JPWO2018186420A1 - 間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、間葉系幹細胞及び医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することである。本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、が提供される。

Description

本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。さらに本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞集団、間葉系幹細胞、並びに医薬組成物に関する。

間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）ともよばれる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。間葉系幹細胞は、骨、軟骨及び脂肪などに分化する能力を有するため、再生医療における有望な細胞ソースとして注目されている。

また、間葉系幹細胞は、分化能だけでなく免疫抑制能を有するため、経静脈的に投与することにより免疫関連疾患や炎症性疾患等の治療が可能であることが報告されている。

特許文献１には、羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤について記載されている。特に、ジメチルスルホキシドを５〜１０質量％含有し、ヒドロキシルエチルデンプンを５〜１０質量％又はデキストランを１〜５質量％含有する溶液中に羊膜間葉系細胞を含む混合物を凍結保存することによって、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることが記載されている。

特許文献２には、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００〜３５０００／ｃｍ^２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法が記載されている。

特開２０１５−６１５２０号公報 国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報

近年、胎児付属物に由来する間葉系幹細胞には、分化能や増殖能、サイトカイン産生能が異なる様々な細胞を含むヘテロな細胞集団であることが分かってきた。安定した品質の細胞製剤を製造するために、純化された均一性の高い細胞集団を調製する必要がある。

特許文献１には、羊膜間葉系細胞を含む混合物を、特定の凍結保存液にて凍結保存することにより、解凍後の羊膜間葉系細胞の生存率減少を抑制し、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることは記載されている。しかしながら、間葉系幹細胞の中から特定の優れた特徴を有する間葉系幹細胞を選択的に調製すること、具体的には、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を、間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについては、一切記載されていない。また、特許文献２には、低密度で細胞を播種することによって、高い増殖能と分化能を有する間葉系幹細胞集団を調製しているものの、間葉系幹細胞集団に含まれる間葉系幹細胞の特性を指標として、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を選択することについては記載も示唆もない。

本発明は、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団において、ＣＤ９７及びＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞が含まれていることを見出し、さらに、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、細胞集団においては、免疫抑制関連サイトカインをコードする遺伝子（ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子及びＣＣＬ２遺伝子）を高発現することから高い免疫抑制作用を示すことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。
［２］ 間葉系幹細胞の細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。
［３］ 前記間葉系幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、［２］に記載の細胞集団。
［４］ ＣＤ９７及びＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞。
［５］ ［２］又は［３］に記載の細胞集団あるいは［４］に記載の間葉系幹細胞と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［６］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０^９個／ｋｇ体重以下である、［５］に記載の医薬組成物。
［７］ 前記医薬組成物が、注射用製剤である、［５］又は［６］に記載の医薬組成物。
［８］ 前記医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［５］又は［６］に記載の医薬組成物。
［９］ 免疫関連疾患の治療剤である、［５］から［８］の何れか一に記載の医薬組成物。

［１０］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＧＦＢ２遺伝子の相対発現量が１．５以上であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量が０．２以上であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＩＬ１Ａ遺伝子の相対発現量が０．２以上であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＩＬ１Ｂ遺伝子の相対発現量が１．３以上であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＣＬ２遺伝子の相対発現量が１．０以上であることの何れか一以上を満たす、［２］又は［３］に記載の細胞集団。
［１１］ ［１］に記載の製造方法により得られる、細胞集団。
［１２］ 医薬組成物の製造のための、［２］又は［３］に記載の細胞集団あるいは［４］に記載の間葉系幹細胞の使用。
［１３］ 医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０^９個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［１２］に記載の使用。
［１４］ 医薬組成物が、注射用製剤である、［１２］又は［１３］に記載の使用。
［１５］ 医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［１２］又は［１３］に記載の使用。
［１６］ 医薬組成物が、免疫関連疾患の治療剤である、［１２］から［１５］の何れか一に記載の使用。
［１７］ 疾患の治療において使用するための、［２］又は［３］に記載の細胞集団あるいは［４］に記載の間葉系幹細胞。
［１８］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０^９個／ｋｇ体重以下である、［１７］に記載の細胞集団あるいは間葉系幹細胞。
［１９］ 注射用製剤である、［１７］又は［１８］に記載の細胞集団あるいは間葉系幹細胞。
［２０］ 細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［１７］又は［１８］に記載の細胞集団あるいは間葉系幹細胞。
［２１］ 疾患が、免疫関連疾患である、［１７］から［２０］の何れか一に記載の細胞集団あるいは間葉系幹細胞。
［２２］ ［２］又は［３］に記載の細胞集団あるいは［４］に記載の間葉系幹細胞を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
［２３］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０^９個／ｋｇ体重以下である、［２２］に記載の疾患の治療方法。
［２４］ 注射用製剤である、［２２］又は［２３］に記載の疾患の治療方法。
［２５］ 細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［２２］又は［２３］に記載の疾患の治療方法。
［２６］ 疾患が、免疫関連疾患である、［２２］から［２５］の何れか一に記載の疾患の治療方法。
［２７］ ［２］又は［３］に記載の細胞集団あるいは［４］に記載の間葉系幹細胞と、媒体とを含む、組成物。

