JPWO2017221775A1 - 反応方法、ならびにこれを行う反応システムおよび反応装置 - Google Patents

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Abstract

ピペットチップを用いて流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引を含む液体接触工程を複数回行うことで、前記流路内において所定の反応を行う。複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引が行われる。一方で、複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引が行われる。

Description

本発明は、ピペットチップを用いて流路内への液体の注入および流路内からの液体の吸引を複数回行うことで流路内において所定の反応を行う反応方法、ならびにこれを行う反応システムおよび反応装置に関する。
生化学検査において抗原抗体反応などの生化学反応が利用されている。たとえば、蛍光免疫測定法(以下、「FIA」とも称する)では、被検出物質(抗原)に蛍光物質を含む標識物質を反応させる。その後、標識物質で標識された被検出物質に励起光を照射して、蛍光物質が発する蛍光を検出する。そして、検出された蛍光の強度などから、被検出物質の量を特定する。このようなFIAの中でも、特に高感度に被検出物質の検出を行うことが可能な方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「SPFS」とも称する)が知られている。
SPFSでは、被検出物質に特異的に結合できる第1の捕捉体(例えば1次抗体)を金属膜上に固定して、被検出物質を捕捉するための反応場を形成する。通常、反応場は、微細な流路内に形成される。そして、この流路に被検出物質を含む試料液(検体)を注入することで、第1の捕捉体に被検出物質を結合させる(1次反応)。次いで、蛍光物質で標識された第2の捕捉体(例えば2次抗体)を流路に注入することで、1次抗体に結合している被検出物質に、第2の捕捉体をさらに結合させる(2次反応)。つまり、被検出物質を、間接的に蛍光物質で標識する。この状態で金属膜に励起光を照射すると、蛍光物質が表面プラズモン共鳴(以下、「SPR」とも称する)により増強された局在場光により励起され、蛍光を放出する。そして、蛍光物質が放出した蛍光を検出することで、被検出物質を検出できる。
ここで、被検出物質を極少量含む検体を用いる場合、流路内において検体を往復送液することで、被検出物質と第1の捕捉体との接触機会を増やすことができ、検体中の被検出物質の損失を防止しつつ被検出物質の大部分を第1の捕捉体に結合させることができる。流路を洗浄するための洗浄液や、第2の捕捉体についても、同様に往復送液することが好ましい。しかしながら、図1Aに示されるように、流路44内に気泡74が発生してしまうと、第1の捕捉体70を気泡74が覆ってしまい、被検出物質71が気泡74に覆われた第1の捕捉体70に結合できなくなることがある。同様に、図1Bに示されるように、流路44内に気泡74が発生してしまうと、第2の捕捉体72が気泡74に覆われた被検出物質71に結合できなくなることがある。また、蛍光検出時に流路44内に気泡74が存在すると、屈折などの影響で蛍光を適切に検出できなくなってしまう。
このような気泡の発生を防ぐために、検体や洗浄液、第2の抗体などの液体を流路内において往復送液するときに、液体の注入および吸引のタイミングを調整することが提案されている(例えば特許文献1参照)。特許文献1に記載の発明では、空の流路内に液体を注入するとき、および流路内から液体をすべて除去するときを除いては、液体と気体との界面が反応場を通過しないように、往復送液の際における液体の注入および吸引のタイミングを調整している。このようにすることで、反応場の近傍における気泡の発生が防止される。
一方で、使い切りのピペットチップを用いて液体の分注を行う装置において、ピペットチップの先端の位置を光学式非接触センサーで検出することが開示されている(例えば特許文献2参照)。このようにピペットチップの先端の位置を検出した上でピペットチップを用いて容器内の液体の吸引を行うことで、容器内の液体を十分にピペットチップ内に吸引して残液量を少なくすることができると説明されている。
国際公開第2011/027851号 特開2005−201882号公報
特許文献1に記載の発明では、図2Aに示されるように、液体注入部45内において所定の位置に固定されたピペット(ピペットチップ135)を用いて、流路44内への液体73の注入および流路44内からの液体73の吸引を行っている。このように液体注入部45の底と接触していない位置に固定されたピペットチップ135を用いて流路44内の液体73を除去する場合、図2Bに示されるように、流路44のピペットチップ135側の端部近傍に液体73がわずかに残ってしまう。この状態で、液体73を吸引したピペットチップ135を取り出し、新たな液体73’を保持するピペットチップ135を所定の位置まで挿入すると、図2Cに示されるように、残っていた液体73が流路44内に押し出される。このままピペットチップ135から流路44内に新たな液体73’を注入すると、図2Dに示されるように、流路44内において残っていた液体73と新たに注入された液体73’との間に気泡74が発生してしまうこととなる。前述のとおり、流路44内に気泡74が存在すると、流路44内において適切に反応を行うことができなくなるおそれ、また蛍光を適切に検出できなくなるおそれがある。
また、気泡74が発生しなかったとしても、図2Bに示されるように、1次反応の直前に流路44内に液体73が残存していると、液体注入部45内に検体を注入したときに検体中の被検出物質の濃度が低下してしまい、被検出物質の検出の定量性が損なわれてしまうおそれもある。同様に、2次反応の直前に流路44内に液体73が残存していても、液体注入部45内に標識液を注入したときに標識液中の第2の捕捉体の濃度が低下してしまい、被検出物質の検出の定量性が損なわれてしまうおそれがある。
流路44内からの液体73の吸引時に流路44内に残る液体73の量を少なくする手段としては、図2Eに示されるように、ピペットチップ135を液体注入部45の底に接触させた状態で液体73の吸引を行うことが考えられる。しかしながら、ピペットチップ135を液体注入部45の底に繰り返し接触させると、ピペットチップ135およびそれを支持するノズルに荷重がかかるため、図2Eに示されるように、ピペットチップ135が変形したりピペットチップ135とノズルとの嵌合状態が変化したりしてしまい、ピペットチップ135の先端位置を適切に制御することができなくなるおそれがある。たとえば、流路44内からの液体73の吸引を行う前に、特許文献2に記載されているようにピペットチップ135の先端の位置を検出していたとしても、ピペットチップ135を液体注入部45の底に繰り返し接触させることでピペットチップ135の先端の位置が変化してしまい、一連の反応工程の後半において流路44内からの液体73の吸引を適切に行うことができなくなるおそれがある。
本発明の目的は、ピペットチップを用いて流路内への液体の注入および流路内からの液体の吸引を複数回行うことで流路内において所定の反応を行う反応方法であって、ピペットチップの変形および位置ずれを抑制しつつも適切に反応を行うことができる反応方法、ならびにこれを行う反応システムおよび反応装置を提供することである。
本発明の一実施形態に係る反応方法は、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップの前記液体注入部に前記開口部から挿入されたピペットチップにより、前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引を含む液体接触工程を複数回行うことで、前記流路内において所定の反応を行う反応工程を含み、複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引が行われ、複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引が行われる。
また、本発明の一実施形態に係る反応システムは、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップと、ピペットチップを装着された、前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、を有し、前記ピペット制御部は、前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引の組み合わせを複数回行わせ、複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引を前記ピペットに行わせ、複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引を前記ピペットに行わせる。
また、本発明の一実施形態に係る反応装置は、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップを保持するためのチップホルダーと、ピペットチップを装着することが可能であり、前記チップホルダーに保持された前記反応チップの前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、を有し、前記ピペット制御部は、前記チップホルダーに保持された前記反応チップの前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引の組み合わせを複数回行わせ、複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引を前記ピペットに行わせ、複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引を前記ピペットに行わせる。
本発明によれば、ピペットチップの変形および位置ずれを抑制しつつも適切に反応を行うことができる反応方法、ならびにこれを行う反応システムおよび反応装置を提供することができる。
