;Dokshin et al、2013;Soh et al、2015)の発現を、c5の早期に開始[〜40.7%/SC(+)細胞]し、c7ではSC(+)細胞の大部分(〜91.7%)がSTRA8の発現を示し、そのうちいくつか(〜27.1%)はSCP3(+)であった(図10BおよびC)。注目すべきことに、c9では、90%以上のSC(+)細胞がSCP3をシナプトネーム複合体様構造形成を伴って発現し、STRA8は減弱し始めた(図10BおよびC)。興味深いことに、SCP3は、培養中の所定の時間に異なるコロニーを含むすべてのSC(+)細胞において同調した様態で上方制御された(図10BおよびD)。c5からc9まで、SC(+)細胞はDAZLに関して明確な陽性を示した(図10B)。
減数分裂の進入は、前減数分裂期DNA複製および4倍染色体(4C)状態での停止を特徴とする(Baltusら、2006)。RAおよびBMP2の存在下では、BV/SC(+)細胞はc5までの増殖の増強を示し、c7までに増殖を停止させ、c9までにそのピーク数の約半分に減少した(図10E)。細胞周期解析により、c7において、BV/SC(+)細胞の相当部分(〜46.0%)がそれらのDNAを複製している(約23.6%)か、または4C状態(〜23.6%)かのいずれかであることを明らかになった(図10F)。c9では、意外なことに、BV/SC(+)細胞の大多数(約58.7%)が4C状態にあった(図10F)。PGCLCを対照条件またはRA単独で培養した場合はそうではなかった(図10F)。まとめると、これらの知見は、RAおよびBMP2と培養されたPGCLCが雌の運命をとり、減数分裂前期に進入することを示している。実際、拡散解析により、減数分裂前期のSC(+)細胞が太糸期(細糸期:約50.4%;接合期:約47.8%;太糸期:約1.8%)まで進行したことを明らかになった(図10G)。
本発明者らが採用した条件下では、RA単独では雌の生殖細胞運命を誘導するには不十分であった。RAと培養したPGCLCは、DT/DAZLをある程度活性化し、STRA8を上方制御した[BV/SC(+)細胞の〜77.7%がSTRA8を発現していた]が、RAはVR/DDX4やSCP3を活性化せず(図9BおよびC、10A)、RA添加BV/SC(+)細胞はc9でも減数分裂に移行せず細胞周期が回っているようであった(図10F)。予期せぬことには、BMP2単独では、RAおよびBMP2よりも効果的ではないが、c9においてVRおよびSCP3(+)減数分裂細胞が誘導された(図9D)。本発明者らの培養物には、10%のKSRおよび2.5%のウシ胎児血清(FCS)(図9A)が含まれていたので、かかる成分中のBMP活性の存在は無視し得る一方、RA活性の存在(Hore et al、2016)は、外因性BMPシグナル伝達に応答して雌の運命をとる能力をPGCLCに与え得る。したがって、PGCLCの、BMP2およびRA受容体(RAR)に対する阻害薬(BMS493)との培養(Koubova et al、2006)は、VR/DDX4の上方制御ならびにSCP3の誘導を無効にした。同様に、LDN193189によるBMPシグナル伝達の阻害は、RAおよびBMP2によって誘発されるVR活性化および減数分裂進入を用量依存的様式で遮断した。本発明者らは、PGCLCを雌経路に誘導するのに、RAおよびBMPシグナル伝達が必要であり、かつ十分である可能性が高く、RAまたはSTRA8単独ではかかる誘導ができないと結論付ける。
本発明者らは次に、PGCにおける雌の性決定におけるRAおよびBMPシグナル伝達の役割を調べた。本発明者らは、FACSによってStella−EGFP(SG)トランスジェニック胚(Payer et al、2006;Seki et al、2007)からE11.5でPGCを単離し、RA、BMP2、またはその両方と4日間培養した(図11A)。対照培養もRA単独の培養もSCP3を誘導せず、SGおよびDDX4発現にも有意に影響しなかったが、RAおよびBMP2との培養は、SCP3−陽性(+)/DDX4−強陽性(+)/SG−陰性(−)の誘導を相当増加させた(〜65.6%)(図11BおよびC)。BMP2単独との培養も、SCP3−陽性(+)/DDX4−強陽性(+)/SG−陰性(−)細胞を誘導(〜22.9%)した(図11BおよびC)。