本発明によれば、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を調製できる。また、本発明によれば、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標として、表面抗原の陽性率と各種遺伝子のハウスキーピング遺伝子に対する相対発現量を使用することができる。これにより、細胞製剤（医薬組成物）を製造することができる。

実施例１で培養した羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ９７に対して陽性となる細胞の比率を測定した結果を示す。 比較例１で培養した羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ９７に対して陽性となる細胞の比率を測定した結果を示す。 実施例１で培養した羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３５８に対して陽性となる細胞の比率を測定した結果を示す。 比較例１で培養した羊膜ＭＳＣに関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３５８に対して陽性となる細胞の比率を測定した結果を示す。

以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。

［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。

本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。

間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性。

本明細書における「間葉系幹細胞集団」は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を意味し、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。

本明細書における「羊膜間葉系幹細胞」は、羊膜に由来する間葉系幹細胞を指し、「羊膜間葉系間質細胞」と区別なく用いられる。本明細書において、「羊膜間葉系幹細胞」は「羊膜ＭＳＣ」と記載されることがある。

本明細書における「免疫抑制作用」とは、生体内における免疫系の応答を抑制する作用のことをいう。免疫抑制作用は、ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子又はＣＣＬ２遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量により評価することができ、その評価方法は、後述の実施例にて記載されるマイクロアレイ解析により実施することができる。

本明細書における「ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した上記表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、「ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率」は「陽性率」と記載されることがある。

［２］間葉系幹細胞を含む細胞集団
本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、
ことを特徴とする。

ＣＤ９７は、分化クラスター９７を意味し、ＡＤＧＲＥ５（Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ５）遺伝子によってコードされるＢＬ−Ａｃ［Ｆ２］としても知られているタンパク質である。
ＣＤ３５８は、分化クラスター３５８を意味し、ＴＮＦＲＳＦ２１（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ ２１）遺伝子によってコードされるタンパク質である。

本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、という条件を満たすと、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を、高い免疫抑制作用を示す細胞集団形成の指標とすることができる。

細胞集団においてＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、３１％以上、３２％以上、３３％以上、３４％以上、３５％以上、３６％以上、３７％以上、３８％以上、３９％以上、４０％以上、４１％以上、４２％以上、４３％以上、４４％以上、４５％以上、４６％以上、４７％以上、４８％以上、４９％以上、５０％以上、５１％以上、５２％以上、５３％以上、５４％以上、５５％以上、５６％以上、５７％以上、５８％以上、５９％以上、又は６０％以以上でもよい。

「ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む」とは、細胞集団において、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞が存在していればよく、その比率は５％以上であれば特に限定されず、例えば、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上でもよい。

表面抗原マーカー（ＣＤ９７、ＣＤ３５８）は、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。表面抗原マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。

