JPWO2018097222A1

JPWO2018097222A1 - 栄養状態の評価方法

Info

Publication number: JPWO2018097222A1
Application number: JP2018552961A
Authority: JP
Inventors: 睦稲田; 恵子川田; 公義首藤
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2019-10-17
Also published as: WO2018097222A1; EP3546936A1; EP3546936A4; US20200182856A1

Abstract

対象の栄養状態を評価する方法であって、（１）１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出する工程、および、（２）当該割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する工程、を含む方法を提供する。また、対象の栄養状態を評価するための、１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物を提供する。

Description

本特許出願は、日本国特許出願第２０１６−２２９１２１号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、栄養状態を評価する方法、および、当該方法に使用する組成物に関する。

栄養状態の評価は、適切な栄養状態の維持や栄養状態の向上に有用である。栄養状態の評価には、一般的に、静的栄養指標（例えば、血中アルブミン値、身体計測、上腕皮下厚）および動的栄養指標（例えば、急速代謝回転タンパク質（ＲＴＰ）、安静時エネルギー消費量（ＲＥＥ）、呼吸商（ＲＱ））が用いられる。静的栄養指標は、長期的な栄養状態を反映するものであり、短期間の栄養状態の変化を評価することはできない。一方、動的栄養指標は、短期間、リアルタイムの栄養状態を反映する。

動的栄養指標の１つである呼吸商は、生体内で栄養素が分解されてエネルギーに変換される際の酸素消費量に対する二酸化炭素排出量の体積比を意味する。糖質、脂質、タンパク質の呼吸商は、各々、１．０、約０．７、約０．８であることが知られており、呼吸商に基づいて、体内で分解された栄養素を推定することができる。食事が十分であり、肝臓にグリコーゲンが貯蔵されている状態では、主に糖質が分解されるので、呼吸商は高くなる。一方、食事が十分でない、あるいは、肝臓にグリコーゲンを貯蔵できない状態では、脂肪やタンパク質が分解されるので、呼吸商は低くなる。このように、呼吸商により栄養状態を評価し得る。

しかしながら、呼吸商の測定には間接熱量計という特殊かつ高価な機器が必要であり、測定できる施設は限定されている。また、間接熱量計による測定には通常２時間以上を要し、その間、患者は横になり安静にしていることが求められるが、眠ることは禁じられる。このため、適切な条件下で測定されているかを注視する監督者が必要であり、被験者と監督者の双方に苦痛や負担を与える。

従って、呼吸商の代わりに動的栄養状態を評価し得る方法の開発が求められている。例えば、肝疾患を有する被験者に同位元素で標識されたグルコースを投与し、呼気に含まれる同位元素を測定することにより、被験者のエネルギー低栄養を評価する方法が提案されている（特許文献１）。また、同位元素で標識されたグルコースおよび／または脂肪酸を用いて、糖質と脂質の燃焼割合を測定する方法が提案されている（特許文献２および３）。しかしながら、同位元素で標識されたアミノ酸を用いて栄養状態を評価することは、これまで知られていない。

国際公開第２０１６／００６６０１号国際公開第２０１４／０３０６５０号国際公開第２０１４／１４２２４８号

対象のリアルタイムの栄養状態を、簡便かつ迅速に評価する方法を提供することが求められている。

本発明者らは、^１３Ｃで標識したアミノ酸を対象に投与し、その後採取された呼気中の標識炭酸ガス（ＣＯ_２）の挙動、特に呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する標識ＣＯ_２量の割合）の挙動から、対象の栄養状態を簡便かつ迅速に評価できることを見いだした。

従って、ある態様では、本願は、対象の栄養状態を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する工程、
を含む方法を提供する。

ある態様では、本願は、対象の栄養状態を評価するための、^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物を提供する。

本願によると、対象のリアルタイムの栄養状態を、従来の呼吸商を用いる方法よりも簡便かつ迅速に評価することができる。このような栄養状態の評価は、肝疾患や代謝性疾患などの疾患の診断および処置方法の選択のために有用な情報を提供し得る。

図１は、非絶食時および絶食時のZDF leanラットにおける呼吸商の測定結果を示す。図２は、１−^１３Ｃ−ロイシン、１−^１３Ｃ−アラニンおよび１−^１３Ｃ−グルタミン酸を投与された非絶食時および絶食時のZDF leanラットの呼気におけるΔ^１３Ｃ（‰）の測定結果を示す。図３は、ZDF fattyラットＦ１およびＦ２における呼吸商の測定結果を示す。図４は、１−^１３Ｃ−アラニンを投与されたZDF fattyラットＦ１およびＦ２の呼気におけるΔ^１３Ｃ（‰）および血中アルブミンの測定結果を示す。図５は、ZDF fattyラットＦ１〜Ｆ３における呼吸商の測定結果を示す。図６は、１−^１３Ｃ−グルタミン酸を投与されたZDF fattyラットＦ１〜Ｆ３の呼気におけるΔ^１３Ｃ（‰）および血中アルブミンの測定結果を示す。

特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。

本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。

「対象」は、栄養状態を評価しようとするいかなる哺乳動物であってもよい。例えば、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマなどが例示され、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が例示される。

対象は、健康であってもよく、疾患、例えば、癌、肝疾患、代謝性疾患、サルコペニアまたは肺疾患を有してもよい。肝疾患には、例えば、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、および、自己免疫性肝炎等が含まれ、特に肝硬変が挙げられる。代謝性疾患には、肝臓でのグリコーゲン貯蔵に異常がある疾患、エネルギー代謝に異常がある疾患などが含まれ、例えば、糖尿病、境界型糖尿病、および、インスリン抵抗性が含まれる。サルコペニアには、例えば、一次性サルコペニアおよび二次性サルコペニアが含まれる。肺疾患には、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれる。対象は、これらの疾患を有することが疑われる対象であってもよい。

また、対象の摂食状態は、^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する直前に絶食状態であってもよく、非絶食状態であってもよい。^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する直前に対象を絶食状態とする場合、対象に^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する少なくとも２時間以上前、好ましくは少なくとも４時間以上前から絶食であることが例示される。水分は摂取してもよい。^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する直前に対象を絶食状態としない場合は、通常食を通常通り摂取すればよい。

