CN113774015B - 一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，该诱导方法将雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织用琼脂块进行三维培养，在卵巢组织培养液中5～7天后，再置于含有他莫昔芬的培养液中培养5～7天，促进了E11.5时期的卵原细胞在体外条件下形成大量初级卵泡，然后在卵巢组织液中培养5～7天；分离出单个卵泡，将分离出来的卵泡经过体外单卵泡贴壁培养和卵泡体外成熟培养，获得了大量MII期的卵母细胞。通过选取雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织，使卵巢组织中只存在处于有丝分裂阶段的卵原细胞，构建了一种研究完整体外卵子发生过程的最佳模型；通过3D琼脂培养、含有他莫昔芬的培养基、以及实验步骤的设计，成功将早期卵原细胞在完全体外条件下诱导形成了MII期的卵母细胞。

Description

一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及生殖生物学技术领域，特别涉及一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法。
背景技术
伴随着人类不孕不育问题的日益严峻，哺乳动物体外配子发生技术的研究一直是生殖生物学领域的热点研究问题。目前，在雄性上，利用精原干细胞体外诱导分化获得功能性的配子技术体系已经相对完善，但是，在雌性上利用早期有丝分裂阶段的卵原细胞体外高效获得功能性卵母细胞的技术体系仍有待进一步完善，尤其是卵原细胞减数分裂能否正常启动一直是研究卵子体外发生的难点问题。对于雌性小鼠而言，原始生殖细胞特化起源于胚胎6.25天(E6.25，embryonic day)，随后，原始生殖细胞不断的增殖，并于E12.5天完全迁移到生殖嵴中，此时的原始生殖细胞尚未启动减数分裂，称为卵原细胞。随后在E13.5天，在Stra8(Stimulated By Retinoic Acid 8)基因的驱动下，卵原细胞开始启动减数分裂，直到E16.5天时阻滞在第一次减数分裂前期的双线期阶段。之后，由于生殖细胞出现核分裂而胞质不完全分裂的现象，形成了大量生殖细胞簇，称为“germ cell cyst”。在小鼠出生前后，伴随着颗粒细胞侵入生殖细胞cyst，cyst中的优势生殖细胞逐渐形成由颗粒细胞包围的原始卵泡，这一过程中也称为“cyst breakdown”。
2016年，Obata等首次利用小鼠E12.5时期的胎鼠卵巢组织进行体外培养，成功在体外将早期生殖细胞诱导分化形成了功能性的卵子，实现了体外卵子发生过程。Obata在体外卵子发生过程中采用的是E12.5时期的卵巢组织，其原因在于传统的观点认为，小鼠减数分裂启动发生在E13.5，E12.5时期卵巢组织的生殖细胞尚未进入减数分裂。并且，由于小鼠在E12.5时期已经出现性别分化，此时的雌性卵巢组织即可从形态上与雄性区分开来，更利于后续的研究。
但是，随着近几年单细胞转录组测序技术的发展，在2021年《Science Advances》杂志上，Laird等发现在E12.5时期Stra8等减数分裂相关的基因已经表达，并且利用组织荧光染色分析发现E12.5时期的卵巢组织中已经存在STRA8阳性的生殖细胞，这就表明E12.5时期的卵巢组织已经有部分生殖细胞进入了减数分裂。因此，严格意义上而言，E12.5时期的卵巢组织并不是研究完整体外卵子发生过程的最佳模型。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，旨在解决现有的研究完整体外卵子发生过程的模型不够准确的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：
S10、分离获得胎鼠E11.5时期的生殖嵴，同时取所述胎鼠的尾部组织进行性别鉴定，收集鉴定结果为雌性的所述生殖嵴，即为卵巢组织；