本発明者らは、E11.5で全胚卵巣の培養を行い、RAまたはBMPシグナル伝達の阻害薬が雌の生殖細胞運命の誘導に及ぼす影響を調べた。結果は、いずれのタイプの阻害薬も、SCP3の発現によって表されるように、雌の生殖細胞運命への進行を抑制したことを示した(図11D−F)。同様に、E11.5からE14.0まで12時間ごとにLDN193189を妊娠した雌に投与することによるインビボ条件下でのBMPシグナル伝達の阻害は、E14.5での雌性生殖細胞運命への進行の重大な障害を引き起こした(図11G−I)。本発明者らは、E14.5でFACSによりLDN投与胚から雌または雄のVR(+)細胞を単離し、定量的(q)PCRによって雌性または雄性生殖細胞発生の重要な遺伝子の発現を、それぞれ調べた。この解析により、LDN処理された雌性細胞が、Ddx4、Dazl、Sycp3、Prdm9、およびSpo11等の後期PGC/雌性生殖細胞発生の重要な遺伝子の上方制御が示されたが、興味深いことに、出現した雄性生殖細胞発生は影響を受けなかった(図11JおよびK)。本発明者らは、PGCおよびPGCLCの両方が、雌の生殖細胞の運命を獲得するためにRAおよびBMPシグナル伝達を必要とすると結論する。
次に、本発明者らは、PGC/PGCLCの雌の性決定中の転写の動態を分析した。この目的のために、本発明者らは、PGC[E9.5、E10.5、E11.5、E12.5(雌)、E12.5(雄)でのStella−EGFP(+)細胞](Kagiwada et al、2013)、胎児一次卵母細胞[E13.5でのStella−EGFP(+)、E14.5、E15.5でのDDX4−RFP(+)]、PSG[E13.5でのStella−EGFP(+)(Kagiwada et al,2013)、E14.5、E15.5でのDDX4−RFP(+)]、コントロール条件(d4/c0、c3、c5、c7、c9)の下で培養したPGCLC、c3以降(c5 RB2、c7 RA2、c9 RA2)RAとともに培養したPGCLC、c3以降(c5 RAB2、c7 RAB2、c9 RAB2)RAおよびBMP2とともに培養したPGCLCから全RNAを単離し、RNAシーケンシング(RNA−seq)(Nakamura et al、2015)により、そのトランスクリプトームを解析した。
教師なし階層的クラスタリング(UHC)は、E11.5までの性未分化PGCがd4 PGCLCと、次いでc3−c9 PGCLCとおよびc5でのRAまたはRAB2刺激PGCLC(c5 RA、c5 RAB2)と近くにクラスタリングしていることを明らかにした(図12A)。胎児一次卵母細胞(E14.5、E15.5)およびPSG(E14.5、E15.5)はそれぞれ明確なクラスターを形成し、意外なことに、c9におけるRAB2刺激PGCLC(R9c9)は胎児一次卵母細胞と堅固なクラスターを形成した(図12A)。性分化を開始した生殖細胞(E12.5、E13.5での雄および雌の生殖細胞)及びc7におけるRAB2刺激PGCLC(c7 RAB2)およびc7/c9におけるRA刺激PGCLC(c7/c9RA)は、性未分化のPGC/PGCLCと胎児一次卵母細胞/c9 RAB2細胞との間の性質を示す明確なクラスターを形成した(図12A)。一貫して、主成分分析(PCA)は、性未分化のPGCおよびd4/c3−c9 PGCLCを近接してクラスター化し、雌性および雄性の生殖細胞特性の発生に沿って進行する移行を強調し、雌経路に沿ってRAB2と培養したPGCLCと、E14.5/E15.5において胎児の一次卵母細胞とクラスター化されたc9 RAB2細胞との、並行的な進行を明らかにした(図12B)。対照的に、RAで培養したPGCLCは、胎児卵母細胞の特性を部分的にしか獲得しなかった(図12B)。したがって、RA およびBMP2で刺激された培養PGCLCは、雌性経路のトランスクリプトームの進行を反復して、胎児一次卵母細胞を形成する。
生殖細胞/PGCLCの性分化過程における遺伝子発現のダイナミクスの理解を促進するために、本発明者らは、これらの細胞の発生段階段階を特徴づける、4クラスの遺伝子セット、初期PGC遺伝子(318遺伝子)、後期生殖細胞遺伝子(254遺伝子)、胎児卵母細胞遺伝子(476遺伝子)及びPSG遺伝子(323遺伝子)を定義した(図12C)。初期のPGC遺伝子は、「細胞分化の負の調節/細胞周期の調節」(Prdm1、Prdm14、Tfap2c、Nanog、Sox2等)のような遺伝子オントロジー(GO)の機能的用語を有する遺伝子を多くした;後期の生殖細胞遺伝子は、「有性生殖/配偶子生成」の遺伝子(Dazl、Ddx4、Piwil2、Mael、Mov1011等)を多くした;胎児卵母細胞遺伝子は、「減数分裂/雌配偶子生成」の遺伝子(Stra8、Rec8、Sycp3、Dmc1、Sycp1等)を多くした;そしてPSG遺伝子は「piRNA代謝プロセス/雄性配偶子生成」の遺伝子(Nanos2、Dnmt3l、Tdrd9、Tdrd5、Piwil1など)を多くした(図12C)。
