JPWO2017082186A1 - Ｎｐｒ−ａアゴニストの新規用途 - Google Patents

Abstract

（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト、及び（Ｂ）抗悪性腫瘍剤投として微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤〔（Ｂ’）〕を組み合わせてなる医薬。（Ｂ）抗悪性腫瘍剤投与の５日以上前に投与されることで、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストの効果が発揮されて、血流を介して（Ｂ）抗悪性腫瘍剤を効果的に腫瘍細胞内に到達させることができることから、強力な効果を有する悪性腫瘍治療用医薬として有用である。

Description

本発明は、医薬に関する。

ナトリウム利尿ペプチドと称されるペプチドには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、及びＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）がある。これらは、グアニレートシクラーゼドメインを有する受容体と特異的に結合し、具体的には、ＡＮＰとＢＮＰはナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａ（別名：ＮＰＲ−Ａ）と、ＣＮＰはナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ｂ（別名：ＮＰＲ−Ｂ）とそれぞれ結合することで、細胞内のＧＭＰ濃度を上昇させて様々な生理活性を発現することが知られている。

ＡＮＰは、心房細胞で産生されて分泌されるアミノ酸２８個から成るペプチドであるが、腎臓では利尿作用を示し、血管では血管平滑筋を弛緩・拡張する等の血圧調整作用を奏することから、臨床において、ヒト型ＡＮＰ（ｈＡＮＰ）は急性心不全治療薬として用いられている。また、近年では、癌細胞の増殖や転移を抑制する報告や、各臓器の線維化を抑制する報告も多数なされている。

例えば、特許文献１、２、及び非特許文献１には、ＡＮＰに加えて、Long Acting Natriuretic Peptide、Vessel Dilator、及びKaliuretic Peptideの４つのペプチドが、膵癌、前立腺癌、小細胞性肺癌、乳癌等の各腫瘍細胞に直接作用して、ＤＮＡ合成を阻害したりすることで、腫瘍の増殖を抑制できると報告している。

また、特許文献３は、ＡＮＰの受容体に着目したものであり、ｓｉＲＮＡ等を用いてＮＰＲ−Ａの合成を阻害したり、ＡＮＰアナログを用いたりしてＮＰＲ−Ａの活性を抑制することで、ＡＮＰカスケードによって誘導される癌等の疾患を治療できると開示されている。

非特許文献２には、ＡＮＰが血管内皮細胞の炎症反応を抑制することで、癌細胞そのものの血管内皮細胞への吸着を抑制して、癌細胞の転移が抑制されるとの報告がなされている。

また、特許文献４では、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストが、ＧＣ−Ａを発現する腫瘍細胞に対しては、直接作用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）をはじめとした遊走能及び浸潤能の取得を抑制することで転移を抑制する効果（直接効果）を示すことに加え、細胞内ｃＧＭＰの上昇に伴って生成されたシグナル伝達物質が血管やリンパ管の内皮細胞に作用することによって該血管内皮への腫瘍細胞の接着・浸潤が阻害されて、腫瘍の転移を抑制する効果（間接効果）をも発揮すると開示されている。そして、かかるＧＣ−Ａアゴニストは腫瘍細胞の転移や浸潤を抑制することができることから、他の抗腫瘍剤と併用してもよいことが記載されており、例えば、実施例において、シスプラチンとの併用により、シスプラチンがＧＣ−Ａアゴニストによる癌細胞へのアポトーシス誘導活性を増強していると開示されている。

特許文献５には、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ｂアゴニストが癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の、悪性腫瘍を増悪させる各因子やサイトカインの産生を抑制し、また、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストが癌細胞のＥＭＴを抑制し、癌細胞からの悪性腫瘍を増悪させる各因子やサイトカインの産生を特異的に抑制することから、これらを併用することで、悪性腫瘍を増悪させる各成長因子や炎症性サイトカイン等の産生がより顕著に抑制され、且つ、癌細胞のＥＭＴが抑制されることが報告されている。

また、線維化抑制については、腹膜線維症や腎線維症のモデル動物にＡＮＰを投与することで改善効果があることが報告されている（非特許文献３、４参照）。非特許文献５では、ＡＮＰとシルデナフィルを併用することで、肺線維症が抑制されることが開示されている。

ＵＳ６９４３１４７号公報 ＵＳ２００５／０２０９１３９号公報 ＵＳ２００５／０２７２６５０号公報 ＷＯ２０１２／１１８０４２号公報 ＷＯ２０１３／０２７６８０号公報

in vivo 21; 973-978(2007) PNAS, March 31, 2015, vol.112, No.13, 4086-4091 Nephrol Dial Transplant(2012), 27: 526-536 Regulatory Peptides(2009), 154(1-3), 44-53 British Journal of Pharmacology(2014), 171(14), 3463-3475

しかしながら、ＡＮＰによる悪性腫瘍の増殖抑制効果は未だ不明なものである。例えば、特許文献１では、１μＭのＡＮＰが細胞実験においてコントロールと比較して約３４％の癌細胞の減少を示す（特許文献１、Ｆｉｇ．２）が、多くの癌細胞は生き残ることになり、抗癌剤としての有効性は示唆されない。特許文献２では、細胞実験においてＡＮＰの濃度を１ｍＭに上げると８９％の癌細胞が減少することが記載されている（特許文献２、Ｆｉｇ．３）が、細胞実験としては高濃度での実験であり、細胞毒性を生じて細胞増殖が抑制されている可能性が疑われる。ＡＮＰは臨床において血圧低下の副作用が見られるため、投与量に注意が必要な薬剤として知られていることからも、細胞実験において高濃度で癌細胞の増殖が抑制されたからといって、ＡＮＰが抗癌剤として利用できるとは言えない。また、例えば、SCIENCE 307, 58-62, (2005)に記載されているように、腫瘍組織中の血管構造は未熟な血管が多く作られて異常構造をとることから、血管壁が崩れたり、血管透過性の亢進に伴って血液内成分が周囲組織に漏出することによって、腫瘍組織中の癌細胞まで薬剤が届きにくいことが知られている。よって、in vitroの実験系においてＡＮＰの腫瘍増殖抑制効果が確認されたとしても、in vivoにおいて確認されるＡＮＰの作用は癌細胞への直接作用によるものであるとは考えにくく、例えば、特許文献４において開示されたシスプラチンによってＡＮＰのアポトーシス誘導活性が増強されたとする報告は、メカニズムとして十分ではないことが分かる。

また、線維化抑制の報告についても、線維化状態が進行することによって血管構造が壊れ、薬剤が届きにくいことから、ＡＮＰが直接作用しているとは考えにくい。また、非特許文献５の図４からは、ヒト肺線維芽細胞を用いた実験ではＡＮＰとシルデナフィルを併用すると分化能の抑制が確認された一方、ＡＮＰ単独では分化能の抑制が確認されないことからも、ＡＮＰの直接作用は不明であり、メカニズムは十分でないことが分かる。

本発明の課題は、悪性腫瘍あるいは肺線維症又は間質性肺炎を効果的に治療又はその悪性化を抑制することができる医薬を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決する為に検討を重ねた結果、腫瘍深部への到達が難しい抗癌剤として、微小管阻害作用を有する化合物を、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと組み合わせることにより、腫瘍組織中の血管をＧＣ−Ａアゴニストによって保護する（成熟化する）ことで、微小管阻害作用を有する化合物を癌細胞へ効率的に到達させることが可能となって、該化合物による抗腫瘍効果がより発揮されることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、下記〔１〕〜〔１０〕に関する。
〔１〕 （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有し、（Ｂ）抗悪性腫瘍剤投与の５日以上前に投与されることを特徴とする、前記（Ｂ）抗悪性腫瘍剤の治療効果の増強剤。
〔２〕 （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト、及び（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を組み合わせてなる医薬。
〔３〕 （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤の悪性腫瘍の治療効果の増強剤。
〔４〕 （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを有効成分として含む、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤と併用するための医薬組成物。
〔５〕 （Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を有効成分として含む、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと併用するための医薬組成物。
〔６〕 （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを有効成分として含む、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤による治療を受けている患者用の医薬組成物。
〔７〕 （Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を有効成分として含む、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストによる治療を受けている患者用の医薬組成物。
〔８〕 ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のために用いられる医薬組成物。
〔９〕 ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを投与することを特徴とする、肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療方法。
〔１０〕 肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のための、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト。

本発明の医薬は、微小管阻害作用を有する化合物を単独で服用する場合に比べて、より強力に抗腫瘍効果を発揮するという優れた効果を奏するものである。

また、本発明は、腫瘍組織中の血管をＧＣ−Ａアゴニストによって保護する（成熟化する）ことで、抗癌剤を癌細胞へ効率的に到達させる、というコンセプトがもとになっており、微小管阻害作用を有する化合物以外の抗癌剤であっても、癌細胞に到達させることが困難な薬剤にとっては、同様の効果が期待される。

図１は、乳癌マウス同所移植モデルにおける腫瘍内の血管状態を示す図である。上段がコントロール群、下段がＡＮＰ群であり、左列が血管内皮細胞を染色した図、真ん中列が壁細胞を染色した図、右列が核染色も含めた全染色図を合わせた図である。 図２は、乳癌マウス同所移植モデルにおける腫瘍血管の壁細胞の裏打ち率を示す図である。 図３は、乳癌マウス同所移植モデルにおける腫瘍内のシスプラチン濃度を示す図である。 図４は、肺癌を同所移植した遺伝子改変マウスにおける腫瘍内の血管状態を示す図である。上から順に、ＷＴ（野生型）群、ＥＣ−ＧＣＡ−Ｔｇ（ＧＣ−Ａ過剰発現）群、Flox/flox（コントロール）群、ＥＣ−ＧＣＡ−ＫＯ（ＧＣ−Ａノックアウト）群であり、左列が血管内皮細胞を染色した図、真ん中列が壁細胞を染色した図、右列が核染色も含めた全染色図を合わせた図である。 図５は、肺癌を同所移植した遺伝子改変マウスにおける腫瘍血管の壁細胞の裏打ち率を示す図である。 図６は、肺癌マウス同所移植モデルにおける腫瘍内のシスプラチン濃度を示す図である。 図７は、シスプラチン誘発骨髄抑制モデルにおける体重と血液成分の推移を示す図である。 図８は、シスプラチン誘発骨髄抑制モデルにおける骨髄成分の推移を示す図である。 図９は、シスプラチン誘発骨髄抑制モデルにおける血清中Ｇ−ＣＳＦ濃度の推移を示す図である。 図１０は、乳癌マウス同所移植モデルにおけるＡＮＰとＤＴＸ投与後の併用効果を示す図である。 図１１は、乳癌マウス同所移植モデルにおけるＡＮＰとＣＤＤＰ（シスプラチン）の併用時のＡＮＰ投与期間による腫瘍ボリュームの推移を示す図である。 図１２は、乳癌マウス同所移植モデルにおけるＡＮＰと抗ＰＤ−１抗体の併用効果を示す図である。 図１３は、肺線維症マウスモデルにおけるＡＮＰ投与による肺線維化面積を示す図である。 図１４は、組織特異的トランスジェニックにおける肺線維化面積を示す図である。