対象は、食事制限を受けていてもよい。「食事制限」とは、摂取する栄養素の種類および／または量を制限することを意味し、例えば、肝疾患または代謝性疾患などの疾患の処置または予防のために、あるいは、美容を目的とするダイエットのために実施され得る。疾患の処置または予防のために行われる食事制限は、食事療法とも呼ばれる。食事療法には、一定期間にわたり栄養素を摂取しない断食療法も含まれる。食事療法は、例えば、糖尿病、境界型糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖、腎臓病、高血圧症、脂質異常症、代謝症候群、肥満症、高尿酸血症、痛風、血栓塞栓症、虚血性心疾患、動脈硬化などの処置および／または予防のために実施され得る。

本願に関して、「栄養状態」とは、エネルギー源としての栄養素の摂取、保持、代謝等の状態を意味する。哺乳動物は、食物の摂取が十分であり、肝臓にグリコーゲンが貯蔵されていれば、主に糖質をエネルギー源として分解する。一方、食物の摂取が不十分であったり、インスリン抵抗性のために糖が利用出来ない、あるいは、肝臓にグリコーゲンを貯蔵できていないと、脂質やタンパク質をエネルギー源として分解する。肝臓にグリコーゲンを貯蔵できない原因としては、上記の肝疾患および代謝性疾患、特に肝硬変が挙げられる。本願に関して、「正常な栄養状態」とは、対象が主に糖質をエネルギー源としている状態を意味し、「低栄養状態」とは、対象が主に脂質やタンパク質をエネルギー源としている状態を意味する。

「^１３Ｃ標識アミノ酸」は、^１３Ｃで標識された哺乳動物が代謝可能なアミノ酸であって、代謝経路を経て生成されるＣＯ_２の少なくとも一部が^１３Ｃで標識されるように、標識されているものである。典型的には、アミノ酸のカルボキシル基の炭素および／またはα炭素が^１３Ｃであるものが挙げられるが、代謝経路を経てＣＯ_２に変換される側鎖の炭素が^１３Ｃで標識されていてもよい。アミノ酸分子内の１つの位置の炭素が標識されていてもよく、複数の位置の炭素が標識されていてもよい。好ましくは、１つの位置の炭素が標識されたアミノ酸を使用する。さらに好ましくは、カルボキシル基の炭素が標識されたアミノ酸を使用する。対象に投与される^１３Ｃ標識アミノ酸は、典型的には同じ位置で標識されたアミノ酸分子の混合物であるが、異なる位置で標識されたアミノ酸分子の混合物であってもよい。

アミノ酸を^１３Ｃで同位元素標識する方法は特に制限されず、通常使用される方法が広く採用される（佐々木康人、「５．１安定同位体の臨床診断への応用」、化学の領域増刊１０７、ｐｐ．１４９−１６３（１９７５）、南江堂；梶原、ＲＡＤＩＯＩＳＯＴＯＰＥＳ，４１，４５−４８（１９９２）等）。このような同位元素標識化合物、特に後述の実施例で使用される^１３Ｃ標識アミノ酸は、いずれも商業的に入手することができ、簡便には市販品を使用することもできる。

アミノ酸は、代謝分解の観点で、糖原性アミノ酸、ケト原性アミノ酸または両方の特徴を有するアミノ酸に分類される。糖原性アミノ酸は、脱アミノ化を受けた後、炭素骨格が糖新生に用いられるアミノ酸である。例えば、ヒトの糖原性アミノ酸には、ピルビン酸からオキサロ酢酸になり糖新生に入るもの（アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、トリプトファン）、スクシニルＣｏＡになりクエン酸回路のオキサロ酢酸から糖新生に入るもの（イソロイシン、メチオニン、バリン、トレオニン）、オキサロ酢酸になり糖新生に入るもの（アスパラギン酸、アスパラギン）、α−ケトグルタル酸になりクエン酸回路のオキサロ酢酸から糖新生に入るもの（アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン）、フマル酸になりクエン酸回路のオキサロ酢酸から糖新生に入るもの（チロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸）が含まれる。ケト原性アミノ酸は、脱アミノ化を受けた後、炭素骨格部分が脂質代謝経路を経由して、脂肪酸やケトン体に転換され得るアミノ酸である。例えば、ヒトのケト原性アミノ酸には、ロイシン、リシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンが含まれる。ヒトにおいて、トレオニン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンは、糖原性であり、かつ、ケト原性である。１種のアミノ酸を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ある実施態様では、^１３Ｃ標識アミノ酸は^１３Ｃ標識糖原性アミノ酸である。別の実施態様では、^１３Ｃ標識アミノ酸は^１３Ｃ標識ケト原性アミノ酸である。

例えば、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンおよびリシンからなる群から選択され得る。また、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンおよびリシンからなる群から選択され得る。さらに、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識アラニン、グルタミン酸、およびロイシンからなる群から選択され得る。さらにまた、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識アラニンおよびグルタミン酸からなる群から選択され得る。ある実施態様では、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、トリプトファン、特に^１３Ｃ標識アラニンである。ある実施態様では、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、特に^１３Ｃ標識グルタミン酸である。ある実施態様では、^１３Ｃ標識アミノ酸は、^１３Ｃ標識ロイシン、リシン、トレオニン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特に^１３Ｃ標識ロイシンである。

対象に投与される^１３Ｃ標識アミノ酸は、遊離の^１３Ｃ標識アミノ酸であってもよく、ペプチドもしくはタンパク質に含まれてもよく、これらの医薬的に許容し得る塩の形態であってもよい。^１３Ｃ標識アミノ酸は、上記のいずれかの形態の^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物として投与され得る。組成物は、^１３Ｃ標識アミノ酸が体内に吸収され、また代謝された後に、^１３Ｃ標識ＣＯ_２が呼気に排出されるのであるものであれば、いかなる組成物であってもよい。組成物は有効成分である^１３Ｃ標識アミノ酸だけからなるものであってもよく、担体および添加剤等の他の成分を含んでもよい。また、組成物の形態、^１３Ｃ標識アミノ酸以外の成分、各成分の配合割合、組成物の調製方法等は特に制限されない。当該組成物、即ち、対象の栄養状態を評価するための^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物は、本開示における１つの態様である。