図1Aおよび図1Bは、気泡の影響を説明するための模式図である。 図2A〜Fは、従来の送液方法の問題点を説明するための模式図である。 図3は、本発明の一実施形態に係る反応装置(SPFS装置)の構成を示す模式図である。 図4は、反応チップの断面図である。 図5は、本発明の一実施形態に係る検出方法(反応方法)のフローチャートであり、反応装置(SPFS装置)の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図6A〜Dは、本発明の一実施の形態に係る反応方法を示す模式図である。 図7A〜Dは、ピペットチップの先端の位置を検出する工程を説明するための模式図である。 図8は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。 図9は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。 図10A〜Dは、ピペットチップの先端の位置を検出する工程を説明するための模式図である。 図11は、変形例に係る検出方法(反応方法)のフローチャートである。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明では、本発明に係る反応システムおよび反応装置の代表例として、本発明の一実施の形態に係る反応方法を実施可能なSPFS装置について説明するが、本発明に係る反応システムおよび反応装置はこれに限定されない。以下の説明において、反応チップおよびピペットチップが装着されている状態のSPFS装置が本発明の一実施の形態に係る反応システムに該当し、反応チップおよびピペットチップが装着されていない状態のSPFS装置が本発明の一実施の形態に係る反応装置に該当する。
図3は、本発明の一実施の形態に係るSPFS装置100の構成を示す模式図である。図3に示されるように、SPFS装置100は、励起光照射ユニット110、蛍光検出ユニット120、送液ユニット130、搬送ユニット140、および制御部150を有する。SPFS装置100では、搬送ユニット140のチップホルダー142に反応チップ10を装着した状態で、反応チップ10の金属膜30に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光αを照射し、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光を発生させる。そして、当該局在場光により、金属膜30上に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質の有無や量を測定する。なお、本実施の形態では、反応チップ10は、液体チップ50と一体化されており、かつSPFS装置100のチップホルダー142に取り外し可能に装着されている。また、ピペットチップ135は、SPFS装置100のノズルユニット134に取り外し可能に装着されている。
以下では、反応チップ10およびSPFS装置100(反応システムおよび反応装置)について先に説明し、その後、反応チップ10において各種液体を送液して所定の反応を行う方法(反応方法)およびSPFS装置100を用いた被検出物質の検出方法について説明する。
(反応チップ)
図3に示されるように、反応チップ10は、入射面21、成膜面22、および出射面23を有するプリズム20と、プリズム20の成膜面22に形成された金属膜30と、プリズム20の成膜面22または金属膜30上に配置された流路蓋40とを有する。この後説明するように、反応チップ10は、さらに、流路44と、流路44の一端に接続された液体注入部45と、流路44の他端に接続された貯留部46も有する。本実施の形態では、流路蓋40は、両面テープなどの接着層60を介して金属膜30(またはプリズム20)に接着されており、接着層60は流路44の側面形状を規定する役割も担っている。流路蓋40は、接着層60を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、反応チップ10の金属膜30(またはプリズム20)に接合されていてもよい。この場合は、流路44の側面形状は、流路蓋40により規定される。また、本実施の形態では、反応チップ10は、液体チップ50と一体化されている。
プリズム20は、励起光αに対して透明な誘電体からなり、図3に示されるように、入射面21、成膜面22および出射面23を有する。入射面21は、励起光照射ユニット110からの励起光αをプリズム20の内部に入射させるための面である。また、成膜面22上には、金属膜30が配置されており、プリズム20の内部に入射した励起光αは、金属膜30の裏面、より具体的にはプリズム20と金属膜30との界面(成膜面22)にて反射する。一方、出射面23は、成膜面22にて反射した反射光をプリズム20の外部に出射させるための面である。
プリズム20の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム20の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面22であり、一方の脚に対応する面が入射面21であり、他方の脚に対応する面が出射面23である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面21と出射面23とが対称になり、励起光αのS波成分がプリズム20内に滞留しにくくなる。
入射面21は、励起光αが励起光照射ユニット110に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード(以下「LD」ともいう)である場合、励起光αがLDに戻ると、LDの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面21に垂直に入射しないように、入射面21の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜30に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面23から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜30に対する励起光αの入射角を走査した場合に、反応チップ10の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光(以下「プラズモン散乱光」という)γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施形態では、入射面21と成膜面22との角度および成膜面22と出射面23との角度は、いずれも約80°である。
なお、反応チップ10の設計により、共鳴角(およびその極近傍にある増強角)が概ね決まる。設計要素は、プリズム20の屈折率や、金属膜30の屈折率、金属膜30の膜厚、金属膜30の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜30上に第1の捕捉体を介して捕捉された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
プリズム20は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム20の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム20の材料は、好ましくは、屈折率が1.4〜1.6であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
金属膜30は、プリズム20の成膜面22上に配置されている。これにより、成膜面22に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜30中の自由電子との間で相互作用(SPR)が生じ、金属膜30の表面上に局在場光(一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる)が生じる。
金属膜30の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜30の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜30の形成方法は、特に限定されない。金属膜30の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜30の厚みは、特に限定されないが、30〜70nmの範囲内であることが好ましい。
図4は、図3とは別の方向から見た反応チップ10の断面図である。図4に示されるように、流路蓋40は、枠体41、液体注入部被覆フィルム42および貯留部被覆フィルム43を有する。枠体41には、2つの貫通孔が形成されている。一方の貫通孔の一方の開口部が金属膜30(またはプリズム20)により塞がれ、他方の開口部が液体注入部被覆フィルム42により塞がれることで、この貫通孔は液体注入部45として機能する。他方の貫通孔の一方の開口部が金属膜30(またはプリズム20)により塞がれ、他方の開口部が貯留部被覆フィルム43により塞がれることで、この貫通孔は貯留部46として機能する。貯留部被覆フィルム43には、通気孔47が設けられている。
前述のとおり、本実施の形態では、流路蓋40(枠体41)は、両面テープなどの接着層60を介して金属膜30(またはプリズム20)に接着されており、接着層60は流路44の側面形状を規定する役割も担っている。すなわち、接着層60には細長い形状の貫通孔が設けられており、この貫通孔の一方の開口部が金属膜30(またはプリズム20)により塞がれ、他方の開口部が枠体41により塞がれることで、一方の端部が液体注入部45に開口し、他方の端部が貯留部46に開口する流路44が形成される。流路蓋40が接着層60を用いずに金属膜30(またはプリズム20)に接合される場合は、枠体41の金属膜30側の面には、流路44の形状を規定する溝が形成される。この場合は、溝の開口部が金属膜30(またはプリズム20)により塞がれることで、一方の端部が液体注入部45に開口し、他方の端部が貯留部46に開口する流路44が形成される。
