JPWO2015098928A1 - Il−1及びtnf活性阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖尿病を治療及び合併症の発症を予防するため並びに糖尿病の自然史を変える治療法、進行を防止する有効な手段として、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした炎症性サイトカイン活性阻害剤の提供を目的とする。また、炎症性サイトカイン活性阻害作用が有効な自己炎症性疾患の治療・予防剤の提供を目的とする。【解決手段】ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有していることを特徴とする。【選択図】 図1
Description
本発明は糖尿病、インスリン抵抗性を特徴とする疾患状態および病態、機能的膵β細胞量の低下、高血糖、高脂血症、肥満、代謝異常症候群、動脈硬化症、自己炎症性疾患(痛風など)ならびに慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症の治療あるいは予防のため医薬に関する。
糖尿病はインスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、様々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群であり、病態の進行に伴い、眼、腎臓、神経、及び血管を含む種々の器官に重篤な衰弱性合併症を引き起こす。
遺伝的素因に、高脂肪食・運動不足・肥満といったインスリン抵抗性増大をきたす生活環境因子が加わって発症するものと考えられている。
インターロイキン1(IL−1)はマクロファージ、単球、線維芽細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞など多くの細胞から産生、分泌される炎症性サイトカインである(非特許文献1)。
産生細胞から放出されたIL−1は種々の細胞に表現されているIL−1受容体を介して局所的および全身的炎症作用を惹起することが知られている。
また、IL−1はプロスタグランジンE2(PGE2),腫瘍壊死因子(TNF,IL−6,IL−8,コルチコトロピンなどの他の炎症メディエータの誘導を通して媒介される一連の生物作用を引き起こす。
IL−1ファミリーのサイトカインは11のメンバーで構成されているが、IL−1α,IL−1β,IL−1Ra(IL−1受容体アンタゴニスト)、及びIL−18の作用がヒト、実験動物の炎症性疾患状態で研究されている。
IL−1α,IL−1β及びIL−1RaはIL−1受容体に同程度の親和性で結合するが、異なる遺伝子によって発現され、異なる一次アミノ酸配列を有し、生理学的活性も互いに異なる。
近年、糖尿病の発症、悪化やインスリン分泌障害、インスリン抵抗性にIL−1βが関与していることを示す研究が多数報告されている(例えば、非特許文献2)。
メタボリック症候群は、高インスリン血症、耐糖能異常、肥満、内臓脂肪蓄積、高血圧、ならびに高脂血を特徴とする脂質代謝異常などを集合したものである。
インスリン抵抗性は、これらの疾患状態に密接に関連しており、将来、2型糖尿病、心臓発作、脳卒中、動脈硬化症を発症する強力なリスク因子である。
IL−1を含む炎症性サイトカインがインスリン抵抗性に関与すると考えられる脂肪組織内の炎症を媒介することが示されている(非特許文献6)。
TNFα、IL−6は脂肪細胞をインスリン抵抗性にすることは知られていたが、IL−1もIRS−1(Insulin Receptor Substrate 1)のセリン残基をリン酸化することによりインスリンシグナルの阻害、インスリン抵抗性を誘発することが報告された(非特許文献7)。
自己炎症性疾患は発熱、皮疹など炎症に由来する症状を主徴とするもののうち、自己免疫疾患でみられるような自己抗体の関与が否定される症候群の総称である。
近年、その多くがインフラマソームの機能異常によって発症することが解ってきた。
インフラマソームによるカスパーゼー1の活性化とそれに引き続く活性型IL−1β産生の亢進が、全身性炎症を惹起すると考えられている。
現在、抗IL−1薬が診療に用いられており、いずれも著しい効果をあげている。
多くの自己炎症性疾患は遺伝性疾患であるが、IL−1とIL−1Raのバランスシステムの崩壊が自己炎症性疾患発症の原因と考え、一部の変形関節症、痛風、2型糖尿病を自己炎症性疾患に分類することを提唱している(非特許文献8)。
炎症性サイトカインの自己免疫疾患に対する関与については、関節リウマチのモデルマウス及び関節リウマチ患者を中心に解析が進められ、IL−1阻害療法としてIL−1受容体アンタゴニスト、TNF阻害療法として抗TNF抗体、IL−6阻害療法としてIL−6受容体阻害抗体が関節リウマチの治療薬として承認され診療に用いられており、いずれも従来の標準的薬物療法を上回る効果をあげている。
遺伝的素因に、高脂肪食・運動不足・肥満といったインスリン抵抗性増大をきたす生活環境因子が加わって発症するものと考えられている。
インターロイキン1(IL−1)はマクロファージ、単球、線維芽細胞、血管内皮細胞、滑膜細胞など多くの細胞から産生、分泌される炎症性サイトカインである(非特許文献1)。
産生細胞から放出されたIL−1は種々の細胞に表現されているIL−1受容体を介して局所的および全身的炎症作用を惹起することが知られている。
また、IL−1はプロスタグランジンE2(PGE2),腫瘍壊死因子(TNF,IL−6,IL−8,コルチコトロピンなどの他の炎症メディエータの誘導を通して媒介される一連の生物作用を引き起こす。
IL−1ファミリーのサイトカインは11のメンバーで構成されているが、IL−1α,IL−1β,IL−1Ra(IL−1受容体アンタゴニスト)、及びIL−18の作用がヒト、実験動物の炎症性疾患状態で研究されている。
IL−1α,IL−1β及びIL−1RaはIL−1受容体に同程度の親和性で結合するが、異なる遺伝子によって発現され、異なる一次アミノ酸配列を有し、生理学的活性も互いに異なる。
近年、糖尿病の発症、悪化やインスリン分泌障害、インスリン抵抗性にIL−1βが関与していることを示す研究が多数報告されている(例えば、非特許文献2)。
メタボリック症候群は、高インスリン血症、耐糖能異常、肥満、内臓脂肪蓄積、高血圧、ならびに高脂血を特徴とする脂質代謝異常などを集合したものである。
インスリン抵抗性は、これらの疾患状態に密接に関連しており、将来、2型糖尿病、心臓発作、脳卒中、動脈硬化症を発症する強力なリスク因子である。
IL−1を含む炎症性サイトカインがインスリン抵抗性に関与すると考えられる脂肪組織内の炎症を媒介することが示されている(非特許文献6)。
TNFα、IL−6は脂肪細胞をインスリン抵抗性にすることは知られていたが、IL−1もIRS−1(Insulin Receptor Substrate 1)のセリン残基をリン酸化することによりインスリンシグナルの阻害、インスリン抵抗性を誘発することが報告された(非特許文献7)。
自己炎症性疾患は発熱、皮疹など炎症に由来する症状を主徴とするもののうち、自己免疫疾患でみられるような自己抗体の関与が否定される症候群の総称である。
近年、その多くがインフラマソームの機能異常によって発症することが解ってきた。