組成物の形態は特に制限されず、例えば経口投与形態であっても非経口投与形態であってもよい。経口投与形態の場合、液剤（シロップ剤を含む）、懸濁剤および乳剤などの液状形態；錠剤（裸剤、被覆剤を含む）、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤および顆粒剤などの固形形態など、任意の経口投与形態を採用することができる。非経口投与形態の場合、例えば注射剤や点滴剤の投与形態（液状、懸濁状または乳液状等）を採用することができる。経口投与形態、注射投与形態、特に静脈内投与形態が好ましく例示される。ある実施態様では、組成物は経口投与形態である。

例えば、^１３Ｃ標識アミノ酸を生理食塩水、注射用蒸留水、精製水など任意の溶媒と組み合わせて、液体、懸濁液、乳液状等の注射投与形態といった液状形態の組成物を調製し得る。また、該組成物は、他の成分として必要に応じて、通常当業界において用いられる薬学上許容される任意の担体や添加剤などの成分、例えば、等張化剤（例えば塩化ナトリウム）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、水酸化ナトリウム）、緩衝剤（例えばホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム）、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム）、増粘剤（例えばカルボキシビニルポリマー）などの通常用いられる成分を含み得る。

組成物は、使用時に生理食塩水、注射用蒸留水、精製水などで溶解して用いられる形態、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥されてなる製剤などの固形形態を有するものであってもよい。

また、^１３Ｃ標識アミノ酸を各種担体や添加剤などの成分と組み合わせて、錠剤、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等の固形形態の組成物を調製し得る。また、錠剤は、更に必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。また、カプセル剤は常法に従い、有効成分である標識グルコースを必要に応じて各種成分と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製してもよい。

前記担体や添加剤などの任意の成分として、例えば、乳糖、白糖、デキストリン、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、リン酸二水素カルシウム、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、プルラン、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポピドン、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等、ポリソルベート８０、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類、硬化油、クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素、銅クロロフィル、リボフラビン、アスコルビン酸、各種甘味料等が例示される。

これらの形態や任意の成分は、当業者が必要に応じて適宜決定すればよい。
また、組成物は、このような製剤形態のものに限定されず、例えば、^１３Ｃ標識アミノ酸を任意の食品素材と組み合わせて調製される、固形食、流動食または液状食の形態であってもよい。

組成物が有効成分として含有する^１３Ｃ標識アミノ酸の量は特に制限されず、例えば、組成物中に１〜９９重量％を例示することができる。対象に投与する^１３Ｃ標識アミノ酸の量は、ケース（例えば対象の種類、対象の状態、絶食／非絶食の別など）、組成物の形態等に応じて適宜調節し得る。例えば、組成物が経口投与形態または静脈投与形態である場合、１回あたりの使用量（投与量）は、^１３Ｃ標識アミノ酸（有効成分）の量に換算して、０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜１ｇ／体重ｋｇ、好ましくは０．０２ｍｇ／体重ｋｇ〜０．５ｇ／体重ｋｇであり得る。

工程（１）において、^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から投与後の任意の時点ｔにおいて排出された呼気を被験試料とし得る。即ち、被験試料は、^１３Ｃ標識アミノ酸を対象に投与してからｔ時間後に採取された呼気であり得る。本明細書において、該ｔ時間を呼気採取時間ｔとも称する。呼気採取時間ｔは、当業者が適宜決定できる。例えば、対象への^１３Ｃ標識アミノ酸投与後約１分〜１２０分、約１分〜６０分、約１分〜４０分、約１分〜２０分、約５分〜６０分、約５分〜４０分、約５分〜２０分の間のいずれかの時間が例示され、該範囲内で任意の時間を選択することができる。例えば、対象と同種の哺乳動物に^１３Ｃ標識アミノ酸を投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出し、^１３ＣＯ_２量の割合が高い時点を選択し、呼気採取時間ｔとすることができる。例えば、呼気採取時間ｔとしては、^１３Ｃ標識アミノ酸投与後約１分〜１２０分または約５分〜６０分が例示される。

対象から排出された呼気は、従来公知の呼気試験の方法に基づいて採取し得る。呼気試料中に含まれる^１３ＣＯ_２、非標識ＣＯ_２、総ＣＯ_２の測定、分析は従来公知の手順に基づいて行えばよく、当業者に公知である。例えば、^１３ＣＯ_２の測定、分析は、通常、液体シンチレーションカウンター法、質量分析法、赤外分光分析法、発光分析法、磁気共鳴スペクトル法等の一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは、赤外分光分析法または質量分析法を用いる。

上記の方法の工程（１）では、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する。呼気中の炭酸ガスの割合を求める手順は従来公知の手順に従えばよく、本発明を制限するものではないが、例えば以下のように説明される。

（１）δ^１３Ｃ値（‰）
同位体の存在比を表す場合、同一元素の中で最も組成比の高い元素を分母にした同位体比（Ｒ）を用いる。従って、炭素１３（^１３Ｃ）のＲ値は、炭素１２（^１２Ｃ）を分母とした次式で表される。

Ｒは非常に小さい数値であるため、直接測定することは困難である。より正確に定量するため、質量分析計を用いる場合には、常に標準物質との比較が行われ、測定結果は、次式で定義されるδ値で表される。

なお、標準ガスとして、石灰石由来の炭酸ガス（ＰＤＢ）を使用する場合、Ｒ_ＳＴＤは、Ｒ_ＰＤＢ＝０．０１１２３７２である。

（２）Δ^１３Ｃ値（‰）
Δ^１３Ｃ値（‰）は、下式で示すように、試薬投与前のδ^１３Ｃ値（すなわち天然に存在する^１３Ｃのδ値）をｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとして、これを、試薬投与後のδ^１３Ｃ値から差し引いた値（Δ^１３Ｃ）を意味する。

（３）呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ：ａｔｏｍ％）
呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ：ａｔｏｍ％）は下式で定義される。