枠体41は、光(例えば、蛍光βおよびプラズモン散乱光γ)に対して透明な材料で形成されている。ただし、後述の検出方法における光の取り出しの妨げにならない限り、枠体41の一部は光に対して不透明な材料で形成されていてもよい。光に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。
液体注入部被覆フィルム42は、ピペットチップ135を挿入可能であり、かつピペットチップ135を挿入した際には、ピペットチップ135の外周に隙間なく密着することが可能なフィルムである。たとえば、液体注入部被覆フィルム42は、弾性フィルムおよび粘着フィルムの2層フィルムである。液体注入部被覆フィルム42には、ピペットチップ135を挿入するための微細な貫通孔を設けられていてもよい。本実施の形態では、液体注入部被覆フィルム42に外径が1.2mmの貫通孔が設けられている。
弾性フィルムの種類は、ピペットチップ135挿入時にピペットチップ135の外周に密着可能であれば特に限定されない。たとえば、弾性フィルムは、引張弾性定数が0.05〜2GPa、引張破断伸度が200〜2000%、引裂強度が80〜3000mNであるポリウレタンフィルムである。弾性フィルムのその他の例には、低密度ポリエチレン(LDPE)、直鎖状低密度ポリエチレン(LLDPE)、中密度ポリエチレン(MDPE)、ナイロン、無延伸ポリプロピレン(CPP)、エチレン−ビニルアルコール共重合体(EVOH)、シリコーン、ポリビニルアルコール(PVA)およびポリ塩化ビニル(PVC)などからなるフィルムが含まれる。弾性フィルムの厚みは、特に制限されないが、例えば100μm程度である。粘着フィルムの種類は、弾性フィルムと枠体41とを互いに固定可能であれば特に制限されない。
前述のとおり、貯留部被覆フィルム43は、通気孔47を有する。貯留部被覆フィルム43の構成は、特に制限されない。たとえば、貯留部被覆フィルム43は、前述の液体注入部被覆フィルム42と同様の2層フィルムであってもよい。
流路44内に露出している金属膜30には、第1の捕捉体が固定されている。第1の捕捉体は、検体中の被検出物質と特異的に結合するための認識部位を有する物質である。流路44内に第1の捕捉体が固定されていると、流路44内に検体を往復送液したときに、第1の捕捉体に被検出物質が選択的に結合する。つまり、第1の捕捉体が固定されている領域が反応場となり、被検出物質が反応場に捕捉される。後述のように、この反応場では、第1の捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する反応も行われる。この蛍光物質から放出される蛍光を検出することで被検出物質を検出することができる。第1の捕捉体の種類は、被検出物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第1の捕捉体の例には、被検出物質に特異的に結合可能な抗体(1次抗体)またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などが含まれる。流路44の幅および高さは、特に制限されず、反応チップ10の用途などに応じて適宜選択される。
液体注入部45には、図6に示されるように、ピペットチップ135が挿入される。このとき、液体注入部45の開口部(液体注入部被覆フィルム42に設けられた貫通孔)はピペットチップ135の外周に隙間なく接触している。このため、ピペットチップ135から液体注入部45内に液体を注入することで流路44内に液体を導入することができ、液体注入部45内の液体をピペットチップ135に吸引することで流路44内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路44内において液体を往復送液することもできる。液体注入部45の形状および容積は、ピペットチップ135の形状などに合わせて適宜選択される。
液体注入部45から流路44内に流路44の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部46には流路44から液体が流入する。また、流路44内において液体を往復送液するときにも、貯留部46には液体が流入する。貯留部46に流入した液体は、貯留部46内で攪拌される。貯留部46内で液体が攪拌されると、流路44を通過する液体(検体や洗浄液など)の成分(例えば被検出物質や洗浄成分など)の濃度が均一になり、流路44内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。なお、貯留部46の形状および容積は、液体の往復送液時に液体を十分に貯留可能であれば、特に制限されない。
前述のとおり、本実施の形態では、反応チップ10および液体チップ50は、一体可されている(図3参照)。液体チップ50は、検体や標識液、洗浄液、測定用緩衝液などの液体をそれぞれ収容した複数のウェルを含む。これらのウェルの開口部は、液体を収容した状態でフィルムなどにより閉塞されていてもよい。ウェルの開口部を閉塞するフィルムは、液体チップ50の使用前にユーザーにより取り除かれてもよい。また、ピペットチップ135がフィルムを貫くことができる場合は、ウェルの開口部がフィルムで閉塞された状態で液体チップ50が使用されてもよい。
反応チップ10および液体チップ50は、通常、測定のたびに交換される。また、反応チップ10は、好ましくは各片の長さが数mm〜数cmの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
(SPFS装置)
次に、SPFS装置100の反応チップ10以外の構成要素について説明する。前述のとおり、SPFS装置100は、励起光照射ユニット110、蛍光検出ユニット120、送液ユニット130、搬送ユニット140および制御部150を有する。
励起光照射ユニット110は、チップホルダー142に保持された反応チップ10に励起光αを照射する。蛍光βまたはプラズモン散乱光γの測定時には、励起光照射ユニット110は、金属膜30に対する入射角がSPRを生じさせる角度となるように、金属膜30に対するP波のみを入射面21に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム20を介して金属膜30にSPRが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜30の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット110は、光源ユニット111、角度調整機構112および光源制御部113を含む。
光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜30裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット111は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、APC機構および温度調整機構(いずれも不図示)を含む。
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード(LD)である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜30にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜30裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
APC機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、APC機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、APC機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
角度調整機構112は、金属膜30(プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22))に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構112は、プリズム20を介して金属膜30の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー142とを相対的に回転させる。
たとえば、角度調整機構112は、光源ユニット111を励起光αの光軸と直交する軸(図3の紙面に対して垂直な軸)を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜30上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における2つの励起光αの光軸の交点近傍(成膜面22上の照射位置と入射面21との間)に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
前述のとおり、金属膜30に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。反応チップ10のプリズム20の材料および形状、金属膜30の膜厚、流路44内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路44内の蛍光物質の種類および量、プリズム20の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
光源制御部113は、光源ユニット111に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット111からの励起光αの出射を制御する。光源制御部113は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
蛍光検出ユニット120は、金属膜30への励起光αの照射によって生じた蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット120は、金属膜30への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。蛍光検出ユニット120は、受光ユニット121、位置切り替え機構122およびセンサー制御部123を含む。