インフラマソームによるカスパーゼー1の活性化とそれに引き続く活性型IL−1β産生の亢進が、全身性炎症を惹起すると考えられている。
現在、抗IL−1薬が診療に用いられており、いずれも著しい効果をあげている。
多くの自己炎症性疾患は遺伝性疾患であるが、IL−1とIL−1Raのバランスシステムの崩壊が自己炎症性疾患発症の原因と考え、一部の変形関節症、痛風、2型糖尿病を自己炎症性疾患に分類することを提唱している(非特許文献8)。
炎症性サイトカインの自己免疫疾患に対する関与については、関節リウマチのモデルマウス及び関節リウマチ患者を中心に解析が進められ、IL−1阻害療法としてIL−1受容体アンタゴニスト、TNF阻害療法として抗TNF抗体、IL−6阻害療法としてIL−6受容体阻害抗体が関節リウマチの治療薬として承認され診療に用いられており、いずれも従来の標準的薬物療法を上回る効果をあげている。
特許文献1には、ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来のアルカロイドを有効成分とするNF−κβ活性阻害剤を開示する。
しかし、本発明が後述するように、膵β細胞機能の改善、機能的膵β細胞量の温存、インスリン抵抗性の改善により、糖尿病の治療、糖尿病発症の予防、肥満の改善と予防及び炎症性サイトカインが関与する自己炎症性疾患の治療、予防に有用であることを見出したものである点で、特許文献1に開示する発明と目的及び作用が相違する。
しかし、本発明が後述するように、膵β細胞機能の改善、機能的膵β細胞量の温存、インスリン抵抗性の改善により、糖尿病の治療、糖尿病発症の予防、肥満の改善と予防及び炎症性サイトカインが関与する自己炎症性疾患の治療、予防に有用であることを見出したものである点で、特許文献1に開示する発明と目的及び作用が相違する。
本発明は、糖尿病を治療及び合併症の発症を予防するため並びに糖尿病の自然史を変える治療法、進行を防止する有効な手段として、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした炎症性サイトカイン活性阻害剤の提供を目的とする。
また、炎症性サイトカイン活性阻害作用が有効な自己炎症性疾患の治療・予防剤の提供を目的とする。
また、炎症性サイトカイン活性阻害作用が有効な自己炎症性疾患の治療・予防剤の提供を目的とする。
本発明に係る炎症性サイトカインであるインターロイキン−1(IL−1)及び腫瘍壊死因子(TNF)の活性阻害剤は、ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有していることを特徴とする。
ここで、アルカロイドはビスベンジルイソキロリン(Bisbenzylisoquinoline)化合物であり、具体的には、セファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上であってよい。
また、これらの化合物は、化学合成されたものを含む。
ここで、アルカロイドはビスベンジルイソキロリン(Bisbenzylisoquinoline)化合物であり、具体的には、セファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上であってよい。
また、これらの化合物は、化学合成されたものを含む。
本発明に用いられるツヅラフジ科ステファニア属に属する植物としては、タマサキツヅラフジ(Stephania cepharantha),コウトウツヅラフジ(Stephania merrilli),イボツヅラフジ(Stephania crispa),ステファニア(Stephania venosa)等が例として挙げられる。
本発明の有効成分としては、タマサキツヅラフジ由来のアルカロイドを用いるのが好ましい。
本発明の有効成分としてはタマサキツヅラフジからのアルカロイド含有画分、また常法により分離精製して得られる結晶、公知の方法により製造される当該アルカロイド誘導体などを用いることができる。
例えばタマサキツヅラフジの根茎、茎、葉、種子などを使用し、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルなどの溶媒で抽出し、抽出液を濃縮し、濃縮液を希塩酸、希硫酸、クエン酸水溶液、シュウ酸水溶液などの酸性水溶液に溶解し、溶解液をアルカリ性にして生じた沈殿物を採取することによりアルカロイド画分を分離できる。
得られた画分を各種クロマトグラフィー、再結晶などの公知の方法によりアルカロイドを精製して用いてもよい。
本発明に用いられるアルカロイドの誘導体としては、アシル誘導体、アルキル誘導体、カルバモイル誘導体などが挙げられる。
本発明の有効成分としては、タマサキツヅラフジ由来のアルカロイドを用いるのが好ましい。
本発明の有効成分としてはタマサキツヅラフジからのアルカロイド含有画分、また常法により分離精製して得られる結晶、公知の方法により製造される当該アルカロイド誘導体などを用いることができる。
例えばタマサキツヅラフジの根茎、茎、葉、種子などを使用し、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルなどの溶媒で抽出し、抽出液を濃縮し、濃縮液を希塩酸、希硫酸、クエン酸水溶液、シュウ酸水溶液などの酸性水溶液に溶解し、溶解液をアルカリ性にして生じた沈殿物を採取することによりアルカロイド画分を分離できる。
得られた画分を各種クロマトグラフィー、再結晶などの公知の方法によりアルカロイドを精製して用いてもよい。
本発明に用いられるアルカロイドの誘導体としては、アシル誘導体、アルキル誘導体、カルバモイル誘導体などが挙げられる。
本発明の薬剤を投与する場合、当該有効成分をそのまま用いてもよく、また、錠剤,散剤、顆粒剤、カプセル剤などに製剤化して経口的に投与してもよい。
さらに、坐剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、外用剤などに製剤化して非経口的に投与してもよいが、経口剤として投与することが望ましい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤,散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造する。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
本発明の薬剤の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、当該アルカロイド、その誘導体、その塩として0.1〜5mg/kgを1日1回〜数回に分けて投与する。
本発明の薬剤は単独あるいは異なる作用様式で働く少なくとも1つまたは複数の活性薬剤と併用して用いることもできる。
活性薬剤としては糖尿病治療薬剤の1)スルホニル尿素薬 2)ビグアナイド薬 3)αグルコシダーゼ阻害薬 4)インスリン抵抗性改善薬 5)グルカゴン様ペプチド(GLP−1)類似薬、6)DPP−4阻害薬 7)インスリン 8)SGLT阻害剤が挙げられる。
更に別の態様において、併用する活性薬剤は高脂血症治療剤、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド剤であっても良い。
本発明の薬剤の使用方法には、1型糖尿病、2型糖尿病、肥満、高血糖、インスリン分泌障害、インスリン抵抗性並びにインスリン抵抗性を特徴とする疾患状態及び病態を処置または病態の進行予防、合併症の発生を予防するために哺乳動物に使用することができる。
