JPWO2018203572A1 - 非特異反応抑制剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、従来の非特異反応抑制剤では異好性抗体等の非特異因子の影響を十分に抑制できなかった検体であっても、非特異因子による非特異反応を十分に抑制することができる非特異反応抑制剤を提供することを課題とする。本発明は、ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下であり、かつ、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上である抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することを特徴とする免疫測定法用の非特異反応抑制剤に関する。
Description
本発明は、免疫測定法用の非特異反応抑制剤、それを含有するイムノクロマトグラフ用テストストリップ及びイムノクロマトグラフ用テストキット、並びに、非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる免疫測定法に関するものである。
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できることから、臨床検査に広く利用されている。そのような免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が知られている。
抗原抗体反応は、ある抗原決定基に対して誘導された抗体の抗原結合部位が、その抗原決定基と高い相補性をもつことにより生ずる、特異性の高い結合反応である。ところが、抗原抗体反応を利用した免疫測定においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応が生じ、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。
このような現象が起こる原因の１つとして、被検出物質（抗原）以外の成分であるにもかかわらず、免疫測定に用いる抗体に結合する成分（以下、非特異因子という）が検体中に存在することが挙げられる。検体中に非特異因子が存在すると、被検出物質が存在しないにもかかわらず、被検出物質が存在することを示す測定結果が得られることとなる。
このような非特異因子は、被検出物質と特異的に反応する抗体のみならず、被検出物質と反応しない抗体とも結合する物質である。非特異因子としては、異好性抗体やリウマトイド因子が知られている。
異好性抗体は、ヒト血液等に存在するヒト以外の動物種由来の抗体に対する抗体であり、マウス抗体に対するヒト抗体（ＨＡＭＡ）をはじめ、ヤギ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＧＡ）、ヒツジ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＳＡ）、及びウサギ抗体に対するヒト抗体（ＨＡＲＡ）等がある。
リウマトイド因子は、ヒト血液等に存在するヒトの抗体に対する抗体であり、関節リウマチ患者に多く見られる自己抗体である。
さらに、上記異好性抗体やリウマトイド因子以外にも、いまだ成分が明らかになっていない非特異因子が多く存在するといわれている。
検体中の非特異因子の存在は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できるという免疫測定法の利点を損ない、臨床検査分野においては、患者などの疾病の診断を誤らせることにもつながる重大な問題であるため、従来、非特異因子による非特異反応を抑制し正しい測定値を得るための様々な試みが行われてきた。
特許文献１には、試料中に存在する非特異因子であるＩｇＭ型またはＩｇＧ型の自然抗体に対して反応する抗ヒトＩｇＭ抗体や抗ヒトＩｇＧ抗体を免疫測定系に添加することにより、非特異因子による非特異反応を抑制し、抗原を正確に測定することができる、免疫学的測定法が開示されている。
特許文献２には、ヒト免疫グロブリンＭと特異的に反応し、溶液状態でヒト免疫グロブリンＭとの間で抗原抗体反応に基づく免疫凝集体を形成できる抗ヒト免疫グロブリンＭモノクローナル抗体が記載されており、同抗体により非特異反応を抑制することのできる免疫学的測定法が開示されている。
特許文献３には、抗ヒトリウマチ因子（ＩｇＭ型）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ型）を含有する非特異反応阻害剤、及びそれを用いた免疫学的測定法が記載されており、異好性阻止試薬ＨＢＲと比較して異好性抗体による非特異反応を抑制できたと記載されている。
しかしながら、従来の方法では、免疫測定法における非特異反応の抑制にある程度の効果を示すものの、必ずしもその効果は十分とは言えず、いまだ改良の余地があった。また、検体によっては、従来用いられてきた非特異反応抑制剤による効果がほとんど得られず、非特異因子による非特異反応を抑制できないものも少なからず存在し、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
したがって、本発明では、従来用いられてきた非特異反応抑制剤では異好性抗体等の非特異因子の影響を十分に抑制できなかった検体であっても、非特異因子による非特異反応を十分に抑制することができる非特異反応抑制剤を提供することを目的とする。
上記特許文献では、非特異因子による非特異反応を抑制する方法として、ヒトＩｇＭやヒトＩｇＧといったヒトに由来する免疫グロブリンに対し特異的に反応する抗体を用いている。これは、免疫測定法における非特異反応を抑制しようと試みる場合、ヒト由来の非特異因子を除去するためには、ヒト由来の非特異因子に対して反応する抗体を用いることが必要であると考えられてきたためである。このように、ヒト由来の検体を用いる免疫測定法においては、従来、ヒト由来の非特異因子に特異的に反応する非特異反応抑制剤、すなわち、ヒト由来の非特異因子以外と交叉反応性を有しない非特異反応抑制剤を用いることが通常であった。
本発明者らは、ヒトに由来する免疫グロブリンのみならず、ヒト以外の動物種に由来する免疫グロブリンに対しても反応性を示す抗体が、非特異反応の抑制に対してどのような影響を及ぼすかという点に着目し、鋭意研究を重ねた。その結果、驚くべきことに、ヒトに由来するＩｇＭの他、イヌに由来するＩｇＭ、及びネコに由来するＩｇＭに対して所定の反応性を示す抗体を用いて免疫測定法を実施した場合、非特異反応を顕著に抑制することができることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は以下の通りである。
１．ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下であり、かつ、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上である抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することを特徴とする免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
２．前記Ａ３／Ａ１が、２．５以下である、前記１に記載の非特異反応抑制剤。
３．前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体が、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体又は抗ネコＩｇＭ抗体である、前記１又は２に記載の非特異反応抑制剤。
