JPWO2016186140A1

JPWO2016186140A1 - 新規な細胞膜透過性ペプチド

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Publication number: JPWO2016186140A1
Application number: JP2017519383A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　慎悟; 慎悟伊藤; 純男大槻
Original assignee: Kumamoto University NUC
Current assignee: Kumamoto University NUC
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2018-03-08
Anticipated expiration: 2036-05-18
Also published as: WO2016186140A1; US20190054148A1; JP6857875B2; US10736941B2

Abstract

本発明は、高分子医薬品にも適用できる新規な膜透過性改善剤を提供することを目的とする。より具体的には、小腸における高分子の薬剤の吸収効率を改善できる薬剤キャリア、およびそのキャリアを含む膜透過改善剤を提供することを目的とする。本発明により、下記のアミノ酸配列：アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、およびＭＳＶＡＮ（配列番号４）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む細胞膜透過性ペプチドが提供される。本発明によりまた、該ペプチドおよび生理活性物質を含む細胞膜透過性組成物が提供される。

Description

本発明は、新規な細胞膜透過性ペプチドに関する。

経口投与は普段の生活において自然で簡便に服用ができ非侵襲的であることから比較的安全に医薬品を服用することができる方法である。また、消化管が薬物吸収に適した構造をとり、吸収表面積が大きいことから、医薬品製剤として経口製剤の開発が望まれている。しかし、薬物の経口投与を可能とするためには克服しなければならないいくつかの問題がある。

一つは、薬物が全身循環に移行する前に消化管内の酵素により分解されてしまう可能性である。そのための解決策として、腸溶性製剤技術等により胃での薬物の失活を防ぎ、腸管まで薬物を送達することが可能となっている。
他の問題点は、薬物が腸管粘膜、上皮を十分に透過しないことである。消化管での吸収性は経口投与における医薬品の体内動態や薬理活性の重要な決定因子のひとつである。しかし、次世代医薬品として期待されている核酸などの水溶性高分子医薬品は消化管吸収性が極めて低いため、臨床では、経口投与ではなく静脈内注射による投与方法に限られている。

これまでに、医薬品の消化管吸収性改善を達成するために、一時的に生体膜の物質透過性を増加させる吸収促進剤や添加剤などを用いた研究が行われてきた。吸収促進剤としては、界面活性剤、脂肪酸、アルコールなどをあげることができる。しかし、吸収促進剤や添加剤は、密着結合（タイトジャンクション）の開閉などによって非特異的に消化管吸収を増加させること、生体内の水分等で希釈を受けるために十分に効果が発揮できないこと、そして、局所における粘膜障害等の安全性が問題となっている。そのため、実用化が座剤に限定されている。また、これらの方法は、低分子医薬品の吸収効率の改善には適用できても、高分子医薬品の吸収効率の改善は不充分である。

また、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）−１Ｔａｔペプチド、ＨＩＶ−１Ｌｅｖペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、アルギニンオリゴマーなどの細胞膜透過ペプチドを用いて消化管吸収を増加させる研究も行われてきた。しかしながら、基礎研究においてはインスリンの消化管からの吸収を促進させたものがあるが、まだその効率は２０％程度であり、臨床応用されたものはなく、さらに効率のよい配列が模索されている。
さらに、細胞膜透過ペプチドを基剤である幹高分子に結合して共存する薬剤の吸収を改善した経上皮吸収促進剤も提案されている（特許文献１）。

他に、キトサン修飾したリポソームが開発されている（非特許文献１）。その輸送機構は細胞間隙の透過が主であり、Ｆ−アクチンに作用し、タイトジャンクションを減弱する。しかし、経細胞輸送に関しても、ムチンとの相互作用を介した吸着性エンドサイトーシスではないかと言われている。これも臨床応用には至っていない。

高分子医薬品の小腸吸収を改善する方法として、タンパク質分解酵素阻害剤とドラッグキャリアとを組み合わせた方法が提案されている（非特許文献２）。そこでは、タンパク質分解酵素阻害剤によりペプチド・タンパク質製剤であるインスリンの分解が１００％抑制できている。そして、ドラッグキャリアであるスマートハイドロゲルにインスリンを封入することで、ラット経口投与時のバイオアベイラビリティが１０％まで改善されたと報告されている（非特許文献３）。しかし、薬物が小腸まで到達するが吸収率としてはまだ十分ではない。
そのため、経口投与が可能で、小腸での吸収改善を目的としたさらに優れた薬物キャリアが望まれていた。

