JPWO2016098581A1 - 表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法 - Google Patents

Abstract

表面プラズモン増強蛍光測定装置は、回折格子を形成された金属膜と、回折格子に固定化され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップを装着され、励起光を回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、直線偏光の励起光を回折格子に照射する光源と、平面視したときにおける回折格子に対する励起光の光軸の方向を変化させるか、または回折格子に対する励起光の偏光方向を変化させる回転部と、蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、偏光子により取り出された直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。

被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。

ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、ＰＣ−ＳＰＦＳは、測定装置の小型化の点で課題を有している。

これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（特許文献１および非特許文献１参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化することができる。

特開２０１１−１５８３６９号公報

Keiko Tawa, Hironobu Hori, Kenji Kintaka, Kazuyuki Kiyosue, Yoshiro Tatsu, and Junji Nishii, "Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance", Optics Express, Vol. 16, pp. 9781-9790.

上記のように、ＧＣ−ＳＰＦＳは、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化できるという利点を有するが、ＧＣ−ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ−ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法には、検出感度に改善の余地がある。

本発明の目的は、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法であって、被検出物質をより高感度に検出することができる測定装置および測定方法を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置は、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、直線偏光の励起光を前記回折格子に照射する光源と、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させるか、または前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる回転部と、前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップを準備する第１工程と、前記金属膜上に前記蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に直線偏光の励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光に含まれる、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の直線偏光の第２の光とをそれぞれ検出し、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値が０となるように、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させるか、または前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる第２工程と、前記金属膜に固定された前記捕捉体に、前記蛍光物質で標識された被検出物質を接触させるか、前記金属膜に固定された前記捕捉体に捕捉された被検出物質を前記蛍光物質で標識する第３工程と、前記第２工程および前記第３工程の後、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に直線偏光の励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光に含まれる、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の第３の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の直線偏光の第４の光とをそれぞれ検出する第４工程と、前記第３の光の検出値と前記第４の光の検出値の差分値を算出する第５工程と、を含む。

本発明によれば、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、被検出物質をより高感度に検出することができる。

図１は、実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）の構成を示す模式図である。 図２Ａ、Ｂは、回折格子の斜視図である。 図３Ａは、実施の形態１に係るチップの第１の態様を模式的に示す図であり、図３Ｂは、実施の形態１に係るチップの第２の態様を模式的に示す図である。 図４Ａ、Ｂは、入射角度を説明するための模式図である。 図５は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。 図６Ａ、Ｂは、蛍光強度の測定手順を示す模式図である。 図７Ａは、蛍光強度の測定手順を示す模式図であり、図７Ｂは、測定原理を説明するための図である。 図８は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 図９は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。 図１０は、実施の形態１、２に係るＳＰＦＳ装置の他の例の構成を示す模式図である。 図１１Ａ、Ｂは、参考実験の手順を示す模式図である。 図１２Ａ、Ｂは、参考実験の測定結果を示すグラフである。 図１３Ａ、Ｂは、参考実験の測定結果を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。

図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、回転部１２０、蛍光検出ユニット１３０および制御部１４０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、回転部１２０のチップホルダー１２２にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。

（チップおよびＳＰＦＳ装置の構成）
チップ２００は、基板２１０と、基板２１０の上に形成された金属膜２２０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。

基板２１０は、金属膜２２０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。

金属膜２２０は、基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。また、金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。さらに、金属膜２２０の厚みは、例えば３０〜５００ｎｍであり、好ましくは１００〜３００ｎｍである。

回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条（金属膜２２０の表面方向に延びた突出部）が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。

回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。

回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。

捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下、「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。

図１に示されるように、励起光αは、所定の入射角度θ_１で金属膜２２０（回折格子２３０）に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＧＣ−ＳＰＦＳでは、ＰＣ−ＳＰＦＳと異なり、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。たとえば、蛍光βの出射角度θ_２は、２θ_１で近似される。なお、励起光αの反射光γは、ほとんど生じない。

回折格子２３０は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常は、回折格子２３０は、液体を収容可能な空間に配置される。たとえば、回折格子２３０は、図３Ａに示されるように、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。図３Ａに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、バルクと金属膜２２０表面との間の物質移動解析（リアルタイム測定）や、増強電場空間スケール（ｚ軸方向）の測定などにも好適である。図３Ｂに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、金属膜２２０表面に固定化された分子（捕捉体）に対する、別の分子（被検出物質）の反応定数解析（リアルタイム測定）などにも好適である。なお、回折格子２３０のピッチとしては、例えば４００ｎｍ程度であることが好ましい。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述したように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、回転部１２０、蛍光検出ユニット１３０および制御部１４０を有する。

励起光照射ユニット１１０は、波長および光量が一定である直線偏光の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。このとき、励起光照射ユニット１１０は、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、直線偏光の励起光αを金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。本実施の形態では、励起光αの光軸は、チップ２００を側面視したとき、金属膜２２０の法線Ｎに対して傾斜している（図４Ａ参照）。また、励起光αの光軸は、チップ２００を平面視したとき、回折格子２３０における周期的構造の配列方向に沿う直線Ｌに対して平行であるか傾斜している(図４Ｂ参照)。