４．前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量が０．５μｇ以上２０μｇ以下である、前記１〜３のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤。
５．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記１〜４のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤。
６．前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
７．前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
８．検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
９．前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
１０．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
１．ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下であり、かつ、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上である抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することを特徴とする免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
２．前記Ａ３／Ａ１が、２．５以下である、前記１に記載の非特異反応抑制剤。
３．前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体が、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体又は抗ネコＩｇＭ抗体である、前記１又は２に記載の非特異反応抑制剤。
４．前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量が０．５μｇ以上２０μｇ以下である、前記１〜３のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤。
５．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記１〜４のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤。
６．前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
７．前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
８．検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、前記１〜５のいずれか１に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
９．前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
１０．前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記８に記載の免疫測定法。
本発明の非特異反応抑制剤を用いることにより、免疫測定法における非特異反応を十分に抑制することができる。
以下、本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
本発明の非特異反応抑制剤は、ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下であり、かつ、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上である抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有する。
ここで、「イヌＩｇＭ」とは、イヌに由来するＩｇＭ型の免疫グロブリンを意味し、「ネコＩｇＭ」とは、ネコに由来するＩｇＭ型の免疫グロブリンを意味し、「ヒトＩｇＭ」とは、ヒトに由来するＩｇＭ型の免疫グロブリンを意味するものとする。また、「抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体」とは、哺乳動物由来のＩｇＭを免疫原として得られる抗体を意味するものとする。
本発明の非特異反応抑制剤は、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭに対し、上記所定の吸光度比で示される反応性を示す抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することで、免疫測定法の非特異反応を十分に抑制することができる。本発明の非特異反応抑制剤が免疫測定法の非特異反応を十分に抑制できる理由は明らかではないが、本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭに対し、上記所定の吸光度比で示される反応性を示し、特定のＩｇＭに対して強い反応性を示すものではないことから、ヒト、イヌ、ネコなどの哺乳動物に共通する部分を認識している可能性が高いと考えられる。本発明の非特異反応抑制剤は、そのような抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することで、様々な非特異因子に対して作用し、従来技術では抑制できなかった非特異反応を強く抑制していると推測される。
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下である。吸光度比（Ａ２／Ａ１）が０．１未満の場合、又は１．５を超える場合は、非特異反応を十分に抑制することはできない。吸光度比（Ａ２／Ａ１）の上限として１．０以下であることが好ましい。また、下限として０．５以上であることが好ましい。本発明において吸光度比（Ａ２／Ａ１）は、好ましくは０．５以上１．５以下であり、より好ましくは０．５以上１．０以下である。
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）は、０．５以上である。吸光度比（Ａ３／Ａ１）が０．５未満の場合は、非特異反応を十分に抑制することはできない。吸光度比（Ａ３／Ａ１）の上限として２．５以下であることが好ましく、１．８以下であることがより好ましい。また、下限として１．０以上であることが好ましい。本発明において吸光度比（Ａ３／Ａ１）は、好ましくは０．５以上２．５以下であり、より好ましくは０．５以上１．８以下であり、さらに好ましくは１．０以上１．８以下である。
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、ＥＬＩＳＡ試験において、吸光度比（Ａ２／Ａ１）が０．５以上１．５以下、かつ、吸光度比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上２．５以下であることが好ましく、吸光度比（Ａ２／Ａ１）が０．５以上１．５以下、かつ、吸光度比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上１．８以下であることがより好ましく、吸光度比（Ａ２／Ａ１）が０．５以上１．０以下、かつ、吸光度比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上１．８以下であることがさらに好ましく、吸光度比（Ａ２／Ａ１）が０．５以上１．０以下、かつ、吸光度比（Ａ３／Ａ１）が１．０以上１．８以下であることが特に好ましい。