特開２００８−２７５７２９号公報

ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ．２００３Ｊａｎ１７；８６（２−３）：２３５−４２ＩｎｔＪＰｈａｒｍ．２００１Ａｕｇ２８；２２５（１−２）：３１−９ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ９７（２００４）１１５−１２４

本発明は、高分子医薬品にも適用できる新規な膜透過性改善剤を提供することを目的とする。より具体的には、小腸における高分子の薬剤の吸収効率を改善できる薬剤キャリア、およびそのキャリアを含む膜透過改善剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定のアミノ酸配列を含む短いペプチドを持つ高分子が小腸透過性であることを見出し、本発明を完成した。
本発明は以下を含むものである。
［１］下記のアミノ酸配列：アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、およびＭＳＶＡＮ（配列番号４）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む細胞膜透過性ペプチド。
［２］少なくとも一つの非天然型アミノ酸（好ましくは、Ｄ型アミノ酸またはＮ−メチルアミノ酸）を含む上記［１］に記載の細胞膜透過性ペプチド。
［３］前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）、ＴＶＳＲＰＡＦ（配列番号６）、ＨＳＮＤＰＲＮ（配列番号７）、およびＰＦＭＳＶＡＮ（配列番号８）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む上記［１］または［２］に記載の細胞膜透過性ペプチド。
［４］前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）またはＤＮＰＧＮＥ（配列番号９）を含む上記［１］または［２］に記載の細胞膜透過性ペプチド。
［５］前記ペプチドが環状ペプチドである上記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の細胞膜透過性ペプチド。
［６］前記環状ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、上記［５］に記載の細胞膜透過性ペプチド。
［７］前記ペプチドが、哺乳動物細胞の小腸上皮細胞を透過するペプチドである上記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の細胞膜透過性ペプチド。

［８］下記のアミノ酸配列：ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、およびＭＳＶＡＮ（配列番号４）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド、および生理活性物質を含む組成物であって、該ペプチドは、該生理活性物質または該生理活性物質を含む活性物質担体と結合または複合体を形成している細胞膜透過性である組成物。
［９］前記ペプチドが、少なくとも一つの非天然型アミノ酸（好ましくは、Ｄ型アミノ酸またはＮ−メチルアミノ酸）を含む上記［８］に記載の組成物。
［１０］前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）、ＴＶＳＲＰＡＦ（配列番号６）、ＨＳＮＤＰＲＮ（配列番号７）、およびＰＦＭＳＶＡＮ（配列番号８）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む上記［８］または［９］に記載の組成物。
［１１］前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）またはＤＮＰＧＮＥ（配列番号９）を含む上記［８］または［９］に記載の組成物。
［１２］前記ペプチドが環状ペプチドである上記［８］〜［１１］のいずれか一つに記載の組成物。
［１３］前記環状ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、上記［１２］に記載の組成物。
［１４］前記生理活性物質が高分子を含む上記［８］〜［１３］のいずれか一つに記載の組成物。
［１５］前記高分子が、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む上記［１４］に記載の組成物。
［１６］前記生理活性ペプチドがインスリンである上記［１５］に記載の組成物。
［１７］前記高分子が核酸を含む上記［１４］に記載の組成物。
［１８］前記核酸が、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである上記［１７］に記載の組成物。
［１９］前記生理活性物質を含む活性物質担体が、リポソームである上記［８］〜［１８］のいずれか一つに記載の組成物。
［２０］前記生理活性物質を含む活性物質担体が、シクロデキストリンである上記［８］〜［１８］のいずれか一つに記載の組成物。

本発明によれば、消化管吸収の主要組織である小腸を効率的に透過する新規な細胞膜透過性ペプチドが提供される。本発明によればまた、高分子を効率良く小腸上皮細胞へと輸送できる細胞膜透過性ペプチドおよび該ペプチドを含む高分子医薬品が提供できる。