励起光照射ユニット１１０は、少なくとも光源１１２および第１偏光子１１４を有する。励起光照射ユニット１１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。

光源１１２は、チップ２００の回折格子２３０に向けて励起光αを出射する。本実施の形態では、光源１１２は、レーザーダイオードである。なお、光源１１２の種類は、特に限定されず、レーザーダイオードでなくてもよい。光源１１２の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。

第１偏光子１１４は、光源１１２と回折格子２３０との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αから直線偏光の励起光αを取り出す。第１偏光子１１４の種類は、所定の偏光方向の直線偏光の励起光αを取り出すことができれば特に限定されない。第１偏光子１１４の例には、偏光プリズム、液晶フィルター、その他の偏光フィルターが含まれる。本実施の形態では、第１偏光子１１４は、偏光板である。第１偏光子１１４は、光源１１２から出射された励起光αから、金属膜２２０の表面に対する法線Ｎと励起光αの光軸とを含む平面（以下、「前記平面）という）に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の励起光αを取り出す。

励起光フィルター（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αを整波する。励起光フィルターは、例えば、バンドパスフィルターを含む。レーザーダイオード（光源１１２）からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。

コリメートレンズ（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αをコリメートする。レーザーダイオード（光源１１２）から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、レーザーダイオードは所定の姿勢で保持される。照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。

金属膜２２０に対する励起光αの入射角度θ_１は、チップ２００を側面視したときにおける励起光αの入射角度θ_１ａと、チップ２００を平面視したときにおける励起光αの入射角度θ_１ｂとにより表すことができる。

図４は、励起光αの入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）を説明するための模式図である。図４Ａは、チップ２００を側面視したときにおける励起光αの入射角度θ_１ａを説明するための模式図であり、図４Ｂは、チップ２００を平面視したときにおける励起光αの入射角度θ_１ｂを説明するための模式図である。なお、以下の説明では、回折格子２３０における周期的構造の配列方向をｘ軸方向とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に平行な軸をｙ軸とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸をｚ軸とする。

図４Ａに示されるように、チップ２００を側面視したとき、励起光αの光軸は、金属膜２２０の表面の法線Ｎに対して所定の角度傾斜している。チップ２００を側面視したとき、励起光αの光軸と金属膜２２０の表面の法線Ｎとのなす角度のうち小さい角度θ_１ａ（以下、「励起光αの入射角度θ_１ａ」ともいう）は、蛍光β（増強電場）が最も強くなる角度である。励起光αの入射角度θ_１ａは、回折格子２３０のピッチや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。チップ２００を側面視したときの励起光αの最適な入射角度θ_１ａは、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸と前記金属膜２２０（回折格子２３０）との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面に位置する直線を中心軸として励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角度θ_１ａを調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面上の直線を中心軸として、励起光照射ユニット１１０またはチップ２００を相互に回転させればよい。

また、図４Ｂに示されるように、チップ２００を平面視したとき、励起光αの光軸は、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（ｘ軸方向）に沿う直線Ｌに対して平行であるか傾斜している。チップ２００を平面視したとき、励起光αの光軸と回折格子２３０における周期的構造の配列方向に沿う直線Ｌとのなす角度のうち小さい角度θ_１ｂ（以下、「励起光αの入射角度θ_１ｂ」ともいう）は、後述する金属膜２２０上に蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、第１の光（例えば、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°）の検出値と、第２の光（例えば、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°）の検出値との差分値が０となる角度である。チップ２００を平面視したときの励起光αの入射角度θ_１ｂの調整方法は、特に限定されない。本実施の形態では、チップ２００を平面視したときの励起光αの入射角度θ_１ｂは、回転部１２０によって調整している。なお、蛍光β（増強電場）が最も強くなるためには、チップ２００を平面視したときの最適な入射角度θ_１は、励起光αの光軸が、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ、Ｂにおけるｘ軸方向）に沿うことが必要となる。しかし、本実施の形態では、より高精度に被検出物質を測定するために、回折格子２３０における周期的構造の配列方向に沿う直線Ｌに対する励起光αの光軸の角度を設定している。

回転部１２０は、平面視したときにおける回折格子２３０に対する励起光αの光軸の方向（角度）を変化させる。本実施の形態では、回転部１２０は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通る金属膜２２０の表面に対する法線Ｎを中心軸として、回折格子２３０（チップ２００）を回転させる。

回転部１２０の構成は、平面視したときにおける回折格子２３０に対する励起光αの光軸の方向を変化させることができれば特に限定されない。たとえば、回転部１２０は、チップホルダー１２２およびモーター１２４を有する。チップホルダー１２２の構造は、チップ２００を保持することができれば特に限定されない。本実施の形態では、チップホルダー１２２は、上面が開放された箱状に形成されており、内部にチップ２００を収容できるようになっている。モーター１２４は、前記法線Ｎを中心軸としてチップホルダー１２２を回転させる。モーター１２４がチップホルダー１２２に接続されており、モーター１２４を回転させることによりチップ２００が所定の角度だけ回転する。