本発明において、上記吸光度Ａ１〜Ａ３を測定するためのＥＬＩＳＡ試験の測定条件は、吸光度Ａ１〜Ａ３の測定間で統一されていればよく、特に限定されるものではない。吸光度Ａ１〜Ａ３は、ＥＬＩＳＡ試験において、抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体と、ヒトＩｇＭ、イヌＩｇＭ、又はネコＩｇＭとを反応させた場合に測定される吸光度から、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体を入れて、発色反応を行ったウェル）で測定される吸光度を引いた値をいうものとする。
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、ヒトＩｇＭ、イヌＩｇＭ、及びネコＩｇＭに対して上記所定の反応性を示す抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体であれば特に限定されない。そのような抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体としては、例えば、ヒトＩｇＭを免疫原として得られる抗体（抗ヒトＩｇＭ抗体と表記できる）であってもよいし、イヌＩｇＭを免疫原として得られる抗体（抗イヌＩｇＭ抗体と表記できる）であってもよいし、ネコＩｇＭを免疫原として得られる抗体（抗ネコＩｇＭ抗体と表記できる）であってもよいし、あるいは、上記以外の哺乳動物種由来ＩｇＭを免疫原として得られる抗体であってもよい。抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体、または抗ネコＩｇＭ抗体であることが好ましい。また、本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体のクラス（アイソタイプ）も特に限定されるものではないが、反応の特異性や取扱いの容易さの観点から、ＩｇＧ型であることが好ましい。
さらに、本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、市販のものであってもよいし、必要に応じて、以下のように作製したものであってもよい。
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体がモノクローナル抗体の場合は、常法に従って、上記免疫原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得することができる（例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照）。上記免疫原の入手方法は特に限定されず、例えば市販のものを使用できる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の上記免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。
このハイブリドーマは、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、このハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、単離および／または精製されることが好ましい。
本出願人は、本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体のうち、後述する実施例に示す方法により得られたハイブリドーマ（Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＭ Ｎｏ．１２）を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。以下に寄託を特定する内容を記載する。
本出願人は、上記ハイブリドーマ（Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＭ Ｎｏ．１２）を下記の条件で寄託した。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室 電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５５６
（４）識別のための表示：Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＭ Ｎｏ．１２
（５）原寄託日：２０１７年１０月１０日
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室 電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５５６
（４）識別のための表示：Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＭ Ｎｏ．１２
（５）原寄託日：２０１７年１０月１０日
本発明に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体がポリクローナル抗体の場合は、常法に従って、上記免疫原を産生動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等）に免疫して得られた抗血清中から、目的とする抗体を分離することにより得ることができる。上記免疫原の入手方法は特に限定されず、例えば市販のものを使用できる。
抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有する非特異反応抑制剤は、抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体のみからなるものであってもよく、本発明の効果を妨げない範囲で、抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体以外の他の成分を含有するものであってもよい。また、本発明の非特異反応抑制剤に用いられる抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用することもできる。他の成分としては、例えば、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等の緩衝剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩等が挙げられる。
本発明の非特異反応抑制剤の形態は、特に限定されるものではなく、固体であってもよく、液体であってもよい。液体の場合は、溶媒中に非特異反応抑制剤が含有する成分を溶解又は懸濁させることで調製することができる。溶媒としては、例えば、水、グリセロール等の有機溶媒、これらの混合溶媒等が挙げられる。
本発明の非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、特に限定されるものではなく、検体の種類、検体の量、免疫測定法の測定条件等に基づいて適宜調整することができる。例えば、１検体あたりに使用する非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、０．５μｇ以上２０μｇ以下が好ましく、１μｇ以上１５μｇ以下がより好ましく、２μｇ以上１０μｇ以下がさらに好ましい。