図１は、ファージにディスプレイされる環状アミノ酸構造を示している図２は、Ｃａｃｏ−２細胞を用いて、スクリーニングされた７アミノ酸配列からなるペプチドを提示したそれぞれのファージの透過性を確認した結果を示している。図３は、スクリーニングした環状ペプチドの小腸透過性を、ＩＣＲマウスの消化管ループを用いたｉｎｓｉｔｕｃｌｏｓｅｄｌｏｏｐｍｅｔｈｏｄにより確認した結果である。図４は、合成ペプチドのアミノ酸配列と構造を示した図である。Ａは、ＤＮＰ提示Ｍ１３ファージの構造を、Ｂは、合成非標識ＤＮＰペプチドを、Ｃは、合成ＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドを示す。図５は、非標識ＤＮＰの存在下、非存在下での、Ｃａｃｏ−２細胞を透過するＤＮＰ提示ファージを測定した結果を示す。図６は、非標識ＤＮＰの存在下、非存在下での、Ｃａｃｏ−２細胞を透過するＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドを測定した結果を示す。図７は、合成ＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドの小腸透過性を、ＩＣＲマウスの消化管ループを用いたｉｎｓｉｔｕｃｌｏｓｅｄｌｏｏｐｍｅｔｈｏｄにより確認した結果である。図８は、Ｍ−Ｃｏｆｆｅｗｅｂｓｅｒｖｅｒを用いた、同定された４つのペプチドのアライメント解析の結果を示している。本発明の環状ＤＮＰペプチドの共投与によるインスリン吸収を、血糖値を測定することにより確認した結果である。

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。

（１）細胞膜透過性ペプチド
本発明において細胞膜透過性ペプチドとは、ＤＮＰＧＮ、ＳＲＰＡＦ、ＮＤＰＲＮ、またはＭＳＶＡＮのアミノ酸配列を有するＬ体またはＤ体のペプチドをあげることができる。天然に存在するアミノ酸である立体配置がＬ体であるアミノ酸の他に、天然のアミノ酸の構造を一部改変した誘導体など非天然のアミノ酸も使用されうる。非天然アミノ酸としては、特に制限されず、公知の任意のアミノ酸を用いることができる。例えば、立体配置がＤ体のアミノ酸やＮ−メチルアミノ酸は、蛋白分解酵素による分解を受けにくいことから本発明のペプチドに有効に使用されうる。本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列のうち、少なくとも一部がＤ体やＮ−メチルアミノ酸などの非天然型アミノ酸であってもよい。

本発明の細胞膜透過性ペプチドは、ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、またはＭＳＶＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む細胞膜透過性ペプチドであり、好ましくは、ＤＮＰＧＮ、ＤＮＰＧＮＥ（配列番号９）、ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）、ＴＶＳＲＰＡＦ（配列番号６）、ＨＳＮＤＰＲＮ（配列番号７）、またはＰＦＭＳＶＡＮ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むペプチドであり、より好ましくは、ＤＮＰＧＮ、ＤＮＰＧＮＥ、またはＤＮＰＧＮＥＴのアミノ酸配列を含むペプチドである。
本発明において細胞膜透過性ペプチドとは、上記配列で示されるＬ体またはＤ体あるいはそれらが混合したペプチド、およびその逆鎖ペプチドを含む意味である。例えば、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮを含むペプチドとは、（Ｎ末端）−ＤＮＰＧＮ−（Ｃ末端）の順にその配列を含むペプチドと、（Ｎ末端）−ＮＧＰＮＤ−（Ｃ末端）の順にその配列を含むペプチドのいずれをも含む意味である。

上記のアミノ酸配列を有するとは、上記配列、例えば、ＤＮＰＧＮで示される５個のアミノ酸配列のみのアミノ酸を有することでもよく、または上記配列のアミノ酸のＣ末端側および／またはＮ末端側に任意にアミノ酸を、それぞれあるいは合わせて１個あるいは複数個、好ましくはそれぞれ独立に１〜４個有するものでもよい。
ここで、上記配列のアミノ酸のＣ末端側および／またはＮ末端側に任意にアミノ酸を有する場合は、上記配列からなるペプチド部分は逆鎖ペプチド配列であってもよい。例えば、ＤＮＰＧＮのアミノ酸配列の場合は、例えばアミノ酸のＣ末端側に１個のアミノ酸を有するとは、（Ｎ末端）−ＤＮＰＧＮＸ−（Ｃ末端）（Ｘは任意のアミノ酸）であっても、（Ｎ末端）−ＮＧＰＮＤＸ−（Ｃ末端）（Ｘは任意のアミノ酸）であってもよい。
本発明の細胞膜透過性ペプチドとは、上記配列を有することにより、高分子、例えば、これに限定しないが、生理活性ペプチド、タンパク質または核酸を細胞内、好ましくは小腸の細胞内に輸送することができる。

