JPWO2019107445A1

JPWO2019107445A1 - 活性調節剤

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Publication number: JPWO2019107445A1
Application number: JP2019557290A
Authority: JP
Inventors: 渋谷　彰; 彰渋谷; ちぐさ小田; 史枝阿部; 聡藤山
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-11-26
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CA3073494C; US20220340659A1; RU2020121200A3; CN111447950B; EP3718568A1; EP3718568A4; AU2018376379A1; KR20200085300A; TW201924717A; JP7246094B2; CN111447950A; NZ762749A; CA3073494A1; RU2020121200A; KR102577180B1; IL272732A; US20210188973A1; IL272732B; WO2019107445A1

Abstract

本発明はＣＤ３００ｂ依存性貪食作用の活性を調節するための手段である活性調節剤、さらに当該活性が関与する疾病または病状を治療または予防するための薬剤に関し、当該活性調節剤はＣＤ３００ａ結合性物質を含み、マクロファージにおけるＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを調節する。

Description

本発明は、ＣＤ３００ａ結合性物質を含む活性調節剤および虚血性疾患用薬剤に関する。

高齢化・生活習慣の欧米化などを背景に我が国では虚血性疾患の罹患者が数多く存在し、死亡原因の上位を占めるとともに医療経済面での負担となっている。虚血性疾患は、心臓、脳などの臓器における血管が一時的又は持続的に閉塞したり狭窄することにより引き起こされる急激な血流減少による酸素・栄養欠乏状態により引き起こされる疾患であり、虚血性疾患の代表的な疾患としては、例えば、心筋梗塞、脳梗塞等が挙げられる。

アポトーシスは生体内の恒常性の維持などに関わる細胞死の機構の一つであり、悪化した生体内環境、例えば、前記虚血性疾患において引き起こされる酸素・栄養欠乏状態などに曝された細胞において惹起されることが知られている。アポトーシスを引き起こした細胞はマクロファージなどの食細胞に認識されることで貪食処理され、速やかに除去される。

マクロファージ等によるアポトーシス細胞の速やかな貪食による除去は、虚血性疾患の病態進行の抑制に大きく貢献している。細胞がアポトーシスを引き起こした場合、マクロファージが誘引されてアポトーシス細胞が体内から除去（クリアランス）されることで、周囲の細胞や組織の負荷が軽減される。このようなアポトーシス細胞のクリアランスが正常に引き起こされない場合、アポトーシス細胞やその内容物が周囲に蓄積することで周囲の細胞や組織に負荷がかかり、周辺組織の損傷を引き起こす。このように、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食は生体の恒常性を維持するためには極めて重要である。

アポトーシスを引き起こした細胞は、正常細胞においては細胞膜の内側に存在するリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ：phosphatidylserine）を細胞の表面に露出することが知られている。このＰＳはマクロファージ等の貪食細胞に対して、いわゆる「ｅａｔｍｅ」シグナルを介在することが知られており、アポトーシス細胞上のＰＳをマクロファージが認識することでマクロファージはアポトーシス細胞を貪食する（非特許文献１、２）。

マクロファージにおいて「ｅａｔｍｅ」シグナルを受け取る因子の一つとして、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属するMer tyrosine kinase（ＭｅｒＴＫ）が知られている。ＭｅｒＴＫはそのリガンドであるｇａｓ６やｐｒｏｔｅｉｎ６を介して、アポトーシス細胞表面のＰＳと結合することでマクロファージの貪食作用を亢進する。例えば、ＭｅｒＴＫを欠損するマウスから調製したマクロファージはアポトーシス細胞を貪食できないという知見がある（非特許文献３）。

また、受容体ファミリータンパク質であるＣＤ３００ファミリーのメンバーであるＣＤ３００ｂ（ＣＬＭ７／ＬＭＩＲ５）が、アポトーシス細胞表面のＰＳをリガンドとして認識し、アポトーシス細胞の食作用を調節することも報告されている（非特許文献４）。

一方、同じくＣＤ３００受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ３００ａについては、免疫系細胞であるマスト細胞等においてＣＤ３００ａはＰＳと結合することにより免疫系抑制性シグナルの伝達が亢進すること（特許文献１）、マクロファージのＣＤ３００ａはＰＳと結合しても貪食は促進しないこと（非特許文献５）、を本発明者らが報告している。