本発明の医薬は、有効成分として、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと（Ｂ）抗悪性腫瘍剤とを併用することを特徴とする。具体的には、例えば、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと白金製剤とを併用するものであったり、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物とを併用するものであったり、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと（Ｂ’）ＰＤ−１経路阻害剤とを併用するものが挙げられる。

＜（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト＞
本発明において、「ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト」とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａ（以下、単に「ＧＣ−Ａ」と表記する場合もある（Chinkers M,etal．，Nature 338;78-83,1989））に結合し、そのグアニレートシクラーゼを活性化する作用（以下、「ＧＣ−Ａアゴニスト活性」）を有する物質を意味し、本明細書においては単に「ＧＣ−Ａアゴニスト」と表記される場合もある。代表的なＧＣ−Ａアゴニストとしては、例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial Natriuretic Peptide：ＡＮＰ）や脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain Natriuretic Peptide：ＢＮＰ）が挙げられる。本発明のＧＣ−Ａアゴニストとしては、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有するものであれば特に限定されず、ＡＮＰ、ＢＮＰ、並びにそれらの変異体などを１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明におけるＡＮＰとしては、２８個のアミノ酸よりなるヒト由来ＡＮＰ（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧ ＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧ ＬＧＣＮＳＦＲＹ：配列番号１）、ラット由来ＡＮＰ／マウス由来ＡＮＰ（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧ ＲＩＤＲＩＧＡＱＳＧ ＬＧＣＮＳＦＲＹ：配列番号２）などが挙げられる。ヒト由来ＡＮＰについては、Biochem.Biophys.Res.Commun., 118巻, 131頁, 1984年に記載のα−ｈＡＮＰが、一般名カルペリチド（ｃａｒｐｅｒｉｔｉｄｅ）として、日本において製造販売承認を取得し、販売（商品名：ハンプ、ＨＡＮＰ）されている。α−ＡＮＰは、一般的にはＨｕｍａｎ ｐｒｏ−ＡＮＰ［９９−１２６］としても知られている。

本発明におけるＢＮＰとしては、３２個のアミノ酸よりなるヒト由来ＢＮＰ（ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ ＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲ ＲＨ：配列番号３）、ブタ由来ＢＮＰ（ＳＰＫＴＭＲＤＳＧＣ ＦＧＲＲＬＤＲＩＧＳ ＬＳＧＬＧＣＮＶＬＲ ＲＹ：配列番号４）を例示することができる。また、４５個のアミノ酸よりなるラット由来ＢＮＰ（ＳＱＤＳＡＦＲＩＱＥ ＲＬＲＮＳＫＭＡＨＳ ＳＳＣＦＧＱＫＩＤＲ ＩＧＡＶＳＲＬＧＣＤ ＧＬＲＬＦ：配列番号５）、マウス由来ＢＮＰ（ＳＱＧＳＴＬＲＶＱＱ ＲＰＱＮＳＫＶＴＨＩ ＳＳＣＦＧＨＫＩＤＲ ＩＧＳＶＳＲＬＧＣＮ ＡＬＫＬＬ：配列番号６）も例示することができる。ヒト由来ＢＮＰは、一般名ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）として、米国等で薬事承認を受けており、商品名：ナトレコール（Ｎａｔｒｅｃｏｒ）として販売されている。

本発明において、ＡＮＰ又はＢＮＰの「変異体」とは、ＡＮＰ又はＢＮＰのアミノ酸配列の一箇所〜数箇所において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加（以下、まとめて「置換等」という）されたものであって、且つ、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有するもの、を意味する。「数箇所」とは、通常３箇所程度、好ましくは２箇所程度である。「数個」とは、通常１０個程度、好ましくは５個程度、より好ましくは３個程度、更に好ましくは２個程度である。複数箇所で置換等される場合には、置換、欠失、挿入、及び付加の何れか一つであっても良く、二つ以上が組み合わされていても良い。また、置換等されるアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、そのアシル化体等の修飾物であってもよく、人工的に合成されたアミノ酸類似体であってもよい。

例えば、ＡＮＰの変異体は、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有する限り、例えば、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列中の所望の一箇所〜数箇所において１〜数個のアミノ酸が置換等されていても良い。また、ＢＮＰの変異体は、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有する限り、配列番号３、４、５、又は６に記載のアミノ酸配列の所望の一箇所〜数箇所において１〜数個のアミノ酸が置換等されていても良い。

ＡＮＰの変異体の具体例としては、例えば、ｈＡＮＰの１２位のMetがIleに置換されたラットα−ｒＡＮＰ（Biochem.Biophys.Res.Commun., 121巻, 585頁, 1984年）、ｈＡＮＰにおいてＮ末のSer−Leu−Arg−Arg−Ser−Serが欠失したＡＮＰ等が挙げられる。この様なＡＮＰ又はＢＮＰ変異体に関しては、例えば、Medicinal Research Review, 10巻, 115頁, 1990年に記載されている一連のペプチド等が挙げられる。また、アミノ酸配列の１乃至複数のアミノ酸が欠失するとともにアミノ酸配列の１乃至複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された例としては、例えば、１５アミノ酸残基から成るｍｉｎｉ−ＡＮＰ（Science, 270巻, 1657頁, 1995年）等が挙げられる。

さらに、本発明のＡＮＰ又はＢＮＰは、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有する限り、誘導体や修飾体であってもよい。

ＡＮＰ又はＢＮＰの「誘導体」とは、ＡＮＰ、ＢＮＰ又はそれらの変異体のアミノ酸配列を含み、さらに別のペプチド又はタンパク質が付加された融合ペプチドであり、且つ、ＡＮＰ又はＢＮＰの有する生物活性の少なくとも一部を保持する融合ペプチドを意味する。このような生物活性（本発明においては、ＧＣ−Ａに結合し、そのグアニレートシクラーゼを活性化する作用）の少なくとも一部を有する融合ペプチドを、ＡＮＰ又はＢＮＰの誘導体ともいう。本発明の誘導体において、ＡＮＰ、ＢＮＰ又はそれらの変異体の、Ｃ末端又はＮ末端の一方に付加ペプチドが融合されていてもよく、Ｃ末端及びＮ末端の両方に付加ペプチドが融合されたものであっても良い。付加されるペプチドとしては、特に限定されないが、そのペプチド自身が生理活性を有さないものが好ましい。また、付加ペプチドは直接結合していてもよく、１〜数個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して結合していても良い。リンカー配列としては、様々なものが知られているが、Ｇｌｙ、Ａｌa、Ｓｅｒ等を多く含むものが好ましく使用される。そのような付加ペプチドとしては、免疫グロブリン（好ましくはＩｇＧ）のＦｃ部位、血清アルブミン、グレリンのＣ末端側配列などを挙げることができる（例えばＡＮＰを免疫グロブリンのＦｃ部位と結合させた融合タンパク質（米国特許出願公開２０１０／０３１０５６１号明細書等参照）、ＧＬＰ−１を血清アルブミンと結合させた融合タンパク質（国際特許公開第２００２／０４６２２７号等参照））。

「誘導体」としては、好ましくはｈＡＮＰの誘導体及びｈＢＮＰの誘導体である。具体的には、例えばＡＮＰを免疫グロブリンのＦｃ部位と結合させた融合タンパク質（米国特許出願公開第２０１０／０３１０５６１号明細書等参照）がＡＮＰの生物活性を保持したまま、血中滞留性が改善されることが知られている。また、ＡＮＰ及びＢＮＰの各種誘導体に関しては、例えば、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ，１０巻，１１５頁，１９９０年に記載されている一連のペプチドが挙げられる。

また、ＡＮＰの誘導体の具体例として、国際公開第２００９／１４２３０７号（対応米国特許出願公開第２０１０／３０５０３１号明細書）に開示された各種のＡＮＰ誘導体などを挙げることができる。ここでは、ＡＮＰに、グレリンのＣ末端に由来する部分配列を付加した誘導体において、元ペプチドの生理活性を保持したまま、血中滞留性が改善されたことが報告されている。この報告では、ｈＡＮＰのＮ末端又はＣ末端の何れか一方及びそれらの両方にグレリンのＣ末端由来の部分ペプチドを付加した多様な誘導体のいずれにおいても、ＧＣ−Ａアゴニスト活性が保持され、その血中半減期が延長された。

ＡＮＰ又はＢＮＰの「修飾体」とは、ＡＮＰ、ＢＮＰ又はそれらの変異体に含まれるアミノ酸の１箇所から数箇所が、別の化学物質との化学反応により修飾されたもので、且つ、ＡＮＰ又はＢＮＰの有する生物活性の少なくとも一部を保持するもの、を意味する。修飾を受ける部位は、ＡＮＰ又はＢＮＰの活性を保持する限り、いずれの部位を選択してもよい。例えばポリマーのようなある程度大きな化学物質を付加する修飾では、ＡＮＰ又はＢＮＰの活性部位、又は、受容体結合部位以外の箇所において修飾されることが好ましい。また、分解酵素による切断を防止するための修飾の場合、当該切断を受ける箇所が修飾されたものも採用する事ができる。また、別の化学物質は直接結合していてもよく、１〜数個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して結合していても良い。リンカー配列としては、様々なものが知られているが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ等を含むものが好ましく使用される。

