JPWO2018151046A1 - 肺線維症治療剤、ptprr発現促進剤及び肺線維症治療用キット - Google Patents
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Abstract
Description
[2]肺線維症が、通常型間質性肺炎(UIP)、又は特発性肺線維症(IPF)である[1]に記載の肺線維症治療剤。
[3]間葉系幹細胞が脂肪組織由来である[1]又は[2]に記載の肺線維症治療剤。
[4]間葉系幹細胞が他家由来である、[1]〜[3]のいずれかに記載の肺線維症治療剤。
[5]PTPRR発現促進剤を含有する、肺線維症治療剤。
[6]PTPRR発現促進剤が、リン酸化ERKを脱リン酸化する、[5]に記載の肺線維症治療剤。
[7][1]〜[6]のいずれかに記載の肺線維症治療剤、容器及びラベルを含む、肺線維症治療用キット。
本発明の肺線維症治療剤は、間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞は、肺線維化を起こしている組織の細胞に対して作用し、細胞の線維化関連遺伝子の発現を低下させる効果を奏する。また、細胞レベルのみでなく、線維化をおこしている動物に間葉系幹細胞を投与することで、線維化を軽減させることが期待できる。本発明における肺線維症治療剤は、間葉系幹細胞以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の成分を含有していてもよい。以下に間葉系幹細胞、その他の成分について詳細に説明する。
本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上、好ましくは二種以上、更に好ましくは三種以上の細胞(骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など)への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、脂肪組織に含有される間葉系幹細胞を意味し、脂肪組織由来間質細胞と称してもよい。これらのうち、肺線維症の治療に対する有効性の観点、入手容易性の観点等から、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞がより好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞がさらに好ましい。
間葉系幹細胞は、当業者に周知の方法により調製することができる。以下に、一つの例として、脂肪組織由来間葉系幹細胞の調製方法を説明する。脂肪組織由来間葉系幹細胞は、例えば米国特許第6,777,231号に記載の製造方法によって得られて良く、例えば、以下の工程(i)〜(iii)を含む方法で製造することができる:
(i) 脂肪組織を酵素による消化により細胞懸濁物を得る工程;
(ii) 細胞を沈降させ、細胞を適切な培地に再懸濁する工程;ならびに
(iii) 細胞を固体表面で培養し、固体表面への結合を示さない細胞を除去する工程。
(1)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
(2)表面抗原CD44、CD73、CD90が陽性であり、CD31、CD45が陰性であり、及び
(3)培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。
本発明における間葉系幹細胞は、肺線維症に対する治療効果を備えていれば、適宜、凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液へ間葉系幹細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜、処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。
本発明の間葉系幹細胞は、いずれの状態の細胞であってもよいが、例えば培養中の細胞を剥離して回収された細胞でもよいし、凍結保存液中に凍結された状態の細胞でもよい。拡大培養して得られる同ロットの細胞を小分けして凍結保存したものを使用すると、安定して同様の作用効果が得られる点、取扱い性に優れる点等において好ましい。凍結保存状態の間葉系幹細胞は、使用直前に融解し、凍結保存液に懸濁したまま輸液もしくは培地等の間葉系幹細胞懸濁用溶液に直接混合してもよい。また、遠心分離等の方法により凍結保存液を除去してから輸液もしくは培地等の間葉系幹細胞懸濁用溶液に懸濁してもよい。ここで、本発明における「輸液」とは、ヒトの治療の際に用いられる溶液のことをいい、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、日局生理食塩液、5%ブドウ糖液、日局ブドウ糖注射液、リンゲル液、日局リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、1号液(開始液)、2号液(脱水補給液)、3号液(維持液)、4号液(術後回復液)等が挙げられる。なお、上記の輸液もしくは培地等の間葉系幹細胞懸濁用溶液は、後述するその他の成分(薬学的に許容される担体や添加物)を含むように調製されてもよい。
本発明におけるPTPRR発現促進剤は、肺線維化の原因となる細胞や組織におけるPTPRR発現を促進することで、チロシンリン酸化されたタンパク質の脱リン酸化を亢進し、結果的に、その細胞の増殖、ひいては組織の線維化を抑制することができる。このようなチロシンリン酸化されたタンパク質としては、例えば、ERK、JNK、p38等が挙げられ、これらのうち肺線維化抑制効果に優れるという観点から、ERKが好ましい。
