CN111773251B - 一种肺泡吸入组合物及其制备方法和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肺泡吸入组合物及其制备方法和其应用。所述肺泡吸入组合物包括干细胞提取物和植物提取物，其在肺部疾病、肺部病变后功能修复的治疗与预防具有显著疗效。

Description

一种肺泡吸入组合物及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肺泡吸入组合物及其制备方法和其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。间充质干细胞广泛存在于全身多处组织中，包括骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎等，均可分离用于制备间充质干细胞。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性。MSCs除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在免疫调节、组织修复等方面发挥重要的功能调节作用，可产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等细胞活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。
徐畅等(Sci Sin Vitae，2020，50)报道了间充质干细胞(MSCs)用于治疗COVID-19并取得了初步疗效。第一例临床试验利用人脐带来源MSCs进行三次静脉回输治疗，结果表明，受试者中性粒细胞下降，淋巴细胞增加，CD4+T、CD8+T细胞恢复至正常水平，大部分生命体征得到改善。第二例临床试验显示，MSCs静脉移植治疗2-4天后，受试者调节型树突细胞群增大、促炎因子TNF-a水平下降、抗炎因子IL-10水平升高。结果表明，MSCs对重症患者治疗的有益作用。但MSCs产品为“活的药物”，要求在其储存、生产、运输和应用等环节冷链运输且要求极为苛刻。为此，如何开发新型药物组合物利于提高其质量和疗效、更好地满足临床应用需求成为医药领域迫切需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种肺泡吸入组合物，每100mg所述的组合物中包括由3-10×108个细胞制备得到的细胞提取物、5-25mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，所述细胞提取物为干细胞提取物，优选为间充质干细胞提取物。
本发明的优选技术方案中，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、羊水间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胚胎间充质干细胞、多能干细胞来源的间充质干细胞的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述细胞提取物的制备方法包括下述步骤：将培养成熟的细胞重悬于原培养液上清中，破碎细胞，收集破碎液，离心去除碎片，收集上清，即得。
本发明的优选技术方案中，所述培养成熟的细胞为传代1-10次的细胞，优选为传代3-7次的细胞，更优选为传代5-6次的细胞。
本发明的优选技术方案中，所述重悬步骤中的细胞浓度为1-5×108/ml，优选为1.5-4×108/ml，更优选为2-3×108/ml。
本发明的优选技术方案中，所述培养液中不含有抗生素及胎牛血清。
本发明的优选技术方案中，所述培养液为DMEM/F12(1:1)培养液。
本发明的优选技术方案中，采用超声破碎法破碎细胞。
本发明的优选技术方案中，所述超声破碎条件为：超声功率为135w，超声频率为25KHz，超声30-60min。
本发明的优选技术方案中，所述离心条件为：转速为1000-3000g，离心5-10min。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物选自丹酚酸、维生素、黄芪多糖、水溶性白藜芦醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的丹酚酸为浓度为5％(w/w)的丹酚酸B水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的丹酚酸B水溶液占比为30％-60％(v/v)，优选为35％-55％(v/v)，更优选为40％-50％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的维生素选自维生素B6、维生素B9的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中维生素B6占比为5％-20％(v/v)，优选为8％-15％(v/v)，更优选为10％-12％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中维生素B9占比为2％-8％(v/v)，优选为3％-7％(v/v)，更优选为5％-6％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的黄芪多糖为浓度为50％(w/w)的黄芪多糖水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中黄芪多糖水溶液占比为1％-10％(v/v)，优选为2％-8％(v/v)，更优选为5％-6％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的水溶性白藜芦醇为浓度为10％(w/w)的水溶性白藜芦醇水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的水溶性白藜芦醇溶液占比为20％-45％(v/v)，优选为25％-40％(v/v)，更优选为30％-35％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为50％，维生素B6为10％，维生素B9为5％，50％黄芪多糖水溶液为5％和10％水溶性白藜芦醇为30％。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为40％，维生素B6为10％，维生素B9为6％，50％黄芪多糖水溶液为8％，10％水溶性白藜芦醇为36％。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为55％，维生素B6为5％，维生素B9为8％，50％黄芪多糖水溶液为4％，10％水溶性白藜芦醇为28％。