国際公開第２０１３／０７７１８６号

V.A.Fadok et al. J Immunol 148,2207 Apr 1,1992 J.Savill,I.Dransfield, C.Gregory,C.Haslett, Nat Rev Immunol 2,965, 2002 Nishi et al. Mol. Cell. Biol. April 2014 vol. 34 no. 8 1512-1520 Murakami et al. Cell Death and Differentiation (2014) 21, 1746-1757 Nakahashi-Oda et al. J. Exp. Med., 209, 1493-1503

本発明は、ＣＤ３００ｂ依存性貪食作用の活性化制御機構を解明し、当該ＣＤ３００ｂ依存性貪食作用の活性を調節するための手段である活性調節剤、さらに当該活性が関与する疾病または病状を治療または予防するための薬剤を提供することを目的とする。

本発明者は、マクロファージの貪食作用におけるＣＤ３００ｂ依存性貪食作用の活性化制御機構を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＳと結合することで活性化したＣＤ３００ａが、マクロファージのＣＤ３００ｂ依存性貪食作用を抑制するという知見を得た。

本発明者はさらに、生体内において虚血が生じた場合においてＣＤ３００ｂ依存性貪食作用がＣＤ３００ａによって抑制され、当該虚血によりアポトーシスを引き起こした細胞やその細胞内物質が組織内に蓄積することが、虚血性疾患を引き起こすまたは憎悪させる原因となると考えた。ここから、抗ＣＤ３００ａ抗体を用いてＣＤ３００ａの活性を調節し、ＣＤ３００ｂ依存性貪食作用を制御することで虚血性疾患を治療できること、抗ＣＤ３００ａ抗体は虚血性疾患を治療するためのツールとなり得ることを想到し、本発明に至った。

これらの知見に基づいてなされた本発明により、例えば、下記［１］〜［９］に示される活性調節剤および薬剤が提供される。
［１］ＣＤ３００ａ結合性物質を含み、マクロファージにおけるＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを調節するための活性調節剤。
［２］前記ＣＤ３００ａ結合性物質がマクロファージにおけるＣＤ３００ａの活性を阻害する物質である［１］に記載の活性調節剤。
［３］前記ＣＤ３００ａ結合性物質がＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質である［１］または［２］に記載の活性調節剤。
［４］前記ＣＤ３００ａ結合性物質が抗体またはペプチドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の活性調節剤。
［５］前記ＣＤ３００ａ結合性物質が抗ＣＤ３００ａ抗体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の活性調節剤。
［６］前記抗ＣＤ３００ａ抗体がＣＤ３００ａ中和抗体である、［５］に記載の活性調節剤。
［７］前記抗ＣＤ３００ａ抗体が抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体である、［５］または［６］に記載の活性調節剤。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の活性調節剤を含有する虚血性疾患用薬剤。
［９］前記虚血性疾患用薬剤が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性腸疾患、虚血性腎疾患、四肢虚血、網膜虚血、虚血性肺疾患および脊髄虚血から選択される一種以上を治療または予防するための薬剤である、［８］に記載の虚血性疾患用薬剤。