受光ユニット121は、反応チップ10の金属膜30の法線方向に配置される。受光ユニット121は、第1レンズ124、光学フィルター125、第2レンズ126および受光センサー127を含む。
第1レンズ124は、例えば、集光レンズであり、金属膜30上から出射される光を集光する。第2レンズ126は、例えば、結像レンズであり、第1レンズ124で集光された光を受光センサー127の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター125は、両レンズの間に配置されている。
光学フィルター125は、蛍光成分のみを受光センサー127に導き、高いS(シグナル)/N(ノイズ)比で蛍光βを検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光γ)を除去する。光学フィルター125の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター125は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
受光センサー127は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー127は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー127は、例えば、光電子増倍管(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)などである。
位置切り替え機構122は、光学フィルター125の位置を、受光ユニット121における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー127が蛍光βを検出する時には、光学フィルター125を受光ユニット121の光路上に配置し、受光センサー127がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター125を受光ユニット121の光路外に配置する。
センサー制御部123は、受光センサー127の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー127の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー127の感度の変更、などを制御する。センサー制御部123は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
送液ユニット130は、チップホルダー142に保持された反応チップ10の液体注入部45内に各種液体を注入して流路44内に液体を導入する。また、送液ユニット130は、チップホルダー142に保持された反応チップ10の液体注入部45から各種液体を吸引して流路44内の液体を除去する。また、送液ユニット130は、液体注入部45内への液体の注入および液体注入部45内の液体の吸引を交互に繰り返すことで、流路44内において液体を往復送液する。本実施の形態では、送液ユニット130は、例えば検体や、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を含む標識液、洗浄液、蛍光測定時に用いられる測定用緩衝液などの注入および吸引を行う。このように、流路44内への液体の注入および流路44内からの液体の吸引を含む液体接触工程を複数回行うことで、流路44内において所定の反応が行われる。本明細書では、このように複数回の液体接触工程を行うことで、流路44内において所定の結果を生じさせる一連の工程を「反応工程」ともいう。
送液ユニット130は、ピペット131およびピペット制御部132を有する。
ピペット131は、シリンジポンプ133と、シリンジポンプ133に接続されたノズルユニット134と、ノズルユニット134の先端に装着されたピペットチップ135と、シリンジポンプ133とノズルユニット134との間に接続された圧力センサー136とを有する。シリンジポンプ133内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ135における液体の吸引および排出が定量的に行われる。圧力センサー136は、ピペットチップ135内の圧力を検出する。
本実施の形態では、ピペットチップ135を反応チップ10の液体注入部45内に挿入したときに、液体注入部45の開口部(液体注入部被覆フィルム42に設けられた貫通孔)とピペットチップ135の外周とが隙間なく接触する必要がある。そこで、ピペットチップ135のうち、反応チップ10の液体注入部被覆フィルム42と接触する領域は、外径が一定であることが好ましく、円柱形状であることが好ましい。なお、液体注入部被覆フィルム42と接触しない領域では、外径が一定である必要はなく、任意の形状とすることができる。また、ピペットチップ135を数百μm程度上下方向(ピペットチップ135の軸方向)に移動させても、液体注入部45の開口部(液体注入部被覆フィルム42に設けられた貫通孔)とピペットチップ135の外周との間に隙間が生じないということであれば、ピペットチップ135の外形形状は、特に限定されず、例えば円錐台形状であってもよい。
ピペットチップ135の材料は、特に限定されない。通常、ピペットチップ135は、樹脂製の使い切りのピペットチップである。このような樹脂製のピペットチップ135は、大きな荷重が繰り返し加わると、変形してしまったり、ノズルユニット134との嵌合状態が変化してしまったりすることがある。
ピペット制御部132は、シリンジポンプ133の駆動装置、およびピペットチップ135の移動装置を含む。シリンジポンプ133の駆動装置は、シリンジポンプ133のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、送液量や送液速度を管理できるため、反応チップ10の残液量を管理する観点から好ましい。ピペットチップ135の移動装置は、例えば、ノズルユニット134を、ピペットチップ135の軸方向(例えば垂直方向)に自在に動かす。ピペットチップ135の移動装置は、例えば、ステッピングモーターを含む駆動装置、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
ピペット制御部132は、シリンジポンプ133を駆動して、液体チップ50から各種液体をピペットチップ135内に吸引させる。そして、ピペット制御部132は、ピペットチップ135を移動させて、反応チップ10の液体注入部45内に開口部(液体注入部被覆フィルム42に設けられた貫通孔)からピペットチップ135を挿入させるとともに、シリンジポンプ133を駆動して、ピペットチップ135内の液体を液体注入部45内に注入させる。また、液体の供給後、ピペット制御部132は、シリンジポンプ133を駆動して、液体注入部45内の液体をピペットチップ135内に吸引させる。ピペット制御部132は、シリンジポンプ133を駆動して、液体の注入および液体の吸引を交互に繰り返させることで、流路44内において液体を往復送液させる。このように往復送液することによって、流路44内を洗浄したり、流路44内において第1の捕捉体と被検出物質を反応させたり(1次反応)、被検出物質と蛍光物質で標識された第2の捕捉体とを反応させたりする(2次反応)。流路44内の液体を除去する場合は、ピペット制御部132は、液体注入部45内の液体をピペットチップ135内に吸引させる。この後説明するように、ピペット制御部132は、ピペットチップ135の変形やピペットチップ135の位置ずれなどを防ぐために、その次に行われる工程の内容に応じて、流路44内の液体を除去するときのピペットチップ135の先端の位置を調整する。
また、ピペット制御部132は、ピペットチップ135内に液体または気体を吸引するときのピペットチップ135内の圧力を圧力センサー136を用いて検出することで、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の先端の位置を特定する。
搬送ユニット140は、反応チップ10および液体チップ50を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット110が反応チップ10に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを蛍光検出ユニット120が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット130が液体チップ50のウェル内の液体を吸引するか、送液ユニット130が反応チップ10の液体注入部45内に液体を注入するか、または反応チップ10の流路44内の液体を液体注入部45から吸引する位置である。搬送ユニット140は、搬送ステージ141およびチップホルダー142を含む。チップホルダー142は、搬送ステージ141に固定されており、反応チップ10および液体チップ50を着脱可能に保持する。チップホルダー142の形状は、反応チップ10および液体チップ50を保持することが可能であり、かつ励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー142には、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ141は、チップホルダー142を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ141も、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。搬送ステージ141は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
制御部150は、角度調整機構112、光源制御部113、位置切り替え機構122、センサー制御部123、ピペット制御部132および搬送ステージ141を制御する。制御部150は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
(検出方法)