本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受载体选自吸附剂、分散介质、防腐剂、稳定剂、冻干保护剂中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述吸附剂选自硅酸钙、硅酸镁、硅酸铝、硫酸铝、碳酸镁中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述分散介质选自丙二醇、丙三醇、山梨醇、聚乙二醇400-600中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述防腐剂选自山梨酸钾、甘油、异抗坏血酸钠、肉桂醇、乳酸、桉油醇中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、甘油、木糖醇、聚乙二醇、葡聚糖、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由5×108个细胞制备得到的细胞提取物、10.5mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由3×108个细胞制备得到的细胞提取物、8.5mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由1.5×108个细胞制备得到的细胞提取物、20mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物的制备方法包括下述步骤：将所需量的5％(w/w)丹酚酸B水溶液、维生素、50％(w/w)黄芪多糖水溶液、10％(w/w)水溶性白藜芦醇水溶液加入到蒸馏水中，控制溶质浓度为0.5-2g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g离心10min，收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物为无菌冻干粉。
本发明的优选技术方案中，所述冻干工艺包括下述步骤：将生理盐水、细胞提取物、植物提取物、冻干保护剂溶液混合均匀后，静置，冷冻干燥，即得。
本发明的优选技术方案中，所述冻干工艺包括下述步骤：将生理盐水：含0.5-5×108的间充质干细胞的破碎成分的细胞提取物：植物提取物溶液(溶质浓度为0.5-2g/L)：20％甘露醇溶液按照体积比为5:2:1:2量取后，混合均匀，37℃静置30-60min，-80℃预冷冻8-24h后，冷冻干燥12-24h，即得组合物冻干粉。
本发明的优选技术方案中，所述的组合物冻干粉于4℃低温保存。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物经雾化处理后被肺泡吸入。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物被雾化成颗粒后被肺泡吸入。
本发明的优选技术方案中，所述雾化颗粒的空气动力学粒径为0.1-10μm，优选为0.3-5μm，更优选为0.5-2μm。
本发明的另一目的在于提供所述肺泡吸入组合物的制备方法，包括如下步骤：称取所需量的细胞提取物、植物提取物与药学上可接受的载体，将其均匀混合，冻干，即得。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由3-10×108个细胞制备得到的细胞提取物、5-25mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，所述细胞提取物为干细胞提取物，优选为间充质干细胞提取物。
本发明的优选技术方案中，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、羊水间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胚胎间充质干细胞、多能干细胞来源的间充质干细胞的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述细胞提取物的制备方法包括下述步骤：将培养成熟的细胞重悬于原培养液上清中，破碎细胞，收集破碎液，离心去除碎片，收集上清，即得。
本发明的优选技术方案中，所述培养成熟的细胞为传代1-10次的细胞，优选为传代3-7次的细胞，更优选为传代5-6次的细胞。
本发明的优选技术方案中，所述重悬步骤中的细胞浓度为1-5×108/ml，优选为1.5-4×108/ml，更优选为2-3×108/ml。
本发明的优选技术方案中，所述培养液中不含有抗生素及胎牛血清。
本发明的优选技术方案中，所述培养液为DMEM/F12(1:1)培养液。
本发明的优选技术方案中，采用超声破碎法破碎细胞。
本发明的优选技术方案中，所述超声破碎条件为：超声功率为135w，超声频率为25KHz，超声30-60min。