図12CおよびDに示されるように、RAB2と培養したPGCLCは、遅い生殖細胞および胎児卵母細胞遺伝子を徐々に獲得する一方、初期PGC遺伝子を下方制御した。対照的に、RAと培養されたPGCLCは、かかる進行を部分的にしか示さなかった(図12CおよびD):例えばc9 RAB2細胞は減数分裂(Stra8、Rec8、Sycp3、Sycp1、Spo11、Dmc1、Hormad1、Prdm9)(全て胎児卵母細胞中に含まれる)及び卵母細胞発生(Figla,Ybx2,Nobox,Cpeb1)の主要遺伝子を、E14.5/E15.5胎児卵母細胞と同様のレベルまで上方制御した(図12E)。対照的に、c9 RA細胞は、異種細胞の状況においてもRAイベントに応答するStra8およびRec8遺伝子を上方制御したにもかかわらず、かかる遺伝子の十分な獲得を示さなかった(Oulad−Abdelghani et al、1996;Mahony et al、2011)(図12E)。雌の生殖細胞の運命決定におけるBMPシグナル伝達の役割と一致して、RAB2と培養されたPGCLCおよび発生中の雌の生殖細胞は、同様の様態でBMPシグナル伝達の受容体および重要な標的を発現した。
本発明者らは、c9 RAB2細胞(323遺伝子:RA遺伝子)と比較して、c9 RA細胞において上方制御された遺伝子を同定した。かかる遺伝子はまた、E14.5/E15.5での胎児一次卵母細胞と比較して上方制御され、「細胞接着/血管系発生/胚器官発生」のためのもの(Hoxa5、Hesx1、Pax6、Lmx1b、Pitx2、Dnmt3b、等)に富んでいた。したがって、BMPシグナリングは、雌の経路を強く駆動するだけでなく、RAによって誘発される不適切な発生プログラムを抑制するためにも重要である。
本発明者らは次に、PGCLCからの胎児一次卵母細胞分化中のStra8の喪失の影響を評価した。本発明者らは、CRISPR/Cas9システム(Ran et al、2013a、b)を用いていくつかの株のStra8−Knockout BVSC ESC(XY)を作製し、これらの株における標的エクソン内のフレームシフト欠失およびSTRA8発現の喪失を確認した。3つの独立した株(Stra8−knockout(SK)1,2,3)は、本質的に同一の表現型を示したので、代表的な株SK1を用いて結果を提示する。野生型PGCLCとは異なり、RAB2と培養したSK1細胞は、c7まで確固としたBVSC発現を保持し続け、c9においてのみBVSCの軽度の下方制御を示した(図13A)。野生型細胞と比較して、SK1細胞は、RAB2に応答してそれほど効果的に増殖しなかったが、c9(図13BおよびC)でも周期プロファイルを示し続けた。このことは、それらが減数分裂前期に進むことができなかったことを示す。この知見は、Stra8ノックアウト生殖細胞が減数分裂前のDNA複製を起こさず、その後除去されるという事実とよく一致している(Baltus et al、2006;Dokshin et al、2013)。
本発明者らは、SK1細胞のトランスクリプトームを決定した。PCAは、SK1 RAB2細胞が雌経路に沿って長期間に進行し、c9において、E13.5の胎児一次卵母細胞により近い野生型c7細胞と同様の性質を獲得したことを明らかにした(図13D)。野生型細胞と比較して、SK1細胞は、c7以降数多くの異なる発現遺伝子(DEG)を示し(図13E)、c9 SK1細胞において完全に上方制御されなかった遺伝子(178遺伝子)は、「減数分裂/細胞周期プロセス」のためのもの(Prdm9、Sycp3、Spo11、Smc1b、Msh4、Msh5、Dmc1、Ccdc111、Polnなど)に富んでおり(図13F)、Stra8に依存することが報告されている12個の遺伝子(Soh et al、2015)すべてが、c9 SK1細胞において下方制御されていた。