本発明により、マクロファージのＣＤ３００ｂ依存性貪食作用に関するシグナル伝達を調節することを特徴とする、活性調節剤および虚血性疾患用薬剤を提供することができる。

図１は、参考例１で得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。抗ＭｅｒＴｋ抗体＋コントロール抗体で処理した細胞群についての結果を丸で、抗ＭｅｒＴｋ抗体＋抗ＣＤ３００ａ抗体で処理した細胞群についての結果を四角で示す。図２Ａは、参考例２において腎虚血処置を行い、再灌流処置２４時間後のＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）およびＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスにおける尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒｅ）の血清中濃度の測定値を示したグラフである。図２Ｂは、それぞれのマウスについて腎虚血処置・再灌流処置後の生存率を示したグラフである。図３は、参考例３における、腎虚血処置前（ｎａｉｖｅ）、腎虚血処置および再灌流処置２４時間後および７２時間後のＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）およびＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスの腎臓組織切片におけるヘマトキシリンエオジン染色の染色像、および虚血処置および再灌流処置２４時間後のＴＵＮＥＬ染色の染色像である。図４は、実施例１において腎虚血処置を行い、再灌流処置２４時間後の尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒｅ）の血清中濃度の測定値を示したグラフである。抗ＣＤ３００ａ抗体投与群を三角で、非投与群を四角で示す。図５は、参考例４において一過性脳虚血処置を行った、ＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−ＣｒｅマウスおよびＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）における神経学的所見のスコアをあらわしたグラフである。図６は、実施例２において一過性脳虚血処置を行ったマウスにおける神経学的所見のスコアをあらわしたグラフである。抗ＣＤ３００ａ抗体投与群を四角で、非投与群を丸で示す。図７Ａは実施例３において一過性脳虚血処置を行ったマウスにおける、神経学的所見のスコアをあらわしたグラフである。抗ＣＤ３００ａ抗体投与群を四角で、非投与群を丸で示す。図７Ｂは実施例３において作製した、抗ＣＤ３００ａ抗体投与または非投与マウスにおける大脳組織標本におけるヘマトキシリンエオジン染色の染色像およびその解析結果を示したグラフである。図８は参考例５において作製したＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスおよび野生型マウス（C57BL/6J）を用いた心筋梗塞モデルの生存率をあらわしたグラフである。

本発明の活性調節剤および虚血性疾患用薬剤は、マクロファージにおけるＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを調節することを特徴とする。具体的には、ＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナル伝達を調節することで、虚血部位におけるアポトーシス細胞の貪食による除去（クリアランス）に関わる。

本発明の活性調節剤および虚血性疾患用薬剤について、以下詳細に説明する。

本明細書における「虚血」とは、血管の狭窄や閉塞により、組織に供給される動脈血量が減少することによる組織の酸素や栄養等の欠乏状態を意味し、「虚血性部位」とは、虚血によって動脈血量が減少し、その結果、栄養や酸素等が減少している状態の部位を意味する。

虚血によりアポトーシスが引き起こされた細胞上のＰＳによりマクロファージ表面のＣＤ３００ｂが活性化されると、ＣＤ３００ｂはアダプター分子であるＤＡＰ１２と会合する。その結果、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activating motif）に存在するチロシンがリン酸化されることでＳＨ２ドメインを持つＳｙｋファミリーキナーゼがリクルートされ活性化され、その下流のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化することで、マクロファージの貪食作用が亢進される。

一方でＣＤ３００ａは、ＰＳと結合して活性化することで、その細胞内領域のＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）配列を介してチロシンフォスファターゼであるＳＨＰ−１をリクルートする。その結果、前記ＤＡＰ１２のＩＴＡＭに存在するチロシンのリン酸化を阻害することで、ＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを抑制する。

＜活性調節剤＞
本発明の「活性調節剤」はＣＤ３００ａ結合性物質を含み、マクロファージにおけるＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを調節することを特徴とする。本発明の活性調節剤は、具体的には、該活性調節剤に含まれるＣＤ３００a結合性物質がＣＤ３００ａと結合することで、ＣＤ３００ａとＰＳとの結合が阻害（中和）されることでＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナル伝達を促進する。

＜ＣＤ３００ａ結合性物質＞
前記ＣＤ３００ａ結合性物質は、マクロファージにおけるＣＤ３００ａの活性を阻害する物質であることが好ましく、ＣＤ３００ａとＰＳとの結合を阻害する物質であることがさらに好ましい。ＣＤ３００ａの活性を阻害する物質は、特に限定されないが、抗体またはペプチドであることが好ましく、抗ＣＤ３００ａ抗体であることがより好ましい。

＜抗ＣＤ３００ａ抗体＞
本発明の活性調節剤において用いられる抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＣＤ３００ａを抗原として特異的に認識する抗体である。抗ＣＤ３００ａ抗体は遊離の抗体であってもよいし、他の任意の物質（例えば補助薬剤等）が直接または間接的に固定された抗体であってもよい。前記活性調節剤において含まれるのは特定の一種類のモノクローナル抗体であってもよいし、二種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせ（ないしポリクローナル抗体）であってもよいが、特異性という観点から一種類のモノクローナル抗体が含まれていることが好ましい。