本発明のペプチドは、公知のペプチド合成方法に従って作製することができる。また、材料として、天然アミノ酸に加えて非天然アミノ酸を用いることにより、少なくともペプチドの一部が非天然アミノ酸からなる本発明の細胞膜透過性ペプチドを作製できる。例として、一部がＤ体やＮ−メチル化されたアミノ酸からなるペプチドをあげることができる。ペプチドの合成方法としては、例えば、固相合成法、液相合成法等があげられ、合成反応後は、ペプチドの分野において通常用いられる精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶等の技術を組み合わせて用いることにより、本発明のペプチドを単離・精製できる。

本発明のペプチドは、好ましくは環状ペプチド、特に好ましくはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである。本発明の環状ペプチドは、環状ペプチドを作製するための公知の方法を用いて作製することができる。これに限定されないが、例えば、２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合を利用して架橋を形成して環状化する方法、オレフィンメタセシスを利用して分子内架橋を形成して環状化する方法、アミノ酸残基の側鎖官能基同士を架橋して環状化する方法、システイン残基との間に環状チオエーテルを形成させて環状化する方法等をあげあることができる。
本発明のペプチドの一つの態様は、環状ペプチドであってその環状内の配列として上記配列のうちの一つから選択される配列を含むペプチドである。環状内のアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは、架橋を形成するアミノ酸を除いて、上記配列を含む５〜１５、より好ましくは５〜９である。
これに限定されないが、例えば、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む本発明の細胞膜透過性ペプチドは、上記配列のうちの一つから選択される配列を環状内の内部配列として含むアミノ酸配列を含み、内部配列のＮ末端方向の外部に位置する第一のＣｙｓと、内配列のＣ末端方向の外部に位置する第二のＣｙｓとをさらに含み、これらのＣｙｓが互いにジスルフィド結合を形成して環状ペプチドとなったものである。

（２）生理活性物質
本発明において生理活性物質（以下、単に活性物質という場合もある）とは、生体に投与した場合に、生理的活性を示す低分子量化合物および高分子物質のいずれも含む意味で用いられる。
上記低分子量化合物とは、これに限定されないが、種々の疾患の治療および／または予防のために用いられる医薬品に有効成分として含まれている低分子化合物、または種々の生理活性を有する低分子化合物をあげることができる。
上記高分子物質としては、これに限定されないが、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、およびこれらの類似体をあげることができる。
タンパク質としては、生理活性を有するタンパク質をあげることができ、疾患の治療および／または予防のために用いられるタンパク質等をあげることができる。例えば、これに限定されないが、酵素、抗体、転写因子、あるいはそれらを構成する特定の部分をあげることができる。具体的には、アルブミンや抗体をあげることができる。
上記ペプチドとしては、生理活性ペプチドをあげあることができ、疾患の治療および／または予防のために用いられるペプチド等をあげることができる。具体的には、これに限定されないが、糖尿病治療に対するインスリン、グルカゴン様ペプチド−１およびその誘導体をあげることができる。
上記核酸としては、疾患の治療および／または予防のために用いられる核酸をあげることができる。例えば、アンチセンスＤＮＡやＲＮＡ干渉を用いた遺伝子ノックダウン法による各種疾患の治療のためのアンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡをあげることができる。具体的には、これに限定されないが、劇症肝炎に対するＮＦ−ｋｂ標的ｓｉＲＮＡや家族性アミロイドアンジオパシーに対するトランスサイレチン標的ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡをあげることができる。

本発明の組成物において生理活性物質として好ましく使用できる薬剤は、例えば、これに限定されないが、例えば、インスリンおよびインスリン分泌促進剤などのペプチド・タンパク質医薬品、ステロイドホルモン、非ステロイド系鎮痛抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー薬、抗喘息薬、抗パーキンソン病薬、抗痴呆薬、向精神薬、抗高血圧薬、心疾患治療薬、循環器改善薬、制吐剤、利尿剤、抗血栓薬、抗腫瘍薬をあげることができる。本発明の細胞膜透過性ペプチドは、小腸での透過を促進するものであるので、消化管からの吸収促進に基づいてより有効な薬効を示す物質は本発明の対象の範囲である。