さらに、IL−1、TNFα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤として使用できる。
本発明に係る薬剤は、上記に示した肥満等の改善又は予防にも使用できることから、メタボリックシンドロームの改善・予防剤にもなる。
本発明に係る薬剤を含有した飲食品にすることもでき、その場合飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。
本発明の有効成分を飲食品に使用するには、そのまま又は種々の栄養成分とともに加工肉、清涼飲料等の飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、本発明の有効成分を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。
上記の飲食品における本発明の有効成分の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、0.01〜1重量%配合するのが望ましい。
さらに、坐剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、外用剤などに製剤化して非経口的に投与してもよいが、経口剤として投与することが望ましい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤,散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造する。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
本発明の薬剤の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、当該アルカロイド、その誘導体、その塩として0.1〜5mg/kgを1日1回〜数回に分けて投与する。
本発明の薬剤は単独あるいは異なる作用様式で働く少なくとも1つまたは複数の活性薬剤と併用して用いることもできる。
活性薬剤としては糖尿病治療薬剤の1)スルホニル尿素薬 2)ビグアナイド薬 3)αグルコシダーゼ阻害薬 4)インスリン抵抗性改善薬 5)グルカゴン様ペプチド(GLP−1)類似薬、6)DPP−4阻害薬 7)インスリン 8)SGLT阻害剤が挙げられる。
更に別の態様において、併用する活性薬剤は高脂血症治療剤、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド剤であっても良い。
本発明の薬剤の使用方法には、1型糖尿病、2型糖尿病、肥満、高血糖、インスリン分泌障害、インスリン抵抗性並びにインスリン抵抗性を特徴とする疾患状態及び病態を処置または病態の進行予防、合併症の発生を予防するために哺乳動物に使用することができる。
さらに、IL−1、TNFα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤として使用できる。
本発明に係る薬剤は、上記に示した肥満等の改善又は予防にも使用できることから、メタボリックシンドロームの改善・予防剤にもなる。
本発明に係る薬剤を含有した飲食品にすることもでき、その場合飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。
本発明の有効成分を飲食品に使用するには、そのまま又は種々の栄養成分とともに加工肉、清涼飲料等の飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、本発明の有効成分を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。
上記の飲食品における本発明の有効成分の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、0.01〜1重量%配合するのが望ましい。
IL−1受容体拮抗薬(アナキンラ)は高価なタンパク質製剤で連日皮下注射することが必要であり、長期に渡る糖尿病治療薬としては適さない。
患者は自己注射による治療システム遵守に関する問題を引き起こし、有効性の低下、安全性、簡便性などの課題がある。
これに対して本発明に係る医薬は、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした膵β細胞機能温存する糖尿病治療剤・予防剤となり、IL−1、TNFα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤となる。
本発明の有効成分は、膵β細胞保護又はβ細胞機能維持、糖質代謝改善、脂質代謝改善、高脂血症改善などの効果を有する。更に、天然物に由来するため安全性に優れており、メタボリックシンドロームの予防・改善剤として飲食品の形態で日常的に使用することができる。
患者は自己注射による治療システム遵守に関する問題を引き起こし、有効性の低下、安全性、簡便性などの課題がある。
これに対して本発明に係る医薬は、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などを満たした膵β細胞機能温存する糖尿病治療剤・予防剤となり、IL−1、TNFα活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤となる。
本発明の有効成分は、膵β細胞保護又はβ細胞機能維持、糖質代謝改善、脂質代謝改善、高脂血症改善などの効果を有する。更に、天然物に由来するため安全性に優れており、メタボリックシンドロームの予防・改善剤として飲食品の形態で日常的に使用することができる。
次に、本発明に係る有効成分が細胞死に対するIL−1,TNFαの活性阻害作用を有し、肥満予防効果及び肥満改善効果を有することを試験したので説明する。
また、IL−1α及びIL−1β刺激によるプロスタングランジンE2の産生に対する抑制作用も確認した。
また、IL−1α及びIL−1β刺激によるプロスタングランジンE2の産生に対する抑制作用も確認した。
まず初めに確認試験に用いた試薬及び試験条件を説明する。
<試薬及び医薬品>
ヒト及びマウスのインターロイキン1α(IL−1α)、インターロイキン1β(IL−1β)、ヒトの腫瘍壊死因子(TNF−α)、インターロイキン受容体拮抗因子(IL−1Ra)は、R&D Systems Inc.(Minneapolis,MN)及び大塚製薬(株)(Tokushima,Japan)で製造されたリコンビナント製品を使用した。
抗ヒトIL−1β中和抗体は大塚製薬(株)(Tokushima,Japan)より入手した。
タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイド原末(以下MBMXという。)、セファランチン、イソテトランドリン、ベルバミン、シクレアニン、及びその誘導体であるE6−ベルバミンはWAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)より入手した。