前記抗ＣＤ３００ａ抗体は本発明の作用効果を奏する抗体、すなわちＣＤ３００ａとＰＳとの結合を阻害または抑制する作用（中和作用）を有するものであれば特に限定されず、特にＣＤ３００ａに対する中和抗体を選択することが好ましい。中和抗体は、公知の手法によって作製することができる。前記抗ＣＤ３００ａ抗体としてモノクローナル抗体を選択する場合であれば、一般的には、ＣＤ３００ａを用いた免疫、ハイブリドーマの作製、スクリーニング、培養、回収といった手順で、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体は作製される。それらの中から、ＣＤ３００ａとＰＳとの好適な中和作用を有し、本発明の作用効果を奏する適切なモノクローナル抗体を選択すればよい。

前記抗ＣＤ３００ａ抗体としてポリクローナル抗体を選択する場合、ポリクローナル抗体として、抗原分子のエピトープを含む特定の配列部分を免疫抗原にして作成される一般的なポリクローナル抗体を用いることができるが、これに限らず、例えば、２種類以上のモノクローナル抗体の混合物をポリクローナル抗体の代替品（同等品）として使用してもよい。なお、抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。

前記抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＣＤ３００ａとＰＳとの結合を阻害または抑制する作用（中和作用）を有し、本発明の作用効果を奏する抗体であれば、天然の抗体のように全長を有するものである必要はなく、抗体断片または誘導体であってもよい。すなわち、本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、抗体断片（Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）₂等）、キメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体などの誘導体が包含される。

＜ペプチド＞
本発明においてＣＤ３００ａ結合性物質として用いられるペプチドは、マクロファージにおけるＣＤ３００ａの活性を阻害するペプチドであることが好ましく、ＣＤ３００ａとＰＳとの結合を阻害するペプチドであることがさらに好ましい。例えば、ＣＤ３００ａと特異的に結合するペプチドを選択することが好ましく、具体的にはＣＤ３００ａのリガンドとなり得るペプチドであって、マクロファージにおけるＣＤ３００ａの活性を阻害するペプチドであることが好ましい。

＜虚血性疾患用薬剤＞
本発明の「虚血性疾患用薬剤」は、前記活性調節剤を有効成分として含有する。該活性調節剤により、ＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナル伝達が促進されることで、虚血部位におけるアポトーシス細胞は速やかに貪食により除去（クリアランス）されることから、アポトーシス細胞の組織内への蓄積を抑制することができ、虚血性疾患の治療、または予防を行うことが可能となる。

なお、「治療」には疾病または症状を治癒することと共に、それを緩和（軽快）することも含まれ、また「予防」には、疾病または症状を未然に防ぐことと共に、疾病または症状の治癒後にその再発を防ぐことも含まれる。

本発明の虚血性疾患用薬剤の投与対象は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（例えばマウス等の哺乳類）を問わないが、好ましくはヒトであり、さらに好ましくは虚血性疾患に罹患しているかまたは罹患の虞のあるヒトである。

本発明の虚血性疾患用薬剤の対象疾患である「虚血性疾患」とは、自覚症状の有無に拘わらず、動脈の狭窄や閉塞により、組織の虚血が持続している状態、またはかかる虚血により引き起こされる好ましくない状態をいう。虚血性疾患としては、特に限定されないが、例えば、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞やもやもや病などの虚血性脳疾患、腎不全などの虚血性腎疾患、虚血性大腸炎や腸間膜動脈閉塞症などの虚血性腸疾患、壊疽や閉塞性動脈硬化症などの四肢虚血、糖尿病網膜症などの網膜虚血、虚血性肺疾患、脊髄虚血、またはそれらの兆候のある状態などが挙げられる。

本発明の虚血性疾患用薬剤の投与部位は、投与対象とする疾病または病状に応じて選択ができ、特に限定されるものではない。例えば、血中に投与することで全身的に投与してもよいし、虚血が生じている部位の粘膜下組織や結合組織またはその付近に投与してもよいし、虚血が生じている部位に直接投与してもよい。投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈注射、皮下注射、局所注入、脳室内投与等を行うことができ、静脈注射、すなわち全身投与が最も好ましい。