化学修飾の方法としては、様々な方法が知られているが、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）など製薬技術において利用される（薬理上用いられる）高分子ポリマーを付加する方法や、Ｌｙｓ残基等の側鎖のアミノ基にリンカーとなる化合物を付加させ、それを介して別のタンパク質等（例えば血清アルブミン）と結合させる方法などが知られているが、これらに限定されず、様々な方法を採用することができる。また、ＡＮＰ又はＢＮＰの修飾体の製造方法については、米国特許出願公開第２００９／０１７５８２１号明細書などを参考に、適宜作製することができる。修飾体は、好ましくは製薬上用いられる高分子ポリマーを付加することにより化学修飾されたものである。

例えば、ＡＮＰの修飾体は、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有する限り、配列番号１又は２のアミノ酸配列中の所望の１つ〜複数の箇所において修飾されていても良いが、好ましくは、配列表の配列番号１又は２のアミノ酸配列を含み、その配列番号７（Cys -Phe -Gly -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Asp -Arg -Ile -Xaa5 -Xaa6 -Xaa7 -Xaa8 -Xaa9 -Leu -Gly -Cys -Xaa10 -Xaa11 -Xaa12 -Arg（ここで、Xaa3はMet、Leu又はIle）（「リング構造」）に表示されたアミノ酸に相当するもの以外のアミノ酸の少なくとも一つにおいて、化学修飾を受けているものである。より好ましくは、配列番号１又は２のアミノ酸配列中の配列番号７に表示されたアミノ酸以外のアミノ酸において１箇所〜数箇所で修飾されたものであり、さらに好ましくは配列番号１又は２のアミノ酸配列の１乃至６位及び２８位の何れか１箇所〜数箇所で修飾されたものである。また、ＢＮＰの変異体は、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を有する限り、配列番号３〜６のアミノ酸配列の所望の１つ〜複数の箇所において修飾されていても良いが、好ましくは、配列表の配列番号３〜６のアミノ酸配列を含み、その配列番号７に表示されたアミノ酸に相当するもの以外のアミノ酸の少なくとも一つにおいて、化学修飾を受けているものである。より好ましくは、配列番号３〜６のアミノ酸配列中の配列番号７に表示されたアミノ酸以外のアミノ酸において１箇所〜数箇所で修飾されたものであり、より好ましくは配列番号３又は４のアミノ酸配列の１乃至９位、３１位及び３２位の何れか１箇所〜数箇所で修飾されたもの、或いは、配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列の１位乃至２２位、４４位及び４５位の何れか１箇所〜数箇所で修飾されたものである。さらに、上述したＡＮＰ又はＢＮＰの活性断片、変異体及びそれらの誘導体の修飾体も本発明に含まれる。このような各種修飾体もＧＣ−Ａアゴニスト活性を保持する限り、本発明に用いることができる。

このようなＧＣ−Ａアゴニストとして採用されうる修飾体の具体例としては、例えばｈＡＮＰ、ｈＢＮＰ、又はその変異体に、ＰＥＧ、ＰＶＡ等の親水性ポリマーやアルキル基、アリール基などの炭化水素基に代表される疎水性基が、リンカーを介して又は介さずに、結合された各種修飾体において、ＧＣ−Ａアゴニスト活性を保持することが知られている（米国特許第７６６２７７３号明細書、国際特許公開第２００９／０２０９３４号等参照）。

ＡＮＰ又はＢＮＰと、ＧＣ−Ａ受容体との結合は、ＡＮＰ及びＢＮＰのリング構造とそのＣ末端テール部分が重要であるため、特にそのＮ末端部に別の配列又は物質が結合した誘導体や修飾体は、その付加ペプチドや修飾物がリング構造に影響を与えることが少なく、ＧＣ−Ａ受容体との結合を阻害することなくＧＣ−Ａアゴニスト活性を保持することになる。このことは、上述の多くの文献により実証されている。

本発明においては、ＡＮＰ、ＢＮＰ、並びにそれらの変異体は、天然の細胞又は組織から採取されたものでもよく、遺伝子工学的、細胞工学的な手法を用いて調製したものであってもよく、化学合成したものであってもよい。このような調製は、公知技術に従って行うことができる。

なお、ある物質がＧＣ−Ａアゴニスト活性を有するか否かについては、当業者であれば従来知られている方法により容易に測定を実施することができる。具体的には、例えば、ＧＣ−Ａ（Chinkers M,et al., Nature 338; 78-83, 1989）を強制発現させた培養細胞に物質を添加し、細胞内ｃＧＭＰレベルを測定することで可能である。ＧＣ−Ａアゴニスト活性の一部が保持されるとは、同一の試験系を用いて、ＧＣ−Ａアゴニスト物質とＡＮＰ又はＢＮＰ（当該アゴニスト物質がＡＮＰ又はＢＮＰの配列を参考にして作製されたものである場合は、当該参考としたペプチド）とを並べてＧＣ−Ａアゴニスト活性を測定した場合に、該アゴニスト物質によるｃＧＭＰ上昇活性のピークが、少なくともＡＮＰ又はＢＮＰが示すｃＧＭＰ上昇活性ピークの約１０％以上を保持することを通常意味するが、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上、更に好ましくは約７０％以上を保持することを意味する。また、ピークにおいて活性の上昇が大きくなくても、生体に投与した場合の活性持続時間が長いものは、本発明に用いることができる。

本発明におけるＧＣ−Ａアゴニストとして好ましいものは、ＡＮＰ、ＢＮＰ、それらの変異体であり、より好ましくは、ｈＡＮＰ又はｈＢＮＰである。

また、上述したＧＣ−Ａアゴニストとして、当該アゴニストの薬学的に許容される塩を用いてもよい。薬学的に許容される塩としては、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、又は有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等の酸付加塩を挙げることができる。また、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態をとるものであってもよい。

＜（Ｂ）抗悪性腫瘍剤＞
本発明における抗悪性腫瘍剤としては、白金製剤、微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を用いることができる。なお、本明細書において、抗悪性腫瘍剤のことを抗癌剤と記載することもある。

〔白金製剤〕
白金製剤（プラチナ製剤）は、ＤＮＡの二重らせん構造に結合してＤＮＡの複製を阻害する他、癌細胞を自滅（アポトーシス）へ導く働きも併せ持つものである。

本発明において、白金製剤（プラチナ製剤）としては、抗腫瘍性白金錯体を有効成分として含む製剤を用いることができる。具体的には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、オルマプラチン、ロボプラチン、セブリプラチン、ミボプラチン又はスピロプラチン等が例示される。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

〔（Ｂ’−１）微小管阻害作用を有する化合物〕
微小管は細胞分裂の際に紡錘体を形成したり、細胞内小器官の配置や物質輸送など、細胞の正常機能の維持に重要な役割を果たしていることから、当該微小管の阻害作用を有する化合物を作用させることで腫瘍細胞の増殖を抑制できると考えられている。

本発明において、微小管阻害作用を有する化合物としては、タキサン系抗悪性腫瘍剤、ビンアルカロイド系悪性腫瘍剤が含まれる。タキサン系抗悪性腫瘍剤は、微小管の脱重合を阻害して異常な形のチューブリンを形成するものであり、具体的には、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等が例示される。ビンアルカロイド系悪性腫瘍剤は、チューブリンが脱重合して微小管を形成するのを阻害するものであり、具体的には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等が例示される。また、その他の微小管阻害作用を有する化合物としては、エリブリン等が例示される。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

〔（Ｂ’−２）ＰＤ−１経路阻害剤〕
ＰＤ−１は、免疫チェックポイントプロテインであり、活性化Ｔ細胞やＢ細胞上に発現して、感染に対する免疫反応中に末梢におけるＴ細胞活性化を制限したり、抗腫瘍Ｔ細胞反応を抑制する作用を有することから、当該ＰＤ−１の経路を阻害する化合物を作用させることで免疫反応を誘導して、腫瘍増殖を抑制できると考えられている。

本発明において、ＰＤ−１経路阻害剤としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２等に対する阻害剤が含まれており、ＰＤ−１もしくはＰＤ−１リガンドに対する抗体、ＰＤ−１もしくはＰＤ−１リガンドに対する抗体をコードする核酸が例示される。具体的には、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ等が例示される。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

現在上市されている抗癌剤の副作用としては、体重減少、骨髄抑制、腎障害等がよく知られている。癌治療は一般的に、治療が行われる日と行わない日を組み合せた１〜数週間程度の周期（コース又はクール）を設定して治療を行うが、上記副作用が原因となり、周期を重ね、癌治療が長期化すると抗癌剤の投与量を減らさざるを得ず、最終的には抗癌剤を使用し続けることが難しくなり、治療を中止せざるを得なくなる。そのため、副作用を予防又は軽減する対策が重要となってくる。例えば、微小管阻害作用を有する化合物である、ドセタキセルは、従来、単独でも抗悪性腫瘍剤として用いられているが、重篤な骨髄抑制（汎血球減少、白血球減少、好中球減少（発熱性好中球減少を含む）、ヘモグロビン減少、血小板減少等）が高頻度に起こることが知られており、異常が認められた場合、投与間隔の延長、投与量の減量、休薬等の適切な処置を行うこと、発熱性好中球減少症を抑制するＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）製剤の適切な使用について考慮することが推奨されている。但し、多くのＧ−ＣＳＦ製剤は血中半減期が短いことから、好中球数が回復するまで連日投与が必要となり、患者の身体的かつ金銭的負担が大きいことが知られている。本発明では、詳細なメカニズムは不明なるも、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと併用した場合、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストにより腫瘍組織中の血管が保護されて崩壊が抑制されることから、血流を介して、微小管阻害作用を有する化合物が腫瘍細胞中に効率よく送達されたり、ＰＤ−１経路阻害剤が腫瘍組織中に存在する免疫細胞に効率よく送達されることになり、ひいては、腫瘍細胞中の微小管阻害作用を有する化合物濃度が上昇し、あるいは自己免疫反応が活性化することで腫瘍増殖を抑制することができると考えられる。さらには、癌ペプチドワクチンや腫瘍溶解性ウイルスなどによって誘導された腫瘍障害性の免疫細胞などが血流を介して腫瘍組織へ効率よく送達されることにより、腫瘍増殖を効率よく阻害できると考えられる。また、微小管阻害作用を有する化合物は副作用として骨髄抑制作用を有することから、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと併用することにより、微小管阻害作用を有する化合物の投与量の減量が可能となり、これまで、副作用が原因で治療を中止せざるを得なかった患者への抗癌剤の投与を続けることが可能になるという効果が奏されると考えられる。さらに、本発明者らは、ＡＮＰを数日前から事前投与した所に抗癌剤を投与したところ、抗癌剤の主たる副作用である白血球減少（骨髄抑制作用）が見られなかったことを確認しており、その機序として、内因性の血清Ｇ−ＣＳＦ濃度が高められることを確認している。ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと併用することにより、骨髄抑制の副作用の出現を低減し、さらには血中Ｇ−ＣＳＦ濃度が高められることから、本発明によりＧ−ＣＳＦ製剤の投与量の減量が可能となる、あるいは、全く不要となるという効果も奏されると考えられる。