S20、将琼脂块置于24孔板中，并添加α-MEM培养基浸泡所述琼脂块10～14h，以交换所述琼脂块中的水分，然后将所述卵巢组织置于所述琼脂块顶端的中间位置，再向所述24孔板中加入卵巢组织培养液，在37℃、5％CO2下培养5～7天；
S30、将所述24孔板中的所述卵巢组织培养液更换成含有他莫昔芬的培养液，在37℃、饱和湿度以及5％CO2下培养5～7天以促进卵泡的发生，然后将所述含有他莫昔芬的培养液更换为所述卵巢组织培养液，继续培养5～7天；
S40、将所述卵巢组织于卵泡分离操作液中分离出单个卵泡，并将所述卵泡转移到卵泡生长培养液中贴壁培养12～15天，直到能观察到明显的卵泡腔形成后，将所述卵泡细胞培养液更换为卵泡成熟培养液，15～20h后即可观察到MII时期的卵母细胞。
可选地，所述性别鉴定步骤包括：
将所述胎鼠的尾部组织转移到PCR管中用于DNA提取，将提取到的所述DNA进行PCR反应，最后判断PCR产物中是否有Sry基因条带，若有，则为雄性，反之，则为雌性。
可选地，所述琼脂块的长为9～11mm，宽为9～11mm，高为4～6mm。
可选地，所述卵巢组织培养液包括胎牛血清、维生素C、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述卵巢组织培养液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM。
可选地，步骤S30中：
所述含有他莫昔芬的培养液包括胎牛血清、维生素C、他莫昔芬、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述含有他莫昔芬的培养液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM，所述他莫昔芬的添加量为10μM。
可选地，步骤S40中：
所述卵泡分离操作液包括L-15培养基、胎牛血清和青链霉素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5％和0.1％。
可选地，步骤S40中：
所述卵泡生长培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、维生素C、青链霉素和促卵泡素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM，所述促卵泡素的添加量为50mIU/ml。
可选地，步骤S40中：
所述卵泡成熟培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、促卵泡素和人绒毛膜促性腺激素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5％和0.1％，所述促卵泡素的添加量为0.1IU/ml，所述人绒毛促性腺激素的添加量为1.2IU/mL。
本发明提供的技术方案中，将雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织用琼脂块进行三维培养，在卵巢组织培养液中5～7天后，将卵巢组织置于含有他莫昔芬的培养液中培养5～7天，促进了E11.5时期的卵原细胞在体外条件下形成大量初级卵泡，然后将含有他莫昔芬的培养液更换为卵巢组织液，继续培养5～7天；再分离出单个卵泡，将分离出来的单个卵泡经过体外单卵泡贴壁培养和卵泡体外成熟培养，获得了大量MII期的卵母细胞。通过选取雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织，使卵巢组织中只存在处于有丝分裂阶段的卵原细胞，构建了一种研究完整体外卵子发生过程的最佳模型；通过3D琼脂培养、含有他莫昔芬的培养基、以及实验步骤的设计，成功将早期卵原细胞在完全体外条件下诱导形成了MII期的卵母细胞；此外，采用3D琼脂培养卵巢组织的方式，相对于现有的采用Transwell-COL membranes培养卵巢组织的方式，原料易得，且成本较低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为胎鼠E11.5、E12.5以及E13.5时期生殖嵴的形态示意图；