本発明の非特異反応抑制剤を適用できる免疫測定法としては、免疫反応を利用して、検体中の被検出物質を測定する方法であれば特に限定されず、その効果を発揮することができる。例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である。本発明の非特異反応抑制剤は、検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。
次に、本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップについて説明する。本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップは、上述の非特異反応抑制剤を含有する。
本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップは、イムノクロマトグラフ法を利用して、例えば、被検出物質の有無を判定したり、被検出物質の濃度を測定したりするために使用することができる。
本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップは、上述の非特異反応抑制剤を含有すること以外は特に限定されるものではなく、公知のイムノクロマトグラフ用テストストリップと同様の構成とすることができる。本発明においては、非特異反応抑制剤は、イムノクロマトグラフ用テストストリップを構成する部材のうち、検体を含む液相が毛細管現象によって展開する部材の中に免疫反応に関与し得る態様で含まれていればよい。このようにすることで、非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うことができ、非特異反応を抑制できる。
以下、本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態を図面に基づいて説明するが、本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップは以下の実施形態に限定されるものではない。
図１に示す本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態は、サンプルパッド１と、コンジュゲートパッド２と、メンブレンパッド３と、吸収パッド５と、バッキングシート６とを備える。
サンプルパッド１は、検体を含む試料を添加し、毛細管現象によって試料を下流へ移動させるために設けられている部材である。サンプルパッド１の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、サンプルパッド１の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。サンプルパッド１には、後述のコンジュゲートパッドの機能を持たせることもできる。
コンジュゲートパッド２は、検体中の被検出物質と特異的に反応する抗体又は抗原を標識物質で標識した標識試薬を含有する部材である。検体を含む試料がコンジュゲートパッド２を通過すると、被検出物質と標識試薬との複合体が形成される。コンジュゲートパッド２の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、コンジュゲートパッド２の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
標識物質としては、特に限定されるものではなく、例えば、金、銀、白金等の金属ナノ粒子、ラテックス粒子等の公知のものを使用することができる。金属ナノ粒子の平均粒径は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ〜１００ｎｍである。また、ラテックス粒子の平均粒径は、特に限定されるものではないが、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ〜２５０ｎｍである。検体中の被検出物質の有無を目視で判定できることから、標識物質は、金ナノ粒子であることが好ましい。
標識試薬中の抗体又は抗原は、検体中の被検出物質と特異的に結合することができるものであれば市販されている抗体又は抗原を使用することができ、必要に応じて作製したものを使用することができる。被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体は、例えば被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。動物種の具体例としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。
標識試薬中の抗体又は抗原の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストストリップあたり、好ましくは０．０１μｇ以上１０μｇ以下、より好ましくは０．０２μｇ以上５μｇ以下、さらに好ましくは０．０２μｇ以上１μｇ以下である。
メンブレンパッド３は、被検出物質を検出することにより、被検出物質の有無等を判定したり、被検出物質の濃度を測定したりするための検出部４を有する部材である。検出部４には、被検出物質を捕捉するための抗体又は抗原を含む捕捉試薬が固定されている。検出部４では、検体中に被検出物質が含まれると、標識試薬、被検出物質及び捕捉試薬からなる複合体が形成されて発色し、検体中に被検出物質が含まれないと、標識試薬、被検出物質及び捕捉試薬からなる複合体が形成されないため発色しない。
メンブレンパッド３の材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、メンブレンパッド３の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原は、上記標識試薬に含有される抗体又は抗原と同一の抗体又は抗原であってもよく、異なる抗体又は抗原であってもよい。
捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原は、検体中の被検出物質と特異的に結合することができるものであれば市販されている抗体又は抗原を使用することができ、必要に応じて作製したものを使用することができる。被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体は、被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。動物種の具体例としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。
捕捉試薬に用いられる抗体又は抗原の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストストリップあたり、好ましくは０．１μｇ以上１０μｇ以下、より好ましくは０．２μｇ以上５μｇ以下、さらに好ましくは０．２μｇ以上４μｇ以下である。
検出部の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば、線状、円状等が挙げられる。視認性、検出効率の観点から、線状が好ましい。
メンブレンパッド３は、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、及びゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、及びＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