本発明の医薬は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせたものであれば特に限定はなく、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の抗腫瘍成分を含有することができる。具体的には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、ホルモン、ビタミン、抗腫瘍性抗体、分子標的薬、その他の抗腫瘍剤等を挙げることができる。これらの含有量は特に限定されない。

より具体的に、アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシドもしくはクロラムブチル等のアルキル化剤；カルボコンもしくはチオテパ等のアジリジン系アルキル化剤；ディブロモマンニトールもしくはディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシンもしくはラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤；ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン又はテモゾロミド等が挙げられる。

各種代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、チオイノシン、ネララビン、フルダラビンもしくはペントスタチン等のプリン代謝拮抗剤；フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン、カペシタビンもしくはゲムシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤；メトトレキサート、トリメトレキサートもしくはペメトレキセド等の葉酸代謝拮抗剤等が挙げられる。

抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４’−エピドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシンもしくはミトキサントロン等のアントラサイクリン系抗生物質抗腫瘍剤；クロモマイシンＡ３又はアクチノマイシンＤ等が挙げられる。

抗腫瘍性植物成分としては、例えば、（Ｂ）成分として用いた成分以外のタキサン類（パクリタキセル、ドセタキセル等）；（Ｂ）成分として用いた成分以外のビンアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等）；イリノテカン、ノギテカン等のカンプトテシン誘導体；又はエトポシド、テニポシド、ソブゾキサン等のエピポドフィロトキシン類が挙げられる。

ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子又はインドメタシン等が挙げられる。

ホルモンとしては、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メドロキシプロゲステロン、タモキシフェン、アナストロゾール、エキセメスタン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、リュープロレリン、レトロゾール等が挙げられる。

ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣ又はビタミンＡ等が挙げられる。

抗腫瘍性抗体、分子標的薬としては、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、デノスマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、メシル酸イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、イブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ダサチニブ、タミバロテン、トレチノイン、パニツムマブ、ボルテゾミブ等が挙げられる。

その他の抗腫瘍剤としては、例えば、（Ｂ）成分として用いた成分以外の白金製剤（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等）、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア、クレスチン等が挙げられる。また、免疫抗体薬（（Ｂ）成分として用いた成分以外の抗ＰＤ−１抗体：ニボルマブ、ペムブロリズマブ等、ＰＤ−Ｌ１抗体：アテゾリズマブ等、抗ＣＴＬＡ４抗体：イピリムマブ等）、生物製剤関連（インターフェロン・α、インターフェロン・β、インターフェロン・γ、インターロイキン２、ウベニメクス乾燥ＢＣＧ、レンチナン等）等が挙げられる。

さらに、近年ではバイアグラ（登録商標）に代表されるＰＤＥ５阻害剤が悪性腫瘍に対する抑制効果を有することが報告されており（Das et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2010), vol/107, No. 42, pp.18202-18207）、本発明の医薬はこれらＰＤＥ５阻害剤と併用することもできる。ＰＤＥ５阻害剤としては、ＰＤＥ５酵素によるｃＧＭＰの分解を阻害する活性を有する物質であれば、特に限定されず、様々な薬剤を採用することができる（例えば、M. P. Govannoni, et al.(Curr. Med. Chem.(2010) 17, pp. 2564-2587)等参照）。好ましくは、シルデナフィル（sildenafil）、バルデナフィル(vardenafil)、タダラフィル（tadalafil）、ウデナフィル（udenafil）、ミロデナフィル（mirodenafil）、SLx-2101、ロデナフィル（lodenafil）、 Lodenafil carbonate、Exisulindなど、及びそれらの誘導体、ならびにそれらの薬理学的に許容される塩であり、より好ましくは、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル、ミロデナフィル又はそれらの薬理学上許容される塩であり、更に好ましくは、クエン酸シルデナフィル、塩酸バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル又はミロデナフィルであり、更により好ましくは、クエン酸シルデナフィルである。これらの薬剤については、上記の参考文献（その引用文献を含む）の記載及び周知の技術により、製造及び製剤化することができる。

また、その他の製剤原料として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、防腐剤、キレート剤、抗酸化剤、清涼化剤、コーティング剤、安定化剤、流動化剤、粘稠剤、溶解補助剤、増粘剤、緩衝剤、香料、着色剤、吸着剤、湿潤剤、防湿剤、帯電防止剤、可塑剤、消泡剤、界面活性剤、乳化剤、希釈剤等の添加剤を含有してもよい。これらの含有量は特に限定されない。

本発明の医薬は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせたものであれば特に限定はなく、当業者に公知の方法に従って、調製することができる。また、その形状や大きさも特に限定はなく、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。非経口投与の場合は、腫瘍部位に直接投与することも可能である。具体的には、経口投与の場合は、錠剤（口腔内速崩解錠、咀嚼可能錠、発泡錠、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤を含む）、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与の場合は、経肺剤形(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤形、経皮投与剤形(例えば軟膏、クリーム剤)、注射剤形等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。また、（Ａ）成分を含む場合は、消化管内での分解を受けにくい製剤設計を行ったり、消化管以外の粘膜から吸収可能な剤形とする製剤設計も可能である。

例えば、（Ａ）成分の注射剤と、（Ｂ）成分の注射剤を組み合わせたもの（キットを含む）が挙げられる。また、（Ａ）成分の経肺吸入剤と、（Ｂ）成分の注射剤を組み合わせたもの（キットを含む）等も例示される。

本発明の医薬は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を有効成分として組み合わせることを特徴とするのであって、その使用形態としては、（Ａ）成分と（Ｂ）成分それぞれについて別途調製された単剤を同時に使用する態様と、（Ａ）成分と（Ｂ）成分それぞれについて別途調製された単剤を順次に使用する態様と、（Ａ）成分と（Ｂ）成分それぞれについて別途調製された単剤を別々に使用する態様と、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を一緒に処方して調製された製剤（合剤）として使用する態様とが挙げられる。また、（Ａ）成分による治療を受けている患者に（Ｂ）成分を有効成分として使用する態様、あるいは、（Ｂ）成分による治療を受けている患者に（Ａ）成分を有効成分として使用する態様、も本発明に含まれる。なお、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を順次に又は別々に使用する場合は、いずれの使用が先であってもよく、別々に使用する場合の間隔は患者の症状などにより異なり、最終的には医師の判断に従って適宜設定することができる。特に（Ｂ）成分の副作用を回避することを目的とする場合は、（Ａ）成分を（Ｂ）成分の投与日の１〜７日前（例えば、２〜３日前、５日以上前）に投与してもよい。

本発明の医薬として用いる場合の（Ａ）成分と（Ｂ）成分の投与量は、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは他の併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられる。例えば、体重６０ｋｇの成人１日あたり、（Ａ）成分を０．１〜１０００ｍｇ静脈内投与、及び（Ｂ）成分を０．１〜１００００ｍｇ静脈内投与する態様が挙げられ、好ましくは（Ａ）成分を０．１〜１００ｍｇ静脈内投与及び（Ｂ）成分を０．１〜１０００ｍｇ静脈内投与する態様、より好ましくは（Ａ）成分を１〜１０ｍｇ静脈内投与及び（Ｂ）成分を１〜５００ｍｇ静脈内投与する態様が挙げられる。かかる投与量は一度に投与しても分割して投与してもよく、投与期間は各成分で適宜設定される。なお、非経口投与、例えば静脈内投与する場合は、ボーラス投与のみならず、インフュージョンポンプ、カテーテル等を用いて持続的に投与してもよい。

（Ａ）成分を投与する場合には、例えば凍結乾燥製剤を注射用水に溶解して微量輸液ポンプ（それがない場合には、小児用微量輸液セット）等を用いて連続投与（継続投与ともいう）することができる。連続投与する場合の投与期間としては、通常数時間〜数日間であり、例えば、１〜１４日間であり、好ましくは３〜７日間程度である。この場合の投与量としての上限は、例えば約５０μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７２ｍｇ／ｋｇ）以下の濃度を適宜採用することができ、約５μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７．２ｍｇ／ｋｇ）以下であってもよく、好ましくは約０．５μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７２０μｇ／ｋｇ）以下であり、より好ましくは約０．２μｇ／ｋｇ／分以下であり、更に好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ／分以下であり、更により好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ／分以下である。また下限としては、通常約０．０００１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約０．１４４μｇ／ｋｇ）以上であり、好ましくは約０．００１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約１．４４μｇ／ｋｇ）以上、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約１４．４μｇ／ｋｇ）以上である。これらは、投与期間中、一定であっても適宜組み合わせて変動させてもよい。具体的な投与方法としては、例えば、３〜４日間程度、約０．０２５μｇ／ｋｇ／分を採用することができ、この場合の１日当りの投与量は、約３６μｇ／ｋｇとなる。