次に、SPFS装置100(反応装置、反応システム)を用いた被検出物質の検出方法について説明する。図5は、本実施形態の検出方法を行う際のSPFS装置100の動作手順の一例を示すフローチャートである。前半の、反応チップ10の流路44内に各種液体を送液して、蛍光物質で標識された被検出物質が反応場に捕捉されている状態を生じさせる工程(工程S30〜S70)が、本発明の一実施の形態に係る反応方法に相当する。また、図6A〜Dは、本実施の形態に係る反応方法を説明するための模式図である。
まず、SPSF装置100のチップホルダー142に前述の反応チップ10を設置する(工程S10)。
次いで、ピペットチップ135の先端の位置を検出する(工程S20)。具体的には、ピペットチップ135内に気体を吸引させたときのピペットチップ135内の圧力に基づいてピペットチップ135と液体注入部45の底との接触状態を検出して、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定する。
たとえば、図7Aおよび図7Bに示されるように、ピペットチップ135を液体注入部45の底に向けて移動させながら、ピペットチップ135内に液体注入部45内の気体を吸引させればよい。このとき、圧力センサー136によりピペットチップ135内の圧力を検出する。このようにすると、図8に示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触した時または接触する直前に、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に増大する。したがって、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に増大したときのピペットチップ135の先端の位置を液体注入部45の底の位置と判断することができる。なお、図8のグラフでは、負圧量が顕著に増大した後に吸引を停止している。
より具体的には、まず、あらかじめ保持している大まかな情報に基づき、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に対して200μm上方に位置するように、ピペットチップ135(ノズルユニット134)を移動させる。この状態で、圧力センサー136によりピペットチップ135内の負圧量を検出しながら液体注入部45内の気体を500μL/分の速度で25μL吸引する。その後、ピペットチップ135を下方に100μm移動させ、圧力センサー136によりピペットチップ135内の負圧量を検出しながら液体注入部45内の気体を25μL吸引する。ピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を超えるまで、この動作を繰り返すことで、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定することができる。なお、ピペットチップ135の下方への移動回数があらかじめ設定されている回数を超えてもピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を超えない場合は、何らかのトラブルが発生していると判断して本工程を終了してもよい。
また、図7Cおよび図7Dに示されるように、ピペットチップ135の先端を液体注入部45の底に接触させた状態でピペットチップ135内への気体の吸引を開始し、その後ピペットチップ135を液体注入部45の開口部に向けて移動させてもよい。このときも、圧力センサー136によりピペットチップ135内の圧力を検出する。このようにすると、図9に示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触している状態では、ピペットチップ135の内部の負圧量が大きいが、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底から離れると、ピペットチップ135の内部の負圧量が顕著に減少する。したがって、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に減少したときのピペットチップ135の先端の位置を液体注入部45の底の位置と判断することができる。
より具体的には、まず、あらかじめ保持している大まかな情報に基づき、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に対して100μm下方に位置するように、ピペットチップ135(ノズルユニット134)を移動させる。実際はピペットチップ135は液体注入部45の底より下方に移動することはできないが、このようにピペットチップ135を移動させることで、ピペットチップ135の先端を液体注入部45の底に確実に接触させることができる。なお、この条件であれば、ピペットチップ135の先端にかかる荷重はそれほど大きくないため、ピペットチップ135の先端が変形することはない。この状態で、ピペットチップ135内の気体を4800μL/分の速度で80μL吸引して、ピペットチップ135内部を負圧にする。その後、ピペットチップ135内の負圧量が閾値を下回るまでピペットチップ135を上方に移動させる。このようにすることで、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定することができる。なお、ピペットチップ135の上方への移動回数または移動距離があらかじめ設定されている回数を超えてもピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を下回らない場合は、何らかのトラブルが発生していると判断して本工程を終了してもよい。
一つ目のピペットチップ135を下方に移動させることでピペットチップ135の先端の位置を検出する方法(図7Aおよび図7B)は、ピペットチップ135の先端にかかる荷重を小さくすることができるという利点を有している。一方、二つ目のピペットチップ135を上方に移動させることでピペットチップ135の先端の位置を検出する方法(図7Cおよび図7D)は、シリンジポンプ133の容量が小さくてもよいという利点、および短時間で位置検出が完了するという利点を有している。なお、図7A〜Dでは、流路44内に液体が無い状態でピペットチップ135内に気体を吸引させた例を示しているが、この後説明するように、流路44内に液体がある状態でピペットチップ135内に液体を吸引させても、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定することができる。また、上記の説明では、シリンジポンプ133の駆動およびピペットチップ135(ノズルユニット134)の移動を断続的かつ異なるタイミングで行っているが、シリンジポンプ133の駆動およびピペットチップ135(ノズルユニット134)の移動は、連続的かつ同時に行ってもよい。
次いで、光学ブランク値を測定する(工程S30)。この工程では、液体注入部被覆フィルム42とピペットチップ135との間を密閉した状態で、流路44内への測定用緩衝液の注入(図6A参照)および流路44内からの測定用緩衝液の吸引(図6B参照)が行われる。具体的には、制御部150は、搬送ステージ141を制御して、反応チップ10を設置位置から送液位置に移動させる。この後、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、測定用の緩衝液を液体注入部45内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Aに示されるように液体注入部45の底から離れている。次いで、制御部150は、搬送ステージ141を制御して、反応チップ10を送液位置から検出位置に移動させる。この後、制御部150は、光源制御部113を制御して、金属膜30(成膜面22)に向けて光源ユニット111から、増強角で励起光αを出射させる。これと同時に、制御部150は、センサー制御部123を制御して、受光センサー127で光の光量を検出し、これをブランク値として記録する。次いで、制御部150は、搬送ステージ141を制御して、反応チップ10を検出位置から送液位置に移動させる。この後、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、測定用の緩衝液を流路44内から吸引する。このとき、図6Bに示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触するか、または近接する状態で、流路内44内からの液体の吸引が行われる(第1の吸引)。したがって、液体注入部45内にはほとんど測定用の緩衝液(液体73)は残らない(図6Dと比較参照)。ここで、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に近接する状態とは、ピペットチップ135を用いて液体注入部45内の液体または気体を吸引しようとした場合に、ピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが十分に離れているときに比べて、ピペットチップ135内の負圧量が大きくなる程度に、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に近づいている状態を意味する。たとえば、ピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが近接している状態とは、ピペットチップ135の先端と液体注入部45の底との間隔が、0μmを超え、かつ100μm以下の状態である。
工程S30の最後に測定用緩衝液の除去を行う際には、以後の工程においてピペットチップ135をより正確に移動させるために、ピペットチップ135の先端の位置も検出することが好ましい。具体的には、ピペットチップ135の先端の位置を検出する工程(工程S20)と同様に、ピペットチップ135内に液体を吸引させたときのピペットチップ135内の圧力に基づいてピペットチップ135と液体注入部45の底との接触状態を検出して、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定する。