图2为E11.5时期胎鼠尾部组织Sry基因性别鉴定电泳结果图；
图3为E11.5时期卵巢组织经步骤2的体外培养4天后SYCP3/RAD51染色分析；
图4为E11.5时期卵巢组织在用他莫昔芬诱导培养、以及不用他莫昔芬培养的示意图；
图5为E11.5时期卵巢组织在体外三维培养12天后的DDX4/LAMININ免疫荧光染色分析；
图6为实施例步骤4分离出的卵泡在体外贴壁培养不同天数时的形态；
图7为E11.5时期卵巢组织来源的卵母细胞体外成熟。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，旨在解决现有的研究完整体外卵子发生过程的模型不够准确的问题。在一实施例中，所述体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法包括以下步骤：
步骤S10、分离获得胎鼠E11.5时期的生殖嵴，同时取所述胎鼠的尾部组织进行性别鉴定，收集鉴定结果为雌性的所述生殖嵴，即为卵巢组织。
请参阅图1，图1中分别为胎鼠E11.5时期、E12.5时期和E13.5时期的生殖嵴，由图1可以看出，E11.5时期的胎鼠生殖嵴更为细长。此外，由于雌性动物的生殖器官在发育早期叫生殖嵴，后期叫卵巢组织，为了便于描述，直接将筛选出的雌性生殖嵴称为卵巢组织。
其中，E11.5时期的生殖嵴由于尚未出现性别分化，无法根据其形态特征来区分其性别，为了挑选雌性生殖嵴用于后续体外培养，采用PCR(polymerase chain reaction)的方法后进行性别鉴定。在一实施例中，鉴定步骤包括：将所述胎鼠的尾部组织转移到PCR管中用于DNA提取，将提取到的所述DNA进行PCR反应，最后判断PCR产物中是否有Sry基因条带，若有，则为雄性，反之，则为雌性。
在一具体实施例中，步骤S10包括：
步骤S11、利用脱颈法处死11.5dpc(days post coitum，即性交后天数)孕鼠，取出子宫内的小鼠(即胎鼠)转移到含5mL生理盐水的10cm培养皿中，然后于超净工作台中用镊子分离得到胎鼠的生殖嵴，将生殖嵴转移到含100μL DMEM/F12培养液的1.5mL离心管中，置于冰上备用。同时，取对应胎鼠长度1mm左右的尾部组织，用于性别鉴定；
需要说明的是，由于E11.5时期的卵巢组织与中肾连接紧密，因此，从胎鼠中初步分离得到的生殖嵴中一般还包括位于其周边的中肾组织，需要将其去除，以得到生殖嵴。
步骤S12、将尾部组织转移到PCR管中，利用鼠尾DNA直提试剂盒(思科捷生物技术有限公司)提取小鼠DNA作为PCR的模板，之后，利用
Figure BDA0003240288040000061
PCR SuperMix试剂盒(全式金生物技术有限公司)配制PCR反应体系并进行PCR反应，最后，根据电泳结果中Sry基因条带的有无则可判断小鼠的性别，有Sry条带即为雄性，反之则为雌性。其中，PCR反应条件为94度5min，(94度30s，64度30s，72度30s)，72度10min，4度。第2到4步循环35次。其中Sry基因F引物序列为：TTGTCTAGAGAGCATGGAGGGCCATGTGAA，Sry基因R引物序列为CCACTCCTCTGTGACACTTTAGCCCTCCGA，Gapdh基因F引物序列为：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，Gapdh基因R引物序列为：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。
步骤S13、收集鉴定结果为雌性的生殖嵴，即卵巢组织。
步骤S20、将琼脂块置于24孔板中，并添加α-MEM培养基浸泡所述琼脂块10～14h，以交换所述琼脂块中的水分，然后将所述卵巢组织置于所述琼脂块顶端的中间位置，再向所述24孔板中加入卵巢组织培养液，在37℃、5％CO2下培养5～7天。