本発明は、間葉系幹細胞と、間葉系幹細胞懸濁用溶液と含む、肺線維症治療用のキットも含む。本発明のキットが含む間葉系幹細胞、間葉系幹細胞懸濁用溶液については、肺線維症治療剤の項における説明を適用できる。
本発明は、間葉系幹細胞を用いることを特徴とする、肺線維症の治療方法も含む。本発明の治療方法によると、間葉系幹細胞が、肺線維化を促進する遺伝子発現を抑制することにより、肺線維症を効果的に治療することが可能である。また、本発明は、間葉系幹細胞を用いることを特徴とする、細胞・組織等におけるPTPRR発現の促進方法も含む。本発明の促進方法によると、間葉系幹細胞が細胞や組織に作用し、PTPRR発現の発現を効果的に促進させることができる。なお、間葉系幹細胞についての説明は、肺線維症治療剤の項における説明を適用できる。
市販細胞(Lonza社製PT―5006)に間葉系幹細胞用無血清培地(Rohto社)を加え、当該細胞懸濁液を400gで5分間遠心分離し、上清除去後に間葉系幹細胞用無血清培地(Rohto社)に再懸濁し、フラスコに細胞を播種した。細胞を37℃で数日間、5%CO2中で継代培養した。数日後に培養物をPBSで洗浄して、培養液中に含まれていた血球や脂肪組織の残存等を除去し、プラスチック容器に接着している間葉系幹細胞を得た。
肺線維化病変を指摘され、肺癌で手術した症例から検体を採取した。線維化が見られない部位(線維化(−))、線維化が見られる部位(線維化(+))を区別し、それぞれ組織を切り刻み、15%血清入りDMEM培地(Wako社製)で37℃、10%CO2中で培養を開始し、各1、2、4、7日目にはPBS(Wako社製)で洗浄した後に培地交換を行い、計10日間培養を行い、UIP(Usual interstitial pneumonia;通常型間質性肺炎)患者由来の肺線維芽細胞、(以下「UIP細胞」という)を得た。
24ウェルプレートに、1%血清入りDMEM培地に懸濁した肺胞上皮様細胞株(A549;5.0×104cells/well)を播種し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内に入れ、培養を開始した。培養を開始してから12時間後に、TGF−β最終濃度100ng/mlにて上皮間葉転換を誘導した。1日間培養後、TGF−βを、DMEM培地を用いて完全にwash outし、ADMSC共培養群にはトランスウェルインサート(corning, #3460)を設置し、トランスウェルインサートに、実施例1と同様に調整した継代培養して凍結保存されていたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(2.0×105cells/well)を、1%血清入りDMEM培地に懸濁して添加した。共培養を開始してから24時間後に、A549細胞のRNAを回収し、線維化関連遺伝子であるACTA2(α−Smooth muscle actin; α−SMA)、CDH2(Cadherin2)及びFN1(Fibronectin1)のmRNA発現量を定量PCRで測定した。
結果を図3に示した。
重症複合免疫不全マウスSCID−Beige(CB17.Dg−PrkdcscidKystbg−J/CrlCrli)マウス(7−10週齢、雌、日本チャールズリバー株式会社)に、実施例2と同様に調整したUIP細胞を静脈内投与した。なお、UIP細胞は遠心して培地を取り除き、PBS(Wako社製)に懸濁した細胞(2x106cells)500μLを上記投与に用いた。PBSのみを投与したマウスを陰性対照とした。PBS及びUIP細胞懸濁液投与63日後に、肺の病理切片を作成し、マッソントリクローム染色を行った。結果を図4に示す。図4に示すとおり、UIP細胞懸濁液投与群においては明らかな線維化が認められ、ヒトにおいてみられるのと同様のUIP特異的な病変が認められた。
実施例4と同様に、重症複合免疫不全マウスSCID−Beige(CB17.Dg−PrkdcscidKystbg−J/CrlCrli)マウス(7−10週齢、雌、日本チャールズリバー株式会社)に、実施例2と同様に調整したUIP細胞を静脈内投与した。UIP細胞投与35日後に、それぞれPBSのみ(200μL、Lonza社製;PBS群)及び実施例1と同様に調製して継代培養したヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(200μL、1.5x106cells;ADMSC群)を静脈内投与した。UIP細胞投与63日後に肺の病理切片を作成し、マッソントリクローム染色を行い、組織学的解析を行った。ADMSC群ではPBS群と比較して線維化の軽減が見られ、肺線維症に対して治療効果があることが示唆された。
Claims (7)
- 間葉系幹細胞を含有する、肺線維症治療剤。
- 肺線維症が、通常型間質性肺炎(UIP)または、特発性肺線維症(IPF)である請求項1に記載の肺線維症治療剤。
- 間葉系幹細胞が脂肪組織由来である、請求項1又は2に記載の肺線維症治療剤。
- 間葉系幹細胞が他家由来である、請求項1から3のいずれか1項に記載の肺線維症治療剤。
- PTPRR発現促進剤を含有する、肺線維症治療剤。
- PTPRR発現促進剤が、リン酸化ERKを脱リン酸化する、請求項5に記載の肺線維症治療剤。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の肺線維症治療剤、容器及びラベルを含む、肺線維症治療用キット。
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