本发明的优选技术方案中，所述离心条件为：转速为1000-3000g，离心5-10min。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物选自丹酚酸、维生素、黄芪多糖、水溶性白藜芦醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的丹酚酸为浓度为5％(w/w)的丹酚酸B水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的丹酚酸B水溶液占比为30％-60％(v/v)，优选为35％-55％(v/v)，更优选为40％-50％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的维生素选自维生素B6、维生素B9的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中维生素B6占比为5％-20％(v/v)，优选为8％-15％(v/v)，更优选为10％-12％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中维生素B9占比为2％-8％(v/v)，优选为3％-7％(v/v)，更优选为5％-6％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的黄芪多糖为浓度为50％(w/w)的黄芪多糖水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中黄芪多糖水溶液占比为1％-10％(v/v)，优选为2％-8％(v/v)，更优选为5％-6％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的水溶性白藜芦醇为浓度为10％(w/w)的水溶性白藜芦醇水溶液。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中的水溶性白藜芦醇溶液占比为20％-45％(v/v)，优选为25％-40％(v/v)，更优选为30％-35％(v/v)。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为50％，维生素B6为10％，维生素B9为5％，50％黄芪多糖水溶液为5％和10％水溶性白藜芦醇为30％。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为40％，维生素B6为10％，维生素B9为6％，50％黄芪多糖水溶液为8％，10％水溶性白藜芦醇为36％。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物中各组份的体积比组成为：5％丹酚酸B水溶液为55％，维生素B6为5％，维生素B9为8％，50％黄芪多糖水溶液为4％，10％水溶性白藜芦醇为28％。
本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受载体选自吸附剂、分散介质、防腐剂、稳定剂、冻干保护剂中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述吸附剂选自硅酸钙、硅酸镁、硅酸铝、硫酸铝、碳酸镁中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述分散介质选自丙二醇、丙三醇、山梨醇、聚乙二醇400-600中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述防腐剂选自山梨酸钾、甘油、异抗坏血酸钠、肉桂醇、乳酸、桉油醇中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、甘油、木糖醇、聚乙二醇、葡聚糖、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由5×108个细胞制备得到的细胞提取物、10.5mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由3×108个细胞制备得到的细胞提取物、8.5mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，每100mg所述的组合物中包括由1.5×108个细胞制备得到的细胞提取物、20mg植物提取物(溶质质量)和药学上可接受的载体。
本发明的优选技术方案中，所述植物提取物的制备方法包括下述步骤：将所需量的5％(w/w)丹酚酸B水溶液、维生素、50％(w/w)黄芪多糖水溶液、10％(w/w)水溶性白藜芦醇水溶液加入到蒸馏水中，控制溶质浓度为0.5-2g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g离心10min，收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物为冻干粉。
本发明的优选技术方案中，所述冻干工艺包括下述步骤：将生理盐水、细胞提取物、植物提取物、冻干保护剂溶液混合均匀后，静置，冷冻干燥，即得。
本发明的优选技术方案中，所述冻干工艺包括下述步骤：将生理盐水：含0.5-5×108的间充质干细胞的破碎成分的细胞提取物：植物提取物溶液(溶质浓度为0.5-2g/L)：20％甘露醇溶液按照体积比为5:2:1:2量取后，混合均匀，37℃静置30-60min，-80℃预冷冻8-24h后，冷冻干燥12-24h，即得组合物冻干粉。
本发明的优选技术方案中，所述的组合物冻干粉于4℃低温保存。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物经雾化处理后被肺泡吸入。
本发明的优选技术方案中，所述的肺泡吸入组合物被雾化成颗粒后被肺泡吸入。
本发明的优选技术方案中，所述雾化颗粒的空气动力学粒径为0.1-10μm，优选为0.3-5μm，更优选为0.5-2μm。
本发明的另一目的在于提供所述肺泡吸入组合物用于制备预防和/或治疗肺部疾病、肺部病变后功能修复的任一种的药物中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述肺部疾病为肺炎，肺纤维化，肺癌。
本发明的优选技术方案中，所述肺炎选自细菌、病毒、真菌、非典型病原体感染、理化因素的任一种或其组合所引发的肺炎。