该步骤的实质为利用琼脂块对卵巢组织的三维培养方式，诱导有丝分裂阶段的卵原细胞在体外启动减数分裂。
其中，所述琼脂块由以下步骤制得：称取1.5g琼脂于微波炉中溶于100mL蒸馏水中，然后将11mL琼脂糖溶液倒入一个10cm贴壁培养板(CORNING公司)中，待冷却之后，用手术刀片将琼脂大块切割成多个琼脂块，保存4℃备用。在本实施例中，所述琼脂块的长为9～11mm，宽为9～11mm，高为4～6mm。进一步地，琼脂块的长宽高尺寸为10mm×10mm×5mm。
在一实施例中，所述卵巢组织培养液包括胎牛血清(FBS)、维生素C、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述卵巢组织培养液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM。也即，卵巢组织培养液的配方为：α-MEM培养基+10％FBS+1.5mM维生素C+0.1％青链霉素。
在一具体实施例中，步骤S20包括：将琼脂块置于24孔板中，然后向24孔板中加入500μLα-MEM培养基(Gibco公司)浸泡12h，以交换出琼脂块中的水分；将卵巢组织转移至L15培养基(Gibco公司)中，利用L15培养基将卵巢组织清洗3遍；随后弃净24孔板中的α-MEM培养基，将卵巢组织置于琼脂块的正上方，并加入300μL卵巢组织培养液，将24孔板板置于37℃、饱和湿度以及5％CO2的培养箱中培养6天。
步骤S30、将所述24孔板中的所述卵巢组织培养液更换成含有他莫昔芬的培养液，在37℃、饱和湿度以及5％CO2下培养5～7天以促进卵泡的发生。
需要说明的是，将卵巢组织在体外三维培养的第6天，大部分生殖细胞已经进入减数分裂。步骤S30的实质是利用他莫昔芬(Tamoxifen)诱导卵泡形成。
在一实施例中，所述含有他莫昔芬(Tamoxifen)的培养液包括胎牛血清、维生素C、他莫昔芬(Sigma公司)、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述含有他莫昔芬的培养液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM，所述他莫昔芬的添加量为10μM。也即，含有他莫昔芬的培养液的配方为：α-MEM培养基+10％胎牛血清+1.5mM维生素C+10μM他莫昔芬+0.1％青链霉素。
在一具体实施例中，步骤S30包括：
步骤S31、将24孔板中的卵巢组织液全部弃掉，加入300μL含有他莫昔芬的培养液，然后将24孔板置于37℃、饱和湿度以及5％CO2的培养箱中培养6天(即体外三维培养至第12天)，此阶段可明显观察到初级卵泡结构的形成；
步骤S32、将经步骤S31培养6天后的24孔板内的含有他莫昔芬的培养液弃掉，并加入300μL卵巢组织培养液，继续培养6天(即体外三维培养至第18天)，此阶段可在显微镜下观察到部分卵泡发育到次级卵泡阶段。
步骤S40、将所述卵巢组织于卵泡分离操作液中分离出单个卵泡，并将所述卵泡转移到卵泡生长培养液中贴壁培养，直到能观察到明显的卵泡腔形成后，将所述卵泡细胞培养液更换为卵泡成熟培养液，15～20h后即可观察到MII时期的卵母细胞。
在一实施例中，所述卵泡分离操作液包括L-15培养基、胎牛血清和青链霉素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5％和0.1％。
在另一实施例中，所述卵泡生长培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、维生素C、青链霉素和促卵泡素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为10％和0.1％，所述维生素C的添加量为1.5mM，所述促卵泡素的添加量为50mIU/ml。