（Ａ）成分は、前述のように血管を弛緩・拡張し血圧を低下させる作用を有することから、悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制若しくは予防に当たっては、血圧を必要以上に低下させない速度で投与することが好ましく、投与時及び投与直後には血圧をモニターすることが好ましい。また、この場合の（Ａ）成分の投与期間は、通常数時間以上、好ましくは１日間以上である。この期間、継続投与することが好ましく、その期間は通常１日以上であり、好ましくは１〜１４日間程度であり、より好ましくは、１〜５日間程度である。長期間に亘って悪性腫瘍を制御する場合、上記の投与方法を適宜繰り返したり、患者の状態に応じて投与量や投与期間を適宜変更したりすることができる。

また、上記の静脈注射と同様の効果をもたらすように（Ａ）成分の血中濃度（例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬ〜約１．６ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１．６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．４ｎｇ／ｍＬ〜約１．６ｎｇ／ｍＬ）をコントロール可能な持続性製剤、例えば、持続性皮下注射等を用いることもできる。持続性製剤を用いる場合は、製剤及び患者の状態に応じて投与量や投与間隔を適宜変更することが可能であるが、好ましくは、週１回投与である。

具体的にＡＮＰを例えば静脈に投与する場合には、例えば、ｈＡＮＰの１０００μｇ（例えば、ハンプ注射用１０００（商品名）、第一三共社製）を注射用水１０ｍＬに溶解し、“体重×約０．０６ｍＬ／時間”の速度（約０．１μｇ／ｋｇ／分）又はそれ以下の投与速度で投与することが好ましい。投与速度は、上記の速度に限られることなく、病状により、約０．２μｇ／ｋｇ／分以下の速度（好ましくは、約０．０１μｇ／ｋｇ／分以上）で、血圧や心拍数をモニターしながら適宜調整することが好ましい。特に、ｈＡＮＰを、約０．０２５μｇ／ｋｇ／分の用量で３又は４日間程度継続投与しても、血圧、心拍等の血行動態を大きく変動させないことが確認されており、この用量用法を採用することも好ましい。

ｈＢＮＰを例えば静脈に投与する場合には、例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ／分を連続投与することが好ましく、更にその連続投与前に、約２μｇ／ｋｇのｈＢＮＰをボーラス投与することを組み合わせた投与方法を採用することもできる。この場合にも、血圧を必要以上に低下させない速度で投与することが好ましく、投与時及び投与直後には血圧をモニターすることが推奨される。

ＡＮＰ及びＢＮＰが上記の投与速度で血圧や心拍数等に大きな影響を与えない場合には、さらに投与速度を上げてもよい。

天然型（ｈＡＮＰ、ｈＢＮＰなど）ではなく、ＡＮＰ、ＢＮＰの変異体を用いる場合、その活性の強さ、体内における持続性、分子量等、その物質の特徴を考慮して、投与量、投与方法、投与速度、投与頻度等を適宜決定することができる。また、ｈＡＮＰ又はｈＢＮＰについて、放出制御製剤技術又は持続化製剤技術、ペプチドの分解を受けにくくした各種の変異体、誘導体又は修飾体等を採用することにより、連続投与又はボーラス投与に限定されず、より患者への負担の少ない投与方法、投与頻度等の選択が可能となる。

（Ｂ）成分は、既知の臨床実践を参照して投与することができ、例えば、静脈内にボーラス投与することができる。投与量および投与計画は特定の疾病症状および患者の全症状にしたがって変更することができる。年齢、症状または副作用の発現に応じて、また、本発明の医薬は腫瘍組織中の血管を（Ａ）成分によって保護して（Ｂ）成分を効率的に癌細胞へ到達させることが可能となることから、適宜減量することもできる。本発明の医薬を使用する場合、（Ｂ）成分は、特に限定されないが、通常成人１日あたり０．０１〜１００００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍ^２であり、これを通常１日１〜３回に分けて投与することができる。患者が過度の毒性を経験した場合は、投与量の減量が必要となる。投与量および投与計画は、本発明の併用療法に加えて、１またはそれ以上の追加の化学療法剤が使用される場合にも変更してもよい。投与計画は、特定の患者を治療している医師により決定することができる。

また、シスプラチンを静脈に投与する場合、特に限定されないが、例えば、投与量を、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、０．０１〜１００００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍ^２であり、更に好ましくは１０〜１５０ｍｇ／ｍ^２とする。

より具体的には、パクリタキセルを静脈に投与する場合、特に限定されないが、例えば、投与量を、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、０．０１〜１００００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍ^２、更に好ましくは５０〜２５０ｍｇ／ｍ^２とする。

また、ドセタキセルを静脈に投与する場合、特に限定されないが、例えば、投与量を、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、０．０１〜１００００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは１〜５００ｍｇ／ｍ^２、更に好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍ^２とする。

また、ＰＤ−１抗体を静脈に投与する場合は、特に限定されないが、例えば、投与量を、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１〜５ｍｇ／ｋｇとする。

本発明の医薬は、（Ａ）成分の血管保護作用により（Ｂ）成分の抗悪性腫瘍効果が、（Ｂ）成分の単独使用時に比べて増強されて発揮されるという優れた効果を奏する。即ち、本発明の医薬組成物は、悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制のために用いられる。悪性腫瘍としては、固形癌であっても浸潤癌であってもよく、例えば、乳癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、卵巣癌、食道癌、子宮体癌、前立腺癌、血管肉腫、子宮頸癌、胚細胞腫瘍（精巣腫瘍、卵巣腫瘍、性腺外腫瘍）が例示される。

また、本発明の医薬は、癌の治療だけでなく、癌治療後の再発予防、転移の防止にも使用できる。よって、本発明の医薬の好適態様として、癌治療用医薬、癌再発予防用医薬、癌転移抑制用医薬が挙げられる。

本発明はまた、悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制を必要とする個体に、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせて治療有効量を投与することを含む、悪性腫瘍の治療方法を提供する。

本明細書中において悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制を必要とする個体とは、好ましくは悪性腫瘍の縮小又は根治を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。

また、本明細書中において治療有効量とは、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせて上記個体に投与した場合に、投与していない個体と比較して、悪性腫瘍の増殖を抑制する量のことである。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び個体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。

本発明の治療方法においては、前記治療有効量となるよう、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせてそのまま上記個体に投与してもよく、本発明の医薬の使用形態に応じて投与することができる。

また、本発明は、腫瘍組織中の血管をＧＣ−Ａアゴニストによって保護する（成熟化する）ことで、抗癌剤を癌細胞へ効率的に到達させる、というコンセプトが基になっていることから、（Ｂ’）成分以外の抗癌剤であっても、癌細胞に到達させることが困難な薬剤にとっては、同様の効果が期待される。よって、本発明の医薬は、前記した（Ａ）成分と白金製剤又は（Ｂ’）成分を組み合わせたものであるが、（Ｂ）成分として、前記したその他の抗腫瘍成分を（Ａ）成分に組み合わせることを妨げるものではない。また、前記以外にも、投与後、血中に存在するが、癌細胞に到達させることが困難な薬剤であれば、特に限定されず、例えば、免疫抗体薬（抗ＣＴＬＡ４抗体：イピリムマブ等、抗Ｔｉｍ−３抗体：ＭＢＧ４５３等、抗ＬＡＧ３抗体：ＢＭＳ−９８６０１６等、抗ＯＸ−４０抗体：ＭＥＤＩ−６４６９等、抗ＩＣＯＳ抗体：ＧＳＫ−３３５９６０９等、抗Ｂ７ＲＰ−１抗体：ＡＭＧ−５５７等、抗Ｂ７−Ｈ３抗体：エノブリツズマブ等、抗４−１−ＢＢ抗体：ウレルマブ等、抗ＧＩＴＲ抗体：ＭＫ−４１６６等、抗ＣＤ２７抗体：ヴァルリルマブ等、抗ＣＳＦ−１受容体抗体：エマクツズマブ等）、免疫調節蛋白質（可溶性ＬＡＧ３：ＩＭＰ−３２１等）、免疫調節低分子（ＪＡＫ２阻害剤：パクリチニブ等、Ｆｍｓ／Ｋｉｔ／Ｆｌｔ−３阻害剤：ペキダルチニブ等）、腫瘍溶解性ウイルス(Ｔ−ＶＥＣ等)、癌ワクチン（ＮｅｕＶａｘ、ＩＴＫ−１、ＴＧ−４０１０、シュプーラセル−Ｔ等）等が挙げられる。免疫抗体薬は腫瘍細胞、もしくは腫瘍に浸潤したＴ細胞をはじめとする免疫細胞を標的にしており、効果を発揮するためには、患者の腫瘍における血流を改善し、十分な量のＴ細胞及び免疫抗体薬が腫瘍深部に到達することが重要であることから、本発明と同様に、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと組み合わせることにより、免疫抗体薬の抗腫瘍効果がより発揮されることが期待される。また、例えば、癌ワクチンの１種である癌ペプチドワクチンの場合は、免疫細胞に貪食されることで細胞傷害性Ｔ細胞の産生を促進することから、（Ａ）成分と組み合わせることにより、癌ペプチドワクチンの抗腫瘍効果がより発揮されることが期待される。

また、（Ａ）成分を（Ｂ）成分の投与日の好ましくは１日以上前、より好ましくは２日以上前、更に好ましくは３日以上前、更に好ましくは５日以上前、更に好ましくは７日以上前の日から連日投与又は持続性製剤により投与することが望ましい。

本発明の別の態様としては、（Ａ）成分の血管保護作用により、（Ｂ）成分の抗悪性腫瘍効果が（Ｂ）成分単独使用時に比べて増強されて発揮されるという優れた効果に基づいて、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、（Ｂ）抗悪性腫瘍剤の治療効果の増強剤を提供する。なお、ここでいう各成分の種類やその使用量、使用方法は、本発明の医薬の項を参照することができるが、例えば、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有し、（Ｂ）抗悪性腫瘍剤投与の５日以上前に投与されることを特徴とする、（Ｂ）抗悪性腫瘍剤の治療効果の増強剤を例示することができる。

前記した増強剤において、好適な例としては、具体的には、（Ｂ）成分投与の３日前に、（Ａ）成分の最高血中濃度が好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１．６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ〜１．６ｎｇ／ｍＬ、更に好ましくは約０．４ｎｇ／ｍＬ〜約１．６ｎｇ／ｍＬとなるように投与されることを特徴とする、増強剤が挙げられる。