たとえば、図10Aおよび図10Bに示されるように、ピペットチップ135を液体注入部45の底に向けて移動させながら、ピペットチップ135内に液体注入部45内の液体を吸引させればよい。このとき、圧力センサー136によりピペットチップ135内の圧力を検出する。このようにすると、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触した時または接触する直前に、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に増大する。したがって、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に増大したときのピペットチップ135の先端の位置を液体注入部45の底の位置と判断することができる。
より具体的には、まず、あらかじめ保持している大まかな情報に基づき、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に対して200μm上方に位置するように、ピペットチップ135(ノズルユニット134)を移動させる。この状態で、液体注入部45内の液体を500μL/分の速度で195μL吸引して、流路44内に液体がある場合は液体の大部分を除去する。その後、ピペットチップ135を下方に100μm移動させ、圧力センサー136によりピペットチップ135内の負圧量を検出しながら液体注入部45内の液体を25μL吸引する。ピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を超えるまで、この動作を繰り返すことで、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定することができる。なお、ピペットチップ135の下方への移動回数があらかじめ設定されている回数を超えてもピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を超えない場合は、何らかのトラブルが発生していると判断して本工程を終了してもよい。
また、図10Cおよび図10Dに示されるように、ピペットチップ135の先端を液体注入部45の底に接触させた状態でピペットチップ135内への液体の吸引を開始し、その後ピペットチップ135を液体注入部45の開口部に向けて移動させてもよい。このときも、圧力センサー136によりピペットチップ135内の圧力を検出する。このようにすると、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触している状態では、ピペットチップ135の内部の負圧量が大きいが、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底から離れると、ピペットチップ135の内部の負圧量が顕著に減少する。したがって、ピペットチップ135内の負圧量が顕著に減少したときのピペットチップ135の先端の位置を液体注入部45の底の位置と判断することができる。
より具体的には、まず、あらかじめ保持している大まかな情報に基づき、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に対して100μm下方に位置するように、ピペットチップ135(ノズルユニット134)を移動させる。実際はピペットチップ135は液体注入部45の底より下方に移動することはできないが、このようにピペットチップ135を移動させることで、ピペットチップ135の先端を液体注入部45の底に確実に接触させることができる。なお、この条件であれば、ピペットチップ135の先端にかかる荷重はそれほど大きくないため、ピペットチップ135の先端が変形することはない。この状態で、ピペットチップ135内の気体または液体を4800μL/分の速度で80μL吸引して、ピペットチップ135内部を負圧にする。その後、ピペットチップ135内の負圧量が閾値を下回るまでピペットチップ135を上方に移動させる。このようにすることで、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定することができる。なお、ピペットチップ135の上方への移動回数または移動距離があらかじめ設定されている回数を超えてもピペットチップ135内の負圧量が所定の閾値を下回らない場合は、何らかのトラブルが発生していると判断して本工程を終了してもよい。
前述のとおり、一つ目のピペットチップ135を下方に移動させることでピペットチップ135の先端の位置を検出する方法(図10Aおよび図10B)は、ピペットチップ135の先端にかかる荷重を小さくすることができるという利点を有している。一方、二つ目のピペットチップ135を上方に移動させることでピペットチップ135の先端の位置を検出する方法(図10Cおよび図10D)は、シリンジポンプ133の容量が小さくてもよいという利点、および短時間で位置検出が完了するという利点を有している。なお、上記の説明では、シリンジポンプ133の駆動およびピペットチップ135(ノズルユニット134)の移動を断続的かつ異なるタイミングで行っているが、シリンジポンプ133の駆動およびピペットチップ135(ノズルユニット134)の移動は、連続的かつ同時に行ってもよい。
前述のとおり、反応チップ10の金属膜30(成膜面22)に対する励起光αの入射角は増強角とされる。増強角の値は、あらかじめ設定されていてもよいし、別工程により決定されてもよい。増強角は、金属膜30(成膜面22)に対する励起光αの入射角を走査しながらプラズモン散乱光γを検出したときに、プラズモン散乱光γの強度が最大となる入射角として決定されうる。増強角は、プリズム20の素材および形状、金属膜30の厚み、流路44内の液体の屈折率などにより決まるが、流路44内の液体の種類および量、プリズム20の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、検出を行うたびに増強角を決定することが好ましい。
なお、光学ブランク値を測定する工程(工程S30)の最初の時点において、反応チップ10の流路44内に保湿剤が存在する場合には、測定用の緩衝液を液体注入部45内に提供する前に流路44内を洗浄して保湿剤を除去することが好ましい。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、液体注入部45内への洗浄液の注入および液体注入部45内の洗浄液の吸引を行うことで、流路44内の保湿剤を除去する。
次いで、1次反応を行う(工程S40)。この工程では、液体注入部被覆フィルム42とピペットチップ135との間を密閉した状態で、流路44内への検体の注入(図6C参照)および流路44内からの検体の吸引(図6D参照)が行われる。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、検体を液体注入部45内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Cに示されるように液体注入部45の底から離れている。この状態で、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、液体注入部45内の検体(液体73)の吸引および液体注入部45内への検体(液体73)の注入を交互に繰り返すことで、流路44内において検体(液体73)を往復送液する。これにより、反応チップ10内の金属膜30上に固定された第1の捕捉体に、検体中に含まれる被検出物質が特異的に結合する。次いで、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、検体を流路44内から吸引する。このとき、図6Dに示されるように、前記第1の吸引(工程S30の最後に行われる液体の吸引)よりもピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが離れた状態で、流路内44内からの液体の吸引が行われる(第2の吸引)。したがって、液体注入部45内には少し検体(液体73)が残ることがある(図6Bと比較参照)。
検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。またこれらの検体に含まれる被検出物質の例には、核酸(DNAやRNAなど)、タンパク質(ポリペプチドやオリゴペプチドなど)、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
次いで、流路44内を洗浄する(工程S50)。この工程では、液体注入部被覆フィルム42とピペットチップ135との間を密閉した状態で、流路44内への洗浄液の注入(図6A参照)および流路44内からの洗浄液の吸引(図6B参照)が行われる。洗浄液の種類は、特に限定されない。洗浄液の例には、緩衝液が含まれる。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、洗浄液を流路44内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Aに示されるように液体注入部45の底から離れている。この状態で、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、液体注入部45内の洗浄液(液体73)の吸引および液体注入部45内への洗浄液(液体73)の注入を交互に繰り返すことで、流路44内において洗浄液(液体73)を往復送液する。これにより、遊離の被検出物質などが除去される。次いで、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、洗浄液を流路44内から吸引する。このとき、図6Bに示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触するか、または近接する状態で、流路内44内からの液体の吸引が行われる(第1の吸引)。したがって、液体注入部45内にはほとんど洗浄液(液体73)は残らない(図6Dと比較参照)。
工程S50の最後に洗浄液の除去を行う際には、以後の工程においてピペットチップ135をより正確に移動させるために、ピペットチップ135の先端の位置も検出することが好ましい。具体的には、光学ブランク値を測定する工程(工程S30)の最後に行うピペットチップ135の先端の位置の検出と同様に、ピペットチップ135内に液体を吸引させたときのピペットチップ135内の圧力に基づいてピペットチップ135と液体注入部45の底との接触状態を検出して、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定する(図10A〜D参照)。