吸収パッド５は、メンブレンパッド３を通過した余剰の試料等を吸収する部材である。吸収パッドの材料としては、公知の材料を用いることができ、例えば、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、及びアルミナ等のセラミック微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、綿等が挙げられる。また、吸収パッド５の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
バッキングシート６は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレンパッド３、吸収パッド５等の各部材を固定する支持体として用いられる部材である。バッキングシートの材料としては、特に限定されるものではなく、例えば、粘着剤によって試料に対して不透過性、非透湿性となるような、従来公知の種々の材料を用いることができる。また、バッキングシート６の大きさ、形状は特に限定されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップの一実施形態においては、非特異反応抑制剤は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２及びメンブレンパッド３のうち少なくとも１つに含有されている。
本発明のイムノクロマトグラフ用テストストリップに含まれる非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストストリップあたり、好ましくは０．５μｇ以上２０μｇ以下、より好ましくは１μｇ以上１５μｇ以下、さらに好ましくは２μｇ以上１０μｇ以下である。上記範囲であることによって、非特異反応を強く抑制できる。
次に、本発明のイムノクロマトグラフ用テストキットについて説明する。
本発明においてテストキットとは、免疫測定に必要な試薬等の２以上の物品を備えるキットをいう。本発明のイムノクロマトグラフ用テストキットは、上述の非特異反応抑制剤を含むこと以外は特に限定されるものではなく、公知のイムノクロマトグラフ用テストキットと同様の構成とすることができる。
本発明においては、非特異反応抑制剤は、免疫反応に関与し得る態様でイムノクロマトグラフ用テストキットに含まれていればよい。例えば、非特異反応抑制剤は、試薬として独立して含有されていてもよく、免疫測定に用いる検体希釈液等の試薬、テストストリップ等に予め含有されていてもよい。
本発明の一実施形態においては、イムノクロマトグラフ用テストキットは、テストストリップに加えて、免疫測定に必要な試薬を備える。テストストリップとしては、特に限定されるものではなく、例えば、上述のサンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレンパッド、吸収パッド、バッキングシート等から構成されるものを使用することができる。免疫測定に必要な試薬としては、特に限定されるものではないが、例えば、検体希釈液、展開液等が挙げられる。
本発明の一実施形態においては、テストストリップ、試薬の少なくとも１つに非特異反応抑制剤が含有される。より具体的には、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレンパッド、試薬の少なくとも１つに非特異反応抑制剤が含有される。このようにすることで、非特異反応抑制剤の存在下で抗原抗体反応を行うことができ、非特異反応を抑制することができる。
本発明のイムノクロマトグラフ用テストキットに含まれる非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、特に限定されるものではないが、１テストキットあたり、好ましくは０．５μｇ以上２０μｇ以下、より好ましくは１μｇ以上１５μｇ以下、さらに好ましくは２μｇ以上１０μｇ以下である。上記範囲であることによって、溶液の粘度を増加させることなく非特異反応を効率的に抑制することができる。
次に、本発明の免疫測定法について説明する。
本発明の免疫測定法は、上述の非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うものである。本発明の免疫測定法は、非特異反応抑制剤の存在下で免疫反応を行うことにより、本来の目的とする免疫反応以外の非特異反応を抑制することができる。
本発明の免疫測定法としては、免疫反応を利用して、検体中の被検出物質を定量的若しくは定性的に測定する方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、凝集法、イムノクロマトグラフ法、放射免疫測定法、比濁法等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である。本発明の免疫測定法は、検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。
本発明の免疫測定法に用いられる検体としては、特に限定されるものではなく、例えば、血清、血漿、全血、尿、唾液、鼻汁等が挙げられる。代表的には、ヒト由来の検体である。
本発明の免疫測定法において測定することができる被検出物質としては、例えば、検体中に含まれるウイルス、細菌、寄生虫、代謝物等が挙げられ、より具体的にはそれらが有するタンパク質、ペプチド、多糖類、及び複合糖質等を挙げることができる。特に、検体中に微量に含まれる抗原が好適である。なぜなら、検体中に含まれる抗原の濃度が微量である程、相対的に非特異的反応の影響が大きくなるので、本発明の非特異反応抑制剤が有用となるからである。
本発明における免疫反応は、非特異反応抑制剤の存在下で行うものであれば特に限定されるものではなく、常法にしたがって行うことができる。例えば、免疫反応を行う前に予め検体と非特異反応抑制剤とを接触させ、続いて検体中の被検出物質に結合し得る抗体又は抗原と接触させて免疫反応を行うことができる。また、免疫反応を行う前に予め検体中の被検出物質に結合し得る抗体又は抗原と非特異反応抑制剤とを接触させ、続いて検体と接触させて免疫反応を行うことができる。
本発明に用いられる非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、特に限定されるものではなく、検体の種類、検体の量、免疫測定法の測定条件等に基づいて適宜調整することができる。例えば、１検体あたりに使用する非特異反応抑制剤中の抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量は、０．５μｇ以上２０μｇ以下が好ましく、１μｇ以上１５μｇ以下がより好ましく、２μｇ以上１０μｇ以下がさらに好ましい。
本発明の免疫測定法がイムノクロマトグラフ法である場合には、例えば、抗原を含む検体に予め非特異反応抑制剤を添加して得られた試料を固相に添加し、固相中で免疫複合体を形成することで抗原を検出することができる。また、予め非特異反応抑制剤を添加したサンプルパッド、コンジュゲートパッド等の固相に抗原を含む検体を展開し、固相中で免疫複合体を形成することで抗原を検出することができる。
本発明の免疫測定法が酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）である場合には、例えば、抗原を含む検体に予め非特異抑制剤を添加し、その後、常法にしたがって抗原抗体反応を行うことで抗原の濃度を測定することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
［抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体］
抗イヌＩｇＭ抗体及び抗ネコＩｇＭ抗体を下記の通り作製した。なお、抗ヒトＩｇＭ抗体は市販のものを使用した。
抗イヌＩｇＭ抗体及び抗ネコＩｇＭ抗体を下記の通り作製した。なお、抗ヒトＩｇＭ抗体は市販のものを使用した。
［抗イヌＩｇＭ抗体］
イヌＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＤＯＧ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を免疫原として抗イヌＩｇＭ抗体のモノクローナル抗体を、次のように常法に従って作製した。１００μｇの上記イヌＩｇＭと等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ−グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。
イヌＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＤＯＧ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を免疫原として抗イヌＩｇＭ抗体のモノクローナル抗体を、次のように常法に従って作製した。１００μｇの上記イヌＩｇＭと等量のＡｄｕｖａｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ−グルタミン ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。
クローニングした細胞は、２，６，１０，１４−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。得られた抗体のうち、５種のモノクローナル抗体（Ｎｏ．１２、３２、７０、７５、８０）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。このうち、Ｎｏ．１２の抗イヌＩｇＭ抗体は、上述した受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０２５５６のハイブリドーマにより産生される、イヌＩｇＭに対するモノクローナル抗体である。
［抗ネコＩｇＭ抗体］
イヌＩｇＭの代わりに、ネコＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＣＡＴ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１００μｇを免疫原としたことを除いては、上記抗イヌＩｇＭ抗体と同様の方法で抗ネコＩｇＭ抗体を作製した。得られた抗体のうち、２種のモノクローナル抗体（Ｎｏ．１、７）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。
イヌＩｇＭの代わりに、ネコＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＣＡＴ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１００μｇを免疫原としたことを除いては、上記抗イヌＩｇＭ抗体と同様の方法で抗ネコＩｇＭ抗体を作製した。得られた抗体のうち、２種のモノクローナル抗体（Ｎｏ．１、７）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。
［抗ヒトＩｇＭ抗体］
抗ヒトＩｇＭ抗体としては、市販品（ＸＥＭＡ社製、製品名：Ｘ６１１、Ｘ６１２、Ｘ６１３）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。
抗ヒトＩｇＭ抗体としては、市販品（ＸＥＭＡ社製、製品名：Ｘ６１１、Ｘ６１２、Ｘ６１３）を後述する試験に用いた。これらのアイソタイプはＩｇＧ型であった。
（試験例１）
試験例１では、上記各種抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体（抗イヌＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、及び抗ネコＩｇＭ抗体）それぞれについて、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭそれぞれに対する反応性を、以下のＥＬＩＳＡ試験により測定した。
試験例１では、上記各種抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体（抗イヌＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、及び抗ネコＩｇＭ抗体）それぞれについて、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭそれぞれに対する反応性を、以下のＥＬＩＳＡ試験により測定した。
［実施例１］
抗イヌＩｇＭ抗体（Ｎｏ．１２）について、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭそれぞれに対する反応性を以下のＥＬＩＳＡ試験により測定した。
抗イヌＩｇＭ抗体（Ｎｏ．１２）について、イヌＩｇＭ、ネコＩｇＭ及びヒトＩｇＭそれぞれに対する反応性を以下のＥＬＩＳＡ試験により測定した。
［ＥＬＩＳＡ試験］
まず、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、イヌＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＤＯＧ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ネコＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＣＡＴ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）またはヒトＩｇＭ（オリエンタル酵母社製、製品名ヒトＩｇＭ）を４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファー ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
まず、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、イヌＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＤＯＧ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ネコＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、製品名ＣＡＴ ＩｇＭ Ｗｈｏｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）またはヒトＩｇＭ（オリエンタル酵母社製、製品名ヒトＩｇＭ）を４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファー ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
一次抗体として、上記作製した抗イヌＩｇＭ抗体（Ｎｏ．１２）５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ブロッキング溶液（一次抗体溶液）１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
また、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体を入れて、発色反応を行ったウェル）で測定された吸光度を測定し、上記測定した吸光度から引いた値を吸光度Ａ１〜Ａ３とした。その結果を表１に示す。