其中，所述卵泡成熟培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、促卵泡素和人绒毛膜促性腺激素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5％和0.1％，所述促卵泡素的添加量为0.1IU/ml，所述人绒毛促性腺激素的添加量为1.2IU/mL。
可以理解的是，步骤S40的实质是单卵泡体外培养与成熟。
在一具体实施例中，步骤S40包括：
步骤S41、在CORNING贴壁培养皿中加入10μL卵泡生长培养液，然后添加石蜡油封住培养液液滴，提前4h将CORNING贴壁培养皿放入37℃、饱和湿度以及5％CO2的二氧化碳培养箱平衡上；
步骤S42、卵泡分离时，在10cm培养皿中加入500μL卵泡分离操作液，再将琼脂块上的卵巢组织转移到该10cm培养皿中，在体视镜下用钨针分离单个卵泡；
步骤S42、将分离出来的单个卵泡用口吸管转移至卵泡生长培养液中清洗三遍，最后转移至平衡好的CORNING贴壁培养皿中，每个液滴一个卵泡，3天后加入新鲜培养液10μL，以后每隔一天换半液，即弃掉10μL加入10μL新鲜培养液。培养至12-15天，可观察到明显的卵泡腔形成；
步骤S43、将CORNING贴壁培养皿中的卵泡生长培养液更换为卵泡成熟培养液，17h后可观察到MII期卵母细胞和GV期卵母细胞。
本发明提供的技术方案中，将雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织用琼脂块进行三维培养，在卵巢组织培养液中5～7天后，将卵巢组织置于含有他莫昔芬的培养液中培养5～7天，促进了E11.5时期的卵原细胞在体外条件下形成大量初级卵泡，然后将含有他莫昔芬的培养液更换为卵巢组织液，继续培养5～7天；再分离出单个卵泡，将分离出来的单个卵泡经过体外单卵泡贴壁培养和卵泡体外成熟培养，获得了大量MII期的卵母细胞。通过选取雌性胎鼠E11.5时期卵巢组织，使卵巢组织中只存在处于有丝分裂阶段的卵原细胞，构建了一种研究完整体外卵子发生过程的最佳模型；通过3D琼脂培养、含有他莫昔芬的培养基、以及实验步骤的设计，成功将早期卵原细胞在完全体外条件下诱导形成了MII期的卵母细胞；此外，采用3D琼脂培养卵巢组织的方式，相对于现有的采用Transwell-COL membranes培养卵巢组织的方式，原料易得，且成本较低。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、胎鼠生殖嵴的体外分离与性别鉴定：
(1)将成年CD-1雌鼠在下午五点左右放入成年公鼠的鼠笼中进行合笼，第二天早上对雌性检查是否形成阴道栓以确定是否怀孕，见栓的小鼠记为0.5dpc。到达11.5dpc后，用脱颈法处死孕鼠，将孕鼠的整个子宫取出转移至10cm培养皿中，加入5mL生理盐水进行清洗，然后用镊子将胎鼠分别取出并转移到一个新的10cm培养皿中，并加入5mL生理盐水，清洗掉血渍。清洗之后，将胎鼠转移到体视镜下，机械法在体视镜下分离出E11.5胎鼠的生殖嵴，并用镊子去掉与生殖嵴相连的中肾，在PBS缓冲液做成的滴里面洗2-3次，然后转移到含100μL DMEM/F12培养液的1.5mL离心管中，编号后置于冰上，同时，取对应胎鼠长度1mm左右的尾部组织，用于性别鉴定；
(2)将尾部组织转移到PCR管中，利用鼠尾DNA直提试剂盒(思科捷生物技术有限公司)提取小鼠DNA作为PCR的模板，之后，利用
Figure BDA0003240288040000091
PCR SuperMix试剂盒(全式金生物技术有限公司)配置PCR反应体系并进行PCR反应，最后，将PCR产物进行电泳，电泳结果如图2所示，根据Sry基因条带的有无即可判断胎鼠性别，有Sry条带即为雄性，反之则为雌性，其中，PCR反应条件为94度5min，(94度30s，64度30s，72度30s)，72度10min，4度。第2到4步循环35次。其中Sry基因F引物序列为：TTGTCTAGAGAGCATGGAGGGCCATGTGAA，Sry基因R引物序列为CCACTCCTCTGTGACACTTTAGCCCTCCGA，Gapdh基因F引物序列为：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，Gapdh基因R引物序列为：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。