血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定キットは、WAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)、PGE2測定ELISAキット(R&D Systems Inc.)は平野純薬工業より入手した。
<株化細胞>
IL−1阻害化合物の評価は、IL−1感受性株化細胞A375S2を使用した細胞培養法により行った(Nakai S,Hirai Y,et al. Biochem.Biophy.Res.Commun.154,1189,1988)。
MIN6マウス膵β細胞は大阪大学大学院医学研究科 宮崎博士より入手した。
<MBMX配合高脂肪食給餌試験 −20週間投与試験−>
(a)動物
マウス(C57BL/6J系、5−6週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食(D12492、60% Kcal% Fat、Research Diets)に0.05%MBMX(化研生薬)または0.5%メトフォルミン(和光純薬)を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存した。
給餌は、2日毎に行ない、摂餌量を計量した。
また、対照群では、普通食(D12450B、10% Kcal% Fat、Research Diets)を給餌した。
マウスに被検物配合食を20週間給餌した後、解剖に付した。マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後、血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌19週目のマウスを4時間絶食し,尾静脈より採血した後インスリン(0.8IU/kg、牛膵臓由来、シグマ)溶液を腹腔内投与し,30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した.
<MBMX配合高脂肪食給餌試験 −8週間投与試験−>
(a)動物
マウス(C57BL/6J系、5−6週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食(D12492、60% Kcal% Fat、Research Diets)に0.05%MBMX(タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイドであるセファランチン原末、化研生薬)または0.02%ピオグリタゾン(フナコシ)を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存し、給餌は2日毎に行なった。
また、普通食(D12450B、10% Kcal% Fat、Research Diets)についても同様に給餌した。
マウスに12週間高脂肪食を給餌した後、被検物配合高脂肪食に交換し、さらに8週間給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌7週目のマウスを4時間絶食し,尾静脈より採血した後インスリン(0.8IU/kg、牛膵臓由来、シグマ)溶液を腹腔内投与し,30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した.
<MBMX配合食給餌試験 −糖尿病発症予防試験−>
(a)動物 自然発症糖尿病マウス(db/db系、5週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)db/dbマウスへの被検物配合食の給餌
被検物配合食は、普通食(ラボMRストック粉末、日本農産)に0.05%MBMXまたは0.02%ピオグリタゾン(フナコシ)を均一に混合した後給餌し、2日毎に摂餌量を計量した。
マウスに10週間配合食を給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)耐糖能試験
被検物配合食給餌9週目のマウスを一晩絶食し、尾静脈より採血した後グルコース溶液(2g/kg)を経口投与し、30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した。
<プロスタグランジンE2産生試験>
A375S2細胞をIL−1β(1ng/ml)或いはIL−1α(2ng/ml)存在下で18時間培養し、産生された培養液中のPGE2量はELISAキット(R&D Systems Inc.)を用いて測定した。
<試薬及び医薬品>
ヒト及びマウスのインターロイキン1α(IL−1α)、インターロイキン1β(IL−1β)、ヒトの腫瘍壊死因子(TNF−α)、インターロイキン受容体拮抗因子(IL−1Ra)は、R&D Systems Inc.(Minneapolis,MN)及び大塚製薬(株)(Tokushima,Japan)で製造されたリコンビナント製品を使用した。
抗ヒトIL−1β中和抗体は大塚製薬(株)(Tokushima,Japan)より入手した。
タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイド原末(以下MBMXという。)、セファランチン、イソテトランドリン、ベルバミン、シクレアニン、及びその誘導体であるE6−ベルバミンはWAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)より入手した。
血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定キットは、WAKO Chemicals(Osaka,Japan)及びFunakoshi Co,Ltd(Tokyo,Japan)、PGE2測定ELISAキット(R&D Systems Inc.)は平野純薬工業より入手した。
<株化細胞>
IL−1阻害化合物の評価は、IL−1感受性株化細胞A375S2を使用した細胞培養法により行った(Nakai S,Hirai Y,et al. Biochem.Biophy.Res.Commun.154,1189,1988)。
MIN6マウス膵β細胞は大阪大学大学院医学研究科 宮崎博士より入手した。
<MBMX配合高脂肪食給餌試験 −20週間投与試験−>
(a)動物
マウス(C57BL/6J系、5−6週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食(D12492、60% Kcal% Fat、Research Diets)に0.05%MBMX(化研生薬)または0.5%メトフォルミン(和光純薬)を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存した。
給餌は、2日毎に行ない、摂餌量を計量した。
また、対照群では、普通食(D12450B、10% Kcal% Fat、Research Diets)を給餌した。
マウスに被検物配合食を20週間給餌した後、解剖に付した。マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後、血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌19週目のマウスを4時間絶食し,尾静脈より採血した後インスリン(0.8IU/kg、牛膵臓由来、シグマ)溶液を腹腔内投与し,30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した.