次いで、2次反応を行う(工程S60)。この工程では、液体注入部被覆フィルム42とピペットチップ135との間を密閉した状態で、液体注入部45内への検体の注入(図6C参照)および流路44内からの検体の吸引(図6D参照)が行われる。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を含む標識液を流路44内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Cに示されるように液体注入部45の底から離れている。この状態で、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、液体注入部45内の標識液(液体73)の吸引および液体注入部45内への標識液(液体73)の注入を交互に繰り返すことで、流路44内において標識液(液体73)を往復送液する。これにより、金属膜30上の第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体が結合する。すなわち、第1の捕捉体により捕捉されている被検出物質が、間接的に蛍光物質で標識される。次いで、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、標識液を流路44内から吸引する。このとき、図6Dに示されるように、前記第1の吸引(工程S30の最後に行われる液体の吸引および工程S50の最後に行われる液体の吸引)よりもピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが離れた状態で、流路内44内からの液体の吸引が行われる(第2の吸引)。したがって、液体注入部45内には少し標識液(液体73)が残ることがある(図6Bと比較参照)。
第2の捕捉体は、第1の捕捉体が被検出物質に特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質であればよく、被検出物質に特異的な生体分子であってもよく、その断片などであってもよい。また、第2の捕捉体は、1分子からなるものであってもよく、2以上の分子が結合した複合体であってもよい。
次いで、流路44内を洗浄する(工程S70)。この工程では、液体注入部被覆フィルム42とピペットチップ135との間を密閉した状態で、流路44内への洗浄液の注入(図6A参照)および流路44内からの洗浄液の吸引(図6B参照)が行われる。洗浄液の種類は、特に限定されない。洗浄液の例には、緩衝液が含まれる。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、洗浄液を液体注入部45内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Aに示されるように液体注入部45の底から離れている。この状態で、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、液体注入部45内の洗浄液(液体73)の吸引および液体注入部45内への洗浄液(液体73)の注入を交互に繰り返すことで、流路44内において洗浄液(液体73)を往復送液する。これにより、遊離の第2の捕捉体などが除去される。次いで、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、洗浄液を流路44内から吸引する。このとき、図6Bに示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触するか、または近接する状態で、流路内44内からの液体の吸引が行われる(第1の吸引)。したがって、液体注入部45内にはほとんど洗浄液(液体73)は残らない(図6Dと比較参照)。
工程S70の最後に洗浄液の除去を行う際には、以後の工程においてピペットチップ135をより正確に移動させるために、ピペットチップ135の先端の位置も検出することが好ましい。具体的には、光学ブランク値を測定する工程(工程S30)の最後に行うピペットチップ135の先端の位置の検出と同様に、ピペットチップ135内に液体を吸引させたときのピペットチップ135内の圧力に基づいてピペットチップ135と液体注入部45の底との接触状態を検出して、液体注入部45の底に対するピペットチップ135の位置を特定する(図10A〜D参照)。
次いで、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する(工程S80)。具体的には、制御部150は、ピペット制御部132を制御して、測定用の緩衝液を液体注入部45内に提供する。このとき、ピペットチップ135の先端は、図6Cに示されるように液体注入部45の底から離れている。次いで、制御部150は、搬送ステージ141を制御して、反応チップ10を送液位置から検出位置に移動させる。この後、制御部150は、光源制御部113を制御して、金属膜30(成膜面22)に向けて光源ユニット111から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部150は、センサー制御部123を制御して、受光センサー127で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。
最後に、被検出物質の存在または量を算出する(工程S90)。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分(シグナル値)と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部150は、工程S80で得られた蛍光値から工程S30で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。
以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。
本実施の形態に係る検出方法(反応方法)では、流路44内への液体73の注入および流路44内からの液体73の吸引を含む液体接触工程を複数回行う。具体的には、液体接触工程として、測定用緩衝液の注入および吸引を行う光学ブランク値の測定工程(工程S30)と、検体の注入および吸引を行う1次反応工程(工程S40)と、洗浄液の注入および吸引を行う洗浄工程(工程S50)と、標識液の注入および吸引を行う2次反応工程(工程S60)と、洗浄液の注入および吸引を行う洗浄工程(工程S70)とを行う。
これらの液体接触工程のうち、1次反応の直前の液体接触工程(光学ブランク値の測定工程;工程S30)、2次反応の直前の液体接触工程(洗浄工程;工程S50)および蛍光値の測定の直前の液体接触工程(洗浄工程;工程S70)では、図6Bに示されるように、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触するか、または近接する状態で液体73の吸引が行われる(第1の吸引)。したがって、1次反応工程(工程S40)で検体を注入するときに前工程の残液がほとんどないため、検体が意図せず希釈されてしまい、検出結果が変化してしまうことを防ぐことができる。同様に、2次反応工程(工程S60)で標識液を注入するときも前工程の残液がほとんどないため、標識液が意図せず希釈されてしまい、検出結果が変化してしまうことを防ぐことができる。また、蛍光値の測定工程(工程S80)で測定用緩衝液を注入するときも前工程の残液がほとんどないため、流路内に遊離の第2の捕捉体が残ってしまい、検出結果が変化してしまうことを防ぐこともできる。
一方で、ピペットチップ135の先端を液体注入部45の底に繰り返し接触させると、ノズルユニット134に対するピペットチップ135の嵌合状態が変わったり、ピペットチップ135の先端の形状が変化してしまったりするおそれがある。これを防ぐため、本実施の形態に係る検出方法(反応方法)では、流路44内に液体73が少し残っても検出結果に大きな影響を及ぼさない液体接触工程、具体的には1次反応工程(工程S40)および2次反応工程(工程S60)では、図6Dに示されるように、第1の吸引よりもピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが離れた状態(ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触していない状態)で液体73の吸引が行われる(第2の吸引)。
このように、本実施の形態に係る検出方法(反応方法)では、複数回行われる液体接触工程のうちの少なくとも1回の液体接触工程では、ピペットチップ135と液体注入部45の底とが接触するか、または近接する状態で液体73の吸引(第1の吸引)が行われ、少なくとも1回の他の液体接触工程では、第1の吸引よりもピペットチップ135の先端と液体注入部45の底とが離れた状態で液体73の吸引(第2の吸引)が行われる。このようにすることで、ピペットチップ135に荷重がかかる回数を低減してピペットチップ135の変形および位置ずれを抑制しつつも、適切に反応を行うことができる。
また、第1の吸引を行う際に取得したピペットチップ135の先端の位置情報に基づいて、以後の工程におけるピペットチップ135の移動制御を行うことで、ピペットチップ135の位置ずれをより低減することができる。たとえば、ピペットチップ135の位置検出を行った後に、ピペットチップ135の液体注入部45内への挿入および液体注入部45内からの抜去を繰り返した場合、液体注入部被覆フィルム42からの荷重によりピペットチップ135の位置がずれることがある。また、ピペットチップ135の位置検出を行った後にピペットチップ135の温度が変化した場合、ピペットチップ135のサイズが変化することもある。したがって、ピペットチップ135の先端の位置を早い段階で特定しても、その後の1次反応工程(工程S40)や2次反応工程(工程S60)、蛍光測定の直前の洗浄工程(工程S70)までにピペットチップ135の先端の位置がずれてしまうことがありうる。しかしながら、1次反応工程(工程S40)、2次反応工程(工程S60)および/または洗浄工程(工程S70)の直前に行われる液体接触工程において、同時にピペットチップ135の先端の位置を特定すれば、1次反応工程(工程S40)、2次反応工程(工程S60)および/または洗浄工程(工程S70)におけるピペットチップ135の位置ずれをより低減することができる。