(3)收集鉴定结果为雌性的生殖嵴，即卵巢组织，此时仍置于冰上。
2、卵巢组织体外三维培养以及减数分裂发生：
(1)先用天平称取1.5g琼脂糖(擎科公司)加入含100mL蒸馏水的玻璃瓶中，然后放入高压灭菌锅灭菌30min。待冷却后，用微波炉加热后立刻转入超净工作台，用移液器量取11mL液体琼脂糖溶液加入到10cm培养皿中，室温冷却后，此时琼脂的高度大约为5mm。之后采用无菌手术刀片将琼脂糖分割成10mm×10mm的琼脂糖块，此时即可得到10mm×10mm×5mm的琼脂块，准备好的琼脂块保存4℃备用。
(2)提前12h将琼脂块置于24孔板中，每个孔中加入一个琼脂块，然后向24孔板中加入500μLα-MEM培养基(Gibco公司)浸泡，以交换出琼脂块中的水分；12h后，将卵巢组织(需要说明的是，做了多组平行实验，也即，培养了多个卵巢组织)转移至L15培养基(Gibco公司)中，利用L15培养基将卵巢组织清洗3遍；随后弃净24孔板中的α-MEM培养基，将卵巢组织置于琼脂块的正上方，并加入300μL卵巢组织培养液(即含10％FBS、1.5mM维生素C以及0.1％青链霉素的α-MEM培养基)，将24孔板置于37℃、饱和湿度以及5％CO2的培养箱中培养。
(3)在卵巢组织培养液中培养的第4天，用镊子收集其中一块琼脂块上的卵巢组织，转移到6cm平皿中，加入20μL的柠檬酸钠低渗液，室温低渗1.5-2h。低渗结束之后，将组织样品转移到0.1M的蔗糖溶液中，用镊子将生殖基撕碎制成单细胞悬液。然后在准备好的玻片上加入1mL的1％的多聚甲醛，铺满载玻片，并放入提前准备好的湿盒中。之后，将生殖基的单细胞悬液滴到含多聚甲醛的载玻片上过夜。第二天，将固定好的玻片转移到37℃热台上，烘干剩余的液体，然后加入0.04％的Photo-Flo(柯达公司)孵育4min。孵育结束后，将载玻片转移到湿盒中，每张玻片加入200μL的含0.005％Triton-X100(索莱宝公司)、0.3％牛血清白蛋白(索莱宝公司)以及10％封闭驴血清(中杉金桥公司)的TBS溶液，盖上封口膜，室温封闭30min。封闭结束后，每张片子加入50μL封闭液稀释的一抗(Abcam公司)，37℃孵育8h。孵育结束之后，将片子转移到洗杯中，每张片子用TBS溶液漂洗3遍，每遍10min。之后，每张玻片再加入200μL的含0.005％Triton-X100、0.3％牛血清白蛋白以及10％封闭驴血清的TBS溶液，再次封闭30min。封闭结束后，每张片子添加50μL含有荧光标记二抗(Abcam公司)的封闭液，盖封口膜，转入湿盒，37℃孵育1.5h。孵育结束后，用TBS缓冲液清洗玻片，一共洗3遍，每遍10min。清洗结束后，往玻片上滴加30μL的Hoechst 33342(索莱宝公司)，室温染核5min。染色结束后，用PBS清洗3遍，每遍3～5s，然后添加抗猝灭剂(Vector公司)并封片，染色结果如图3所示(其中，Leptoene即细线期，Zygotene即偶线期，Pachytene即粗线期，Diplotene即双线期)。由图3可以看出，在培养的第四天，胎鼠卵巢中的生殖细胞已经进入第一次减数分裂前期，显微镜下可以观察到细线期、偶线期、粗线期以及双线期的生殖细胞。
3、卵泡的体外发生：
(1)上述卵巢组织在卵巢组织培养液中培养到第6天的时候，此时卵巢组织中的大部分生殖细胞已经进入减数分裂，此阶段颗粒细胞能否侵入生殖细胞cyst，是后期能否获得成熟卵母细胞的关键步骤。在卵巢组织液中培养的第6天，首先用移液器弃净24孔板中的卵巢组织培养液，添加300μL培养基，此处分为实验组和对照组，实验组的培养基为含有他莫昔芬(Tamoxifen)的培养基，配方为：10％FBS、1.5mM维生素C、10μM他莫昔芬以及0.1％青链霉素的α-MEM培养基，对照组的培养基为不含他莫昔芬的培养基，配方为：10％FBS、1.5mM维生素C以及0.1％青链霉素的α-MEM培养基，然后将24孔板转入37℃、饱和湿度以及5％CO2的培养箱中继续培养6天(即体外三维培养至第12天)。