蛍光検出ユニット１３０は、励起光照射ユニット１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面に対する法線Ｎを挟むように配置されている。蛍光検出ユニット１３０は、金属膜２２０で反射した励起光αの反射光γおよび回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。

蛍光検出ユニット１３０は、少なくとも第２偏光子１３２および光検出部１３４を有する。蛍光検出ユニット１３０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。

第２偏光子１３２は、回折格子２３０と光検出部１３４との間に配置され、蛍光物質から放出された蛍光βから直線偏光の光を取り出す。第２偏光子１３２の種類は、所定の偏光方向の直線偏光の光を取り出すことができれば特に限定されない。第２偏光子１３２の例には、偏光プリズム、液晶フィルター、その他の偏光フィルターが含まれる。本実施の形態では、第２偏光子１３２は、偏光板である。第２偏光子１３２は、金属膜２２０から光検出部１３４に向かう蛍光βの進行方向に垂直な平面内で回転できるように保持されている。

第２偏光子１３２は、チップ２００を平面視したときの励起光αの入射角度θ_１ｂの決定時および被検出物質の検出時において、２種類の光をそれぞれ取り出す。励起光αの入射角度θ_１ｂの決定時には、第２偏光子１３２は、金属膜２２０上に蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、蛍光物質から放出された蛍光βから、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光、および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を取り出す。好ましくは、第２偏光子１３２は、蛍光βから、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光を第１の光として取り出し、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光を第２の光として取り出す。

また、被検出物質の検出時には、第２偏光子１３２は、捕捉体に蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉されている状態のときに、蛍光物質からそれぞれ放出された蛍光βから、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第３の光、および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第４の光を取り出す。好ましくは、第２偏光子１３２は、蛍光βから、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光を第３の光として取り出し、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光を第４の光として取り出す。

本実施の形態では、第２偏光子（偏光板）１３２を回転させることで、第１の光または第２の光を取り出す。また、第２偏光子（偏光板）１３２を回転させることで、第３の光または第４の光を取り出す。

光検出部１３４は、第２偏光子１３２により取り出された直線偏光の光を検出して、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。第２偏光子１３２が、蛍光βから第１の光または第２の光を取り出した場合は、光検出部１３４は、第１の光または第２の光を検出する。また、第２偏光子１３２が、蛍光βから第３の光または第４の光を取り出した場合は、光検出部１３４は、第３の光または第４の光を検出する。たとえば、光検出部１３４は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１３４は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。

集光レンズ群（図示省略）は、チップ２００と光検出部１３４との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜２２０上の蛍光像を光検出部１３４の受光面上に結像させる。

蛍光フィルター（図示省略）は、チップ２００と光検出部１３４との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１３４に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１３４に到達する光の光量を調整したりする。

前述のとおり、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光βは、回折格子２３０（反応場）から特定の方向に指向性を持って出射される。したがって、金属膜２２０表面の法線Ｎに対する蛍光検出ユニット１３０の光軸の角度は、蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニット１３０の光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニット１３０の光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニット１３０の光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面上の直線を中心軸として、蛍光検出ユニット１３０またはチップ２００を相互に回転させればよい。

制御部１４０は、励起光照射ユニット１１０（光源１１２、第１偏光子１１４および第１角度調整部）、回転部１２０（モーター１２４）および蛍光検出ユニット１３０（第２偏光子１３２、光検出部１３４および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１４０は、光検出部１３４からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。制御部１４０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

（表面プラズモン増強蛍光測定方法）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作に（表面プラズモン増強蛍光測定方法）ついて説明する。図５は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図６Ａ、Ｂ、図７Ａは、蛍光強度の測定手順を示す模式図である。図７Ｂは、測定原理を説明するための図である。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、チップ２００を準備して、チップホルダー１２２にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御部１４０は、チップ２００を側面視したときの励起光αの入射角度θ_１ａを決定する（工程Ｓ２０）。具体的には、図６Ａに示されるように、制御部１４０は、励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、第１角度調整部により金属膜２２０に対する励起光αの入射角度θ_１ａを走査させる。また、制御部１４０は、光検出部１３４が金属膜２２０上からの反射光γを検出するように、第２角度調整部を制御する。金属膜２２０で反射した励起光αの反射光γは、光検出部１３４に到達する。これにより、制御部１４０は、励起光αの入射角度θ_１ａと励起光αの反射光γの光量との関係を含むデータを得る。そして、制御部１４０は、データを解析して、励起光αの反射光γの光量が最小となる入射角度θ_１ａを決定する。このとき、励起光αの入射角度θ_１ｂは、０°である。なお、第１偏光子１１４および第２偏光子１３２は、それぞれ励起光αの光路上および反射光γの光路上に配置されていなくてもよい。

このように、決定したチップ２００を側面視したときの励起光αの入射角度θ_１ａは、励起光αの反射光γの光量が最小となる角度である。したがって、チップ２００を平面視したときの励起光αの入射角度θ_１ｂが０°の場合、励起光αの入射角度θ_１（θ_１a、θ_１ｂ）は、共鳴角となる。また、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、励起光αの反射光γの光量が最小となる共鳴角と、増強電場の強度が最も強くなる増強角の値とは、ほとんど同じ値である。すなわち、励起光αの入射角度θ_１ｂが０°の場合、励起光αの反射光γの光量が最小となる励起光αの入射角度θ_１（θ_１a、θ_１ｂ）を求めることで、共鳴角および増強角を求めることができる。決定した入射角度θ_１ａは、被検出物質の測定に用いられる。

次いで、第１の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ３０）。具体的には、まず、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を提供する。このように、第１の光の蛍光強度の測定は、金属膜２２０上に蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに行われる。次いで、図６Ｂに示されるように、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、回転部１２０のモーター１２４を駆動して、金属膜２２０の回折格子２３０の周期方向に対する励起光αの光軸の方向（入射角度θ_１ｂ）を走査させる（チップ２００を水平方向に回転させる）。このとき、入射角度θ_１ａは、工程Ｓ２０で決定した反射光γの光量が最小となる角度である。また、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第１の光（例えば、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏ_１）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏ_１は、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）のうち、第１の光の蛍光強度である。

なお、工程Ｓ３０では、蛍光物質のみ含む液体を提供してもよい。この場合、後述する工程Ｓ７０では、まず検体を提供して、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応）。次いで、２次抗体を提供して、被検出物質と２次抗体とを反応させるとともに、２次抗体と蛍光物質を反応させる（２次反応）。

次いで、第２の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、図６Ｂに示されるように、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、回転部１２０のモーター１２４を駆動して、金属膜２２０の回折格子２３０の周期方向に対する励起光αの光軸の方向（入射角度θ_１ｂ）を走査させる。このとき、入射角度θ_１ａは、工程Ｓ３０と同じ角度である。また、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第２の光（例えば、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏ_２）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏ_２は、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）のうち、第２の光の蛍光強度である。

なお、第１の光の蛍光強度の測定（工程Ｓ３０）と第２の光の蛍光強度の測定（工程Ｓ４０）との順番は、これに限定されない。たとえば、第２の光の蛍光強度を測定した後に、第１の光の蛍光強度を測定してもよい。

次いで、制御部１４０は、入射角度θ_１ｂを決定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１４０は、工程Ｓ３０および工程Ｓ４０により得られた測定結果（出力Ｏ_１および出力Ｏ_２）から第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値が０となる角度を求める。そして、制御部１４０は、第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値が０となる角度を入射角度θ_１ｂとする。

前述のとおり、入射角度θ_１ｂは、第１の光の蛍光強度（ノイズ成分）および第２の光の蛍光強度（ノイズ成分）の差分値が０となる角度である。このように、第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値が０となるように、入射角度θ_１ｂを設定することで、後述の工程Ｓ１１０において、浮遊している蛍光物質の蛍光強度と、第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値とをキャンセルすることができる。

次いで、制御部１４０は、チップ２００を平面視したときの励起光αの入射角度θ_１ｂを調整する（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１４０は、金属膜２２０の回折格子２３０の周期方向に対する励起光αの光軸の角度が工程５０で得られた入射角度θ_１ｂとなるように、回折格子２３０（チップ２００）を回転させる。

次いで、制御部１４０は、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させるとともに、被検出物質と標識された２次抗体とを反応させる（１次反応、２次反応；工程Ｓ７０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。また、被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、すでに存在している２次抗体に結合することで蛍光物質により標識される。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

次いで、任意の工程として、金属膜２２０を洗浄する（工程Ｓ８０）。具体的には、蛍光物質で標識した後は、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。なお、１次反応、２次反応（工程Ｓ７０）の後に金属膜２２０上の蛍光標識液を、２次抗体を含まない緩衝液に置換して金属膜２２０を洗浄した場合であっても、被検出物質に結合した２次抗体の一部は緩衝液中に離脱する。また、１次反応、２次反応（工程Ｓ７０）の後に洗浄を行わなかった場合は、金属膜２２０上には蛍光標識液がそのまま存在していることになる。この場合、リアルタイム測定が可能となるほか、洗浄により測定できなくなるアフィニティの低い物質を測定対象にできるメリットがある。また、洗浄工程を省略することで測定時間も短縮できる。

次いで、第３の光の蛍光強度を測定（被検出物質の測定）する（工程Ｓ９０）。具体的には、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１４０は、光検出部１３４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、励起光αの入射角度θ_１ａは、工程Ｓ２０で決定した角度であり、入射角度θ_１ｂは、工程Ｓ５０で決定した角度である。また、図７Ａに示されるように、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第３の光（図では前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏｐは、シグナル成分および第１の光の蛍光強度の少なくとも一部を含む。

ＧＣ−ＳＰＦＳでは、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光、または偏光角度が前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光に近い光であり、第２偏光子１３２を透過して光検出部１３４に到達する。また、浮遊している蛍光物質の蛍光βに含まれる第１の光も光検出部１３４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｐ）は、シグナル成分および第１の光の蛍光強度の少なくとも一部を含む。

次いで、第４の光の蛍光強度を測定（被検出物質の測定）する（工程Ｓ１００）。具体的には、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１４０は、光検出部１３４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、図７Ａに示されるように、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第４の光（図では前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１４０に出力する。被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光、または前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光に近い光をほとんど含まないため、出力Ｏｓは、主として第２の光の蛍光強度の少なくとも一部からなる。

なお、第３の光の蛍光強度の測定（工程Ｓ９０）と第４の光の蛍光強度の測定（工程Ｓ１００）の順番は、これに限定されない。たとえば、第４の光の強度を測定した後に、第３の光の強度を測定してもよい。

最後に、制御部（処理部）１４０は、光検出部１３４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ１１０）。具体的には、制御部（処理部）１４０は、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。

次に、図７Ｂを参照して、表面プラズモン増強蛍光測定方法の測定原理について説明する。なお、図７ＢのＩ_ｐ１は被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分を示しており、Ｉ_ｓ１は被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分を示しており、Ｉ_ｐ２は増強電場が及ばない空間に位置する浮遊の蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分を示しており、Ｉ_ｓ２は増強電場が及ばない空間に位置する浮遊の蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分を示しており、Ｉ_ｐ３は金属膜２２０に非特異的に付着した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分を示しており、Ｉ_ｓ３は金属膜２２０に非特異的に付着した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分を示している。また、図７Ｂの白丸は被検出物質を示しており、白抜きのＹ字様の構造は、捕捉体（１次抗体）を示しており、黒塗りのＹ字様の構造は２次抗体を示しており、白抜きの星形は蛍光物質を示している。

図７Ｂに示されるように、被検出物質の測定時（第３の光の蛍光強度の測定；工程Ｓ９０）において、蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分Ｉ_ｐは、以下の式（１）で表すことができる。
Ｉ_ｐ＝Ｉ_ｐ１＋Ｉ_ｐ２＋Ｉ_ｐ３ （１）

また、被検出物質の測定時（第４の光の蛍光強度の測定；工程Ｓ１００）において、蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分Ｉ_ｓは、以下の式（２）で表すことができる。
Ｉ_ｓ＝Ｉ_ｓ１＋Ｉ_ｓ２＋Ｉ_ｓ３ （２）

さらに、以下の式（３）に示されるように、式（１）から式（２）を差し引くことで、蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分Ｉ_ｐと、蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分Ｉ_ｓとの差分値を求めることができる。
Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ＝（Ｉ_ｐ１−Ｉ_ｓ１）＋（Ｉ_ｐ２−Ｉ_ｓ２）＋（Ｉ_ｐ３−Ｉ_ｓ３） （３）

ここで、増強電場により励起された蛍光物質からは前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光および偏光角度が前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光に近い光がほとんど放出されないため、増強電場が及ぶ領域に存在する蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分（Ｉ_ｓ１）および（Ｉ_ｓ３）は０と近似することができる。これにより、前述の式（３）は、以下の式（４）となる。
Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ＝Ｉ_ｐ１＋（Ｉ_ｐ２−Ｉ_ｓ２）＋Ｉ_ｐ３ （４）

次に、右辺の第２項の「Ｉ_ｐ２−Ｉ_ｓ２」とは、増強電場が及ばない空間に位置する浮遊の蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分と、増強電場が及ばない空間に位置する浮遊の蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分との差分値であり、本実施の形態では、「Ｉ_ｐ２−Ｉ_ｓ２＝０」である（工程Ｓ３０〜工程Ｓ５０参照）。したがって、前述の式（４）は、以下の式（５）となる。
Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ＝Ｉ_ｐ１＋Ｉ_ｐ３ （５）

さらに、金属膜２２０に非特異的に付着した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分（Ｉ_ｐ３）は、被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分（Ｉ_ｐ１）と比較して極めて小さい値であるため、０と近似することができる。よって、前述の式（５）は、以下の式（６）となる。
Ｉ_ｐ−Ｉ_ｓ＝Ｉ_ｐ１ （６）

このように、本実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、「Ｉ_ｐ２−Ｉ_ｓ２＝０」としているため、第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度が異なる値であっても、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光βの蛍光強度を精度良く検出することができる。

以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。

以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、シグナル成分とノイズ成分の偏光特性の違いを利用してシグナル成分のみを検出することができるため、従来のＳＰＦＳ装置に比べてより高感度に被検出物質を検出することができる。

また、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、１次反応、２次反応（工程Ｓ７０）を行った後に遊離の２次抗体を除去（金属膜２２０の洗浄；工程Ｓ８０）しなくても被検出物質の検出を行うことができる。

なお、前述の実施の形態では、回折格子２３０（チップ２００）を金属膜２２０の法線Ｎを回転軸として回転させたが、回折格子２３０（チップ２００）に対して励起光αの光軸を回転させてもよい。

なお、上記実施の形態では、金属膜２２０側から励起光αをチップ２００に照射する例について説明したが、基板２１０側から励起光αをチップ２００に照射してもよい。

［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００は、回転部３２０の構成が回転部１２０と異なる点において実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、主として回転部３２０の構成について説明する。また、ＳＰＦＳ装置１００と同じ構成については同じ符号を付してその説明を省略する。なお、チップ２００は、実施の形態１に係るチップ２００と同様であるため、その説明を省略する。

（ＳＰＦＳ装置の構成）
図８は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００の構成を示す模式図である。図８に示されるように、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置３００は、励起光照射ユニット１１０、回転部３２０、蛍光検出ユニット１３０および制御部１４０を有する。

回転部３２０は、回折格子２３０に対する励起光αの偏光方向を変化させる。回転部３２０は、第１偏光子１１４に接続されており、励起光αの光軸を中心軸として、第１偏光子１１４を回転させる。第１偏光子１１４を回転させることで、直線偏光の励起光αの偏光方向を回転させる。

（表面プラズモン増強蛍光測定方法）
次に、ＳＰＦＳ装置３００の検出動作に（表面プラズモン増強蛍光測定方法）ついて説明する。図９は、ＳＰＦＳ装置３００の動作手順の一例を示すフローチャートである。なお、実施の形態１におけるＳＰＦＳ装置１００の検出動作と同じ工程については、同じ符号を付してその詳細な説明を省略する。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。

次いで、励起光αの入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）を決定する（工程Ｓ２２０）。具体的には、制御部１４０は、励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、第１角度調整部により、チップ２００を側面視したときの金属膜２２０の表面に対する法線Ｎに対する励起光αの入射角度θ_１ａを走査させる。また、制御部１４０は、光検出部１３４が金属膜２２０上からの反射光γを検出するように、第２角度調整部を制御する。金属膜２２０で反射した反射光γは、光検出部１３４に到達する。これにより、制御部１４０は、チップ２００を側面視したときの励起光αの入射角度θ_１ａと励起光αの反射光γの光量との関係を含むデータを得る。そして、制御部１４０は、データを解析して、励起光αの反射光γの光量が最小となる入射角度θ_１ａを決定する。なお、励起光αの入射角度θ_１ａを測定する場合、励起光αの入射角度θ_１ｂは、０°である。そして、制御部１４０は、励起光αの反射光γの光量が最小となる入射角度θ_１ａと、θ_１ｂとにより構成される角度を励起光αの入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）として決定する。

次いで、第１の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ２３０）。具体的には、制御部１４０は、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を提供した後、励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、回転部３２０を駆動することで、励起光αの光軸を中心軸として、第１偏光子１１４を回転（走査）させる。このとき、入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）は、工程Ｓ２２０で得られた角度である。また、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第１の光のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏ_１）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏ_１は、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）のうち、第１の光（例えば前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光）の蛍光強度である。

次いで、第２の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ２４０）。具体的には、工程Ｓ２３０と同様に、制御部１４０は、励起光αを金属膜２２０の所定の位置に照射させながら、回転部３２０を駆動することで、励起光αの光軸を中心軸として、第１偏光子１１４を回転（走査）させる。このとき、入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）は、工程Ｓ２２０で得られた角度である。また、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第２の光のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏ_２）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏ_２は、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）のうち、第２の光（例えば前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光）の蛍光強度である。

次いで、制御部１４０は、励起光αの偏光方向を決定する（工程Ｓ２５０）。具体的には、制御部１４０は、工程Ｓ２３０および工程Ｓ２４０で得られた測定結果（出力Ｏ_１および出力Ｏ_２）から第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値が０となるときの、励起光αの偏光方向を求める。そして、制御部１４０は、第１の光の蛍光強度および第２の光の蛍光強度の差分値が０となる方向を励起光αの偏光方向として決定する。

次いで、制御部１４０は、直線偏光の励起光αの偏光方向を調整する（工程Ｓ２６０）。具体的には、制御部１４０は、第１偏光子１１４の偏光方向が工程Ｓ２５０で得られた方向となるように、第１偏光子１１４を回転させる。

次いで、制御部１４０は、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させるとともに、被検出物質と標識された２次抗体とを反応させる（１次反応、２次反応；工程Ｓ７０）。

次いで、任意の工程として、金属膜２２０を洗浄する（工程Ｓ８０）。

次いで、第３の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ２９０）。具体的には、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１４０は、光検出部１３４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第３の光（図では前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。また、このとき、入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）は、工程Ｓ２２０で得られた角度であり、第１偏光子１１４の偏光方向は、工程Ｓ２６０で得られた方向である。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏｐは、シグナル成分および第１の光の蛍光強度の少なくとも一部を含む。

次いで、第４の光の蛍光強度を測定する（工程Ｓ３００）。具体的には、制御部１４０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１４０は、光検出部１３４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、制御部１４０は、蛍光βに含まれる第４の光（図では前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光）のみが透過できるように、第２偏光子１３２の回転角度を調整する。このとき、入射角度θ_１（θ_１ａ，θ_１ｂ）は、工程Ｓ２２０で得られた角度であり、第１偏光子１１４の偏光方向は、工程Ｓ２６０で得られた方向である。光検出部１３４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１４０に出力する。出力Ｏｓは、主として第２の光の蛍光強度の少なくとも一部である。

最後に、制御部（処理部）１４０は、光検出部１３４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ３１０）。具体的には、制御部（処理部）１４０は、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。

実施の形態２における表面プラズモン増強蛍光測定方法でも、実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法と同様に、浮遊している蛍光物質からの蛍光βのうちの第１の光の蛍光強度および浮遊している蛍光物質からの蛍光βのうちの第２の光の蛍光強度が異なる値であっても、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光βの蛍光強度を精度良く検出することができる。

以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置３００は、実施の形態１のＳＰＦＳ装置１００と同様の効果を有する。

なお、図１および図８に示されるＳＰＦＳ装置１００の代わりに、図１０に示されるＳＰＦＳ装置４００を用いてもよい。図１０に示されるように、ＳＰＦＳ装置４００は、ハーフミラー４３１、第３偏光子４３２および光検出部４３４をさらに有する点を除き、ＳＰＦＳ装置１００、３００と同様に構成されている。

ハーフミラー４３１は、回折格子２３０と第２偏光子１３２との間において蛍光βの光路上に配置されている。光検出部４３４は、ハーフミラー４３１で反射した蛍光βの光路（反射光路）上に配置されており、第３偏光子４３２は、ハーフミラー４３１と光検出部４３４との間において反射光γ路上に配置されている。第２偏光子１３２の回転角度は、第１の光および第３の光（例えば前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光）を通すように調整（あるいは固定）されており、第３偏光子４３２の回転角度は、第２の光および第４の光（例えば前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光）を通すように調整（あるいは固定）されている。なお、ハーフミラー４３１、第２偏光子１３２および第３偏光子４３２の代わりに、偏光ビームスプリッターを使用してもよい。

以上のように、ＳＰＦＳ装置４００は、ＳＰＦＳ装置１００、３００と同様の効果に加え、ハーフミラー４３１、第３偏光子４３２および光検出部４３４をさらに有しているため、第１の光と第２の光、第３の光と第４の光を同時に測定できる。

［参考実験］
本実験では、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、金属膜上で励起された蛍光物質から放出された蛍光（被検出物質の存在または量を示すシグナル成分）と、液体中に浮遊している蛍光物質から放出された蛍光（ノイズ成分）の偏光特性を調べた結果を示す。

本実験では、チップ２００を平面視したときの入射角度θ_１ｂが１０°の場合において、浮遊している蛍光物質から放出される蛍光の指向性の分布について調べた。本実験では、被検出物質を含む検体を提供せず、蛍光物質のみ含む液体を金属膜２２０上に提供した。本実験では、チップ２００を側面視したときの励起光αの入射角度θ_１ａは励起光αの反射光γの光量が最小となる角度とし、励起光αの偏光方向（角度）は金属膜２２０の表面に対する法線Ｎと励起光αの光軸とを含む平面に対して０°とした。この状態で、回折格子２３０に所定の波長の励起光αを照射し、光検出部１３４の受光角度を変更しながら、浮遊している蛍光物質から放出される蛍光の前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数および蛍光の前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数を測定した。また、比較として、チップ２００を平面視したときの入射角度θ_１ｂが０°であり、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数を測定した。

図１１Ａは、参考実験の手順を示す模式図である。図１２Ａは、光検出部１３４の受光角度と、浮遊している蛍光物質から放出される蛍光βの光子数との関係を示すグラフである。図１２Ａの横軸は光検出部１３４の受光角度θ_３（°）であり、縦軸は蛍光の光子数（count）である。図１２Ａの実線は前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光（入射角度θ_１ｂが１０°）を示しており、破線は前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光を示している。

図１１Ａおよび図１２Ａの実線に示されるように、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数は、受光角度が１５°近傍で一時的に低下した。また、チップ２００を平面視したときの入射角度θ_１ｂが１０°の場合には、浮遊の蛍光物質由来の前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数と、浮遊の蛍光物質由来の前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数との差分値が０となる受光角度があることが分かった。また、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数が一時的に低下したときの受光角度は、蛍光βを検出するために最適な受光角度である。前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数が一時的に低下するのは、当該受光角度では、増強電場の強さが一時的に低下することによるものと考えられた。

次いで、チップ２００を平面視したときの入射角度θ_１ｂが９０°の場合において、浮遊している蛍光物質から放出される蛍光の指向性の分布について調べた。その他の条件は、前述の実験と同じである。

図１１Ｂは、参考実験の手順を示す模式図である。図１２Ｂは、光検出部１３４の受光角度と、蛍光βの光子数との関係を示すグラフである。図１２Ｂの横軸は光検出部１３４の受光角度θ_３（°）であり、縦軸は蛍光の光子数（count）である。図１２Ｂの実線は前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光を示しており、破線は前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光を示している。

図１１Ｂと、図１２Ｂの実線および破線とに示されるように、チップ２００を平面視したときの入射角度θ_１ｂが９０°の場合では、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数が一時的に低下することがなかった。また、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数とは、異なることが分かった。

次いで、励起光αの偏光方向と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の蛍光強度または前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の蛍光強度との関係について調べた。

本実験では入射角度θ_１ａを１０°とし、入射角度θ_１ｂを０°とした。この状態で、回折格子２３０に所定の波長の励起光αを照射し、励起光αの偏光方向を変化させながら、浮遊または固定された蛍光物質から放出された前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数を測定した。

図１３Ａは、偏光方向と、蛍光物質から放出される蛍光の光子数との関係を示すグラフである。図１３Ａの横軸は励起光αの偏光方向（°）を示しており、縦軸は蛍光βの光子数（count）を示している。図１３Ａの黒丸のシンボルは蛍光βのうち、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の蛍光成分を示しており、白丸のシンボルは蛍光βのうち、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の蛍光成分を示している。

図１３Ａに示されるように、蛍光βの前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数は、励起光αの反射光γの光量が最小となる角度であって、入射角度θ_１ｂが０°の励起光α（前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光）を照射した場合に最大であった。また、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数との差分値は、偏光方向が±５０°付近で０であった。

次いで、励起光αの偏光方向を変化させたときの被検出物質を蛍光標識した蛍光物質から放出された蛍光の光子数について調べた。検体に含まれる被検出物質をAlexa Fluor色素（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）で蛍光標識した。この状態で、回折格子２３０に所定の波長の励起光αを照射し、励起光αの偏光方向を変化させながら、被検出物質を蛍光標識した蛍光色素から放出された前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の光子数および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の光子数を測定した。

図１３Ｂは、偏光方向と、蛍光βの光子数との関係を示すグラフである。図１３Ｂの横軸は、励起光αの偏光方向（°）を示しており、縦軸は蛍光βの光子数（count）を示している。図１３Ｂの黒丸のシンボルは前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光を示しており、白丸のシンボルは前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光を示している。

図１３Ｂに示されるように、励起光αの偏光方向が±５０°付近であっても、蛍光物質が放出した蛍光βを測定できた。

したがって、シグナル成分以外のノイズ成分が蛍光βに含まれる場合であっても、図１３に示されるように、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光の成分の検出結果から前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光の成分の検出結果を引くことで、ノイズ成分をほとんど含まないシグナル成分の値を算出することができる。

本出願は、２０１４年１２月１５日出願の特願２０１４−２５３１９３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

また、本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、蛍光標識液などを提供した後に金属膜表面を洗浄しなくても、被検出物質を高い信頼性で測定することもできる。よって、測定時間の短縮化が図られるだけでなく、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。

１００、３００、４００ 表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０ 励起光照射ユニット
１１２ 光源
１１４ 第１偏光子
１２０、３２０ 回転部
１２２ チップホルダー
１２４ モーター
１３０ 蛍光検出ユニット
１３２ 第２偏光子
１３４、４３４ 光検出部
１４０ 制御部（処理部）
２００ チップ
２１０ 基板
２２０ 金属膜
２３０ 回折格子
４３１ ハーフミラー
４３２ 第３偏光子
α 励起光
β 蛍光
γ 反射光

Claims (9)

1. 回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
   増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、直線偏光の励起光を前記回折格子に照射する光源と、
   平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させるか、または前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる回転部と、
   前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、
   前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、
   を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
2. 前記光検出部により得られた検出値を処理する処理部をさらに有し、
   前記偏光子は、
   前記金属膜上に前記蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とをそれぞれ取り出し、
   前記捕捉体に前記蛍光物質で標識されている前記被検出物質が捕捉されている状態のときに、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第３の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第４の光とをそれぞれ取り出し、
   前記光検出部は、
   前記金属膜上に前記蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、前記第１の光および前記第２の光を検出し、
   前記捕捉体に前記蛍光物質で標識されている前記被検出物質が捕捉されている状態のときに、前記第３の光および前記第４の光を検出し、
   前記処理部は、
   前記金属膜上に前記蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出し、
   前記捕捉体に前記蛍光物質で標識されている前記被検出物質が捕捉されている状態のときに、前記第３の光の検出値と前記第４の光の検出値との差分値を算出し、
   前記回転部は、前記光検出部が前記第３の光および前記第４の光を検出する前に、前記処理部により算出される前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値が０になるように、前記励起光の光軸と前記回折格子とを相対的に回転させるか、または前記励起光の偏光方向と前記回折格子とを相対的に回転させる、
   請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
3. 前記第１の光および前記第３の光は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光であり、
   前記第２の光および前記第４の光は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光である、
   請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
4. 前記回転部は、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
5. 前記回転部は、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
6. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
   回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップを準備する第１工程と、
   前記金属膜上に前記蛍光物質を含む液体が存在する状態のときに、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に直線偏光の励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光に含まれる、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の直線偏光の第２の光とをそれぞれ検出し、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値が０となるように、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させるか、または前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる第２工程と、
   前記金属膜に固定された前記捕捉体に、前記蛍光物質で標識された被検出物質を接触させるか、前記金属膜に固定された前記捕捉体に捕捉された被検出物質を前記蛍光物質で標識する第３工程と、
   前記第２工程および前記第３工程の後、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に直線偏光の励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光に含まれる、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の第３の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の直線偏光の第４の光とをそれぞれ検出する第４工程と、
   前記第３の光の検出値と前記第４の光の検出値の差分値を算出する第５工程と、
   を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
7. 前記第１の光および前記第３の光は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が０°の光であり、
   前記第２の光および前記第４の光は、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０°の光である、
   請求項６に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
8. 前記第２工程では、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の光軸の方向を変化させる、請求項６または請求項７に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
9. 前記第２工程では、平面視したときにおける前記回折格子に対する前記励起光の偏光方向を変化させる、請求項６または請求項７に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。

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