本発明の組成物においては、本発明の細胞膜透過性ペプチドをこれらの活性物質と結合させても良く、あるいは、これらの活性物質との間で複合体を形成させてもよい。ペプチドと活性物質との結合（例えば、共有結合や非共有結合的相互作用）は、公知の方法により行うことができ、用いる活性物質の種類に応じて、適宜方法を選択できる。例えば、活性物質である生理活性ペプチドや核酸の末端に本発明のペプチドを直接またはリンカーを介して結合させることができ、ペプチドや核酸に短いペプチドを結合する技術は公知の方法を用いて行うことができる。ペプチドと活性物質の複合体の形成も、公知の方法により行うことができ、用いる活性物質の種類に応じて、適宜方法を選択できる。

（３）活性物質担体
本発明の組成物における活性物質担体とは、上記活性物質と結合できる、あるいは上記活性物質をその中に配置できる担体をあげることができる。活性物質担体とは、これに限定されないが、例えば、リポソーム、シクロデキストリンおよびその誘導体、ナノ粒子、ミセルをあげることができる。活性物質をこのような担体に組み込むための手法は公知であり、それらの公知の方法を本発明においても用いることができる。また、各担体についても、種々のものがその製法や入手経路も含めて公知であり、それらを用いることができる。
例えば、これに限定されないが、本発明の細胞膜透過性ペプチドを付加することによって消化管での吸収を促進することができる担体としては、リポソームやシクロデキストリンをあげることができる。

本発明の組成物においては、本発明の細胞膜透過性ペプチドを、これらの生理活性物質を含む活性物質担体（例えば、リポソームやシクロデキストリン）と結合させても良く、あるいは、これらの活性物質を含む担体との間で複合体を形成させてもよい。ペプチドと担体との結合（例えば、共有結合や非共有結合的相互作用）は、公知の方法により行うことができ、用いる担体の種類に応じて、適宜、方法を選択できる。ペプチドと担体の複合体の形成も、公知の方法により行うことができ、用いる活性物質の種類に応じて、適宜、方法を選択できる。例えば、リポソームとの場合は本発明の細胞膜透過性ペプチドのＣ末端に脂肪酸を付加させることでリポソーム膜に挿入させることができる（ＷＯ２０１３／１４０６４３号公報参照）。加えて、公知の方法を用いて、活性物質を封入できるリポソームやシクロデキストリンの表面に本発明の細胞透過性ペプチドを結合させて提示させることもできる。
このようにして、例えば、汎用性の高い小腸透過性ドラッグデリバリーシステムの構築が可能である。

（４）組成物
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、上記した５〜７アミノ酸配列部分において、塩基性アミノ酸であるアルギニンを全く含まないか、あるいは含むとして一塩基である。そのため、水への溶解性に優れ、可溶化が容易であるという特徴を有する。よって、本発明の細胞膜透過性ペプチドは様々な活性物質に対する適用性が高く、本発明の組成物は調製が容易である。
また、本発明の細胞膜透過性ペプチドは、Ｍ１３ファージという非常に大きな分子を輸送可能である。従って、本発明の組成物は、大きな活性物質を輸送するのに優れている。
本発明の組成物は医薬として利用が可能である。本発明の組成物を含む医薬品は、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、そのまま液剤としてまたは適当な剤型の医薬組成物として、ヒトを含む哺乳動物に対して経口的または非経口的に投与することができるが、本発明の組成物を含む医薬組成物は、好ましくは経口的に投与される。

本発明の組成物を含む医薬組成物は、活性物質および本発明の細胞膜透過性ペプチドの効果を損なわない範囲で任意の成分を適宜配合できる。任意成分としては、これに限定されないが、例えば、架橋剤、溶解剤、乳化剤、保湿剤、清涼化剤、無機粉体、酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香味剤、ｐＨ調整剤、安定化剤をあげることができる。

本発明の組成物のヒトに対する投与量は、含まれている活性物質の種類、投与対象の年齢、体重、状態、性別、投与方法、その他の条件に応じて適宜決定される。例えば、活性物質の量として、投与量は、１日あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇがあげられる。