また更に、（Ａ）成分の血管保護作用により、（Ｂ）成分の抗悪性腫瘍効果が（Ｂ）成分単独使用時に比べて増強されて発揮されるという効果の観点から、本発明はまた、以下の医薬組成物を提供する。
・ （Ａ）成分を有効成分として含む、（Ｂ）成分と併用するための医薬組成物。
・ （Ｂ）成分を有効成分として含む、（Ａ）成分と併用するための医薬組成物。
・ （Ａ）成分を有効成分として含む、（Ｂ）成分による治療を受けている患者用の医薬・ （Ｂ）成分を有効成分として含む、（Ａ）成分による治療を受けている患者用の医薬組成物。
なお、ここでいう各成分の種類やその使用量、使用方法、その目的は、本発明の医薬の項を参照することができる

本発明では、前記した（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせることを特徴とするが、（Ｂ）成分として用いることが可能なＰＤ−１抗体は、副作用として肺線維症や突発性間質性肺炎を有することが知られている。しかしながら、（Ａ）成分は血管内皮細胞に特異的に作用して血管からの様々な増殖因子や各種炎症サイトカインの産生を抑制するため、（Ｂ）成分による副作用発現を低減することが可能となって、肺線維症や突発性間質性肺炎の治療又は改善効果を得ることが可能になると推察される。よって、本発明はまた、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のために用いられる医薬組成物を提供する。

肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のために用いられる医薬組成物としては、前記した（Ａ）成分を含有するものであればよく、（Ａ）成分の詳細については、本発明の医薬の項を参照することができるが、例えば、（Ａ）成分を通常数時間〜数日間、好ましくは１〜１４日間、より好ましくは３〜７日間程度で投与することができる。この場合の投与量としての上限は、例えば約５０μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７２ｍｇ／ｋｇ）以下の濃度を適宜採用することができ、約５μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７．２ｍｇ／ｋｇ）以下であってもよく、好ましくは約０．５μｇ／ｋｇ／分（一日当たり、約７２０μｇ／ｋｇ）以下であり、より好ましくは約０．２μｇ／ｋｇ／分以下であり、更に好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ／分以下であり、更により好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ／分以下である。また下限としては、通常約０．０００１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約０．１４４μｇ／ｋｇ）以上であり、好ましくは約０．００１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約１．４４μｇ／ｋｇ）以上、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／分（一日あたり約１４．４μｇ／ｋｇ）以上である。

なお、対象となる肺線維症又は間質性肺炎としては、特に限定はないが、本発明の医薬の項で説明した（Ｂ）成分の副作用である場合が例示される。なお、ここで、（Ｂ）成分の限定は特にないが、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２から選ばれる少なくとも１種に対する阻害剤が好適例としてが挙げられる。

以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。

本実施例では、まずは、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストによる血管の保護作用を検討した実験例を試験例１シリーズとして示す。なお、全ての実験において、測定値の群間比較には、一元配置分散分析とTukey-Kramerの多重比較検定を用い、有意水準は5％未満とした。

試験例１−１−１ 乳癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰの腫瘍血管保護作用
マウスは７週齢の雌のBalb/cマウス（日本SLC）を使用した。また、Osmotic pumpはALZET（Cupertino，CA）のＭＯＤＥＬ２００１（７日間投与用）を使用した。ｈＡＮＰ（配列番号１）は公知の方法に従って製造したものを用いた。

4T1乳癌細胞（和光純薬）を、FBS freeのRPMI-1640を用いて1×10⁶ cell/100μLになるように調製した。この懸濁液を、上記マウスに１匹当たり100μL、右乳腺内に注入した。１週間後に腫瘍を摘出し、この腫瘍から3×3mmサイズの腫瘍片を作製した。
次に、新しく準備したマウスに、１匹につき１個ずつ右乳腺へ3×3mm腫瘍片を同所移植した。移植後５日目に、マウスを無作為に２群（コントロール群、ＡＮＰ群）に群分けし（各群５〜７匹）、コントロール群には生理食塩水を充填したOsmotic pumpを、ＡＮＰ群にはｈＡＮＰを充填したOsmotic pumpを、それぞれマウスの背部皮下に埋め込んだ後、ｈＡＮＰについては1.5μg/kg/分の投与量で投与を開始し、移植後７日目に腫瘍を摘出した。

摘出した腫瘍サンプルを4％ホルマリンで１〜２日間浸けた後、パラフィン切片を作製し、脱パラフィン処理後、免疫染色を行った。免疫染色に使用した一次抗体（血管内皮細胞染色用）はRabbit anti-mouse CD31（abcam、ab28364）であり、二次抗体はAlexa Fluor 488 goat anti-rabbit（abcam、A11034）を使用した。αSMA（壁細胞染色用）の一次抗体は、Anti-actin,α-smooth muscle-Cy3 antibody（Sigma-Aldrich、C6198）を使用した。核染色は、Vectashield hard set with DAPI（Vector Laboratories、H1500）を使用した。蛍光顕微鏡はIX-81（Olympus）を使用し、撮影を行った（図１）。図１に示す写真のうち、“CD31”の箇所では、血管内皮細胞が染色されている様子を示しており、“αSMA”の箇所では、壁細胞が染色されている様子を示している。“Merged”の箇所では、血管内皮細胞と壁細胞に加えて、青色の細胞核が染色されているものが全て写し出された像が示されている。

一般に、正常な（成熟した）血管は、血管内皮細胞の周りに壁細胞がきちんと裏打ちをした（ほぼ100％）構造をとるものであるが、図１より、コントロール群では壁細胞が認められないことから、腫瘍血管は壁細胞が脱落した未熟な構造をとることが分かる。一方、ＡＮＰ群は壁細胞が認められることから、ＡＮＰ投与により腫瘍部における血管内皮細胞が壁細胞により裏打ちされた構造をとることが分かり、ＡＮＰは腫瘍血管の成熟化作用（保護作用）を有することが示唆される。

ここで、CD31陽性血管における抗αSMA陽性血管の割合(pericyte-coating index、血管成熟化の指標)を、下記式：
pericyte-coating index ＝ (CD31とαSMAの二重陽性血管数)／CD31陽性血管数×100
に従って測定・算出した。具体的には、腫瘍部の血管を１匹につき無作為に10ヶ所抽出し、上記計算式に従い、測定・算出したものを平均化し、各群の平均を算出した結果を図２に示す。図２より、ＡＮＰ群では、コントロール群と比較して、pericyte-coated indexは有意に高値であり、ＡＮＰ投与により、腫瘍血管の成熟化作用が発揮されたことが示唆されている。

試験例１−１−２ 乳癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰの腫瘍血管保護作用
試験例１−１−１と同様にして乳癌マウス同所移植モデルを作製し、移植後５日目に、マウスを無作為に２群（コントロール群、ＡＮＰ群）に群分けし（各群５〜７匹）、コントロール群には生理食塩水を充填したOsmotic pumpを、ＡＮＰ群にはｈＡＮＰを充填したOsmotic pumpを、それぞれマウスの背部皮下に埋め込んだ後、ｈＡＮＰについては1.5μg/kg/分の投与量で投与を開始した。次いで、移植後７日目に、それぞれの群に、日本化薬社のシスプラチン注「マルコ」を用いて、１匹当たり10mg/kg（約300μL）のシスプラチン（ＣＤＤＰ）を尾静脈投与し、5分後に腫瘍を摘出した。

摘出した腫瘍について、ICP-MS（誘導結合プラズマ質量分析計）法を用いて、腫瘍内シスプラチン濃度を測定し、各群の平均値を算出した。結果を図３に示す。図３より、ＡＮＰ群では、コントロール群と比較して、腫瘍内シスプラチン濃度は有意に高値であり、ＡＮＰ投与により腫瘍内の血管が保護されて、薬剤到達（シスプラチン量）が効率良く行われたことが分かる。

試験例１−２−１ 肺癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰの血管を介した腫瘍血管保護作用
本試験例では、ＡＮＰが血管に特異的に作用していることを示す為、血管特異的ＧＣ−Ａ遺伝子改変マウスを用いた。遺伝子改変マウスについては、既報の通りに作製されたマウスを使用した（Nojiri et al., PNAS 2015）。

LLC肺癌細胞（和光純薬）を、PBSを用いて5×10⁴cell/20μLになるように調製した。この懸濁液にマトリジェル（Corning）を同量（20μL）加えたものを、各マウスに１匹当たり40μL、右下肺内に注入した。１週間後に腫瘍を摘出し、この腫瘍から3×3mmサイズの腫瘍片を作製した。
次に、新しく準備したマウスに、１匹につき１個ずつ右肺へ3×3mm腫瘍片を同所移植し、移植後７日目に腫瘍を摘出した。

試験例１−１−１と同様にして、腫瘍内の血管状態について、免疫染色を行って調べた。結果を図４に示す。また、壁細胞の裏打ち率についても同様に調べた。結果を図５に示す。その結果、血管内皮特異的ＥＣ−ＧＣＡ−Ｔｇ（過剰発現）マウスでは、ＷＴ（野生型）群と比較して、pericyte-coated indexは有意に高値であった。以上より、ＡＮＰは血管に特異的に作用し、腫瘍血管の成熟化作用を発揮したことが示された。なお、血管内皮特異的ＥＣ−ＧＣＡ−ＫＯ（ノックアウト）マウスでは、コントロールマウス（Flox/flox）と比較して、pericyte-coated indexについて有意差を認めなかった。

試験例１−２−２ 肺癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰの血管を介した腫瘍血管成熟化作用
本試験例では、試験例２−１と同様に、血管特異的ＧＣ−Ａ遺伝子改変マウスを用いた。また、他のマウスについては、８〜１０週齢の雄のC57BL/6マウス（日本SLC）を使用した。Osmotic pumpはALZET（Cupertino，CA）のＭＯＤＥＬ２００２（１４日間投与用）を使用した。ｈＡＮＰ（配列番号１）は公知の方法に従って製造したものを用いた。