しかし、c9 SK1細胞は、Ybx2およびSohlh2等の卵母細胞発生に関連するものを含め、比較的正常な様式で32.1%の胎児卵母細胞遺伝子(153/476遺伝子)を上方制御したことが注目される(図13F−H)。興味深いことに、c9 SK1細胞において異常に上方制御された遺伝子は、「胚性器官発達/胎児胚発生」のものに富んでおり、c9 RA細胞において異常に上方制御されたRA遺伝子とオーバーラップした(図13FおよびG)。一方、c9 SK1細胞は比較的正常な様式で後期生殖細胞遺伝子を獲得した[164/254遺伝子(64.6%)](図13F−H)。したがって、STRA8は、BMPシグナル伝達のエフェクター(複数可)と協力して、RAによって誘発される不必要な発生経路を抑制することに加えて、減数分裂に関与するいくつかの遺伝子の十分な発現レベルを保証する。
骨形成タンパク質のシグナル伝達は、外胚葉/EpiLCをPGC/PGCLCへ運命決定するが、それらを雌の運命に直接的に誘導しない(Hayashi et al、2011)。したがって、本発明者らは、RAおよびBMPシグナル伝達に応答して雌の運命をもたらす細胞の状況を明確にしようと試みた。本発明者らは、d4/c0またはc7のPGCLCを、RAおよびBMP2と2日間培養し、それらのトランスクリプトームを調査することによってそれらの応答を評価した(図14AおよびB)。対照と比較して、RAB2を伴うc7 PGCLCは、相当数のDEGを示し(上昇:218遺伝子、低下:56遺伝子)、減数分裂のためのものに富む遺伝子群を上方制御し、雌経路に沿って進行した(図14CおよびD)。対照的に、RAB2を伴うd4/c0 PGCLCは、遺伝子発現において僅かな変化しか示さず(上昇:7遺伝子;低下:2遺伝子)、そして雌の運命に向かって進行しなかった(図14BおよびC)。
本発明者らは、増幅培養の間の減数分裂のための重要な遺伝子のDNA脱メチル化が、RAおよびBMP2に応答するための、PGCLCによるコンピテンス獲得の基礎となる可能性があると推論した。本発明者らは、プロモーターの5−メチルシトシン(5mC)レベルと、「減数分裂」に関与するものとして分類された遺伝子[GO用語:減数核分裂GO:0007126]の発現レベルとの関係を解析した。かかる152遺伝子のうち、Stra8、Spo11、Sycp3、Dpep3、Dazl、Ddx4およびPiwil2を含む42遺伝子は、d4/c0とc7の間で>20%のプロモーター脱メチル化を示した。一方、110遺伝子は、培養の間に有意なプロモーター5mCレベル変化を示さず(<20%)、「DNA修復」および「DNA損傷刺激に対する応答」等の一般的な過程に関与するするもの(Mlh1、Brca2、Fanca、Cdc20、Plk1など)から成っていた(図14E)。d4/c0 PGCLCにおいて、42遺伝子は、プロモーターの5mCレベルが高く、無発現/低発現を示したが、110遺伝子はほとんどメチル化されておらず、様々な発現レベルを示した、その分布は、プロモーター5mCレベルが低い全遺伝子の分布に類似していた(図14EおよびF)。c7 PGCLCにおいては、42遺伝子は、他のほぼすべての遺伝子と同様に脱メチル化され、DazlおよびHormad1等の、42遺伝子のいくつかが部分的に上方制御されたが、110遺伝子はメチル化されないままであり、d4/c0 PGCLCにおける発現レベル分布と同様の発現レベル分布を維持した(図14EおよびF)。注目すべきことに、c7において、RAおよびBMP2に応答して、42遺伝子が特異的かつ確固とした活性化を示したが、110遺伝子は軽度の上方制御しか示さなかった(図14EおよびF)。まとめると、これらの知見は、PGCLC増幅の間の、関連遺伝子のプロモーターDNA脱メチル化の進行が、かかる遺伝子の基底的な活性化または活性化に対する許容状態を誘導し、ひいては、RAおよびBMPのシグナル伝達に応答して完全に活性化された状態を獲得し、雌の生殖細胞の運命を形成することを示す。
この概念の、インビボでの生殖細胞発生への関連性を検証するために、本発明者らは、E9.5とE11.5との間のPGCの152遺伝子の発現における差異を、d4/c0とc7との間のPGCLCのこれらの遺伝子の発現における差異と比較した;本発明者らは次に、E11.5のPGCとE13.5の胎児一次卵母細胞との間の152遺伝子の差次的発現、および、BMP2およびRAにより2日間刺激されたc7 PGCLCとc7 PGCLCとの間の差次的発現を比較した。図14Gに示す通り、生殖細胞およびPGCLC発生の連続段階の間の42遺伝子の発現の差異(上方制御)は、非常に相関した。152遺伝子を用いたPCAは、一貫して、d4/c0 PGCLCを、E9.5PGCと近接して、c7 PGCをE11.5 PGCと近接して、およびRAB2と48時間培養したc7 PGCLCをE13.5雌性生殖細胞と近接してクラスタリングした(図14H)。本発明者らは、PGCLCベースのインビトロ系がin vivoでの雌性生殖細胞運命の獲得のためのメカニズムを正確に再現すると結論する。