表面抗原マーカー（ＣＤ９７、ＣＤ３５８）に対して陽性である細胞の比率（陽性率）は、具体的には、フローサイトメトリーのドットプロット展開解析を用いて、以下の手順（１）〜（８）にて測定することができる。
（１）対象となる細胞が接着細胞の場合、プラスチック製培養容器から、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。対象となる細胞が非接着細胞の場合、遠心分離により細胞を回収する。
（２）４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１．０×１０^６個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液を１００μＬずつ分注する。
（３）分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬずつ添加する。次いで、各表面抗原マーカーに対応する抗体、又はそのアイソタイプコントロール用抗体を添加する。なお、表面抗原マーカーであるＣＤ３５８を解析する場合は、次いで２次抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加する。各反応液をＶｏｌｔｅｘにて混和した後、４℃にて２０分間静置する。
（４）０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて細胞を懸濁し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過する。
（５）フィルターろ過により得られた細胞懸濁液を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ^ＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・ディッキンソン社）にてＡＬＬ Ｅｖｅｎｔ １００００で解析する。
（６）測定結果を、縦軸にＳＳＣ（側方散乱光）（数値範囲：０以上１６７７７２１５以下）、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度（数値範囲：１０^１以上１０^７．２以下）としたドットプロットで展開する。
（７）ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となる全ての領域（ゲート）を選択する。
（８）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（７）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出する。

上記した表面抗原マーカーを検出するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬品組成物として製剤化する前などが挙げられる。

免疫抑制作用は、ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子又はＣＣＬ２遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量により評価することができる。免疫抑制作用は、後述の実施例にて記載されるマイクロアレイ解析により、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する上記の各遺伝子の相対発現量として評価してもよい。
ＳＤＨＡ（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：６３８９として登録されている。
ＴＧＦＢ２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂｅｔａ ２）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：７０４２として登録されている。
ＴＮＦＡＩＰ６（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ６）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：７１３０として登録されている。

ＩＬ１Ａ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １，ａｌｐｈａ）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：３５５２として登録されている。
ＩＬ１Ｂ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １，ｂｅｔａ）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：３５５３として登録されている。
ＣＣＬ２（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ ２）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：６３４７として登録されている。

ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＧＦＢ２遺伝子の相対発現量は、好ましくは１．５以上であり、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、２．１以上、２．２以上、２．３以上、２．４以上、２．５以上、２．６以上、又は２．７以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量は、好ましくは０．２以上であり、０．３以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＩＬ１Ａ遺伝子の相対発現量は、好ましくは０．２以上であり、０．３以上でもよい。

ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＩＬ１Ｂ遺伝子の相対発現量は、好ましくは１．３以上であり、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、又は１．８以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＣＬ遺伝子の相対発現量は、好ましくは１．０以上であり、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、又は１．７以上でもよい。

上記した遺伝子発現量を測定するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬品組成物として製剤化する前などが挙げられる。

間葉系幹細胞の由来は特に限定されないが、例えば、胎児付属物、骨髄、脂肪、又は歯髄に由来する間葉系幹細胞を使用することができる。間葉系幹細胞は、好ましくは、胎児付属物に由来する間葉系幹細胞であり、より好ましくは、羊膜に由来する間葉系幹細胞である。

本発明の間葉系幹細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の間葉系幹細胞集団は、間葉系幹細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明の細胞集団は、媒体と組み合わせた組成物として提供してもよい。媒体としては、好ましくは液体媒体（例えば、培地、又は後記する製薬上許容し得る媒体など）を使用することができる。

本発明の細胞集団は、任意の数の間葉系幹細胞を含むことができる。本発明の細胞集団は、例えば、１×１０^１個、２×１０^１個、５×１０^１個、１×１０^２個、２×１０^２個、５×１０^２個、１×１０^３個、２×１０^３個、５×１０^３個、１×１０^４個、２×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５個、２×１０^５個、５×１０^５個、１×１０^６個、２×１０^６個、５×１０^６個、１×１０^７個、２×１０^７個、５×１０^７個、１×１０^８個、２×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、２×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個、２×１０^１０個、５×１０^１０個、１×１０^１１個、２×１０^１１個、５×１０^１１個、１×１０^１２個、２×１０^１２個、５×１０^１２個以上又は以下の間葉系幹細胞を含むことができるが、これらに限定されない。

［３］間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む方法である。
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。

即ち、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含むことを維持する条件下において調製する工程を含む方法である。上記の「ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む」という条件は、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標であり、本発明の製造方法は、前記指標を満たせば特に制限されない。

本発明の製造方法は、間葉系幹細胞を含む試料（例えば、羊膜などの胎児付属物など）を酵素処理することにより、間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を含むものでもよい。

羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜ＭＳＣが含まれている。羊膜上皮細胞は、他の上皮細胞同様、特徴として上皮カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＣＤ３２４）及び上皮接着因子（ＥｐＣＡＭ：ＣＤ３２６）を発現しているのに対し、羊膜ＭＳＣはこれら上皮特異的表面抗原マーカーを発現しておらず、フローサイトメトリーで容易に区別可能である。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。

本発明における間葉系幹細胞を含む細胞集団は、好ましくは胎児付属物から採取した上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。

胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。

コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ−ｃｏｌｌａｇｅｎ １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。

金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。

生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を同時一括に処理することが好ましい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系幹細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。

胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。

本発明の製造方法において、所望により、遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した間葉系幹細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系幹細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系幹細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。

メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。

間葉系幹細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。

フィルターを通した間葉系幹細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。

上記の細胞集団取得工程で得られた細胞集団は、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、という条件下において調製する。前記条件は、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。調製方法としては、前記指標を満たすものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、セルソーターにて上記条件を満たす細胞集団を分取することが挙げられる。また、前記指標を満たす他の調製方法としては、細胞集団を、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、という条件下において培養することが挙げられる。

前記指標を満たす培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に４００〜５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは５００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは６００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは７００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは８００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは９００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１１００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１２００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１３００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１４００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１５００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１６００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１７００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１８００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは１９００細胞／ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは２０００細胞／ｃｍ^２以上である。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは４８００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４６００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４４００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４２００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４０００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは３８００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは３６００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは３４００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは３２００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは３０００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは２８００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは２６００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは２４００細胞／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは２２００細胞／ｃｍ^２以下である。

前記指標を満たす他の培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティング剤によりコーティングしたプラスチック製培養容器に４００〜５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度の好ましい条件は、上記した条件と同様である。

コーティング剤としては、例えば、細胞外基質、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンV、コラーゲンVI、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−リジン、マトリゲル（登録商標）マトリックスを挙げることができるが、これらに限定されない。

前記指標を満たすさらに他の培養方法としては、例えば、培養に用いる基礎培地に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加して培養することが挙げられる。塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上である。塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１８ｎｇ／ｍＬ以下であり、１６ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１４ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１２ｎｇ／ｍＬ以下である。塩基性線維芽細胞増殖因子を添加するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養工程の最初、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、又は解凍後などが挙げられる。

上記の１回の培養の培養期間としては、例えば４〜１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。

上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。

基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。

また、上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ ＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｔｅｍｇｒo ヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。

前記基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられる。前記基礎培地にアルブミンを添加する態様においては、アルブミンの濃度は０．０５％より多く５％以下が好ましい。また、前記基礎培地に血清を添加する態様においては、血清の濃度は５％以上が好ましい。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えてさらに添加してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加してもよい。

間葉系幹細胞の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ_２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。

上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ_２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、Ｎ回継代した細胞を取得することができる（Ｎは１以上の整数を示す）。継代回数Ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代回数Ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。

本発明の製造方法によれば、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。培養１バッチあたりの取得細胞数（単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数）の下限は、播種細胞数、播種密度等によって異なるが、例えば、１．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、２．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、３．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、４．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、５．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、６．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、７．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、８．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上、９．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上又は１０．０×１０^５（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以上である。また、培養１バッチあたりの取得細胞数の上限は、特に限定されないが、例えば、１０．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、９．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、８．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、７．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、６．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、５．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、４．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、３．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下、２．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下又は１．０×１０^８（個／ｃｍ^２／ｄａｙ）以下である。

本発明の製造方法によれば、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。これにより、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは４０日以降まで、さらに好ましくは４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、培養することが可能である。

また、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、倍加回数が好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、４０回以上、４５回以上、又は５０回以上になるまで培養することが可能である。

本発明の製造方法は、
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む、という条件を指標として、高い免疫抑制作用を示す間葉系幹細胞を含む細胞集団を識別する識別工程を含むものでもよい。

前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を識別するための手段は、好ましくは、フローサイトメトリーである。

前記細胞集団においてＣＤ９７及びＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率（陽性率）は、フローサイトメトリーのドットプロット展開解析を用いて、段落００２９で述べた手順に従って測定することができる。