<MBMX配合高脂肪食給餌試験 −8週間投与試験−>
(a)動物
マウス(C57BL/6J系、5−6週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)マウスへの高脂肪食の給餌
被検物配合高脂肪食は、高脂肪食(D12492、60% Kcal% Fat、Research Diets)に0.05%MBMX(タマサキツヅラフジ植物抽出アルカロイドであるセファランチン原末、化研生薬)または0.02%ピオグリタゾン(フナコシ)を均一に混合した後ペレット状に成型して作成し、冷蔵庫で保存し、給餌は2日毎に行なった。
また、普通食(D12450B、10% Kcal% Fat、Research Diets)についても同様に給餌した。
マウスに12週間高脂肪食を給餌した後、被検物配合高脂肪食に交換し、さらに8週間給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)インスリン応答能試験
被検物配合高脂肪食給餌7週目のマウスを4時間絶食し,尾静脈より採血した後インスリン(0.8IU/kg、牛膵臓由来、シグマ)溶液を腹腔内投与し,30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した.
<MBMX配合食給餌試験 −糖尿病発症予防試験−>
(a)動物 自然発症糖尿病マウス(db/db系、5週令、雄性)を三協ラボサービスより購入し、1週間の予備飼育の後に試験に供した。
(b)db/dbマウスへの被検物配合食の給餌
被検物配合食は、普通食(ラボMRストック粉末、日本農産)に0.05%MBMXまたは0.02%ピオグリタゾン(フナコシ)を均一に混合した後給餌し、2日毎に摂餌量を計量した。
マウスに10週間配合食を給餌した後、解剖に付した。
マウスはエーテル麻酔下で開腹し、腹大静脈から採血した後血中のグルコース、トリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸、GOT及びGPTなどの測定は、市販キット(和光純薬)を用いて測定した。
(c)耐糖能試験
被検物配合食給餌9週目のマウスを一晩絶食し、尾静脈より採血した後グルコース溶液(2g/kg)を経口投与し、30,60及び120分後に各々採血して血糖値を測定した。
<プロスタグランジンE2産生試験>
A375S2細胞をIL−1β(1ng/ml)或いはIL−1α(2ng/ml)存在下で18時間培養し、産生された培養液中のPGE2量はELISAキット(R&D Systems Inc.)を用いて測定した。
まず初めに本試験に係る評価系の確認をした。
図1に示すグラフはヒト株化細胞の培養日数と縦軸,生細胞量の増加に対するIL−1βの作用を示す。
具体的には、次のように試験を行った。
組織培養プレートの各ウェルに細胞培養液又はIL−1β(2.5ng/ml)を入れる。
2日から5日間培養後、0.05%ニュトラルレッド液を各ウェルに加え、細胞培養器内で2時間培養し、生細胞に色素を取り込ませる。
細胞内に取り込まれなかった色素を洗浄する。
次に、色素溶出液を各ウェルに加え、室温でプレートシェーカーで撹拌し、生細胞に取り込まれた色素を溶出する。マイクロプレート用自動吸光度計でOD540nmを測定する。測定した吸光度より生細胞量を算出する。
この結果、IL−1βは、ヒト株化細胞に細胞死を起こし、生細胞量が増加しないことが確認できた。
次に、ヒトIL−1β(hIL−1β),マウスIL−1β(mIL−1β)のヒト株化細胞の細胞死に対するヒトIL−1レセプタ−アンタゴニスト(hIL−1Ra)とヒトIL−1β中和抗体(hIL−1βAb)の作用を確認した結果を図2のグラフに示す。
ヒトIL−1β(hIL−1β)はマウスIL−1β(mIL−1β)によるヒト株化細胞の細胞死評価系にヒトIL−1Ra(hIL−1Ra)を加えると、細胞死が阻害される。
ヒトIL−1β中和抗体(hIL−1β Ab)はヒトIL−1βによる細胞死は阻害するが、マウスIL−1βによる細胞死は阻害しない。
この評価系を用いれば、IL−1Ra類似活性を持つ化合物がスクリーニングできることが確認できた。
図1に示すグラフはヒト株化細胞の培養日数と縦軸,生細胞量の増加に対するIL−1βの作用を示す。
具体的には、次のように試験を行った。
組織培養プレートの各ウェルに細胞培養液又はIL−1β(2.5ng/ml)を入れる。
2日から5日間培養後、0.05%ニュトラルレッド液を各ウェルに加え、細胞培養器内で2時間培養し、生細胞に色素を取り込ませる。
細胞内に取り込まれなかった色素を洗浄する。
次に、色素溶出液を各ウェルに加え、室温でプレートシェーカーで撹拌し、生細胞に取り込まれた色素を溶出する。マイクロプレート用自動吸光度計でOD540nmを測定する。測定した吸光度より生細胞量を算出する。
この結果、IL−1βは、ヒト株化細胞に細胞死を起こし、生細胞量が増加しないことが確認できた。
次に、ヒトIL−1β(hIL−1β),マウスIL−1β(mIL−1β)のヒト株化細胞の細胞死に対するヒトIL−1レセプタ−アンタゴニスト(hIL−1Ra)とヒトIL−1β中和抗体(hIL−1βAb)の作用を確認した結果を図2のグラフに示す。
ヒトIL−1β(hIL−1β)はマウスIL−1β(mIL−1β)によるヒト株化細胞の細胞死評価系にヒトIL−1Ra(hIL−1Ra)を加えると、細胞死が阻害される。
ヒトIL−1β中和抗体(hIL−1β Ab)はヒトIL−1βによる細胞死は阻害するが、マウスIL−1βによる細胞死は阻害しない。
この評価系を用いれば、IL−1Ra類似活性を持つ化合物がスクリーニングできることが確認できた。
植物由来の各種アルカロイド化合物のヒトIL−1βによる細胞死に対する阻害作用を試験評価した結果を図3のグラフに示す。
グラフ中、MB5C:セファランチン,MB1D:E6−ベルバミン,MB2D:ベルバミン,MB7R:イソテトランドリン,MB1R:シクレアニン、IL−1Ra:IL-1 receptor antagonistをそれぞれ示す。
ビスベンジルイソキノリン化学構造を有するアルカロイド化合物が用量依存的にIL-1βによる細胞死を阻害することが確認できた。
グラフ中、MB5C:セファランチン,MB1D:E6−ベルバミン,MB2D:ベルバミン,MB7R:イソテトランドリン,MB1R:シクレアニン、IL−1Ra:IL-1 receptor antagonistをそれぞれ示す。
ビスベンジルイソキノリン化学構造を有するアルカロイド化合物が用量依存的にIL-1βによる細胞死を阻害することが確認できた。
ヒトTNFα及びヒトIL−1αに対するセファランチン(MB5C)の阻害作用を試験した結果を図4のグラフに示す。
この結果、セファランチンがヒトTNFα,ヒトIL−1αによる細胞死を阻害することが分かる。
また、グラフは省略するが、図3に示した他のアルカロイドも同様の阻害作用が認められた。