また、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体を入れて、発色反応を行ったウェル）で測定された吸光度を測定し、上記測定した吸光度から引いた値を吸光度Ａ１〜Ａ３とした。その結果を表１に示す。
［実施例２、３］
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．３２、Ｎｏ．７５に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．３２、Ｎｏ．７５に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
［実施例４〜６］
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記市販の抗ヒトＩｇＭ抗体Ｘ６１１〜Ｘ６１３（ＸＥＭＡ社製）に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記市販の抗ヒトＩｇＭ抗体Ｘ６１１〜Ｘ６１３（ＸＥＭＡ社製）に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
［比較例１、２］
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．７０、Ｎｏ．８０に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．７０、Ｎｏ．８０に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を表１に示す。
［比較例３、４］
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗ネコＩｇＭ抗体Ｎｏ．１、Ｎｏ．７に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を下記表１に示す。
一次抗体としての抗イヌＩｇＭ抗体Ｎｏ．１２を、上記作製した抗ネコＩｇＭ抗体Ｎｏ．１、Ｎｏ．７に変更した点を除いては、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ試験を行った。その結果を下記表１に示す。
（試験例２）
試験例２では、検体として、非特異反応を示すヒト血清を用い、試験例１でイヌＩｇＭネコＩｇＭ、及びヒトＩｇＭに対する反応性を調べた実施例および比較例の抗ＩｇＭ抗体、及び、従来公知の異好性阻止試薬ＨＢＲによる免疫測定法の非特異反応抑制効果を評価した。
具体的には、図１に示すように、バッキングシート６上に、検出部４を有するメンブレンパッド３と、サンプルパッド１と、コンジュゲートパッド２と、吸収パッド５とを形成したテストストリップ、及び展開試料を以下のとおり作製し、イムノクロマトグラフ法により測定を行い、非特異反応抑制効果を評価した。
試験例２では、検体として、非特異反応を示すヒト血清を用い、試験例１でイヌＩｇＭネコＩｇＭ、及びヒトＩｇＭに対する反応性を調べた実施例および比較例の抗ＩｇＭ抗体、及び、従来公知の異好性阻止試薬ＨＢＲによる免疫測定法の非特異反応抑制効果を評価した。
具体的には、図１に示すように、バッキングシート６上に、検出部４を有するメンブレンパッド３と、サンプルパッド１と、コンジュゲートパッド２と、吸収パッド５とを形成したテストストリップ、及び展開試料を以下のとおり作製し、イムノクロマトグラフ法により測定を行い、非特異反応抑制効果を評価した。
（１）サンプルパッドの作製
サンプルパッドとして、グラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）コンジュゲートパッドの作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ−Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓＮＳ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識試薬を作製した。
上記作製した標識試薬３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。
サンプルパッドとして、グラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）コンジュゲートパッドの作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ−Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓＮＳ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識試薬を作製した。
上記作製した標識試薬３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。
（３）検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ−Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓＮＳ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させた。
（４）テストストリップの作製
検出部を有するメンブレンパッドに、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、及びグラスファイバー製の不織布からなる吸収パッドを順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、バッキングシート（倉本産業社製、製品名イムノクロマト用バッキングシート）上に貼り付け、テストストリップとした。なお、コンジュゲートパッドの試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
（５）展開試料の調製
非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を検体とし、検体３０μＬ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ溶液６０μＬ、及び試験例１で用いた実施例１〜６、比較例１〜４の抗ＩｇＭ抗体各４μｇ、あるいはＨＢＲ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｙ社製）４μｇを混合し、展開試料を調製した。また、抗ＩｇＭ抗体の代わりにＰＢＳ１０μＬを使用したものをコントロールとした。
（６）測定
上記作製したテストストリップ及び展開試料を用いて、以下の方法で非特異反応抑制効果を試験した。
展開試料１５０μＬをテストストリップのサンプルパッドに添加し展開させ、１５分後にイムノクロマトリーダーを用いて、検出部の発色強度（４５０ｎｍの吸光度）を測定した。その結果を表２及び図２に示す。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、抗ジカウイルスＮＳ１抗体（Ａａｌｔｏｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製、製品名Ａｎｔｉ−Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓＮＳ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させた。
（４）テストストリップの作製