上記した識別を行うタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬品組成物として製剤化する前などが挙げられる。

また、本発明の製造方法は、上記（ａ）及び（ｂ）を指標として前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を識別した後に、識別した細胞集団を選択的に分離する工程を含むことができる。前記識別した細胞集団を選択的に分離するための手段は、特に限定されないが、例えば、セルソーターによる細胞集団の分取、培養による細胞集団の純化などが挙げられる。

また、本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。前記細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を識別、分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。

前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下、−１００℃以下、−１１０℃以下、−１２０℃以下、−１３０℃以下、−１４０℃以下、−１５０℃以下、−１６０℃以下、−１７０℃以下、−１８０℃以下、−１９０℃以下、又は−１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、−１℃／分、−２℃／分、−３℃／分、−４℃／分、−５℃／分、−６℃／分、−７℃／分、−８℃／分、−９℃／分、−１０℃／分、−１１℃／分、−１２℃／分、−１３℃／分、−１４℃／分又は−１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、−２℃／分以上−１℃／分以下の凍結速度で−５０℃以上−３０℃以下の間の温度（例えば、−４０℃）まで温度を下げ、さらに−１１℃／分以上−９℃／分以下（例えば、−１０℃／分）の凍結速度で−１００℃以上−８０℃以下の温度（例えば、−９０℃）まで温度を下げることができる。また、かかる凍結手段として液体窒素への浸漬を用いた場合、例えば、−１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で凍結保存することができる。

上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。

上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。かかる凍結保存液として、市販されている凍結保存液を用いても良く、例えば、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＭＳＣ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。

上記の凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上、９質量％以上、１０質量％以上、１１質量％以上又は１２質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）又はデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

上記の凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上又は９質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下、１３質量％以下、１２質量％以下、１１質量％以下又は１０質量％以下である。

上記の凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。

［４］医薬組成物
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。

本発明の医薬組成物は、好ましくは液剤であり、より好ましくは注射用液剤である。
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。

本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。

本発明によれば、免疫関連疾患の治療のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。

本発明によれば、患者又は被験者に投与して、免疫応答の抑制のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。

本発明によれば、患者又は被験者に、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。

本発明によれば、医薬組成物の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。

本発明によれば、免疫関連疾患の治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。

本発明によれば、患者又は被験者に投与して、免疫応答の抑制に必要な治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。

本発明の医薬組成物の投与量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０^４個／ｋｇ体重以上、１０^５個／ｋｇ体重以上又は１０^６個／ｋｇ体重以上である。また、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０^９個／ｋｇ体重以下、１０^８個／ｋｇ体重以下又は１０^７個／ｋｇ体重以下である。

本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。医薬組成物の投与方法については、例えば、特開２０１５−６１５２０号公報、Ｏｎｋｅｎ ＪＥ， ｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００６Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶ， Ａｂｓｔｒａｃｔ １２１．、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ２００５；４８：１４１６−２３．などにおいて、静脈内注射、点滴静脈注射、局所への直接注射、局所への直接移植などが知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている各種方法により投与することができる。

本発明の医薬組成物は、他の疾患治療目的に注射用製剤、或いは細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。

本発明の患者又は被験者とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（カニクイザル、アカゲザル、コモンマーモセット、ニホンザル）、フェレット、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター）等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。本発明の医薬組成物を患者又は被験者に投与する際には、３７℃で急速に解凍して使用することができる。

本発明の医薬組成物は、ヒトの治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

また、本発明の医薬組成物は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤により希釈したものでもよい。本明細書における「輸液製剤（製薬上許容し得る媒体）」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。

本発明の医薬組成物は、保存安定性、無菌性、等張性、吸収性及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。前記増粘剤としては、例えば、ＨＥＳ、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の濃度は、選択される増粘剤によるが、患者又は被験者に投与した場合に安全であり、かつ所望の粘性を達成する濃度の範囲で、任意に設定することができる。

本発明の医薬組成物のｐＨは、中性付近のｐＨ、例えば、ｐＨ６．５以上又はｐＨ７．０以上とすることができ、またｐＨ８．５以下又はｐＨ８．０以下とすることができるが、これらに限定されない。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