前記（１）で定義した相対値δ^１３Ｃ値を、一般的な濃度の概念である総炭素中の^１３Ｃ含量（％）の形に変換するには、下記の方法を用いることができる。
まず、上記式の右辺の分母子を^１２Ｃで割り、（式１）に基づいてＲに変換すると、下記の通りになる。

このＲに、（式２）で求めたＲ_ＳＡＭを代入して整理すると、次式となり、δ^１３Ｃ値を用いて^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ）を表すことができる。

（４）^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）
呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ）の変化量（Δ％^１３Ｃ）は、次式で定義されるように、試薬投与ｔ時間後の^１３Ｃ濃度〔（％^１３Ｃ）_ｔ〕から試薬投与前０時間の^１３Ｃ濃度〔（％^１３Ｃ）_０〕を差し引いて求められる。

（５）δ^１３Ｃ値（‰）と^１３Ｃ濃度変化量（Δ％^１３Ｃ）との関係
^１３Ｃの天然存在比（Ｒ）は約０．０１１であり、標識試薬を投与した場合でも呼気中への増加量はわずかに＋０．００１〜０．００２程度である。そこで、天然存在比Ｒ→０とみなすことができ、％^１３ＣをＲで表した（式４）は、次式で近似することができる。

この近似式を用いて、まずδ^１３Ｃの定義である（式２）よりＲ_ＳＡＭを求めて上記式のＲに代入して整理すると、^１３Ｃ濃度を求める近似（式７）が得られる。

これを（式６）に代入すると、下式（式８）に示すように、Δ^１３ＣからΔ％^１３Ｃを算出することができる。

上記の方法の工程（１）では、採取した呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合）を、下記の方法に従って^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）として算出する。

具体的には、下式に従って、^１３Ｃ標識アミノ酸の対象への投与後の任意の時点ｔに採取された呼気に含まれる総炭素中の^１３Ｃ濃度（呼気中の^１３Ｃ濃度、^１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％^１３Ｃ）_ｔ）を求める。同様に、^１３Ｃ標識アミノ酸の対象への投与前に予め採取された呼気、好ましくは投与前０時間に採取された呼気に含まれる総炭素中の^１３Ｃ濃度（呼気中の^１３Ｃ濃度、^１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％^１３Ｃ）_０）を求める。更に、上記式６に従って、（％^１３Ｃ）_ｔから（％^１３Ｃ）_０を差し引いて、^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ（ａｔｏｍ％））を求める。

なお、必要に応じて前記^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）は、上記式５および式３に基づいて、Δ^１３Ｃ（‰）（δ^１３Ｃ値変化量（‰）またはＤＯＢ（‰））に換算してもよい。

また、呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合は、Δ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおける曲線下面積（Area under the curve；ＡＵＣ_ｔ）として算出してもよい。曲線下面積の算出は、従来公知の算出方法に従って行えばよく、当業者であれば容易に理解できる。例えば、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、横軸を^１３Ｃ標識アミノ酸投与後の経過時間とした、Δ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおいて、その曲線下面積を算出する。例えば、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、^１３Ｃ標識アミノ酸を対象に投与してから呼気採取時間ｔ分の間における曲線下面積を、ＡＵＣ_ｔ−０と表すことができる。また、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、呼気採取時間ｔ_１分から呼気採取時間ｔ_２分の間における曲線下面積を、ＡＵＣ_{ｔ２−ｔ１}と表すことができる。

上記の方法の工程（２）では、工程（１）で得られた割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する。指標値は、対象と同種の栄養状態がわかっている動物群（対照群）について、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得、例えば、正常な栄養状態または低栄養状態の対象と同種の動物群において、工程（１）に従って算出された割合から得られる値であり得る。指標値は、対象における割合（被験値）の算出に採用した呼気採取時間ｔと同じ時間ｔを用いて、対照群について同様の手順で割合を算出することにより、決定し得る。指標値は、被験値の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、対照群について決定した値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。

対照動物は、被験動物と同種の動物であり得る。あるいは、栄養状態がわかっているときの対象の個体を対照動物としてもよい。正常な栄養状態の動物としては、非絶食状態であり、低栄養状態をもたらすことがわかっている疾患に罹患しておらず、その前駆症状もない動物が挙げられる。低栄養状態の動物としては、絶食状態の動物、または、低栄養状態をもたらすことがわかっている疾患に罹患している動物が挙げられる。低栄養状態をもたらすことがわかっている疾患としては、例えば、肝疾患および代謝性疾患などの疾患、特に肝硬変および糖尿病が挙げられる。

さらに、対照動物の栄養状態を、呼吸商の測定によって判定してもよい。即ち、正常な栄養状態の動物として、呼吸商が高い動物を用いることができ、低栄養状態の動物として、呼吸商が低い動物を用いることができる。また、肝硬変診療ガイドラインにおいては、非蛋白呼吸商が０．８５未満であればエネルギー低栄養状態と判定すると定められている（日本消化器病学会、編．肝硬変診断ガイドライン．東京：南江堂；２０１０）。

ある実施態様では、指標値は、対象と同種の正常な栄養状態の動物群（対照群）において、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得る。この場合、対象において算出された割合が指標値よりも高い場合に、対象が低栄養状態であると判定し得、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象が正常な栄養状態であると判定し得る。別の実施態様では、指標値は、対象と同種の低栄養状態の動物群（対照群）において、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得る。この場合、対象において算出された割合が指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象が低栄養状態であると判定し得、指標値よりも低い場合に、対象の栄養状態は対照動物の栄養状態よりも良いと判定し得る。あるいは、指標値は、対象において以前に工程（１）に従って算出された割合であってもよい。この場合、対象において算出された割合が指標値よりも高い場合に、対象の栄養状態が悪化したと判定し得、指標値よりも低い場合に、対象の栄養状態が向上したと判定し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、栄養状態の程度をさらに知ることができる。