(2)在实验组培养6天后(即体外三维培养12天后)，收集其中一块琼脂块上的卵巢组织，转移到含有4％多聚甲醛溶液(索莱宝公司)的1.5mL离心管中，置于4℃过夜固定。固定结束后，弃净离心管中的多聚甲醛，加入500μL PBS洗3遍，每次5min，然后在离心管中加入600μL抗原修复液，用封口膜封好之后，95度水浴抗原修复15min。抗原修复液为10mM柠檬酸钠(索莱宝公司)，0.05％Tween 20(索莱宝公司)的超纯水溶液。抗原修复结束后，室温下复温半小时，然后揭掉封口膜，加入500μL含1％Triton X100的PBS透膜液，室温在摇床上透膜半小时。之后，用移液器弃净透膜液，加入100μL含1％Triton X100、10％封闭驴血清、0.2％叠氮化钠(索莱宝公司)的透膜液中封闭1h。封闭结束后，用移液器弃净封闭液，然后加入100μL含DDX4(Abcam公司)和LAMININ(Abcam公司)一抗的封闭液，4℃孵育3天。孵育结束后，弃净一抗，然后加入200μL封闭液，在摇床上漂洗4次，每次10min，以充分去除未结合的一抗。之后，弃净封闭液，然后加入100μL含荧光标记二抗的封闭液，继续转入4℃避光孵育3天。二抗孵育结束之后，往离心管中加入3μL DAPI染液，孵育5min，然后弃净离心管中的液体，加入200μL封闭液在摇床上漂洗5次，每次5min。最后将样品转移到盖玻片，然后用抗猝灭剂封片。其染色结果如图5所示，由图5可以看出，在体外条件下E11.5时期的生殖嵴可以形成形态正常的卵巢结构，并且其中存在大量的卵母细胞。
(3)同时，将实验组培养6天后(即体外三维培养的第12天后)的24孔板内的含有他莫昔芬的培养液弃掉，并加入300μL卵巢组织培养液(即10％FBS、1.5mM维生素C以及0.1％青链霉素的α-MEM培养基)，继续培养6天(即体外三维培养至第18天)，卵巢组织在体外三维培养的形态如图4所示(需要说明的是，图4中指的是在体外三维培养的总天数)，由图4可以看出，在体外三维培养的第18天，实验组(添加他莫昔芬)即可在显微镜下观察到明显的初级卵泡结构形成，并且在卵泡的周围可以观察到一到两圈颗粒细胞，这表明卵泡结构完整。同时，在不添加他莫昔芬的对照组中，卵母细胞周围无法被颗粒细胞包围，部分卵母细胞出现黏连，出现多卵卵泡。
4、单卵泡体外培养与成熟
(1)卵巢组织在经体外三维培养18天之后，在显微镜下可观察到添加10μM他莫昔芬组的卵巢组织中存在明显的卵泡结构，周围颗粒细胞清晰，部分已经发育到次级卵泡阶段，而不加他莫昔芬组的卵母细胞周围无明显颗粒细胞，并且形成大量多卵卵泡。为了进一步在体外条件下促进卵泡的生长，先在CORNING贴壁培养皿中加入10μL卵泡生长培养液(配方为：α-MEM、10％FBS、1.5mM维生素C、0.1％青链霉素以及50mIU/ml促卵泡素)，然后添加石蜡油封住培养液液滴，提前4h将培养皿放入37℃、饱和湿度以及5％CO2的二氧化碳培养箱平衡上。将卵巢组织从24孔板中取出，转移到500μL卵泡分离操作液(配方为：L-15培养基、5％FBS以及0.1％青链霉素)，在体视镜下用钨针分离单个卵泡结构。将分离得到的单个卵泡立即转入卵泡生长培养液中清洗3遍，然后用口吸管转入平衡好的CORNING贴壁培养皿中，每个液滴一个卵泡，3天后加入新鲜培养液10μL，以后每隔一天换半液，即弃掉10μL加入10μL新鲜培养液，培养至13天左右，其结果如图6所示，由图6可以看出，卵巢组织中可观察到明显的卵泡腔形成，随后，将卵泡生长培养液更换为卵泡成熟培养液(配方为：α-MEM、5％FBS、0.1％青链霉素、0.1IU/mL促卵泡素以及1.2IU/mL人绒毛膜促性腺激素)，17h之后，其显微镜下观察结果如图7所示，即可观察到排出第一极体的MII期卵母细胞，即成熟的GV期卵母细胞。