＜比較例１＞
（工程１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。

（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
上皮細胞層と細胞外基質層とを含む羊膜を、３００ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。

表面抗原解析は、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）社のＢＤ Ａｃｃｕｒｉ^ＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用い、測定条件は解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｓｌｏｗ（１４μＬ／ｍｉｎ）とした。ＣＤ９０抗原に対応する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５６１９６９）を、そのアイソタイプコントロール用抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：３４９０４１）を使用した。

（工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存）
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、１．０×１０^７個／ｍＬとなるようにバンバンカー（リンフォテック社）に懸濁し、クライオチューブに分注した。クライオチューブをバイセル（凍結処理容器）（日本フリーザー社）に入れ、−８０℃にて１２時間保存の後、液体窒素温度にて凍結保存した。

（工程４：羊膜ＭＳＣの培養）
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞を剥離し、１／４量の細胞を先の培養と同じスケールのコーティングしていないプラスチック製培養容器に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は週２回の頻度で実施した。このようにして継代培養を続けた。

＜実施例１＞
（工程１：羊膜の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナーから、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。

（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
比較例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて比較例１と同様にして、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。

（工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存）
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、比較例１の工程３と同様の手法にて凍結保存した。

（工程４：羊膜ＭＳＣの培養）
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、比較例１の工程４と同様の手法にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。継代培養は、比較例１の工程４と同様の手法にて行った。

＜ＣＤ９７発現の解析＞
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ９７に対して陽性となる細胞の比率を測定した。

本測定では、ＣＤ９７抗原に対応する抗体としてＡｎｔｉ−ＣＤ９７−Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ ＩｇＧ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／型番：１３０−０９７−１０２）、アイソタイプコントロール用抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社／型番：１３０−０９８−８４５）を使用した。

＜ＣＤ３５８発現の解析＞
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いてＣＤ３５８に対して陽性となる細胞の比率を測定した。

本測定では、ＣＤ３５８抗原に対応する１次抗体としてＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ ＨｕｍａｎＣＤ３５８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社／型番：ＭＣＡ２３３３）、アイソタイプコントロール用抗体としてＭｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ ＩｇＧ１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社／型番：ＭＣＡ９２８）、ＣＤ３５８抗原に対応する１次抗体及びそのアイソタイプコントロール用抗体に対応する２次抗体としてＭｏｕｓｅ Ｆ（ａｂ）２ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） ＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社／型番：Ｆ０１０１Ｂ）を使用した。

解析の結果を表１、及び図１〜４に示す。

表１より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＣＤ９７及びＣＤ３５８の陽性率が向上した。比較例１の細胞集団では、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％未満（具体的には２０．６％）であるのに対し、実施例１の細胞集団では、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上（具体的には６０．６％）であった。また、比較例１の細胞集団では、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含まない（具体的には０．０％）であるのに対し、実施例１の細胞集団では、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む（具体的には７．１％）ことが明らかになった。

＜免疫抑制作用の評価＞
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、マイクロアレイ解析により、ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子及びＳＤＨＡ遺伝子の発現を解析した。

以下の手順（１）〜（５）によりマイクロアレイ解析を実施した。なお、以下の手順（３）〜（５）は、株式会社理研ジェネシスに委託して実施した。
（１）比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団を、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。
（２）得られた細胞ペレットにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加してＲＮＡを安定保存した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（３）１００ｎｇのトータルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った（３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用）。
（４）１０．０μｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化した。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて解析した。

各遺伝子の発現レベルを、ＳＤＨＡ遺伝子の発現レベルに対する相対発現量として求めた。結果を下記表に示す。

表２より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子及びＣＣＬ２遺伝子の相対発現量が多いことが分かった。