この結果、セファランチンがヒトTNFα,ヒトIL−1αによる細胞死を阻害することが分かる。
また、グラフは省略するが、図3に示した他のアルカロイドも同様の阻害作用が認められた。
ヒトIL−1βによる細胞死に対するタマサキツヅラフジから抽出したアルカロイド製剤(MBMX)の阻害作用試験した結果を図5のグラフに示す。
MBMXは、化研生薬株式会社が販売するセファランチン原末を用いた。
MBMXの主なアルカロイド成分は、セファランチン,イソテトランドリン,ベルバミン,シクレアニンである。
MBMXが、ヒトIL−1βによる細胞死に対して量依存的に阻用作用を示した。
MBMXは、化研生薬株式会社が販売するセファランチン原末を用いた。
MBMXの主なアルカロイド成分は、セファランチン,イソテトランドリン,ベルバミン,シクレアニンである。
MBMXが、ヒトIL−1βによる細胞死に対して量依存的に阻用作用を示した。
IL−1による膵β細胞(MIN6)死に対するMBMXの抑制作用の試験結果を図6のグラフに示す。
(方法) 組織培養プレートの各ウエルに1x105個の膵β細胞(MIN6)、マウスIL−1β(5ng/ml)及びMBMXを加え培養する。48時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図6のグラフに示すように、IL−1βにより膵β細胞死が起こるが、MBMXはIL−1による膵β細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。
(方法) 組織培養プレートの各ウエルに1x105個の膵β細胞(MIN6)、マウスIL−1β(5ng/ml)及びMBMXを加え培養する。48時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図6のグラフに示すように、IL−1βにより膵β細胞死が起こるが、MBMXはIL−1による膵β細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。
MBMXの主なアルカロイド成分、セファランチン、イソテトランドリン、ベルバミン、シクレアニンの、IL−1による膵β細胞(MIN6)死に対する抑制作用の結果を図7のグラフに示す。
(方法)組織培養プレートの各ウエルに1x105個のMIN6細胞、マウスIL−1β(5ng/ml)及び各アルカロイド化合物を加え培養する。72時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図7のグラフに示すようにIL−1βによりMIN6細胞死が起こるが、MBMXの主なアルカロイド各成分は濃度依存的にMIN6細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。
(方法)組織培養プレートの各ウエルに1x105個のMIN6細胞、マウスIL−1β(5ng/ml)及び各アルカロイド化合物を加え培養する。72時間培養後、生存細胞量はニュートラルレッド色素の細胞内への取込みにより算出した。
その結果、図7のグラフに示すようにIL−1βによりMIN6細胞死が起こるが、MBMXの主なアルカロイド各成分は濃度依存的にMIN6細胞死を抑制し、膵β細胞保護作用を有することが確認できた。
高脂肪食給餌肥満モデルに対するアルカロイド製剤(MBMX)の効果を試験した。
体重変化を図8のグラフに示し、インスリン応答性試験結果を図9のグラフに示す。
また、血液生化学値を図10の表に示す。
C57BL/6Jマウス(♂ 6週令、1群N=6)に普通食(ND,Research diet D12450B 10% Kcal fat)或いは高脂肪食(HFD, Research diet D12492 60% Kcal fat)を20週間給餌した。
試験薬物は0.05% MBMX(500μg/g)、陽性対照薬として糖尿病薬メトホルミン(Met)0.5%(5mg/g)を高脂肪食に配合し20週間給餌した。
体重及び4週ごとに血糖値を測定した。
試験開始19週目にインスリン応答性試験、20週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。MBMXは高脂肪食給餌による肥満を抑制する効果が得られた。
19週間、高脂肪食を給餌されたマウスは、普通食のマウスに比べてインスリン応答能が低下していた。
0.05% MBMX配合した高脂肪食を給餌されたマウスではインスリン応答能は、普通食給餌マウスと同等であり、インスリン応答能の低下を防止する効果が得られた。
結果は、普通食給餌マウスに比べ、高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加、脂肪肝に起因する肝機能の異常が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加抑制、肝機能悪化の防止の効果が得られた。
体重変化を図8のグラフに示し、インスリン応答性試験結果を図9のグラフに示す。
また、血液生化学値を図10の表に示す。
C57BL/6Jマウス(♂ 6週令、1群N=6)に普通食(ND,Research diet D12450B 10% Kcal fat)或いは高脂肪食(HFD, Research diet D12492 60% Kcal fat)を20週間給餌した。
試験薬物は0.05% MBMX(500μg/g)、陽性対照薬として糖尿病薬メトホルミン(Met)0.5%(5mg/g)を高脂肪食に配合し20週間給餌した。
体重及び4週ごとに血糖値を測定した。
試験開始19週目にインスリン応答性試験、20週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。MBMXは高脂肪食給餌による肥満を抑制する効果が得られた。
19週間、高脂肪食を給餌されたマウスは、普通食のマウスに比べてインスリン応答能が低下していた。
0.05% MBMX配合した高脂肪食を給餌されたマウスではインスリン応答能は、普通食給餌マウスと同等であり、インスリン応答能の低下を防止する効果が得られた。
結果は、普通食給餌マウスに比べ、高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加、脂肪肝に起因する肝機能の異常が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスではトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロールの増加抑制、肝機能悪化の防止の効果が得られた。
次に高脂肪食給餌肥満モデルにおける治療的投与試験を行った。
図11はマウスの体重変化のグラフを示し、図12はインスリン応答性試験結果を示す。
また、図13及び図14に血液生化学検査結果を示す。