本发明的优选技术方案中，所述细菌选自肺炎球菌、金黄色葡萄球菌的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述病毒选自流感病毒、冠状病毒、腺病毒、巨细胞病毒、科萨奇病毒、麻疹病毒、副流感病毒的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS、229E、NL63、OC43、HKU1中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述真菌选自白念珠菌、曲霉的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述非典型病原体选自军团菌、支原体的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述理化因素选自放射性、胃酸吸入的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述预防和/或治疗SARS-CoV-2所引发的肺炎选自阻断SARS-CoV-2对肺部的入侵、抑制和/或杀灭SARS-CoV-2、免疫调节、改善COVID-19症状中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述免疫调节选自提高免疫力、减少自身免疫对肺组织的攻击的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述改善COVID-19症状选自改善肺炎引起的发热、乏力、干咳、鼻塞、流涕、单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、脓毒症休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍中的任一种症状或其组合症状。
本发明的另一目的在于提供所述肺泡吸入组合物用于制备预防和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述神经系统疾病选自神经退行性疾病，自闭症，阿尔茨海默氏病，帕金森病，神经炎中的任一种症状或其组合症状。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物为所述肺泡吸入组合物与其他药物的组合，优选所述其他药物选自抗病毒药物、抗菌药物的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的抗病毒药物或抗菌药物选自α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、干扰素α-1b、干扰素-α2b、白蛋白、丙种球蛋白、CR3022(大分子单抗药物)、法匹拉韦、瑞德西韦、磷酸奥司他韦、巴洛沙韦(Baloxavir)、羟基氯喹、羟基磷酸氯喹、洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、阿比多尔、盐酸阿比多尔、糖皮质激素、藿香正气胶囊、藿香正气丸、藿香正气水、藿香正气口服液、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、连花清瘟颗粒、疏风解毒胶囊、疏风解毒颗粒、防风通圣丸、防风通圣颗粒、茶树油提取物或其吸入组合物、阿莫西林、阿奇霉素、头孢氨苄、头孢呋辛酯、头孢克肟、头孢地尼中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述茶树油提取物含有松油烯-4-醇、α-松油醇、γ-松油醇、1，8桉叶油素、α-松油烯、烯醇类化合物的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、茶树油提取物或其吸入组合物的任一种或其组合采用雾化吸入方式给药。
本发明的优选技术方案中，本发明所述的肺泡吸入组合物与其他药物联合用药时，采取顺序给药、先后给药、同时给药的任一种方式联合给药。
本发明所述的“空气动力学直径”是指单位密度(ρ0＝1g/cm3)的球体，在静止空气中作低雷诺数运动时，达到与实际粒子相同的最终沉降速度(Vs)时的直径，采用空气动力学直径测定仪测定得到。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明的肺泡吸入组合物包括干细胞提取物和植物提取物，增强了组合物对肺部疾病、肺部病变后功能修复的治疗与预防作用，利于肺部疾病或病变后的康复与肺部功能修复，显著提高了其在治疗肺部疾病及病毒性肺炎防治中的疗效，保证临床用药的有效性和安全性。
2、本发明的制备方法具有操作简便，显著缩短生产周期，进而显著降低生产成本，适合于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1肺泡吸入组合物的制备
肺泡吸入组合物的制备方法，包括下述步骤：
(1)细胞提取物的制备
将培养成熟的第五代脐带间充质干细胞以2.5×108/ml浓度重悬于原培养液DMEM/F12(1:1)上清中，用超声细胞破碎仪进行超声细胞破碎，超声功率135w，超声频率25KHz，超声60min后，收集破碎液，2000g 10min离心去除碎片，收集上清，即得。
(2)植物提取物的制备
将5％丹酚酸B水溶液：维生素B6：维生素B9：50％黄芪多糖水溶液：10％水溶性白藜芦醇按照体积比50:10:5:5:30混合，根据需要加入蒸馏水，控制溶质浓度为1.05g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g 10min离心收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
(3)冷冻干燥
取生理盐水15ml，含1.5×108的干细胞的破碎成分的细胞提取物6ml，植物提取物溶液3ml(溶质浓度为1.05g/L)，20％(v/v)甘露醇溶液6ml，混合均匀后，37℃静置1h，-80℃预冷冻24h后，转移到冻干机中，冷冻干燥24h，得粉末状药物组合物30mg，于4℃低温保存。
实施例2肺泡吸入组合物的制备
肺泡吸入组合物的制备方法，包括下述步骤：
(1)细胞提取物的制备