検出部を有するメンブレンパッドに、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、及びグラスファイバー製の不織布からなる吸収パッドを順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、バッキングシート（倉本産業社製、製品名イムノクロマト用バッキングシート）上に貼り付け、テストストリップとした。なお、コンジュゲートパッドの試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
（５）展開試料の調製
非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を検体とし、検体３０μＬ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ溶液６０μＬ、及び試験例１で用いた実施例１〜６、比較例１〜４の抗ＩｇＭ抗体各４μｇ、あるいはＨＢＲ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｙ社製）４μｇを混合し、展開試料を調製した。また、抗ＩｇＭ抗体の代わりにＰＢＳ１０μＬを使用したものをコントロールとした。
（６）測定
上記作製したテストストリップ及び展開試料を用いて、以下の方法で非特異反応抑制効果を試験した。
展開試料１５０μＬをテストストリップのサンプルパッドに添加し展開させ、１５分後にイムノクロマトリーダーを用いて、検出部の発色強度（４５０ｎｍの吸光度）を測定した。その結果を表２及び図２に示す。
コントロールの結果からもわかるように、検体として使用したヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）は、非特異反応が生じる検体であることがわかる。そして、本発明における抗体を用いた実施例では、従来公知の異好性阻止試薬ＨＢＲと比較しても顕著に非特異反応を抑制できた。
（試験例３）
本試験では、試験例２と同様に、検体として非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を用い、抗ヒトＩｇＧ抗体の各種クローンの非特異反応抑制効果を評価した。
本試験では、試験例２と同様に、検体として非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を用い、抗ヒトＩｇＧ抗体の各種クローンの非特異反応抑制効果を評価した。
試験例２において、各抗ＩｇＭ抗体の代わりに抗ヒトＩｇＧ抗体の各種クローン（ＸＥＭＡ社製、製品名ＸＡ６、ＸＧ１、ＸＧ３、ＸＧ４、ＸＧ６〜９）を使用したことを除いては、試験例２と同様にしてテストストリップ及び展開試料を作成し、測定を行った。その結果を表３及び図３に示す。
以上の結果からわかるように、抗ヒトＩｇＧ抗体の各種クローンを用いても、非特異反応を抑制する効果は得られなかった。
（試験例４）
本試験では、試験例２と同様に、検体として非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を用い、各動物種（マウス、ウサギ、ヤギ、及びトリ）のＩｇＧまたはＩｇＹの非特異反応抑制効果を評価した。
本試験では、試験例２と同様に、検体として非特異反応を示すヒト血清（ＳＣＩＰＡＣ社製、製品名Ｎｏｒｍａｌ Ｆｅｍａｌｅ Ｓｅｒｕｍ）を用い、各動物種（マウス、ウサギ、ヤギ、及びトリ）のＩｇＧまたはＩｇＹの非特異反応抑制効果を評価した。
試験例２において、展開試料に使用する各抗ＩｇＭ抗体の代わりに、下記各動物種（マウス、ウサギ、ヤギ、及びトリ）のＩｇＧまたはＩｇＹを使用したことを除いては、試験例２と同様にしてテストストリップ及び展開試料を作成し、測定を行った。その結果を表４及び図４に示す。・マウスＩｇＧ（日本バイオテスト社製、製品名：精製マウスＩｇＧ）・ウサギＩｇＧ（日本バイオテスト社製、製品名：精製ウサギＩｇＧ）・ヤギＩｇＧ（日本バイオテスト社製、製品名：精製ヤギＩｇＧ）・トリＩｇＹ（日本バイオテスト社製、製品名：精製トリＩｇＹ）
以上の結果からわかるように、各動物種（マウス、ウサギ、ヤギ、トリ）由来のＩｇＧまたはＩｇＹを用いても、非特異反応を抑制する効果は得られなかった。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１７年５月２日付で出願された日本特許出願（特願２０１７−０９１８５８）に基づいており、その全体が引用により援用される。
１ サンプルパッド
２ コンジュゲートパッド
３ メンブレンパッド
４ 検出部
５ 吸収パッド
６ バッキングシート
２ コンジュゲートパッド
３ メンブレンパッド
４ 検出部
５ 吸収パッド
６ バッキングシート
Claims (10)
- ＥＬＩＳＡ試験において、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するネコＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ２の比（Ａ２／Ａ１）が０．１以上１．５以下であり、かつ、イヌＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ１に対するヒトＩｇＭと反応させたときの吸光度Ａ３の比（Ａ３／Ａ１）が０．５以上である抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体を含有することを特徴とする免疫測定法用の非特異反応抑制剤。
- 前記Ａ３／Ａ１が、２．５以下である、請求項１に記載の非特異反応抑制剤。
- 前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体が、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体又は抗ネコＩｇＭ抗体である、請求項１又は２に記載の非特異反応抑制剤。
- 前記抗哺乳動物由来ＩｇＭ抗体の含有量が０．５μｇ以上２０μｇ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤。
- 前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項１〜４のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストストリップ。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤を含有する、イムノクロマトグラフ用テストキット。
- 検体中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせる、免疫測定法。
- 前記免疫測定法が、酵素免疫測定法、凝集法又はイムノクロマトグラフ法である請求項８に記載の免疫測定法。
- 前記免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項８に記載の免疫測定法。
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| WO2010026758A1 (ja) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
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2018
- 2018-05-02 WO PCT/JP2018/017551 patent/WO2018203572A1/ja active Application Filing
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Patent Citations (5)
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