<材料及び方法>
マウス、フィーダー細胞は、実施例[I]に記載のものを使用した。ESCの作製からPGCLCへの分化誘導まで、PGC/PGCLCの精製、免疫染色、PGCLCのマウス精巣への移植及びその解析、並びにRNA−seq及びその解析は、実施例[I]と同様にして行った。
シクロスポリンA(CsA)の併用効果を調べるPGC/PGCLCの維持増幅培養は、10μMフォルスコリン及び10μMロリプラム(FR10)に加えて、5μM CsAを培地に添加する以外は、実施例[I]と同様にして行った。
PGCLCの維持増幅に及ぼすCsA単独の促進効果、及び該促進効果のメカニズムを調べる実験では、FR10に代えて、種々の濃度(10、5、1及び0μM)のCsA又はFK506(タクロリムス)を培地に添加する以外は、実施例[I]と同様にしてPGCLCを維持培養した。
BrdUに代えて、EdU(10μM)を用い、EdUの取り込みの検出に、Click−iTTM Plus EdU Alexa FluorTM 647 Flow Cytometry Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用した以外は、実施例[I]と同様にして行った。
FR10もしくはFR10+CsAで培養したd4c7 PGCLCをTrypLE処理により単一細胞に分散させ、メーカーの説明書に従い、Annexin V Apoptosis Detection Kit APC(eBioscience)を用いて染色した。染色されたサンプルを、FACSDiva(BD)softwareと共にBD FACSAriaIII(BD)を用いて分析し、PGCLCはBVの蛍光により同定した。3つの生物学的複製物を各サンプルについて分析した。
実施例[I]に記載の方法によりPGCLCを移植したマウス精巣から精子を回収し、PMSG及びhCGを注入することにより過排卵させたBDF1のメスから回収した卵子に、マイクロマニピュレーターを用いて直接注入した。得られた2細胞胚を、妊娠後(dpc)0.5日目に偽妊娠ICRメスの卵管に移した。仔を18.5dpcで帝王切開により分娩させた。
PGCLCの培養系におけるCsAの効果
フォルスコリン及びPDE4阻害薬以外に、PGCLCの増殖を支持する化合物を探索するため、実施例[I]にて行った化合物ライブラリースクリーニングの結果を詳細に解析した。その結果、CsAがスクリーニングデータ中に3つ含まれており、その内2つが+3SDを超えていた(図16A)。CsAの効果を確認するため、異なる濃度のCsAをPGCLCに作用させたところ、5μMのCsAが最もPGCLCを増殖させることのできる至適濃度であることが明らかとなった(図16B)。次に、CsAがフォルスコリン及びPDE4阻害薬(FR10)の存在下においても、PGCLCの増殖をさらに支持できるのかを調べたところ(図16C)、CsAの添加により、平均して約50倍程度にまで、PGCLCをより増幅させ得ることが明らかとなった(図16D)。また、CsAにより増幅されたPGCLCは平らなコロニーを形成し、BVSCを強く発現していることを確認した(図16E)。
PGCLCの培養系においてCsAがどのような影響を及ぼすのかを調べるため、細胞周期解析(図16F)及びアポトーシス細胞の検出(図16G)を行った。その結果、CsAを作用させたPGCLCは、FR10のみを作用せたPGCLCに比べて、S期の割合が増加し((図16F、右図)、アポトーシス細胞の割合の低下が認められた(図16G、右図)。以上の結果から、CsAはPGCLCの細胞周期を促進し、さらに、アポトーシスを抑制することにより、PGCLCの増殖を支持していると考えられた。
CsAは免疫抑制作用を有する化合物として知られているが、ミトコンドリアに作用してアポトーシスを抑制する効果も有することが知られている。そこで、CsAのPGCLC増殖効果がどちらによるものなのかを調べるため、FK506のPGCLCへの影響を解析した。