将培养成熟的第六代脂肪间充质干细胞以1.5×108/ml浓度重悬于原培养液DMEM/F12(1:1)上清中，用超声细胞破碎仪进行超声细胞破碎，超声功率135w，超声频率25KHz，超声45min后，收集破碎液，3000g 5min离心去除碎片，收集上清，即得。
(2)植物提取物的制备
将5％丹酚酸B水溶液：维生素B6:维生素B9:50％黄芪多糖水溶液:10％水溶性白藜芦醇按照体积比40:10:6:8:36混合，根据需要加入蒸馏水，控制溶质浓度为0.85g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g 10min离心收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
(3)冷冻干燥
取生理盐水10ml，含6×107的干细胞的破碎成分的细胞提取物4ml，植物提取物溶液2ml(溶质浓度为0.85g/L)，20％甘露醇溶液4ml，混合均匀后，37℃静置1h，-80℃预冷冻8h后，转移到冻干机中，冷冻干燥12h，得粉末状药物组合物20mg，于4℃低温保存。
实施例3肺泡吸入组合物的制备
肺泡吸入组合物的制备方法，包括下述步骤：
(1)细胞提取物的制备
将培养成熟的第五代脂肪间充质干细胞以5×108/ml浓度重悬于原培养液DMEM/F12(1:1)上清中，用超声细胞破碎仪进行超声细胞破碎，超声功率135w，超声频率25KHz，超声50min后，收集破碎液，1000g 10min离心去除碎片，收集上清，即得。
(2)植物提取物的制备
将5％丹酚酸B水溶液：维生素B6：维生素B9：50％黄芪多糖水溶液：10％水溶性白藜芦醇按照体积比55:5:8:4:28混合，根据需要加入蒸馏水，控制溶质浓度为2g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g 10min离心收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
(3)冷冻干燥
取生理盐水20ml，含6×107的干细胞的破碎成分的细胞提取物8ml，植物提取物溶液4ml(溶质浓度为2g/L)，20％甘露醇溶液8ml，混合均匀后，37℃静置1h，-80℃预冷冻12h后，转移到冻干机中，冷冻干燥12h，得药物组合物冻干粉40mg，于4℃低温保存。
实施例4抗流感病毒性肺炎
将70只小鼠随机分成7组：空白组、模型组、达菲治疗组、连花清瘟治疗组和实施例1-3组合物治疗组。
将模型组、达菲治疗组、连花清瘟治疗组、实施例1-3组合物治疗组小鼠采用乙醚进行轻度麻醉后，每只滴鼻感染15×LD50的流感病毒鼠肺适应株FM1 0.05mL。空白组采用等体积生理盐水滴鼻。
感染4d后，给小鼠每日灌胃给药1次(0.2mL，模型组、空白组灌服等量蒸馏水)。达菲治疗组剂量：0.03g·(kg·d)-1。连花清瘟治疗组剂量：0.3g·(kg·d)-1。实施例1-3组合物采用蒸馏水溶解，剂量：0.002g·(kg·d)-1。
各组连续给药6d后，无死亡小鼠。处死小鼠，取肺称重，计算肺指数(肺重/体重×100％)并计算肺指数抑制率((模型组肺指数均值-实验组肺指数均值)/(模型组肺指数均值-空白组肺指数均值)×100％)。结果见表1。
表1实施例1-3组合物对于流感病毒性肺炎小鼠肺指数的影响(
Figure BDA0002540285980000191
n＝10)
组别 肺指数(％) 抑制率(％)
空白组 0.81±0.11 —
模型组 3.12±0.43** —
达菲组 1.59±0.26** 66.2*
连花清瘟组 1.78±0.52* 58.0*
实施例1 1.41±0.38** 74.0*
实施例2 1.54±0.22* 68.4*
实施例3 1.47±0.29* 71.4*
*p＜0.05，有显著差异；**p＜0.01，有极显著差异。
取小鼠肺组织100mg，采用Trizol法提取RNA，反转录成cDNA，RT-PCR法对病毒载量进行检测。结果见表2。
表2实施例1-3组合物对于流感病毒性肺炎小鼠肺组织病毒载量的影响(
Figure BDA0002540285980000192
n＝10)
Figure BDA0002540285980000193
Figure BDA0002540285980000201
*p＜0.05，有显著差异；**p＜0.01，有极显著差异。
实施例5 COVID-19患者感官评定试验
对实施例1组合物对COVID-19症状的改善效果进行感官评定。感官评定人员20名为年龄30-40岁志愿者，临床诊断为轻症患者，随机分为对照组和试验组，每组10人。
对照组：每日服用利巴韦林，每次0.5g，每天两次。
试验组：在服用利巴韦林的基础上，配合使用实施例1组合物。组合物的具体施用方法为：将30mg组合物用5mL蒸馏水溶解后，采用超声雾化器进行雾化给药，每天3次。感官评定结果见表3。
表3 COVID-19症状的改善结果
Figure BDA0002540285980000202
Figure BDA0002540285980000211
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (31)

1.一种肺泡吸入组合物，所述组合物包括细胞提取物、植物提取物和药学上可接受的载体，其中，每100mg组合物中包括由3-10×108个细胞制备得到的细胞提取物、5-25mg植物提取物，所述植物提取物为丹酚酸、维生素、黄芪多糖和水溶性白藜芦醇的组合，所述维生素为维生素B6和维生素B9的组合；