上記の方法により、対象が正常な栄養状態、即ち、主に糖質をエネルギー源としているか、低栄養状態、即ち、主に脂質やタンパク質をエネルギー源としているかを判定することができる。従って、対象が体内の糖質、脂肪、タンパク質のいずれを主なエネルギー源としているかを判定し、被験動物のエネルギー代謝状態を評価することができる。また、呼吸商の測定と比較して、対象および試験実施者の身体的、精神的な苦痛を低減し得、間接熱量計という特殊かつ高価な機器を必要としないため、呼吸商測定に伴う問題点を軽減しながら、栄養状態を精度高く決定、評価し得る。従って、上記の方法は、従来の呼吸商測定に対する有用な代替方法であり得る。

さらに、脂質とタンパク質の呼吸商は各々約０．７および約０．８であり、従来の呼吸商測定では、体内で脂質とタンパク質のどちらが代謝されているのかを判定することは困難であるが、肥満症等の疾患の処置および／または予防、あるいは美容を目的とするダイエットにおいては、筋肉等を構成するタンパク質は代謝されず、体内の脂肪が代謝される食事制限が行われることが望ましい。上記の方法は、体内のタンパク質が代謝されているか否かを判定することを可能にし、適切な食事制限に役立ち得る。

上記の方法は、肝疾患および代謝性疾患などの疾患の診断および処置方法の選択のために有用な情報を提供し得る。例えば、肝硬変の栄養アセスメントにおいて、エネルギー代謝に関する指標として血中アルブミン値、呼吸商、ＢＭＩが使用されているが、呼吸商に代えて、当該方法による栄養状態の評価を用いることができる。例えば、肝硬変の患者において、当該方法による栄養状態の評価と血中アルブミン値を組み合わせることにより、対象がＰＥＭ（タンパク質・エネルギー低栄養状態）であるか否かを評価し得る。また、肝硬変、糖尿病、境界型糖尿尿、インスリン抵抗性などの肝疾患または代謝性疾患の処置または予防において、上記の方法による栄養状態の評価に基づいて、適切な食事療法を実施することができる。さらに、当該方法により、肝臓のグリコーゲン貯蔵を評価し得る。当該方法は、サルコペニアの診断にも寄与し得る。

ある態様では、上記の方法を利用して、対象のサルコペニアを診断する方法が提供される。当該方法は、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象のサルコペニアを診断する工程、
を含む。当該方法を、サルコペニアの診断を補助する方法とすることもできる。

「サルコペニア」とは、筋力および筋肉量の低下を主な特徴とする疾患である。加齢以外に明らかな原因がないものは一次性サルコペニアと呼ばれ、活動に関連するサルコペニア（寝たきり、不活発なスタイル（生活）、失調や無重力状態が原因となり得るもの）、疾患に関連するサルコペニア（重症臓器不全（心臓、肺、肝臓、腎臓、脳）、炎症性疾患、悪性腫瘍、糖尿病などの内分泌疾患に付随するもの）、栄養に関係するサルコペニア（吸収不良、消化管疾患、および食欲不振を起こす薬剤使用などに伴う、摂取エネルギーおよび／またはタンパク質の摂取量不足に起因するもの）は、二次性サルコペニアと呼ばれる。例えば、二次性サルコペニアは糖尿病に起因し得る。サルコペニアは、重症度に応じて、プレ・サルコペニア、サルコペニア、重症サルコペニアの段階に分類される場合もある。

「サルコペニアの診断」には、対象がサルコペニアに羅患しているか否かを判定すること、対象におけるサルコペニアの悪化または改善を判定すること、対象におけるサルコペニアの治療の効果を判定すること、あるいは、対象のサルコペニアの重症度を判定することが含まれる。

工程（１）は、上記の栄養状態を評価する方法の工程（１）に準じて実施し得る。工程（２）では、工程（１）で算出した割合を指標値と比較し、対象のサルコペニアを診断する。指標値は、上記の栄養状態を評価する方法と同様に設定し得る。例えば、サルコペニアに罹患していない対象と同種の動物群（対照群）、または、サルコペニアに罹患している対象と同種の動物群（対照群）において、対象と同等の摂食状態で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得る。

ある実施態様では、指標値は、対象と同種のサルコペニアに罹患していない動物群（対照群）において、対象と同等の摂食状態で、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得る。この場合、対象において算出された割合が指標値よりも高い場合に、対象がサルコペニアに罹患していると診断し得、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象がサルコペニアに罹患していないと診断し得る。別の実施態様では、指標値は、対象と同種のサルコペニアに罹患している動物群（対照群）において、対象と同等の摂食状態で、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、算出された割合から得られる値であり得る。この場合、対象において算出された割合が指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、サルコペニアに罹患していると診断し得、指標値よりも低い場合に、対象はサルコペニアに罹患していないか、または、サルコペニアの重症度が低いと判定し得る。あるいは、指標値は、対象において以前に同等の摂食状態で、同等の条件下で工程（１）に従って算出された割合であってもよい。この場合、対象において算出された割合が指標値よりも高い場合に、対象のサルコペニアが悪化したと判定し得、指標値よりも低い場合に、対象のサルコペニアが改善されたと判定し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、サルコペニアの重症度をさらに知ることができる。

ある態様では、対象の栄養状態を評価する方法であって、
（１）対象に^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する工程、
（２）当該対象から排出された呼気を採集する工程、
（３）呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（４）当該割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する工程、
を含む方法が提供される。

ある態様では、対象のサルコペニアを診断する方法であって、
（１）対象に^１３Ｃ標識アミノ酸を投与する工程、
（２）当該対象から排出された呼気を採集する工程、
（３）呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（４）当該割合を指標値と比較し、対象のサルコペニアを診断する工程、
を含む方法が提供される。

ある態様では、対象の栄養状態を評価するための、^１３Ｃ標識アミノ酸の使用が提供される。
ある態様では、対象の栄養状態を評価するための組成物を製造するための、^１３Ｃ標識アミノ酸の使用が提供される。

ある態様では、対象のサルコペニアを診断するための、^１３Ｃ標識アミノ酸の使用が提供される。
ある態様では、対象のサルコペニアを診断するための組成物を製造するための、^１３Ｃ標識アミノ酸の使用が提供される。