C57BL/6Jマウス(♂ 6週令、1群N=6)に普通食或いは高脂肪食を12週間給餌した。
その後、高脂肪食給餌マウスは、高脂肪食あるいは試験薬物配合高脂肪食を8週間給餌した。
試験薬物として、0.05% MBMX(500μg/g)、陽性対照薬物として、0.02%ピオグリタゾン(Pio,糖尿病薬)を給餌した。
体重及び4週ごとに血糖値を測定した。
試験開始19週目にインスリン応答性試験、20週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。
MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは、肥満を改善する効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスではインスリン応答能の低下(インスリン抵抗性)が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食を7週間給餌したマウスでは、インスリン応答能の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値の上昇、レプチン値の上昇が見られた。
8週間、0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値、レプチン値の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、血清脂質レベルの上昇が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは血清脂質プロファイルの改善効果が得られた。
図11はマウスの体重変化のグラフを示し、図12はインスリン応答性試験結果を示す。
また、図13及び図14に血液生化学検査結果を示す。
C57BL/6Jマウス(♂ 6週令、1群N=6)に普通食或いは高脂肪食を12週間給餌した。
その後、高脂肪食給餌マウスは、高脂肪食あるいは試験薬物配合高脂肪食を8週間給餌した。
試験薬物として、0.05% MBMX(500μg/g)、陽性対照薬物として、0.02%ピオグリタゾン(Pio,糖尿病薬)を給餌した。
体重及び4週ごとに血糖値を測定した。
試験開始19週目にインスリン応答性試験、20週目に血液生化学検査、組織重量の測定を行った。
MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは、肥満を改善する効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスではインスリン応答能の低下(インスリン抵抗性)が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食を7週間給餌したマウスでは、インスリン応答能の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値の上昇、レプチン値の上昇が見られた。
8週間、0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは、インスリン値、レプチン値の改善効果が得られた。
高脂肪食給餌マウスでは、血清脂質レベルの上昇が見られた。
0.05% MBMX配合高脂肪食給餌マウスでは血清脂質プロファイルの改善効果が得られた。
IL−1β及びIL−1α刺激によるプロスタグランジンE2(PGE2)産生に対するアルカロイド製剤(MBMX)の抑制作用を評価した結果を図15及び図16のグラフに示す。
図15のグラフはIL−1β刺激、図16のグラフはIL−1α刺激に対してである。
A375S2細胞株をIL−1β(1ng/ml),IL−1α(2ng/ml)で24時間刺激すると約50倍量のPGE2が産生される。
IL−1Ra(100ng/ml)を共存させるとPGE2産生は10%以下に抑制された。MBMXも濃度依存的にPGE2産生を抑制した。
図15のグラフはIL−1β刺激、図16のグラフはIL−1α刺激に対してである。
A375S2細胞株をIL−1β(1ng/ml),IL−1α(2ng/ml)で24時間刺激すると約50倍量のPGE2が産生される。
IL−1Ra(100ng/ml)を共存させるとPGE2産生は10%以下に抑制された。MBMXも濃度依存的にPGE2産生を抑制した。
2型肥満糖尿病マウスに対するアルカロイド製剤(MBMX)の効果を試験した結果(その1)を図17〜図20に示す。
図17は体重変化、図18は血糖値変化、図19は耐糖能試験結果、図20は摂餌変化を示す。
db/dbマウス(♂ 6週令 1群N=6)にMBMXは0.05%(500ug/g)、ピオグリタゾンは0.02%(200ug/g)を給餌した。
MBMX給餌群は2週目頃より体重増加が抑制された。
ピオグリタゾン群ではPPARγアゴニスト作用の多面性の故、体重増加(脂肪蓄積、水分貯留など)がみられた。
MBMX群では、給餌開始3週目より血糖値が低下し始め、8週目には200mg/dl以下にまで低下した。
また、ピオグリタゾン群では、給餌開始後血糖値の上昇は見られず、150mg/dl前後の値を維持した。
試験開始8週目の空腹時血糖値は、MBMX群、ピオグリタゾン群で対照群より有意に低値であった。
図17は体重変化、図18は血糖値変化、図19は耐糖能試験結果、図20は摂餌変化を示す。
db/dbマウス(♂ 6週令 1群N=6)にMBMXは0.05%(500ug/g)、ピオグリタゾンは0.02%(200ug/g)を給餌した。
MBMX給餌群は2週目頃より体重増加が抑制された。
ピオグリタゾン群ではPPARγアゴニスト作用の多面性の故、体重増加(脂肪蓄積、水分貯留など)がみられた。
MBMX群では、給餌開始3週目より血糖値が低下し始め、8週目には200mg/dl以下にまで低下した。
また、ピオグリタゾン群では、給餌開始後血糖値の上昇は見られず、150mg/dl前後の値を維持した。
試験開始8週目の空腹時血糖値は、MBMX群、ピオグリタゾン群で対照群より有意に低値であった。
2型肥満糖尿病マウスに対するアルカロイド製剤(MBMX)の効果を試験した結果(その2)を図21〜図25に示す。
図21は体重変化、図22は血糖値変化、図23は摂餌量、図24は耐糖能試験結果、図25はインスリン応答能試験を示す。
(方法)食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす糖尿病病態モデル動物である。
8週令の雄性db/dbマウスに0.01%あるいは0.05%MBMX配合食を10週間給餌した。
試験開始10週目に耐糖能試験、試験開始11週目にインスリン応答能試験、試験開始12週目に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
耐糖能試験、インスリン応答能試験は絶食後、常法にて行った