なお、図5に示される動作手順では、最初のピペットチップ135の位置検出を独立工程(工程S20)としたが、最初のピペットチップ135の位置検出工程を他の液体接触工程と同時に行ってもよい。たとえば、図11に示されるように、測定用緩衝液の注入および吸引を行う光学ブランク値の測定工程(工程S30’)において、流路44内から測定用緩衝液を吸引するときにピペットチップ135の位置を検出するようにしてもよい。光学ブランク値の測定工程(工程S30’)においては、ピペットチップ135の先端が液体注入部45の底に接触するか、または近接する状態で測定用緩衝液(液体73)の吸引を行うことから、ピペットチップ135内の圧力の変化を検出しながら測定用緩衝液(液体73)の吸引を行うことで、液体注入部45の底とピペットチップ135の先端との位置関係を特定しながら測定用緩衝液(液体73)の吸引を行うことができる。このようにすることで、ピペットチップ135の位置検出工程と光学ブランク値の測定工程とを独立して行う場合に比べて、短時間でピペットチップ135の位置検出および光学ブランク値の測定を行うことができる。
(効果)
以上のように、本実施の形態の反応方法によれば、ピペットチップ135に荷重がかかる回数を低減してピペットチップ135の変形および位置ずれを抑制しつつも、残液量の低減が重要な工程では残液量を最小限にすることができるので、気泡の発生や検体の希釈、標識液の希釈、遊離の第2の捕捉体の残存などの影響を抑制しつつ適切に反応を行うことができる。したがって、本実施の形態の反応方法を利用する検出装置(検出システム)および検出方法では、気泡や検体の希釈、標識液の希釈などによるシグナルの低下による影響を抑制して、被検出物質を高精度かつ定量的に検出することができる。
なお、上記実施の形態では、SPFSを利用した検出装置および検出方法について説明したが、検出方法や検出装置は、これらに限定されない。本発明は、ELISA法やRIfS法、SPR法、QCMなどを利用した検出装置および検出方法にも適用できる。
本出願は、2016年6月21日出願の特願2016−122695に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
本発明に係る反応方法、反応システムおよび反応装置によれば、ピペットチップの変形および位置ずれを抑制しつつも流路内において所定の反応を適切に行うことができる。また、上記のとおり、本発明に係る反応方法、反応システムおよび反応装置を用いることで、被検出物質を高い信頼性で検出することができる。したがって、本発明に係る反応方法、反応システムおよび反応装置は、例えば臨床検査などに有用である。
10 反応チップ
20 プリズム
21 入射面
22 成膜面
23 出射面
30 金属膜
40 流路蓋
41 枠体
42 液体注入部被覆フィルム
43 貯留部被覆フィルム
44 流路
45 液体注入部
46 貯留部
47 通気孔
50 液体チップ
60 接着層
70 第1の捕捉体
71 被検出物質
72 第2の捕捉体
73,73’ 液体
74 気泡
100 SPFS装置
110 光照射ユニット
111 光源ユニット
112 角度調整機構
113 光源制御部
120 受光ユニット
121 受光光学系ユニット
122 位置切り替え機構
123 センサー制御部
124 第1レンズ
125 光学フィルター
126 第2レンズ
127 受光センサー
130 送液ユニット
131 ピペット
132 ピペット制御部
133 シリンジポンプ
134 ノズルユニット
135 ピペットチップ
136 圧力センサー
140 搬送ユニット
141 搬送ステージ
142 チップホルダー
150 制御部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

Claims (11)

  1. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップの前記液体注入部に前記開口部から挿入されたピペットチップにより、前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引を含む液体接触工程を複数回行うことで、前記流路内において所定の反応を行う反応工程を含み、
    複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引が行われ、
    複数回行われる前記液体接触工程のうちの少なくとも1回の前記液体接触工程では、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引が行われる、
    反応方法。
  2. 前記第1の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触した状態で液体の吸引を行い、
    前記第2の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う、
    請求項1に記載の反応方法。
  3. 前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引は、前記開口部と前記ピペットチップとの間を密閉した状態で行われる、請求項1または請求項2に記載の反応方法。
  4. 前記ピペットチップ内に液体または気体を吸引させたときの前記ピペットチップ内の圧力に基づいて前記ピペットチップと前記液体注入部の底との接触状態を検出して、前記液体注入部の底に対する前記ピペットチップの先端の位置を特定する位置検出工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の反応方法。
  5. 前記位置検出工程は、前記第1の吸引を行う際に行われる、請求項4に記載の反応方法。
  6. 前記位置検出工程を行う際に行われた前記第1の吸引よりも後に行われる前記液体接触工程では、前記位置検出工程で特定された前記ピペットチップの位置の情報に基づいて前記ピペットチップを移動させる、請求項5に記載の反応方法。
  7. 前記流路は、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化された反応場を有し、
    前記反応工程は、
    前記被検出物質を含む試料液の前記流路内への注入および前記流路内からの前記試料液の吸引を含む、前記液体接触工程としての1次反応工程と、
    前記1次反応工程の後に行われる、前記被検出物質を標識するための蛍光物質を含む標識液の前記流路内への注入および前記流路内からの前記標識液の吸引を含む、前記液体接触工程としての2次反応工程と、
    を含み、
    前記1次反応工程の前に行われる1または2以上の前記液体接触工程のうちの最後に行われる前記液体接触工程と、前記2次反応工程の前に行われる2以上の前記液体接触工程のうちの最後に行われる前記液体接触工程とでは、前記第1の吸引が行われる、
    請求項1〜6のいずれか一項に記載の反応方法。
  8. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップと、
    ピペットチップを装着された、前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、
    前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、
    を有し、
    前記ピペット制御部は、前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引の組み合わせを複数回行わせ、
    複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引を前記ピペットに行わせ、
    複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引を前記ピペットに行わせる、
    反応システム。
  9. 前記第1の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触した状態で液体の吸引を行い、
    前記第2の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う、
    請求項8に記載の反応システム。
  10. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する反応チップを保持するためのチップホルダーと、
    ピペットチップを装着することが可能であり、前記チップホルダーに保持された前記反応チップの前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、
    前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、
    を有し、
    前記ピペット制御部は、前記チップホルダーに保持された前記反応チップの前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記流路内への液体の注入および前記流路内からの液体の吸引の組み合わせを複数回行わせ、
    複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触または近接した状態で液体の吸引を行う第1の吸引を前記ピペットに行わせ、
    複数回行われる液体の吸引のうちの少なくとも1回の液体の吸引では、前記ピペット制御部は、前記第1の吸引よりも前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う第2の吸引を前記ピペットに行わせる、
    反応装置。
  11. 前記第1の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが接触した状態で液体の吸引を行い、
    前記第2の吸引では、前記ピペットチップと前記液体注入部の底とが離れた状態で液体の吸引を行う、
    請求項10に記載の反応装置。
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