本発明の虚血性疾患用薬剤は単独で投与することもできるし、また他の薬剤、例えば血栓溶解薬等を組み合わせて用いることができる。

本発明の虚血性疾患用薬剤の投与量は、特に制限はされないが、経済上の観点および副作用を可能な限り回避する観点から、必要な治療効果が得られる範囲においてできる限り少ない方が好ましい。具体的には、疾患の程度、患者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合い等に応じて適宜増減することが好ましい。また、投与回数は１日あたり１回〜数回とすることが好ましい。

同様に、本発明の虚血性疾患用薬剤に含有される抗ＣＤ３００ａ抗体の量も適宜選択することができる。例えば、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、１０〜１００ｍｇ、好ましくは２０〜５０ｍｇであることが好ましい。

本発明の虚血性疾患用薬剤の形態は特に限定されないが、例えば、所望の粘度や含有成分の濃度になるように希釈剤に溶解または分散させた溶液または分散液であることが好ましく、常法に従って、フィルターによる濾過滅菌されてもよいし、殺菌剤の配合等により無菌化されてもよい。また、用時調製の形態としてもよく、例えば、凍結乾燥法などによって固体製剤として調製し、使用前に希釈剤に溶解または分散させてから投与することもできる。

本発明の「虚血性疾患用薬剤」は、必要に応じて、さらに薬学的に許容され得る添加剤を含有していてもよい。例えば、希釈剤、担体または賦形剤を含有していてもよい。

薬学的に許容され得る添加剤とは、本発明の目的に反しないものである限り特に限定されず、例えば、希釈剤、担体、賦形剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、界面活性剤等の乳化剤、着色剤、粘稠剤、グリコール類などの溶解補助剤、塩化ナトリウムやグリセリン等の等張化剤等が挙げられる。

具体的な添加剤の例としては、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アラビアガム、リン酸カルシウム、不活性アルギン酸類、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ウォーターシロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、高張塩水、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油もしくは硬質な脂肪などの脂肪性物質、またはそれらの適当な混合物が挙げられる。

非経口的に投与できる形態は、滅菌されており、生理学的に許容できない薬剤が入っていないものとすべきであり、また投与時の刺激または他の副作用を最小限にするためにモル浸透圧濃度が低いものとすべきであり、それゆえ溶液は、好ましくは等張であるか、わずかに高張であるもの、例えば高張塩水（生理食塩水）とすべきである。

以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

［参考例１］
野生型マウス（C57BL/6J）から胸腺を採取して分離した胸腺細胞に、デキサメサゾン１０μＭを加えて１２時間培養することでアポトーシスを誘導し、さらにｐＨｒｏｄｏ（商標）色素で標識した。

一方で野生型またはＣＤ３００ｂＫＯマウスの腹腔滲出細胞を採取し、３０分培養することで、培養皿にマクロファージを接着させた。

１．５×１０⁶個の前記標識胸腺細胞と１．５×１０⁵個のマクロファージとを、抗ＭｅｒＴｋ中和抗体(2B10C42, Biolegend) ２０ｎｇ／ｍｌおよび抗ＣＤ３００ａ抗体（TKA139, 中外製薬株式会社）の存在下で、または抗ＭｅｒＴｋ抗体(2B10C42, Biolegend社) ２０ｎｇ／ｍｌおよびコントロール抗体 (IC17-mouse IgG1 sFc、中外製薬株式会社) １ｎｇ／ｍｌ存在下で９０分間培養した。その後フローサイトメトリー（BD FACSAria (商標), BD バイオサイエンス社）を用いて、抗ＣＤ１１ｂ抗体（M1/70, TONBO bioscience社）および抗Ｆ４／８０抗体（BM8, Biolegend社）に陽性である総マクロファージ数、およびｐＨｒｏｄｏ陽性細胞数を計測した。その後前者に対する後者の割合を算出して、その数値をアポトーシス細胞を貪食したマクロファージの割合とした（FlowJo（登録商標）, FlowJo LLC社）。