以下、本発明を、実施例をもとに説明するが、本発明は以下に記載の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ヒト小腸透過ペプチドのスクリーニング
消化管吸収の主要組織である小腸を効率的に透過する高分子医薬品の輸送が可能な環状ペプチドの同定を目的として、ヒト小腸透過ペプチドのスクリーニングを行った。
環状ペプチド同定は、７アミノ酸がランダムに提示されるファージライブラリー（１ｘ１０⁹種類）とヒト小腸モデル細胞として汎用されるＣａｃｏ−２細胞を用いた。
（１）ファージライブラリーの作製
Ｐｈ．Ｄ．（登録商標）−Ｃ７ＣＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙＰｅｐｔｉｄｅＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ（ＢｉｏＬａｂ社）を購入し、ファージライブラリーを取得した。ファージにディスプレイされる環状アミノ酸構造を図１に示す。

（２）透過ペプチドのスクリーニング
Ｃａｃｏ−２細胞を用いた透過実験は、Ｏｈｕｒａらの報告（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ１００，Ｎｏ．９，２０１１）に従って行った。各ｐｈａｇｅｓｔｏｃｋをＨＢＳＳ緩衝液で５×１０¹¹ｐｆｕ／ｍＬとなるように希釈調製した。トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に入れたＣｏｃａ−２細胞を培養し、十分な密着結合（タイトジャンクション）が形成されていることを確認した後、新しい６ウェルプレートに移した。細胞のａｐｉｃａｌ（ＡＰ）側にｐｈａｇｅ調製液２ｍＬを加え、３７℃でインキュベーションした（この時点をｔ＝０ｍｉｎとする）。各タイムポイントに達したらトランスウェルを新しい６ウェルプレートに移した。タイムポイントは１，３，５，１０，３０ｍｉｎとした。各タイムポイントにおけるｂａｓａｌ（ＢＡ）側のサンプルを氷上に保持した。３０ｍｉｎに達したらトランスウェルを新しい６ウェルプレートに移し、ＡＰ側のＨＢＳＳ緩衝液をアスピレートした後、細胞を遠沈チューブに回収した。各タイムポイントにおけるＢＬ側の力価および上清中の力価をｑＰＣＲにより測定した。

上記のようにしてＢＡ側へ透過したファージを経時的に回収・増殖させることを合計３回行い、Ｃａｃｏ−２細胞を透過するペプチドを提示するファージを選択した。Ｃａｃｏ−２細胞を透過したファージに提示されているペプチドを同定するためにＤＮＡシークエンス解析を行った結果、４９種類の環状ペプチドが同定された。同定された４９種類の７アミノ酸からなるアミノ酸配列のうち、４５種類は１回のみの出現であったのに対し、以下の表１に記載の４つのアミノ酸配列は、３回の実験において、２回または３回の出現頻度を示した。

（実施例２）同定アミノ酸配列ペプチドの透過性
出現頻度が３回であった同定された上記３つペプチド（ペプチド：ＤＮＰ、ＨＳＮ、ＴＶＳ）を選択し、それぞれのペプチド提示ファージの輸送特性を解析したところ、経時的にＣａｃｏ−２細胞を透過し、３０分までの透過量はペプチド非提示ｐｈａｇｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べてそれぞれ３９倍、２６倍、２１倍高かった。結果を図２に示す。
最も透過活性が高かったペプチドである環状ペプチドＤＮＰを用い、Ｃａｃｏ−２細胞への細胞毒性および密着結合に対する影響を確認した。
細胞毒性は、９６ウェルプレートに培養したＣａｃｏ−２細胞に０−１０μＭのＤＮＰペプチドを１００μＬ添加し、１、６および２４時間後における細胞生存率をＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ８（同仁化学）を用いて確認した。
密着結合に対する影響は、Ｃｏｃａ−２細胞をトランスウェルで培養後に、０−１０ μＭのペプチドＤＮＰをａｐｉｃａｌ（ＡＰ）側に２ｍＬ添加し、添加後１、２、３、６、１２、２４時間における電気抵抗値（ＴＥＥＲ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌＥＲＳ−２を用いて測定し確認した。
最も透過した環状ペプチドＤＮＰを用いて、１０μＭの濃度でＣａｃｏ−２細胞を２４時間処理しても細胞毒性や密着結合の減弱は観察されなかった。透過経路として細胞内を透過する経ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒｒｏｕｔｅと細胞と細胞の間を通り抜けるｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｏｕｔｅがあるが、以上の結果から、この同定された環状ペプチドは細胞内を介して透過し、細胞障害性は低いことが示唆された。