所述植物提取物的制备包括下述步骤： 将5wt％丹酚酸B水溶液：维生素B6：维生素B9：50 wt％黄芪多糖水溶液：10 wt％水溶性白藜芦醇按照体积比50:10:5:5:30混合，根据需要加入蒸馏水，控制溶质浓度为1.05g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g 10min离心收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞提取物为干细胞提取物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述细胞提取物为间充质干细胞提取物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪组织间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、羊水间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胚胎间充质干细胞、多能干细胞来源的间充质干细胞的任一种或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述药学上可接受载体选自吸附剂、分散介质、防腐剂、稳定剂、冻干保护剂中的任一种或其组合。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述吸附剂选自硅酸钙、硅酸镁、硅酸铝、硫酸铝、碳酸镁中的任一种或其组合。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述分散介质选自丙二醇、丙三醇、山梨醇、聚乙二醇400-600中的任一种或其组合。
8.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述防腐剂选自山梨酸钾、甘油、异抗坏血酸钠、肉桂醇、乳酸、桉油醇中的任一种或其组合。
9.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述冻干保护剂选自葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、甘油、木糖醇、聚乙二醇、葡聚糖、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸中的任一种或其组合。
10.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述的肺泡吸入组合物为冻干粉。
11.根据权利要求1-10任一项所述的肺泡吸入组合物的制备方法，包括如下步骤：称取所需量的细胞提取物、植物提取物与药学上可接受的载体，将其均匀混合，冻干，即得。
12.根据权利要求11所述的方法，所述细胞提取物的制备包括下述步骤：将培养成熟的细胞重悬于原培养液上清中，破碎细胞，收集破碎液，离心去除碎片，收集上清，即得。
13.根据权利要求12所述的方法，所述培养成熟的细胞为传代1-10次的细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，所述培养成熟的细胞为传代3-7次的细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，所述培养成熟的细胞为传代5-6次的细胞。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述重悬步骤中的细胞浓度为1-5×108/ml。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述重悬步骤中的细胞浓度为1.5-4×108/ml。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述重悬步骤中的细胞浓度为2-3×108/ml。
19.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述培养液中不含有抗生素及胎牛血清。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述培养液为DMEM/F12 1:1培养液。
21.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，采用超声破碎法破碎细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述超声破碎条件为：超声功率为135w，超声频率为25KHz，超声30-60min。
23.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述离心条件为：转速为1000-3000g，离心5-10min。
24.根据权利要求11所述的方法，所述植物提取物的制备包括下述步骤：将5wt％丹酚酸B水溶液：维生素B6：维生素B9：50 wt％黄芪多糖水溶液：10 wt％水溶性白藜芦醇按照体积比50:10:5:5:30混合，根据需要加入蒸馏水，控制溶质浓度为1.05g/L，混合均匀并密封，4℃过夜，1500g 10min离心收集上清，再经0.22um滤膜过滤，即得。
25.根据权利要求11所述的方法，所述冻干包括下述步骤：将生理盐水、细胞提取物、植物提取物、冻干保护剂溶液混合均匀后，静置，冷冻干燥，即得。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述冻干工艺包括下述步骤：将生理盐水：含0.5-5×108的间充质干细胞的破碎成分的细胞提取物：溶质浓度为1.05g/L的植物提取物溶液：20%甘露醇溶液按照体积比为5:2:1:2量取后，混合均匀，37℃静置30-60min，-80℃预冷冻8-24h后，冷冻干燥12-24h，即得组合物冻干粉。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述的组合物冻干粉于4℃低温保存。
28.根据权利要求1-10任一项所述的肺泡吸入组合物在制备用于预防和/或治疗流感病毒性肺炎药物中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒中的任一种或其组合。
30.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1-10任一项所述的肺泡吸入组合物与利巴韦林。
31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述的肺泡吸入组合物与利巴韦林联合用药时，采取顺序给药、同时给药的任一种方式联合给药。
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