結果を図１に示す。

ＣＤ３００ｂＫＯマウス由来のマクロファージは、ＷＴマクロファージに比べて、抗ＣＤ３００ａ抗体の有無に関わらず、アポトーシス細胞の貪食率が有意に低い。

ここで、抗ＣＤ３００ａ抗体によりＣＤ３００ａを中和した細胞では、ＷＴマクロファージにおいてはアポトーシス細胞の貪食率が有意に亢進したが、ＣＤ３００ｂＫＯマクロファージにおいては貪食率の亢進は見られなかった。

したがってＣＤ３００ｂによるマクロファージの貪食作用は、抗ＣＤ３００ａ抗体により亢進されることがわかった。

［参考例２］
ＣＤ３００ａ^fl/flマウス（筑波大学生命科学動物資源センター製）とＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウス（Jackson laboratory社）とを掛け合わせることで、マクロファージ特異的なＣＤ３００ａコンディショナルノックアウトマウスである、ＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスを作製した。

８−１４週齢のＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）およびＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスそれぞれを麻酔下で開腹し、クリップを用いて両側腎動脈を閉塞した（腎虚血処置）。

２５分、または３５分の閉塞後、クリップを外して閉塞を解除して（再灌流処置）、閉腹した。

それぞれのマウスについて、再灌流処置２４時間後の尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒｅ）の血清中濃度を測定した。

また、３５分閉塞させた後に再灌流処置を行ったマウスについては併せて処置後の生存率の経過観察を行った。

結果を図２に示す。

これらの結果から、マクロファージにＣＤ３００ａが欠損しているマウスにおいてはコントロールに比べ腎虚血処理後における急性腎障害が抑制され、生存率も維持されることがわかる。

［参考例３］
参考例２と同様の手法で作製したＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−ＣｒｅマウスおよびＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）それぞれの両側腎動脈を３０分閉塞させた後、参考例２と同様の手法で再灌流処置を行った。再灌流処置後２４時間、７２時間の腎臓を採取し、常法にしたがって組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン染色、もしくはＴＵＮＥＬ染色(Apoptag, Millipore)を行った。

結果を図３に示す。マクロファージにＣＤ３００ａが欠損しているマウスにおいてはコントロールに比べ、腎虚血処理後の組織におけるアポトーシスが抑制されており、さらに組織内へのアポトーシス細胞の蓄積も抑制されていることがわかった。

［実施例１］
野生型マウス（C57BL/6J）に、コントロール抗体(IC17-mouse IgG1 sFc, 中外製薬株式会社)もしくは抗ＣＤ３００ａ抗体（TKA139, 中外製薬株式会社）２０ｍｇ／ｋｇを経静脈投与した。投与３時間後、参考例２と同様の手法で、腎虚血処置、および３０分後に再灌流処置を行い、さらに２４時間後の尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒｅ）の血清中濃度をそれぞれ測定した。

結果を図４に示す。抗ＣＤ３００ａ抗体をあらかじめマウスに投与しておくことにより、腎虚血処理後の急性腎障害が抑制できることがわかった。

［参考例４］
参考例２と同様の手法で作製したＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−ＣｒｅマウスおよびＣＤ３００ａ^fl/flマウス（コントロールマウス）それぞれについて、麻酔下に頚部を切開し頚動脈からシリコンコートされたモノフィラメントカテーテル(Doccol Corporation社)を挿入し留置して右中大脳動脈を閉塞することで（一過性脳虚血処理）、中大脳動脈閉塞(MCAO: right middle cerebral artery occlusion)モデルを作製した (Shichita et al. Nat Med 2016)。閉塞処理６０分後、カテーテルを抜去して脳血流を再灌流させ、手術創を閉鎖した。

その後のマウスについて経日的に観察を行い、神経学的所見について、Bederson et al. Stroke 1986を参考に、以下の神経学的スコアに基づいた評価を行った。

0: 明らかな症状がない、1: 前肢屈曲、2: 回旋はしないが側方から押すと倒れやすい、3: 回旋する、4: 強制的に回旋する、5: ほとんど動かない、6: 死亡。