（実施例３）マウスにおける小腸透過性の確認
実施例１でスクリーニングした環状ペプチドの小腸透過性を、ＩＣＲマウスの消化管ループを用いたｉｎｓｉｔｕｃｌｏｓｅｄｌｏｏｐ法により以下のようにして解析した。
カニューレから、３つペプチド（ペプチド：ＤＮＰ、ＨＳＮ、ＴＶＳ）のそれぞれのペプチド提示ファージ１．０ｘ１０¹¹ｐｆｕ（ｉｎ１ｍＬＨＢＳＳ緩衝液）を注入した。この時点を０ｍｉｎとする。次いで、１０、２０、３０ｍｉｎに頸静脈から１００μＬずつ採血を行い、血中の力価をプラークカウント法にて測定した。コントロールとして、ペプチド非提示ｐｈａｇｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いた。
結果を図３に示す。環状ペプチドＤＮＰ、ＨＳＮ、ＴＶＳ提示ファージはマウス小腸を経時的に透過し、投与後３０分における血漿中ファージ濃度はｃｏｎｔｒｏｌの１２７１倍、１３８倍、１７倍高かった。
以上の結果から、小腸透過性をもつ環状ペプチドが同定された。また、上記実験で使用した、Ｍ１３ｐｈａｇｅ（約１６ＭＤａ）は巨大分子であり、本発明の細胞透過性ペプチドによりそれを透過させることに成功したことから、本発明の細胞膜透過性ペプチドは高分子医薬品やリポソームの消化管吸収促進に適用可能である。

（実施例４）合成ペプチドによる競合阻害
環状ペプチドＤＮＰ提示ファージのアミノ酸配列部分と同じアミノ酸配列を有する環状ペプチド（”非標識ＤＮＰペプチド：ｕｎｌａｂｅｌｅｄＤＮＰ”とよぶ）、および、そのＣ末端にＬｙｓを介して蛍光色素を結合したＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドを、株式会社スクラムに依頼して合成した。それぞれの構造を図４Ｂおよび４Ｃに示す。図４Ａは、ＤＮＰ提示Ｍ１３ファージの構造を示す。
実施例１と同様にして、非標識ＤＮＰの存在下、非存在下で、Ｃａｃｏ−２細胞を透過するＤＮＰ提示ファージを測定した。用いた非標識ＤＮＰ濃度は、１０μＭである。結果を図５に示す。合成非標識ＤＮＰペプチドにより競合阻害が起こることが確認された。
次いで、実施例１で用いたＣａｃｏ−２細胞の透過実験と同様にして、非標識ＤＮＰの存在下、非存在下で、Ｃａｃｏ−２細胞を透過するＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドを測定した。用いた非標識ＤＮＰ濃度は１０μＭ、ＦＡＭ標識ＤＮＰ濃度は１０μＭとした。結果を図６に示す。

（実施例５）合成ペプチドのマウスにおける小腸透過性の確認
合成したＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドを用いて、実施例３と同様にして、マウスの小腸透過性の確認を行った。結果を図７に示す。合成ＦＡＭ標識ＤＮＰペプチドがマウスの小腸を経時的に透過し、血漿中の濃度が経時的に上昇していることが確認できた。

（実施例６）同定された４つのペプチドのアライメント解析
実施例１により同定された４つのペプチドのアミノ酸配列について、Ｍ−Ｃｏｆｆｅｗｅｂｓｅｒｖｅｒ（Ｍｏｒｅｔｔｉら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００７，ｖｏｌ３５，ＷｅｂＳｅｒｖｅｒＩｓｓｕｅＷ６４５−６４８）を用いてアライメント解析を行った。結果を図８に示す。実線枠で囲ってあるのは、アライメント解析の結果、一致（ｃｏｎｓ）がＧＯＯＤとなったアミノ酸である。４つの配列間で非常に高い一致スコアを示した。