試験例１−２−１と同様にして肺癌マウス同所移植モデルを作製し、遺伝子改変マウスについては、移植後７日目に、日本化薬社のシスプラチン注「マルコ」を用いて、１匹当たり10mg/kg（約300μL）のシスプラチン（ＣＤＤＰ）を尾静脈投与し、5分後に腫瘍を摘出した。また、C57BL/6マウスについては、移植後５日目にマウスを無作為に２群（コントロール群、ＡＮＰ群）に群分けし（各群５〜７匹）、コントロール群には生理食塩水を充填したOsmotic pumpを、ＡＮＰ群にはｈＡＮＰを充填したOsmotic pumpを、それぞれマウスの背部皮下に埋め込んだ後、ｈＡＮＰについては1.5μg/kg/分の投与量で投与を開始し、移植後７日目に、それぞれの群に、日本化薬社のシスプラチン注「マルコ」を用いて、１匹当たり10mg/kg（約300μL）のシスプラチン（ＣＤＤＰ）を尾静脈投与し、5分後に腫瘍を摘出した。

摘出した腫瘍について、試験例１−１−２と同様にして、腫瘍内シスプラチン濃度を測定し、各群の平均値を算出した。結果を図６に示す。図６より、ＡＮＰ群では、コントロール群と比較して、腫瘍内シスプラチン濃度は有意に高値であり、ＡＮＰ投与により薬剤到達（シスプラチン量）が効率良く行われたことを示している。また、血管内皮特異的ＥＣ−ＧＣＡ−Ｔｇ（過剰発現）マウスでは、ＷＴ（野生型）群と比較して、腫瘍内シスプラチン濃度は有意に高値であった。以上より、ＡＮＰは血管に特異的に作用することにより、腫瘍内の血管を保護して崩壊を抑制することが分かる。

試験例１−３ シスプラチン誘発骨髄抑制モデルに対するＡＮＰの作用
８週齢の雄のC57BL/6マウス（日本SLC）を使用した。Osmotic pumpはALZET（Cupertino，CA）のＭＯＤＥＬ２００２（１４日間投与用）を使用した。ｈＡＮＰ（配列番号１）は公知の方法に従って製造したものを、シスプラチン（ＣＤＤＰ）は日本化薬社のシスプラチン注「マルコ」を用いた。

先ず、マウスを無作為に２群（コントロール群、ＡＮＰ群）に群分けし（各群５〜７匹）、コントロール群には生理食塩水を充填したOsmotic pumpを、ＡＮＰ群にはｈＡＮＰを充填したOsmotic pumpを、それぞれマウスの背部皮下に予め埋め込んだ。
次に、ＣＤＤＰ投与を行う１日前（Day-1）に、ＡＮＰ群については1.5μg/kg/分の投与量で投与を開始した。翌日それぞれの群にＣＤＤＰを１匹当たり16mg/kg（約480μL）で腹腔内投与し、Day0（ＣＤＤＰ投与前）、2、4、8、14に、マウス6匹ずつ、体重測定を行ってから屠殺し、大腿静脈より血液採取を行った後、骨髄採取も行った。

得られた血液からは、白血球数、血小板数、ヘモグロビン値を、動物用全自動血球計数器「セルタックα」MEK-6450（日本光電）を用いて測定した。骨髄からは、骨髄内全細胞数、生細胞数、及びgranulocyte macrophage colony forming units (GM-CFU)を、StemCell Technologies社のアッセイキットを用いて測定した。血液の結果を図７に、骨髄の結果を図８に示す。

また、ＣＤＤＰ投与後早期のメカニズムを明らかにする為に、同様の実験を、Day0(ＣＤＤＰ投与前)、0.5、1、2に、マウス大腿静脈より採血を行い、血清保存後、血清中G-CSF濃度を、Mouse G-CSF Quantikine ELISA Kit (Cat. MCS00；R&D systems社)を用いて測定した。結果を図９に示す。

図７より、コントロール群と比較して、ＡＮＰ群で白血球数がDay2、4で有意に高値であった。図８より、コントロール群と比較して、ＡＮＰ群で骨髄内生細胞数及びGM-CFU値がDay2、4、８で有意に高値であった。また、図９より、コントロール群と比較して、ＡＮＰ群ではDay0.5で高い傾向を示し、Day1では有意に高値であった。
以上より、ＡＮＰは血漿G-CSF値を増加させることによって、シスプラチン等の抗癌剤により誘発される副作用である骨髄抑制に対して軽減効果を発揮すると考えられる。

試験例２ 乳癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰとタキサン系抗癌剤の併用効果
マウスは７週齢の雌のBalb/cマウス（日本SLC）を使用した。また、Osmotic pumpはALZET（Cupertino，CA）のＭＯＤＥＬ２００４（２８日間投与用）を使用した。ｈＡＮＰ（配列番号１）は公知の方法に従って製造したものを、代表的なタキサン系抗癌剤である、日本化薬社のドセタキセル点滴静注液20mg/1mL「NK」を用いた。

4T1乳癌細胞（和光純薬）を、FBS freeのRPMI-1640を用いて1×10⁶ cell/100μLになるように調製した。この懸濁液を、上記マウスに１匹当たり100μL、右乳腺内に注入した。１週間後に腫瘍を摘出し、この腫瘍から3×3mmサイズの腫瘍片を作製した。
次に、新しく準備したマウスに、１匹につき１個ずつ右乳腺へ3×3mm腫瘍片を同所移植した。移植後５日目に、マウスを無作為に４群（コントロール群、ＡＮＰ群、ドセタキセル（ＤＴＸ）群、併用群）に群分けし（各群6匹）、表１に記載の内容物を充填したOsmotic pumpをマウスの背部皮下に埋め込み、ｈＡＮＰを充填したものについては1.5μg/kg/分の投与量となるよう設定して投与を開始した。その後、移植後７日目に、表１に記載の生理食塩水又はＤＴＸを１匹当たり約100μL尾静脈投与した。

投与期間も含めて移植後４週間観察を続け、１週毎に、移植した腫瘍の大きさを計測し、腫瘍ボリュームを以下の推定式で求め、各群の平均値を算出した。結果を図１０に示す。
腫瘍ボリューム(mm^３)=(π/6)×d^３
d=縦と横の平均径（mm）

図１０より、コントロール群とＡＮＰ群は特に差を認めなかった。一方、ＤＴＸ群は、コントロール群やＡＮＰ群と比較して腫瘍の増殖が有意に抑制されたが、併用群はＤＴＸ群と比較しても腫瘍の増殖が有意に抑制された。以上の結果より、ＤＴＸの抗腫瘍作用（腫瘍増殖抑制作用）がＡＮＰ投与によって増強される効果があることが示された。

試験例３ 乳癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰとプラチナ系抗癌剤の併用効果に関するＡＮＰ投与期間の検討
本試験例では、マウスは7週齢の雌のBalb/cマウスを使用した。また、Osmotic pumpはALZETのMODEL1002（14日間投与用）を使用した。
Balb/cマウスの背部皮下に、生理食塩水を入れたOsmotic pumpを埋め込んだものをコントロール群とした。同様に、hANPを0.5μg/kg/分（ANP群）の投与量で投与されるように調製されたOsmotic pumpをマウスの皮下に埋め込んだＡＮＰ投与群を作製した。
シスプラチン（ＣＤＤＰ）投与は、1匹当たり10mg/kg（約300μL）のＣＤＤＰを尾静脈投与し、コントロール群では、生理食塩水を同量尾静脈投与した。

4T1乳癌細胞を、FBS freeのRPMI-1640を用いて、4T1細胞が1×10⁶cell/100μLになるように調製した。この懸濁液を、上記マウスに1匹当たり100μL、右乳腺内に注入した。1週間後に、腫瘍を摘出し、この腫瘍から5×5mm細片を作成した。新しく準備したマウスに1匹につき、1個ずつ右乳腺へ5×5mm腫瘍片を同所移植した。マウスを無作為に6群（下記に示す６群）に分け、それぞれの群に応じたＡＮＰ投与のタイミングに調整したOsmotic pumpをマウス皮下に埋め込み、投与を開始した。移植後7日目に、生理食塩水もしくはシスプラチン10mg/kgを尾静脈投与した。
（各群）
コントロール群：生理食塩水を充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、Day7に生理食塩水を尾静脈投与
vehicle＋CDDP群：生理食塩水を充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、Day7に10mg/kgのCDDPを尾静脈投与
ANP1日投与＋CDDP群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay6に埋め込み、Day7に10mg/kgのCDDPを尾静脈投与
ANP3日投与＋CDDP群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay4に埋め込み、Day7に10mg/kgのCDDPを尾静脈投与
ANP5日投与＋CDDP群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay2に埋め込み、Day7に10mg/kgのCDDPを尾静脈投与
ANP7日投与＋CDDP群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、Day7に10mg/kgのCDDPを尾静脈投与

投与期間も含めて移植後4週間観察を続け、1週毎に、細胞注入部の腫瘍の大きさを計測し、腫瘍ボリュームを試験例２と同様にして算出し、各群の平均値を算出した。結果を図１１に示す。

図１１に示されるように、コントロール群と比較して、vehicle＋CDDP群では有意に腫瘍増殖が抑制された。一方、vehicle＋CDDP群と比較して、ANP1日投与＋CDDP群及びANP3日投与＋CDDP群では、腫瘍増殖抑制効果に関して有意差を認めなかったが、ANP5日投与＋CDDP群及びANP7日投与＋CDDP群コントロール＋CDDP群では、有意に腫瘍増殖抑制効果が大きかった。以上の結果より、ＣＤＤＰの抗腫瘍作用（腫瘍増殖抑制作用）が、ＡＮＰ投与によって増強させる為には、ＡＮＰ投与期間が少なくとも5日間以上要することが示された。

試験例４ 乳癌マウス同所移植モデルに対するＡＮＰと抗ＰＤ−１抗体の併用効果
本試験例では、マウスは7週齢の雌のBalb/cマウスを使用した。また、Osmotic pumpはALZETのMODEL2004（28日間投与用）を使用した。
Balb/cマウスの背部皮下に、生理食塩水を入れたOsmotic pumpを埋め込んだものをvehicle群とした。同様に、hANPを0.5μg/kg/分（ＡＮＰ群）の投与量で投与されるように調製されたOsmotic pumpをマウスの皮下に埋め込んだＡＮＰ群を作製した。
代表的な免疫チェックポイント阻害剤である、抗ＰＤ−１抗体の投与に関しては、BioXCell社の抗マウスPD-1抗体を用いて、20又は10mg/kg（計100μL/1匹になるように注射用水を用いて調製）を腹腔内投与し、コントロール群では、抗マウスIgG(BE0260, BioXCell社)を同量（100μL）腹腔内投与した。