結果を図５に示す。マクロファージにＣＤ３００ａが欠損しているマウスを用いて作製したＭＣＡＯモデルマウスにおいてはコントロールマウスを用いて作製したＭＣＡＯモデルマウスに比べて脳虚血によって引き起こされる神経障害が軽度であることが判った。

［実施例２］
野生型マウス（C57BL/6J）について、参考例４と同様の手法で一過性脳虚血処理を行った。処理６０分後、コントロール抗体(IC17-mouse IgG1 sFc, 中外製薬株式会社)または抗ＣＤ３００ａ抗体を２０ｍｇ／ｋｇを、経静脈で投与した。その後、それぞれのマウスにおける神経学的所見について参考例４と同様のスコアに基づいた評価を行った。

結果を図６に示す。抗ＣＤ３００ａ抗体を投与したマウス群においてはコントロール抗体を投与したマウス群に比べて、一過性脳虚血処理により引き起こされる神経障害が比較的軽度であることが判った。ここから抗ＣＤ３００ａ抗体により、脳梗塞などの脳虚血で引き起こされる神経障害を予防できることが示唆される。

［実施例３］
野生型マウス（C57BL/6J）に、参考例４と同様の手法で一過性脳虚血処理を行った。処理３時間後、上述した神経学的スコアが３（回旋する）のマウスを選択し、それぞれコントロール抗体もしくは抗ＣＤ３００ａ抗体を２０ｍｇ／ｋｇ経静脈投与し、その後の神経学的所見について参考例４で示した神経学的スコアに基づいた評価を行った。

抗ＣＤ３００ａ抗体投与後５日目にマウスを堵殺し、大脳を採取して大脳組織標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン染色を行って光学顕微鏡（keyence社）で観察し、梗塞領域の面積を計測した。

結果を図７に示す。抗ＣＤ３００ａ抗体を投与したマウス群においてはコントロール抗体を投与したマウス群に比べて、神経学的スコアが大きく改善しており、また染色結果からは梗塞領域の面積が有意に狭いことが判った。

ここから抗ＣＤ３００ａ抗体により、脳梗塞などの脳虚血で引き起こされる神経障害を治療できることが示唆される。

［参考例５］
参考例２と同様の手法で作製した、ＣＤ３００ａ^fl/flＬｙｓｍ−Ｃｒｅマウスおよび野生型マウス（C57BL/6J）それぞれについて、全身麻酔後、呼吸器補助を行って開胸し、左冠動脈左前下行枝を６−０プロリーン（登録商標）糸にて結紮することで心筋梗塞モデルを作製した（Mahmoud et al. Nat Prot 2014）。術後１週間後に梗塞巣をドップラーエコーにて確認し、梗塞巣が確認されたマウスについてその後の生存率を観察した。

結果を図８に示す。マクロファージにＣＤ３００ａが欠損しているマウスを用いて作製した心筋梗塞モデルマウスにおいてはコントロールマウスを用いて作製した心筋梗塞モデルマウスに比べて生存率が有意に高いことが判った。

Claims

ＣＤ３００ａ結合性物質を含み、マクロファージにおけるＣＤ３００ｂ依存性貪食シグナルを調節するための活性調節剤。
前記ＣＤ３００ａ結合性物質がマクロファージにおけるＣＤ３００ａの活性を阻害する物質である請求項１に記載の活性調節剤。
前記ＣＤ３００ａ結合性物質がＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質である請求項１または２に記載の活性調節剤。
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が抗体またはペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性調節剤。
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が抗ＣＤ３００ａ抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性調節剤。
前記抗ＣＤ３００ａ抗体がＣＤ３００ａ中和抗体である、請求項５に記載の活性調節剤。
前記抗ＣＤ３００ａ抗体が抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体である、請求項５または６に記載の活性調節剤。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の活性調節剤を含有する虚血性疾患用薬剤。
前記虚血性疾患用薬剤が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性腸疾患、虚血性腎疾患、四肢虚血、網膜虚血、虚血性肺疾患および脊髄虚血から選択される一種以上を治療または予防するための薬剤である、請求項８に記載の虚血性疾患用薬剤。