例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］
対象の栄養状態を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する工程、
を含む方法。
［２］
指標値が、対象と同種の正常な栄養状態の動物群において第１項に記載の工程（１）に従って算出された割合から得られる値である、第１項に記載の方法。
［３］
正常な栄養状態の動物が、非蛋白呼吸商が０．８５以上であるヒトである、第２項に記載の方法。
［４］
第１項に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象が低栄養状態であると判定し、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象が正常な栄養状態であると判定する、第２項または第３項に記載の方法。
［５］
指標値が、対象と同種の低栄養状態の動物群において第１項に記載の工程（１）に従って算出された割合から得られる値である、第１項に記載の方法。
［６］
低栄養状態の動物が、非蛋白呼吸商が０．８５未満である動物である、第５項に記載の方法。
［７］
第１項に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象が低栄養状態であると判定し、指標値よりも低い場合に、対象の栄養状態は指標値を算出した動物の栄養状態よりも良いと判定する、第５項または第６項に記載の方法。
［８］
指標値が、対象において以前に第１項に記載の工程（１）に従って算出された割合である、第１項に記載の方法。
［９］
第１項に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象の栄養状態が悪化したと判定し、指標値よりも低い場合に、対象の栄養状態が向上したと判定する、第８項に記載の方法。

［１０］
対象が絶食状態である、第１項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］
対象が非絶食状態である、第１項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１２］
肝疾患または代謝性疾患を診断するための、または、肝疾患または代謝性疾患の診断を補助するための、第１項ないし第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］
肝硬変を診断するための、または、肝硬変の診断を補助するための、第１項ないし第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］
糖尿病を診断するための、または、糖尿病の診断を補助するための、第１項ないし第１２項のいずれかに記載の方法。

［１５］
対象のサルコペニアを診断する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象のサルコペニアを診断する工程、
を含む方法。
［１６］
指標値が、対象と同種のサルコペニアに罹患していない動物群において、対象と同等の摂食状態で、第１５項に記載の工程（１）に従って算出された割合から得られる値である、第１５項に記載の方法。
［１７］
サルコペニアに罹患していない動物が、非蛋白呼吸商が０．８５以上である動物である、第１６項に記載の方法。
［１８］
第１５項に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象がサルコペニアに罹患していると診断し、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象がサルコペニアに罹患していないと診断する、第１６項または第１７項に記載の方法。
［１９］
指標値が、対象において以前に同等の摂食状態で第１項に記載の工程（１）に従って算出された割合である、第１５項に記載の方法。
［２０］
第１５項に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象のサルコペニアが悪化したと診断し、指標値よりも低い場合に、対象のサルコペニアが改善されたと診断する、第１９項に記載の方法。
［２１］
対象が絶食状態である、第１５項ないし第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］
対象が非絶食状態である、第１５項ないし第２０項のいずれかに記載の方法。

［２３］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システイン、^１３Ｃ標識トリプトファン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識メチオニン、^１３Ｃ標識バリン、^１３Ｃ標識アスパラギン酸、^１３Ｃ標識アスパラギン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識ヒスチジン、^１３Ｃ標識プロリン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識ロイシンおよび^１３Ｃ標識リシンからなる群から選択される、第１項ないし第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システイン、^１３Ｃ標識トリプトファン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識ヒスチジン、^１３Ｃ標識プロリン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識ロイシンおよび^１３Ｃ標識リシンからなる群から選択される、第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法。
［２５］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸および^１３Ｃ標識ロイシンからなる群から選択される、第１項ないし第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニンおよび^１３Ｃ標識グルタミン酸からなる群から選択される、第１項ないし第２５項のいずれかに記載の方法。
［２７］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システインおよび^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、第１項ないし第２４項のいずれかに記載の方法。
［２８］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識アラニンである、第１項ないし第２７項のいずれかに記載の方法。
［２９］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識ヒスチジンおよび^１３Ｃ標識プロリンからなる群から選択される、第１項ないし第２４項のいずれかに記載の方法。
［３０］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識グルタミン酸である、第１項ないし第２４項および第２９項のいずれかに記載の方法。
［３１］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識ロイシン、^１３Ｃ標識リシン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、第１項ないし第２４項のいずれかに記載の方法。
［３２］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識ロイシンである、第１項ないし第２５項および第３１項のいずれかに記載の方法。

［３３］
被験試料が、^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から投与後の時点ｔにおいて排出された呼気である、第１項ないし第３２項のいずれかに記載の方法。
［３４］
投与後の時点ｔが、対象と同種の哺乳動物に^１３Ｃ標識アミノ酸を投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出し、^１３ＣＯ_２量の割合が高い時点を選択することにより決定されたものである、第３３項に記載の方法。
［３５］
投与後の時点ｔが、投与の約１分〜１２０分後である、第３３項または第３４項に記載の方法。
［３６］
投与後の時点ｔが、投与の約１分〜６０分後である、第３３項ないし第３５項のいずれかに記載の方法。
［３７］
投与後の時点ｔが、投与の約１分〜４０分後である、第３３項ないし第３６項のいずれかに記載の方法。
［３８］
投与後の時点ｔが、投与の約１分〜２０分後である、第３３項ないし第３７項のいずれかに記載の方法。
［３９］
投与後の時点ｔが、投与の約５分〜６０分後である、第３３項ないし第３６項のいずれかに記載の方法。
［４０］
投与後の時点ｔが、投与の約５分〜４０分後である、第３３項ないし第３７項および第３９項のいずれかに記載の方法。
［４１］
投与後の時点ｔが、投与の約５分〜２０分後である、第３３項ないし第４０項のいずれかに記載の方法。
［４２］
工程（１）において、割合がΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）として算出される、第１項ないし第４１項のいずれかに記載の方法。
［４３］
工程（１）において、割合がＡＵＣとして算出される、第１項ないし第４１項のいずれかに記載の方法。

［４４］
対象が肝疾患または代謝性疾患に罹患している、第１項ないし第４３項のいずれかに記載の方法。
［４５］
対象が肝硬変に罹患している、第１項ないし第４４項のいずれかに記載の方法。
［４６］
対象が糖尿病に罹患している、第１項ないし第４５項のいずれかに記載の方法。
［４７］
対象が食事制限を受けている、第１項ないし第４６項のいずれかに記載の方法。
［４８］
対象の血中アルブミン値を測定し、対象がＰＥＭ（タンパク質・エネルギー低栄養状態）であるか否かを判定する工程をさらに含む、第１項ないし第４７項のいずれかに記載の方法。