間葉系幹細胞に基づく治療は、移植片対宿主病、クローン病等の免疫関連疾患に対する有望なアプローチである。間葉系幹細胞の抗炎症性及び／又は免疫抑制能は、間葉系幹細胞が産生するＴＧＦＢ２、ＴＮＦＡＩＰ６を始めとした種々のサイトカインが関わるとされる。なかでも、ＴＧＦＢ２は、白血球の増殖、分化、活性化及び生存に影響を及ぼすことによる免疫寛容の誘導及び維持だけでなく、炎症応答の開始と消散を調整する上でも不可欠な役割を果たす主要なメディエーターとして機能する（Ｋｙｕｒｋｃｈｉｅｖ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１４；６（５）：５５２−７０．）。ＴＧＦＢ２が免疫細胞機能に及ぼす調節活性は多様であり、例えば、エフェクターＴ細胞の増殖及び機能の阻害、ナイーブＴリンパ球からの制御性Ｔ細胞の生成、ＮＫ細胞によるサイトカイン産生と細胞溶解活性の減弱、Ｂ細胞、樹状細胞及びマクロファージの抑制などがある（Ｋｙｕｒｋｃｈｉｅｖ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１４；６（５）：５５２−７０．）。また、間葉系幹細胞が産生するＴＮＦＡＩＰ６は、インビトロ共培養系におけるマクロファージ活性化の減少や、ザイモサン誘導性腹膜炎モデルにおける炎症の緩和に関与することが示唆されている（Ｂａｒｔｏｓｈ ＴＪ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０；１０７（３１）：１３７２４−９．）。また、間葉系幹細胞は、抗炎症性を獲得するために炎症性サイトカインで刺激されなければならないが、間葉系幹細胞が産生するＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ及びＣＣＬ２は、間葉系幹細胞自身の抗炎症性を高めるための自己炎症性サイトカインとして機能する（Ｃｅｓａｒｚ Ｚ，Ｔａｍａｍａ Ｋ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．２０１６；２０１６：９１７６３５７．）。本発明の間葉系幹細胞は、ＴＧＦＢ２、ＴＮＦＡＩＰ６、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ及びＣＣＬ２を高産生することができ、これらのサイトカインによって高い抗炎症性及び／又は免疫抑制能を発揮することができる。よって、本発明の間葉系幹細胞は、免疫関連疾患（例えば、移植片対宿主病、クローン病）の患者に投与されることにより、患者の免疫状態を改善することができる。
以上より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことが明らかになった。

よって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことが分かった。
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。

また、高い免疫抑制作用を示す細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。

＜実施例２＞
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（比較例１及び実施例１とは異なるドナー）から、実施例１と同様に、「工程１：羊膜の採取」、「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」、「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」及び「工程４：羊膜ＭＳＣの培養」を行った。羊膜ＭＳＣの培養においては、継代ごとに細胞集団の一部を採取し、採取したそれぞれの細胞集団について下記（ａ）及び（ｂ）の条件を評価した。前記条件の評価は、上記「ＣＤ９７発現の解析」及び「ＣＤ３５８発現の解析」と同様の手法を使用した。
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。

採取した細胞集団には、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団と満たさない細胞集団が存在したため、前記２種類の細胞集団について段落０１１６に記載の「免疫抑制作用の評価」と同様の手法にて免疫抑制作用を評価した。

その結果、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団と比べて、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団は、ＴＧＦＢ２遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子及びＣＣＬ２遺伝子の相対発現量が多いことが分かった。上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団と比べて、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことから、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすれば、高い免疫抑制作用を示す細胞集団を選択的に取得することができる。

＜実施例３：医薬組成物の製造＞
上記の実施例１で得られた細胞集団の一部を医薬組成物の調製に供する。羊膜ＭＳＣ４．０×１０^８個、ＨＥＳ８００ｍｇ、ＤＭＳＯ０．７ｍＬ及びヒト血清アルブミン８００ｍｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。

Claims (9)

1. 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
   （ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
   （ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。
2. 間葉系幹細胞の細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団：
   （ａ）前記細胞集団において、ＣＤ９７が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
   （ｂ）前記細胞集団が、ＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞を含む。
3. 前記間葉系幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、請求項２に記載の細胞集団。
4. ＣＤ９７及びＣＤ３５８が陽性を呈する間葉系幹細胞。
5. 請求項２又は３に記載の細胞集団あるいは請求項４に記載の間葉系幹細胞と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
6. ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０^９個／ｋｇ体重以下である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記医薬組成物が、注射用製剤である、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
8. 前記医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
9. 免疫関連疾患の治療剤である、請求項５から８の何れか一項に記載の医薬組成物。