因此，本发明成功利用机械法分离减数分裂启动前的早期卵原细胞，利用三维培养和添加10μM他莫昔芬的方式进行体外培养，成功在完全体外条件下将早期卵原细胞诱导形成成熟的卵母细胞。此外，本发明已经试验实施了多次，试验的结果是成功的，实现了发明的目的。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、分离获得E11.5时期胎鼠的生殖嵴，同时取所述胎鼠的尾部组织进行性别鉴定，收集鉴定结果为雌性的所述生殖嵴，即为卵巢组织；
S20、将琼脂块置于24孔板中，并添加α-MEM培养基浸泡所述琼脂块10~14 h，以交换所述琼脂块中的水分，然后将所述卵巢组织置于所述琼脂块顶端的中间位置，再向所述24孔板中加入卵巢组织培养液，在37 ℃、5% CO2下培养5~7天；
S30、将所述24孔板中的所述卵巢组织培养液更换成含有他莫昔芬的培养液，在37 ℃、饱和湿度以及5% CO2下培养5~7天以促进卵泡的发生，然后将所述含有他莫昔芬的培养液更换为所述卵巢组织培养液，继续培养5~7天；
S40、将所述卵巢组织于卵泡分离操作液中分离出单个卵泡，并将所述卵泡转移到卵泡生长培养液中贴壁培养12~15天，直到能观察到明显的卵泡腔形成后，将所述卵泡生长培养液更换为卵泡成熟培养液，15~20 h后即可观察到MII时期的卵母细胞；
其中，所述卵巢组织培养液包括胎牛血清、维生素C、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述卵巢组织培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5mM；
步骤S30中，所述含有他莫昔芬的培养液包括胎牛血清、维生素C、他莫昔芬、青链霉素和α-MEM培养基，其中，所述胎牛血清和所述青链霉素在所述含有他莫昔芬的培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5 mM，所述他莫昔芬的添加量为10 μM；
步骤S40中，所述卵泡分离操作液包括L-15 培养基、胎牛血清和青链霉素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡分离操作液中的体积分数对应为5%和0.1%；
步骤S40中，所述卵泡生长培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、维生素C、青链霉素和促卵泡素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡生长培养液中的体积分数对应为10%和0.1%，所述维生素C的添加量为1.5 mM，所述促卵泡素的添加量为50 mIU/ml；
步骤S40中，所述卵泡成熟培养液包括α-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素、促卵泡素和人绒毛膜促性腺激素，其中，所述胎牛血清和青链霉素在所述卵泡成熟培养液中的体积分数对应为5%和0.1%，所述促卵泡素的添加量为0.1 IU/ml，所述人绒毛促性腺激素的添加量为1.2 IU/mL。
2.如权利要求1所述的体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的制备方法，其特征在于，所述性别鉴定步骤包括：
将所述胎鼠的尾部组织转移到PCR管中用于DNA提取，将提取到的所述DNA进行PCR反应，最后通过琼脂糖电泳判断PCR产物中是否有Sry基因条带，若有，则为雄性，反之，则为雌性。
3.如权利要求1所述的体外诱导卵原细胞向卵母细胞分化的制备方法，其特征在于，所述琼脂块的长为9~11 mm，宽为9~11 mm，高为4~6 mm。
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