FK506はCsAと同様の作用機序で免疫抑制効果を示すが、ミトコンドリアへの影響は無い化合物であることが知られている。その結果、FK506はPGCLCの増殖効果を有しないことが明らかとなった(図16H)。以上の結果から、CsAはPGCLCのミトコンドリアへ作用し、アポトーシスを抑制することにより、その増殖を支持することが示唆された。
次に、CsAによる増幅培養中のPGCLCの詳細な転写特性(transcriptional properties)を、実施例[I](図4B)と同様の方法を用いて決定した(図17A)。主成分分析(PCA)の結果、FR10にCsAを添加して増幅したPGCLCは、FR10で増幅したPGCLCと同様の遺伝子発現パターンを示すことが明らかとなった(図17A)。また、エピジェネティック特性をIFにより解析したところ、FR10にCsAを添加して増幅したPGCLCは、FR10で増幅したPGCLCと同様のエピジェネティック特性を有することが明らかとなった(図17B、C)。以上の結果から、FR10にCsAを添加して増幅したPGCLCは、FR10で増幅したPGCLCと同様の特性を持つことが示唆された。
また、CsAがin vivo PGCの増殖を支持可能かどうかを調べるため、E9.5のPGCを回収し、試験管内で培養した。その結果、FR10にCsAを添加することにより、in vivo PGCを約16倍程度にまで増幅可能であることが明らかとなった(図17D)。以上の結果から、CsAはPGCLCのみならず、in vivoのPGCの増幅も支持し得ることが明らかとなった。
次に、FR10+CsAにより増幅されたPGCLCが、PGCLCとしての機能を維持するかどうかを評価した。この目的のために、FR10+CsAで増幅したd4c7 PGCLCを内因性生殖細胞を欠く新生児W/Wvマウスの精巣に移植した。移植後10週の精巣を解析したところ、精子形成の証拠を伴う多数の精細管を含み、実際に豊富な精子を産生した(図18A−E)。さらに、得られた精子を用いて顕微授精(ICSI)を行ったところ、正常な産仔が得られ(図18F−I)、正常な成長を示した(図18J)。これらの結果から、CsAで増幅したPGCLCは、機能的な精子へと分化可能であることが明らかとなった。
従って、本発明は、不妊症に関する基礎研究への展開、生殖補助医療への応用が期待され、きわめて有用である。
[配列表]
Claims (9)
- 始原生殖細胞(PGC)又は単離された多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞(PGCLC)の維持増幅方法であって、PGC又はPGCLCをホスホジエステラーゼ4(PDE4)阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養することを含む、方法。
- PGC又はPGCLCを、フォルスコリンをさらに含む条件下で培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- PDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAを含有してなる、PGC又はPGCLCの維持増幅用試薬。
- フォルスコリンを組み合わせてなる、請求項3に記載の試薬。
- PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導する方法であって、PGC又はPGCLCを、骨形成タンパク質(BMP)及びレチノイン酸(RA)の存在下で培養することを含む、方法。
- BMPがBMP2、BMP5及びBMP7から選ばれる1以上である、請求項5に記載の方法。
- BMP及びRAを組み合わせてなる、PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導するための試薬。
- BMPがBMP2、BMP5及びBMP7から選ばれる1以上である、請求項7に記載の試薬。
- PGC又はPGCLCから卵母細胞を誘導する方法であって、
(a)PGC又はPGCLCをPDE4阻害薬及び/又はシクロスポリンAの存在下で培養し、PGC又はPGCLCを維持増幅すること、並びに
(b)工程(a)で得られたPGC又はPGCLCを、BMP及びRAの存在下で培養するBMP及びRAの存在下で培養することを含む、方法。
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