［４９］
対象の栄養状態を評価するための、^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物。
［５０］
肝疾患または代謝性疾患を診断するための、第４９項に記載の組成物。
［５１］
肝硬変を診断するための、第４９項に記載の組成物。
［５２］
糖尿病を診断するための、第４９項に記載の組成物。
［５３］
対象のサルコペニアを診断するための、^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物。

［５４］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システイン、^１３Ｃ標識トリプトファン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識メチオニン、^１３Ｃ標識バリン、^１３Ｃ標識アスパラギン酸、^１３Ｃ標識アスパラギン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識ヒスチジン、^１３Ｃ標識プロリン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識ロイシンおよび^１３Ｃ標識リシンからなる群から選択される、第４９項ないし第５３項のいずれかに記載の組成物。
［５５］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システイン、^１３Ｃ標識トリプトファン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識ヒスチジン、^１３Ｃ標識プロリン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識ロイシンおよび^１３Ｃ標識リシンからなる群から選択される、第４９項ないし第５４項のいずれかに記載の組成物。
［５６］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸および^１３Ｃ標識ロイシンからなる群から選択される、第４９項ないし第５５項のいずれかに記載の組成物。
［５７］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニンおよび^１３Ｃ標識グルタミン酸からなる群から選択される、第４９項ないし第５６項のいずれかに記載の組成物。
［５８］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システインおよび^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、第４９項ないし第５５項のいずれかに記載の組成物。
［５９］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識アラニンである、第４９項ないし第５８項のいずれかに記載の組成物。
［６０］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識ヒスチジンおよび^１３Ｃ標識プロリンからなる群から選択される、第４９項ないし第５５項のいずれかに記載の組成物。
［６１］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識グルタミン酸である、第４９項ないし第６０項および第６０項のいずれかに記載の組成物。
［６２］
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識ロイシン、^１３Ｃ標識リシン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、第４９項ないし第５５項のいずれかに記載の組成物。
［６３］
^１３Ｃ標識アミノ酸が^１３Ｃ標識ロイシンである、第４９項ないし第５６項および第６２項のいずれかに記載の組成物。
［６４］
経口投与形態である、第４９項ないし第６３項のいずれかに記載の組成物。
［６５］
非経口投与形態である、第４９項ないし第６３項のいずれかに記載の組成物。

本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。

使用動物
Zucker Diabetic Fatty Rat (ZDF-Lepr^fa/CrlCrlj)(日本チャールスリバー株式会社、神奈川、日本）を用いた。
ZDF fatty ラット：肥満遺伝子であるレプチン受容体変異をホモで有する（Lepr^fa/Lepr^fa）ラット。糖尿病モデル動物として用いた。
ZDF Lean ラット：優性遺伝子ホモ接合体（＋/＋）またはヘテロ接合体（Lepr^fa/+）を有するラット。

ZDF leanラットにおける呼吸商と ^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験との比較
（１）呼吸商の測定
雄性ZDF leanラット（３５〜３６週齢；ｎ＝２）を用いた。試験期間を通じて水分を自由摂取させた。図１に示すように、試験１日目の１９：００から２日目の１６：００まで非絶食期として、２日目１６：００から３日目１３：００までは絶食期とした。非絶食期には飼料として動物用飼料（商品名ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母社製）を自由摂取させた。１９：００から７：００は暗所とし、７：００から１９：００は明所とした。生体ガス分析用質量分析計（「Oxymax」Columbus社）を用いて、ラットの呼吸商を各時点で測定した。結果を図１に示す。非絶食期には、活動量の多い夜間、活動量が低下する昼間ともに呼吸商は０．９〜０．９５付近を推移し、絶食期には、呼吸商は０．７〜０．７５付近を推移した。絶食により肝臓でのグリコーゲン貯蔵が低下し、脂肪および／またはタンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが示唆される。

（２）^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験
ZDF leanラットを、上記と同様の非絶食／絶食および明暗サイクルに置いた。非絶食（２日目１３：００）または絶食（３日目１３：００）時に、生理食塩水に溶解した１−^１３Ｃ−ロイシン、１−^１３Ｃ−アラニンおよび１−^１３Ｃ−グルタミン酸（Cambridge Isotope Laboratories, Inc (Andover, MA，USA)）を、それぞれ５０μｍｏｌ／ｋｇで経口投与した（各ｎ＝４）。投与前（０分）と投与６０分までの各時点での呼気を採取し、呼気分析用質量分析計（「ABCA」Sercon）を用いて△^１３Ｃ（‰）を測定した。結果を図２に示す。いずれのアミノ酸でも、投与１０分後の△^１３Ｃ（‰）の値は絶食時よりも高く、この傾向は１−^１３Ｃ−ロイシンで約４５分間、１−^１３Ｃ−アラニンで約２０分間、１−^１３Ｃ−グルタミン酸で約４０分間持続した。このことは、絶食時にはアミノ酸代謝が上昇することを示す。絶食により肝臓でのグリコーゲン貯蔵が低下し、タンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが示唆される。

（３）結果
呼吸商の測定と、^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験の両方で、栄養状態（絶食／非絶食）を反映する結果が得られた。従って、呼吸商の測定の代替法として、^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験を利用できることが示唆される。

ZDF fattyラットにおける呼吸商、 ^１３Ｃアラニンを用いた呼気試験およびアルブミン測定
（１）呼吸商の測定
糖尿病モデルである雄性ZDF fattyラットＦ１およびＦ２（３６週齢）を用いた。Ｆ１は、体重が軽くフレイル状態で活動量が少ないことから、糖尿病性サルコペニア（筋力および筋肉量の低下）を発症していることが予測された。試験期間を通じて水分を自由摂取させ、物用飼料（商品名ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母社製）を自由摂取させた。１９：００から７：００は暗所とし、７：００から１９：００は明所とした。生体ガス分析用質量分析計（「Oxymax」Columbus社）を用いて、ラットの呼吸商を各時点で測定した。結果を図３に示す。Ｆ１ラットの呼吸商は０．７〜０．７５付近を推移し、Ｆ２ラットの呼吸商は０．７５〜０．８５付近を推移した。非絶食状態であるにも拘わらず、Ｆ１ラットの呼吸商はＦ２ラットよりも低かった。サルコペニアが疑われるＦ１ラットでは、筋肉由来のタンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが考えられ、この結果はそれを反映していると考えられる。