4T1乳癌細胞（和光純薬）を、FBS freeのRPMI-1640を用いて、4T1細胞が1×10⁶cell/100 μlになるように調製した。この懸濁液を、上記マウスに1匹当たり100μl、右乳腺内に注入した。1週間後に、腫瘍を摘出し、この腫瘍から3×3mm細片を作成した。新しく準備したマウスに1匹につき、1個ずつ右乳腺へ3×3mm腫瘍片を同所移植した。移植と同じ日に、マウスを無作為に4群（下記に示す４群）に群分けし、以下の通り、それぞれの群に応じた投与に調整したOsmotic pumpをマウス皮下に埋め込み、投与を開始した。また、移植後7,13,19日目には、以下の通り、それぞれの群に応じた投与に調整した抗マウスIgG又は抗PD-1抗体を腹腔内投与した。
（各群）
コントロール群：生理食塩水を充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、抗マウスIgGをDay7に20mg/kg、Day13、19に10mg/kgをそれぞれ腹腔内投与
ANP群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込んだ
vehicle＋抗PD-1抗体群：生理食塩水を充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、抗マウスPD-1抗体をDay7に20mg/kg、Day13、19に10mg/kgをそれぞれ腹腔内投与
ANP＋DTX群：hANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpをDay0に埋め込み、抗マウスPD-1抗体をDay7に20mg/kg、Day13、19に10mg/kgをそれぞれ腹腔内投与

投与開始後さらに4週間観察を続け、1週毎に、細胞注入部の腫瘍の大きさを計測し、腫瘍ボリュームを試験例２と同様にして算出し、各群の平均値を算出した。結果を図１２に示す。

図１２に示されるように、コントロール群とANP群は特に差を認めなかった。一方、vehicle＋抗PD-1抗体群は、コントロール群やANP群と比較して、腫瘍の増殖が有意に抑制された。さらに、ANP＋抗PD-1抗体群は、vehicle＋抗PD-1抗体群と比較しても、腫瘍の増殖が有意に抑制された。以上の結果より、抗PD-1抗体の抗腫瘍作用（腫瘍増殖抑制作用）が、ANP投与によって、増強させる効果があることが示された。

試験例５−１ 肺線維症マウスモデルに対するＡＮＰの効果
本試験例では、マウスは7週齢の雄のC57BL/6Nマウス（日本SLC）を使用した。また、Osmotic pumpはALZET(Cupertino, CA)のMODEL1002（14日間投与用）を使用した。
C57BL/6Nマウスの背部皮下に、生理食塩水を入れたOsmotic pumpを埋め込んだものをコントロール群とした。同様に、hANPを0.5μg/kg/分（ANP群）の投与量で投与されるように調製されたOsmotic pumpをマウスの皮下に埋め込んだANP群を作製した。

代表的な肺線維症誘発剤である、ブレオマイシンの投与に関しては、日本化薬社のブレオ注射用5mgを用いて、1mg/kg（計80μL/1匹になるように注射用水を用いて調製）を気管内投与し、コントロール群では、生理食塩水を同量（80μL）気管内投与した。ブレオマイシン及び生理食塩水投与後、21日目に犠牲死させ、マウス肺を4％パラホルムアルデヒド（和光純薬）で伸展固定し、パラフィン包埋ブロックを作製後、マッソン・トリクローム染色を行った。染色標本について、ボックス型蛍光撮像装置 FSX100（Olympus）で撮影を行った。肺線維化面積率については、線維化面積/全体の肺面積と定義し、CellSens Dimension software version 1.6 (Olympus)で自動算出を行った。結果を図１３に示す。
（各群）
コントロール群：生理食塩水を気管内投与した群
Vehicle+ブレオマイシン投与群：生理食塩水を充填したOsmotic pumpを埋め込み、3日後にブレオマイシン(1mg/kg)を気管内投与した群
ANP+ブレオマイシン投与群：ANPを0.5μg/kg/分の投与量で投与するように充填したOsmotic pumpを埋め込み、3日後にブレオマイシン(1mg/kg)を気管内投与した群

図１３に示されるように、コントロール群では認められない肺線維化面積が、vehicle＋ブレオマイシン群では、顕著に増大するが、ANP投与によって、有意に抑制されることが示された。

試験例５−２ 組織特異的トランスジェニック(Tg)マウスを用いた肺線維症抑制効果
本試験例では、12週齢の野生型マウス、血管内皮特異的GC-A-Tg（Tie2-Cre-GC-A-Tg）マウス、繊維芽細胞特異的GC-A-Tg（Periostin-Cre-GC-A-Tg）マウスを使用し、ブレオマイシンの投与は前述と同様の方法で行った。

前述と同様に、各群のマウスに対してブレオマイシン（1mg/kg）を気管内投与し、21日目に犠牲死させ、マウス肺を4％パラホルムアルデヒドで伸展固定し、パラフィン包埋ブロックを作製後、マッソン・トリクローム染色を行った。染色標本について、ボックス型蛍光撮像装置 FSX100（Olympus）で撮影を行った。肺線維化面積率については、試験例５−１と同様にして算出し、肺線維化面積について、野生型マウスを１とした場合の各群の割合を表示した。結果を図１４に示す。
（各群）
野生型マウス群：野生型マウスにブレオマイシン(1mg/kg)を気管内投与した群
血管内皮特異的GC-A-Tg群：血管内皮特異的GC-A-Tgマウスにブレオマイシン(1mg/kg)を気管内投与した群
繊維芽細胞特異的GC-A-Tg群：繊維芽細胞特異的GC-A-Tg マウスにブレオマイシン(1mg/kg)を気管内投与した群

図１４に示されるように、野生型マウス群と比較して、血管内皮特異的GC-A-Tgマウスでは肺線維化面積が有意に抑制されており、繊維芽細胞特異GC-A-Tgマウスでは有意な抑制は認められなかった。以上より、ANPは血管を介して肺線維化抑制効果を発揮することが示唆される。

本発明の医薬は、血流を介して抗悪性腫瘍剤を効果的に腫瘍細胞内に到達させることができることから、強力な効果を有する悪性腫瘍治療用医薬として有用である。

配列表の配列番号１は、ヒト由来ＡＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号２は、ラット由来ＡＮＰ／マウス由来ＡＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号３は、ヒト由来ＢＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号４は、ブタ由来ＢＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号５は、ラット由来ＢＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号６は、マウス由来ＢＮＰのポリペプチドである。
配列表の配列番号７は、ＡＮＰ又はＢＮＰにおけるリング構造のポリペプチドである。

Claims (29)

1. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有し、（Ｂ）抗悪性腫瘍剤投与の５日以上前に投与されることを特徴とする、前記（Ｂ）抗悪性腫瘍剤の治療効果の増強剤。
2. （Ｂ）抗悪性腫瘍剤投与の３日前に、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストの最高血中濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１．６ｎｇ／ｍＬとなるように投与されることを特徴とする、請求項１記載の増強剤。
3. （Ｂ）抗悪性腫瘍剤が、白金製剤、微小管阻害作用を有する化合物、及びＰＤ−１経路阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１又は２記載の増強剤。
4. 白金製剤が、シスプラチンである、請求項３記載の増強剤。
5. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又は脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１〜４いずれかに記載の増強剤。
6. 心房性ナトリウム利尿ペプチドが、
   （１）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び
   （２）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された配列からなり、かつ、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａに対してアゴニスト活性を有するペプチド
   である、請求項５記載の増強剤。
7. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト、及び（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を組み合わせてなる医薬。
8. 配合剤である、請求項７記載の医薬。
9. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト、及び（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤が併用されることを特徴とする、請求項７記載の医薬。
10. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤とが同時または順次に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬。
11. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤とが別々に投与されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬。
12. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又は脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項７〜１１いずれかに記載の医薬。
13. 心房性ナトリウム利尿ペプチドが、
    （１）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び
    （２）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された配列からなり、かつ、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａに対してアゴニスト活性を有するペプチド
    から選ばれる、請求項１２記載の医薬。
14. 微小管阻害作用を有する化合物が、タキサン系抗悪性腫瘍剤である、請求項７〜１３いずれかに記載の医薬。
15. タキサン系抗悪性腫瘍剤が、ドセタキセルである、請求項１４記載の医薬。
16. ＰＤ−１経路阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２から選ばれる少なくとも１種に対する阻害剤から選択される、請求項７〜１３いずれかに記載の医薬。
17. ＰＤ−１経路阻害剤が、ＰＤ−１もしくはＰＤ−１リガンドに対する抗体又はＰＤ−１もしくはＰＤ−１リガンドに対する抗体をコードする核酸である、請求項７〜１３いずれかに記載の医薬。
18. 悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、請求項７〜１７のいずれかに記載の医薬。
19. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤の悪性腫瘍の治療効果の増強剤。
20. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを有効成分として含む、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤と併用するための医薬組成物。
21. （Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を有効成分として含む、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストと併用するための医薬組成物。
22. 悪性腫瘍の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、請求項２０又は２１記載の医薬組成物。
23. （Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを有効成分として含む、（Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤による治療を受けている患者用の医薬組成物。
24. （Ｂ’）微小管阻害作用を有する化合物又はＰＤ−１経路阻害剤を有効成分として含む、（Ａ）ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストによる治療を受けている患者用の医薬組成物。
25. ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを含有する、肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のために用いられる医薬組成物。
26. ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストが、心房性ナトリウム利尿ペプチド又は脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項２５記載の医薬組成物。
27. 心房性ナトリウム利尿ペプチドが、
    （１）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び
    （２）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された配列からなり、かつ、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａに対してアゴニスト活性を有するペプチド
    である、請求項２６記載の医薬組成物。
28. ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニストを投与することを特徴とする、肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療方法。
29. 肺線維症又は間質性肺炎の予防又は治療のための、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａアゴニスト。