JPWO2015121987A1 - 微細藻類の培養状態の判断方法及び微細藻類の培養方法 - Google Patents

Abstract

透過型カラーセンサ１の発光部２から白色光を照射して、培養液４を透過してきた光を受光部３で受光し、カラー・フィルタで緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とを分解して検出し、緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判定する。これにより、光合成を行う微細藻類の培養状態を効率よくモニタリングして、その培養状態を判断することができる。

Description

本発明は、光合成を行う微細藻類の培養状態を管理するための判断方法に関する。また、本発明はこの判断方法を利用した光合成を行う微細藻類の培養方法に関する。

微細藻類は、数μｍ〜数十μｍの大きさの単細胞生物であり、このうち光合成を行うものは、太陽エネルギーを効率よく炭化水素に転換して蓄積し、また各種ミネラルや不飽和脂肪酸などを高濃度に含有することから、ディーゼル燃料などの代替燃料として用いたり、クロレラに代表されるようにそれ自身を健康食品としたり、体内に生産された脂質や油分を燃料原料としたり、不飽和脂肪酸などのサプリメント原料となる機能物質を回収したりするなどの種々の用途に用いる目的で人工培養されている。

このように微細藻類から燃料を生産するプロセスや、健康食品としたりサプリメント原料としたりするための生産プロセスにおいて、安定して微細藻類の生産を行うためには、微細藻を安定して培養することが重要である。ここで微細藻類の培養は、現状では培養コストを削減するためオープンポンドと呼ばれる屋外開放型の培養池で行われることが多い。このオープンポンドでは、バクテリアやカビなどの混入（コンタミネーション）により微細藻類が死滅してしまう虞があり課題となっている。

そこで、培養液のｐＨを酸性やアリカリ性に調整したり、殺菌剤を添加したりしてコンタミネーションの回避が試みられているが、決定的な解決策は見出されていない。一方、実用化時のオープンポンドは数千ｈａ規模となることが予想され、広大な培養池における培養状態を培養液の光線の透過などに基づき効率よくモニタリングする手法が望まれている。

このような培養液の状態を光線の透過などに基づきモニタリングする方法として、濁度計による培養液の濁度に基づき判断する手法が提案されている。また、特許文献１には、培養液の蛍光度を検出して、これに基づき微細藻類の増殖活性を測定する方法が開示されている。さらに、特許文献２、３には、可視光と近赤外線とを組み合わせて、微細藻類の培養状態を判断する方法が開示されている。

特開２００８−２８３９４６号公報 特許３２７６７６０号公報 特開平６−２６１７９３号公報

しかしながら、濁度計を用いて微細藻類の増殖活性を測定する方法や特許文献１に記載されているように蛍光度計を用いて微細藻類の増殖活性を測定する方法では、計測機器である濁度計や蛍光度計は非常に高価であり、測定範囲も限られるので現実的でないという問題点がある。また、特許文献２、３に記載の技術は、可視光の他に赤外線を測定する必要があるため、検出には高額な分光光度計が必要であり、このため、広範囲をモニタリングするのではコストが嵩むという問題点があった。すなわち、広大な培養池における光合成を行う微細藻類の培養状態を効率よく経済的にモニタリングする技術は従来なかった。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、光合成を行う微細藻類の培養状態を効率よくモニタリングして、その培養状態の判断するための方法を提供することを目的とする。また、本発明は、光合成を行う微細藻類の培養状態を判断して、最適化することで微細藻類を効率的に培養する方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、第一に本発明は、微細藻類を含む培養液の色合いから緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とを分解して検出し、緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判断することを特徴とする微細藻類の増殖活性の判定方法を提供する（発明１）。

かかる発明（発明１）によれば、微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光と赤色光とに分解して検出するが、これには色度をＲＧＢに分けて検出すればよく、安価なカラーセンサを適用することができる。このカラーセンサは可視光のみで衛星写真など広い範囲の色超の変化を感知することができる。これらにより、光合成を行う微細藻類の培養状態を効率よく経済的にモニタリングして、その培養状態を判断することが可能となる。

上記発明（発明１）においては、前記赤色光の吸光度を前記緑色光の吸光度で除した値で微細藻類の増殖活性を判断するのが好ましい（発明２）。

かかる発明（発明２）によれば、この赤色光の吸光度と緑色光の吸光度比は、微細藻類の成長差速度と相関性があり、培養状態が悪化すると緑色光の吸光度が小さくなるので、両者の比に基づいて微細藻類の培養状態を簡便に判断することができる。

また、第二に本発明は、微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とに分解して検出し、前記赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出し、該値が１．２を下回ったら、（ａ）前記微細藻類の栄養塩類を添加する、（ｂ）培養を停止し、微細藻類を収穫する、（ｃ）培養液を入れ替える、のいずれかを行うことを特徴とする微細藻類の培養方法を提供する（発明３）。

かかる発明（発明３）によれば、微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光と赤色光とに分解して検出し、赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出しながら監視する。このとき培養状態が悪化するに伴い緑色光の吸光度が大きくなるので、両吸光度の比が１．２を下回ったら、培養状態が悪化していると見なして、培養を促進する（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）の措置を採ることで、微細藻類を良好な状態で培養することができる。

さらに、第三に本発明は、微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とに分解して検出し、前記赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出し、該値が経時的に低下する傾向を示したら、（ａ）前記微細藻類の栄養塩類を添加する、（ｂ）培養を停止し、微細藻類を収穫する、（ｃ）培養液を入れ替える、のいずれかを行うことを特徴とする微細藻類の培養方法を提供する（発明４）。

かかる発明（発明４）によれば、微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光と赤色光とに分解して検出し、赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出しながら監視する。このとき培養状態が悪化するに伴い緑色光の吸光度が大きくなるので、経時的に低下する傾向を示したら、培養状態が悪化しつつあると見なして、培養を促進する（ａ）、（ｂ）あるいは（ｃ）の措置を採ることで、微細藻類を良好な状態で培養することができる。

本発明によれば、微細藻類を含む培養液の色合いから緑色光と赤色光とを分解して検出し、緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判定しているので、安価なカラーセンサを適用することができ、このため可視光のみで衛星写真など広い範囲の色超の変化を感知することができる。これらにより、光合成を行う微細藻類の培養状態を効率よく経済的にモニタリングして、その培養状態を判断することできる。

本発明の第一の実施形態に係る微細藻類の培養状態の判断方法を実施可能な装置を示す概略図である。 本発明の第二の実施形態に係る微細藻類の培養状態の判断方法を実施可能な装置を示す概略図である。 実施例１における微細藻類の培養状態の判断方法における培養期間と吸光度及び比増殖速度との関係を示すグラフである。 実施例２における微細藻類の培養状態の判断方法における培養期間と吸光度及び比増殖速度との関係を示すグラフである。 実施例３における微細藻類の培養状態の判断方法における培養期間と吸光度及び比増殖速度との関係を示すグラフである。 実施例４における微細藻類の培養状態の判断方法における培養期間と吸光度及び比増殖速度との関係を示すグラフである。 実施例１〜４における微細藻類の培養状態の判断方法における吸光度と比増殖速度との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。ただし、本実施形態はいずれも例示であり、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明は、微細藻類を含む培養液の色合い（色度）から緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とを分解して検出し、緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判定する。ここで、微細藻類として、炭化水素生産能に優れているものが好ましい。

また、この培養液の色度を検知する手段としては、安価で緑色光、赤色光及び青色光をそれぞれ分けて検出可能であることから、カラーセンサを用いるのが好ましい。このカラーセンサは、測定した色をカラー・フィルタによってＲＧＢ成分に分解し、それぞれの色成分の強度をフォトダイオード等により検知する仕組みを有するものである。このカラーセンサは、可視光のみで衛星写真など広い範囲の色調の変化を感知することができる。

具体的には、カラーセンサを用いて、以下のようにして微細藻類の培養状態を判断する。すなわち、まず、光の吸収が生じない透明な水（例えば純水）に白色光を照射して、透過した光をカラーセンサで検出する。この白色光は、カラーセンサのカラー・フィルタによってＲＧＢ成分に分解されて受光されるので、このときの赤色帯域光（緑色光）Ｒ１と緑色帯域光（緑色光）Ｇ１とのそれぞれの光強度を計測する。

次に微細藻類を含む培養液を同じカラーセンサを用い、同様に白色光を照射して、透過した光をカラーセンサで検出する。この透過光は、カラーセンサのカラー・フィルタによってＲＧＢ成分に分解されて受光されるので、このときの赤色帯域光（赤色光）Ｒ２と緑色帯域光（緑色光）Ｇ２とのそれぞれの光強度を計測する。

この赤色帯域光（赤色光）と緑色帯域光（緑色光）とは、例えば、特開２０１０−１５１６０５号公報に記載されている、図１に示すような透過型カラーセンサ１を用いて測定することができる。この透過型カラーセンサ１は、発光部２とカラー・フィルタ（図示せず）を備えた受光部３とを有し、発光部２から白色光を照射して、培養液４を透過してきた光を受光部３で受光し、図示しない制御機構で赤色帯域光（緑色光）と緑色帯域光（緑色光）とのそれぞれの光強度を算出する。

また、特開２０１０−１８１１５０号公報に記載されている、図２に示すような反射型カラーセンサ１１を用いることもできる。この反射型カラーセンサ１１は、発光部１２とカラー・フィルタ（図示せず）を備えた受光部１３と、反射板１４とを有し、発光部１２から白色光を照射して、反射板１４を経由して培養液１５を透過してきた光を受光部１３で受光し、図示しない制御機構で赤色帯域光（緑色光）と緑色帯域光（緑色光）とのそれぞれの光強度を算出する。

このようにして、赤色光の吸光度と緑色光の吸光度とを測定したら、下記式により赤色光の吸光度と緑色光の吸光度と両者の比（吸光度比）とを算出する。
赤色帯域光吸光度：Ａ_Ｒ＝−ｌｏｇ（Ｒ２／Ｒ１）
緑色帯域光吸光度：Ａ_Ｇ＝−ｌｏｇ（Ｇ２／Ｇ１）
吸光度比：Ｘ＝Ａ_Ｒ／Ａ_Ｇ

一方、培養液中の微細藻類の重量濃度を測定し、比増殖速度を測定する。この比増殖速度は、例えば、孔径１μｍのガラス繊維ろ紙で培養液の懸濁物質を測定し、重量濃度とする。そして、培養日数Ｔ１［日］のときの重量濃度Ｃ１［ｍｇ／Ｌ］及び培養液量Ｖ１［Ｌ］と、培養日数Ｔ２［日］のときの重量濃度Ｃ２［ｍｇ／Ｌ］及び培養液量Ｖ２［Ｌ］とから下記式により比増殖速度ν［１／日］を算出する。この比増殖速度νがマイナス領域となると培養状態が悪化しているといえる。
比増殖速度：ν＝（ｌｎ（ｍ２／ｍ１））／（Ｔ２−Ｔ１）
（ここで、ｍ１＝Ｃ１×Ｖ１、ｍ２＝Ｃ２×Ｖ２）

本発明者の研究によれば、この比増殖速度νと吸光度比Ｘとの間には高い相関が認められることがわかった。そして、この相関性を解析した結果、吸光度比Ｘ（赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値）が１．０を下回ると、比増殖速度νがマイナスの領域であり、培養状態が悪化しているので、培養状態を向上させるための措置を採る。具体的には、（ａ）前記微細藻類の栄養塩類を添加する、（ｂ）培養を停止し、藻類を収穫する、（ｃ）培養液を入れ替える（遠心分離などで微細藻類を濃縮した後、新しい培養液で希釈する）、のいずれかを行えばよい。上記（ａ）〜（ｃ）の措置は、予防的に吸光度比Ｘが１．２を下回ったら行うようにしてもよい。

さらに、この相関性を応用すれば、吸光度比Ｘ（赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値）が経時的に低下する傾向を示した時点で培養状態が悪化しつつあると判断して、培養状態を向上させるために同様の措置を採るようにしてもよい。

以上、本発明について実施形態に基づき説明してきたが、本発明は前記実施形態に限られず種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態では、緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とに基づいて、微細藻類の培養状態の判断を行っているが、青色光（４５０〜４９０ｎｍ）の吸光度のデータを補助的に用いてもよい。

以下の具体的実施例及び比較例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１〜４）

国立環境研究所微生物系統保存施設より分譲されたイカダモ（ＮＩＥＳ−９６株）を、ｐＨ６．５〜７．５に調整した表１及び表２に示す組成のＣ培地を用い、このＣ培地に空気に工業用ＣＯ_２を３体積％の濃度で添加したものを通気し、蛍光灯照明（明／暗＝１２ｈｒ／１２ｈｒ）で培養を行った。そして、イカダモの重量濃度が１ｇ／Ｌを超えたら、培養液の一部を抜き取り、培養液を補完する半回分培養を行った。

この微細藻類の培養状態を図１に示すカラーセンサを用いて、以下のようにして判断した。すなわち、ヤマト科学社製純水製造装置「ＷＧ２７０」で製造した純水に白色光を照射して、透過した光をカラーセンサで検出し、赤色帯域光（赤色光）Ｒ１と緑色帯域光（緑色光）Ｇ１とのそれぞれの光強度を計測した。

次に前述したイカダモの培養液を同じカラーセンサを用いて同様に白色光を照射して、透過した光をカラーセンサで検出し、赤色帯域光（赤色光）Ｒ２と緑色帯域光（緑色光）Ｇ２とのそれぞれの光強度を計測した。これらの赤色光の吸光度と緑色光の吸光度とから吸光度比を算出した。

一方、孔径１μｍのガラス繊維ろ紙で培養液中の懸濁物質を採取し、この懸濁物質の質量を測定し、培養液量から重量濃度を算出した。そして、培養日数Ｔ１［日］のときの重量濃度Ｃ１［ｍｇ／Ｌ］及び培養液量Ｖ１［Ｌ］と、培養日数Ｔ２［日］のときの重量濃度Ｃ２［ｍｇ／Ｌ］及び培養液量Ｖ２［Ｌ］とから比増殖速度ν［１／日］を算出した。

培養液は、表３に示す４条件（実施例１〜４）でそれぞれ半回分培養を行い、比増殖速度ν及び吸光度比Ｘの６０日間の経時変化を観測した。結果を図３〜図６に示す。さらに、この図３〜図６の結果に基づき、吸光度と比増殖速度との関係を整理したグラフを図７に示す。

図３〜図７より明らかなとおり、比増殖速度νと吸光度比Ｘとの間には相関関係があり、吸光度比Ｘが培養状態を判断する指標となりうることが確認された。そして、吸光度比Ｘが１．０を下回ると比増殖速度がマイナスとなること、あるいは吸光度比Ｘが低下傾向を示すと比増殖速度が低下することから、これらの状態が確認されたら肥料成分の添加や、培養したイカダモ（微細藻類）を回収（収穫）するなどすればよく、微細藻類の培養を安定化させるためのツールとなりうることが確認された。

上述したような本発明の微細藻類の増殖活性の判定方法によれば、微細藻類を含む培養液の色合いから緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とを分解して検出し、緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判定しているので、カラーセンサなどの安価な検出装置で、微細藻類の培養状態を把握することができる。また、赤色光と緑色光の吸光度比の数値の経時変化を観察することで、適切な肥料成分の追加や微細藻類の回収のタイミングを判定できる。これらにより、微細藻類の安定培養を実現することができる。

１…透過型カラーセンサ
２…発光部
３…受光部
４…培養液
１１…反射型カラーセンサ
１２…発光部
１３…受光部
１４…反射板
１５…培養液

Claims (4)

1. 微細藻類を含む培養液の色合いから緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とを分解して検出し、
   緑色光の波長の強度と赤色光の波長の強度とから微細藻類の増殖活性を判断することを特徴とする微細藻類の増殖活性の判定方法。
2. 前記赤色光の吸光度を前記緑色光の吸光度で除した値で微細藻類の増殖活性を判断することを特徴とする請求項１に記載の微細藻類の増殖活性の判定方法。
3. 微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とに分解して検出し、前記赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出し、該値が１．２を下回ったら、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを行うことを特徴とする微細藻類の培養方法。
   （ａ）前記微細藻類の栄養塩類を添加する
   （ｂ）培養を停止し、微細藻類を収穫する
   （ｃ）培養液を入れ替える
4. 微細藻類を含む培養液の色合いを緑色光（５００〜５７０ｎｍ）と赤色光（６２０〜７４０ｎｍ）とに分解して検出し、前記赤色光の吸光度を緑色光の吸光度で除した値を算出し、該値が経時的に低下する傾向を示したら、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを行うことを特徴とする微細藻類の培養方法。
   （ａ）前記微細藻類の栄養塩類を添加する
   （ｂ）培養を停止し、微細藻類を収穫する
   （ｃ）培養液を入れ替える

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