（２）^１３Ｃアラニンを用いた呼気試験
上記のZDF fattyラットＦ１およびＦ２を、上記と同様の明暗サイクルに置いた。生理食塩水に溶解した1-¹³C-アラニンを、５０μｍｏｌ／ｋｇで経口投与した。投与前（０分）と投与６０分までの各時点での呼気を採取し、呼気分析用質量分析計（「ABCA」Sercon）を用いて△^１３Ｃ（‰）を測定した。結果を図４に示す。投与開始から約５０分後まで、Ｆ１ラットの△^１３Ｃ（‰）の値はＦ２ラットよりも高かった。このことは、Ｆ１ラットでアミノ酸代謝が上昇していることを示す。サルコペニアが疑われるＦ１ラットでは、筋肉由来のタンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが考えられ、この結果はそれを反映していると考えられる。

（３）結果
呼吸商の測定と、^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験の両方で、栄養状態（疾患によるグリコーゲン貯蔵状態）を反映する結果が得られた。従って、呼吸商の測定の代替法として、^１３Ｃアミノ酸を用いた呼気試験を利用できることが示唆される。

ZDF fattyラットにおける呼吸商、 ^１３Ｃグルタミン酸を用いた呼気試験およびアルブミン測定
（１）呼吸商の測定
糖尿病モデルである雄性ZDF fattyラットＦ１、Ｆ２およびＦ３（３６週齢）を用いた。Ｆ１は、体重が軽くフレイル状態で活動量が少ないことから、糖尿病性サルコペニアを発症していることが予測された。試験期間を通じて水分を自由摂取させ、動物用飼料（商品名ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母社製）を自由摂取させた。１９：００から７：００は暗所とし、７：００から１９：００は明所とした。生体ガス分析用質量分析計（「Oxymax」Columbus社）を用いて、ラットの呼吸商を各時点で測定した。結果を図５に示す。Ｆ１ラットの呼吸商は０．７〜０．７５付近を推移し、Ｆ２およびＦ３ラットの呼吸商は０．７５〜０．８５付近を推移した。非絶食状態であるにも拘わらず、Ｆ１ラットの呼吸商はＦ２およびＦ３ラットよりも低かった。サルコペニアが疑われるＦ１ラットでは、筋肉由来のタンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが考えられ、この結果はそれを反映していると考えられる。

（２）^１３Ｃグルタミン酸を用いた呼気試験
上記のZDF fattyラットＦ１、Ｆ２およびＦ３を、上記と同様の明暗サイクルに置いた。生理食塩水に溶解した１−^１３Ｃ−グルタミン酸を、５０μｍｏｌ／ｋｇで経口投与した。投与前（０分）と投与６０分までの各時点での呼気を採取し、呼気分析用質量分析計（「ABCA」Sercon）を用いてΔ^１３Ｃ（‰）を測定した。結果を図６に示す。投与開始から測定終了時まで、Ｆ１ラットの△^１３Ｃ（‰）の値はＦ２およびＦ３ラットよりも高かった。このことは、Ｆ１ラットでアミノ酸代謝が上昇していることを示す。サルコペニアが疑われるＦ１ラットでは、筋肉由来のタンパク質をエネルギー源として燃焼させていることが考えられ、この結果はそれを反映していると考えられる。

本発明により、対象のリアルタイムの栄養状態を簡便かつ迅速に評価することができる。従って、本発明の方法を呼吸商の測定の代替法として使用することができる。即ち、従来の呼吸商の測定と同様の用途で、本発明の方法を使用することができる。

Claims

対象の栄養状態を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象の栄養状態を判定する工程、
を含む方法。
指標値が、対象と同種の正常な栄養状態の動物群において請求項１に記載の工程（１）に従って算出された割合から得られる値である、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象が低栄養状態であると判定し、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象が正常な栄養状態であると判定する、請求項２に記載の方法。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システインおよび^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識ヒスチジンおよび^１３Ｃ標識プロリンからなる群から選択される、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識ロイシン、^１３Ｃ標識リシン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸および^１３Ｃ標識ロイシンからなる群から選択される、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
対象が肝疾患または代謝性疾患に罹患している、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
対象が肝硬変に罹患している、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
対象が糖尿病に罹患している、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
対象の栄養状態を評価するための、^１３Ｃ標識アミノ酸を含む組成物。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グリシン、^１３Ｃ標識セリン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識システインおよび^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識グルタミン酸、^１３Ｃ標識グルタミン、^１３Ｃ標識アルギニン、^１３Ｃ標識ヒスチジンおよび^１３Ｃ標識プロリンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識ロイシン、^１３Ｃ標識リシン、^１３Ｃ標識トレオニン、^１３Ｃ標識イソロイシン、^１３Ｃ標識チロシン、^１３Ｃ標識フェニルアラニン、^１３Ｃ標識トリプトファンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
^１３Ｃ標識アミノ酸が、^１３Ｃ標識アラニン、^１３Ｃ標識グルタミン酸および^１３Ｃ標識ロイシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
対象のサルコペニアを診断する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識アミノ酸を投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および、
（２）当該割合を指標値と比較し、対象のサルコペニアを診断する工程、
を含む方法。
指標値が、対象と同種のサルコペニアに罹患していない動物群において、対象と同等の摂食状態で、請求項１６に記載の工程（１）に従って算出された割合から得られる値である、請求項１６に記載の方法。
請求項１６に記載の工程（２）において、当該割合が、指標値よりも高い場合に、対象がサルコペニアであると診断し、指標値と同等であるかそれよりも低い場合に、対象がサルコペニアに罹患していないと診断する、請求項１７に記載の方法。