（実施例７）環状ペプチド共投与によるインスリン吸収の促進の確認
本発明の環状ペプチドの共投与によるインスリン吸収への影響を血糖値を測定することにより確認した。
ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）の配列を含む図４Ｂに示される環状ペプチドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成依頼し購入した。
共投与群にはインスリン１０ＩＵ／ｋｇ、ＤＮＰＧＮＥＴ５ｍＭとなるようにｈｏｔＨＢＳＳｓｏｌｕｔｉｏｎ１００ μＬを用いて調製し、３７℃で１時間インキュベートしたものを用いた。インスリン単独投与群にはインスリン１０ＩＵ／ｋｇとなるようにｈｏｔＨＢＳＳｓｏｌｕｔｉｏｎ１００ μＬを用いて調製し、３７℃で１時間インキュベートしたものを用いた。実施例６と同様にして、マウス小腸ｃｌｏｓｅｄｌｏｏｐを作成後、調製しておいたＤＮＰＧＮＥＴ＋インスリン溶液またはインスリン溶液をループ内に投与した。投与時を０分とし、６０分にわたって経時的に血糖値をＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）ＡｖｉｖａＮａｎｏを用いて測定した。結果を図９に示す。本発明のペプチドの共投与によりインスリンの吸収が促進されていることが確認された。

上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。

本発明の細胞透過性ペプチドは、高分子医薬品にも適用できるものであり、透過性ペプチドとして有用である。本発明細胞膜透過性ペプチドはさらには、高分子医薬品やリポソームの消化管吸収促進に適用可能であり、消化管吸収の主要組織である小腸を効率的に透過する高分子医薬品として有用である。

Claims

下記のアミノ酸配列：アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、およびＭＳＶＡＮ（配列番号４）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む細胞膜透過性ペプチド。
少なくとも一つの非天然型アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド。
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）、ＴＶＳＲＰＡＦ（配列番号６）、ＨＳＮＤＰＲＮ（配列番号７）、およびＰＦＭＳＶＡＮ（配列番号８）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む請求項１または２に記載の細胞膜透過性ペプチド。
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）またはＤＮＰＧＮＥ（配列番号９）を含む請求項１または２に記載の細胞膜透過性ペプチド。
前記ペプチドが環状ペプチドである請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞膜透過性ペプチド。
前記環状ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項５に記載の細胞膜透過性ペプチド。
前記ペプチドが、哺乳動物細胞の小腸上皮細胞を透過するペプチドである請求項１〜６のいずれか一つに記載の細胞膜透過性ペプチド。
下記のアミノ酸配列：ＤＮＰＧＮ（配列番号１）、ＳＲＰＡＦ（配列番号２）、ＮＤＰＲＮ（配列番号３）、およびＭＳＶＡＮ（配列番号４）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド、および生理活性物質を含む組成物であって、該ペプチドは、該生理活性物質または該生理活性物質を含む活性物質担体と結合または複合体を形成している細胞膜透過性である組成物。
前記ペプチドが、少なくとも一つの非天然型アミノ酸を含む請求項８に記載の組成物。
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮＥＴ（配列番号５）、ＴＶＳＲＰＡＦ（配列番号６）、ＨＳＮＤＰＲＮ（配列番号７）、およびＰＦＭＳＶＡＮ（配列番号８）からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む請求項８または９に記載の組成物。
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＤＮＰＧＮ（配列番号１）またはＤＮＰＧＮＥ（配列番号９）を含む請求項８または９に記載の組成物。
前記ペプチドが環状ペプチドである請求項８〜１１のいずれか一つに記載の組成物。
前記環状ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を含む環状ペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
前記生理活性物質が高分子を含む請求項８〜１３のいずれか一つに記載の組成物。
前記高分子が、生理活性ペプチドまたはタンパク質を含む請求項１４に記載の組成物。
前記生理活性ペプチドがインスリンである請求項１５に記載の組成物。
前記高分子が核酸を含む請求項１４に記載の組成物。
前記核酸が、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである請求項１７に記載の組成物。
前記生理活性物質を含む活性物質担体が、リポソームである請求項８〜１８のいずれか一つに記載の組成物。
前記生理活性物質を含む活性物質担体が、シクロデキストリンである請求項８〜１８のいずれか一つに記載の組成物。