図21は体重変化、図22は血糖値変化、図23は摂餌量、図24は耐糖能試験結果、図25はインスリン応答能試験を示す。
(方法)食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす糖尿病病態モデル動物である。
8週令の雄性db/dbマウスに0.01%あるいは0.05%MBMX配合食を10週間給餌した。
試験開始10週目に耐糖能試験、試験開始11週目にインスリン応答能試験、試験開始12週目に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
耐糖能試験、インスリン応答能試験は絶食後、常法にて行った
0.05%MBMX給餌群では、対照群に比べで体重増加は抑制され、随時血糖値は有意に低値であった。
0.05%MBMX配合食群では、給餌開始2週目より血糖値がコントロール群に比べ有意に低く、9週目には200mg/ml以下に低下した。
また、0.05%MBMX給餌群では、機序は不明であるが、肥満動物の食欲を抑える作用も見られた。0.05%MBMX給餌10週目に行った耐糖能試験では、空腹時血糖値はコントロール群に比べて有意に低値であり、膵β細胞機能の有意な改善効果が認められた。
0.05%MBMX給餌11週目に行ったインスリン応答能試験では、コントロール群に比べてインスリン感受性の有意な改善が認められた。
0.05%MBMX配合食群では、給餌開始2週目より血糖値がコントロール群に比べ有意に低く、9週目には200mg/ml以下に低下した。
また、0.05%MBMX給餌群では、機序は不明であるが、肥満動物の食欲を抑える作用も見られた。0.05%MBMX給餌10週目に行った耐糖能試験では、空腹時血糖値はコントロール群に比べて有意に低値であり、膵β細胞機能の有意な改善効果が認められた。
0.05%MBMX給餌11週目に行ったインスリン応答能試験では、コントロール群に比べてインスリン感受性の有意な改善が認められた。
db/db肥満2型糖尿病モデルマウスを用いたMBMXの膵β細胞保護作用の結果を図26に示す。
(方法)食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす病態モデル動物である。
MBMXの膵β細胞保護作用を明らかにするため、db/dbマウスの膵臓中のインスリン含量を試験開始12週目に測定した。
すなわち、雄性db/dbマウスに、0.01%あるいは0.05%MBMX配合食を摂食させた。12週間後に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
エッペンドルフチューブの中に入れた膵臓に酸アルコール混液(75%アルコール、23.5%蒸留水、1.5%濃塩酸)1ml加えてペレットミキサーで破砕した。4℃で一晩静置しインスリンを抽出後、インスリン量を、インスリンELISA測定キットを用いて測定した。
その結果、図26に示すように食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスでは、膵臓中のインスリン含量の著しい減少が認められた。
0.05%MBMX配合食を摂食したdb/dbマウスでは、膵臓中インスリン含量は保持されていることが示された。
これはMBMXが膵β細胞の疲弊、細胞死を保護したためと考えられる。
(方法)食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスは、過食、肥満、インスリン抵抗性により、膵β細胞の萎縮、壊死をきたす病態モデル動物である。
MBMXの膵β細胞保護作用を明らかにするため、db/dbマウスの膵臓中のインスリン含量を試験開始12週目に測定した。
すなわち、雄性db/dbマウスに、0.01%あるいは0.05%MBMX配合食を摂食させた。12週間後に解剖し膵臓中のインスリン量の測定を行った。
エッペンドルフチューブの中に入れた膵臓に酸アルコール混液(75%アルコール、23.5%蒸留水、1.5%濃塩酸)1ml加えてペレットミキサーで破砕した。4℃で一晩静置しインスリンを抽出後、インスリン量を、インスリンELISA測定キットを用いて測定した。
その結果、図26に示すように食欲抑制ホルモンであるレプチン受容体に異常があるdb/dbマウスでは、膵臓中のインスリン含量の著しい減少が認められた。
0.05%MBMX配合食を摂食したdb/dbマウスでは、膵臓中インスリン含量は保持されていることが示された。
これはMBMXが膵β細胞の疲弊、細胞死を保護したためと考えられる。
本発明は、炎症性サイトカインIL−1、TNFα活性阻害作用が有効な炎症性疾患(糖尿病、肥満関連疾患、認知症、自己炎症性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血など)の治療剤、予防剤として広く利用できる。
Claims (10)
- ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体(化学合成したものを含む)ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有する、炎症性サイトカインであるインターロイキン1(IL−1)及び腫瘍壊死因子(TNF)の活性阻害剤。
- 前記アルカロイドはセファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上である請求項1記載のインターロイキン1(IL−1)及び腫瘍壊死因子(TNF)の活性阻害剤。
- ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有する炎症性サイトカインであるインターロイキン1(IL−1)及び腫瘍壊死因子(TNF)の活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療又は予防剤。
- 前記アルカロイドはセファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上である請求項3記載の炎症性疾患の治療又は予防剤。
- ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有する糖尿病の治療又は予防剤。
- 前記アルカロイドはセファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上である請求項5記載の糖尿病の治療又は予防剤。
- 膵β細胞保護作用又はβ細胞機能維持作用によるものである請求項5又は6記載の糖尿病の治療又は予防剤。
- ツヅラフジ科ステファニア属の植物を由来とするアルカロイド及びその誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩のうち、少なくとも1種以上を有効成分して含有するメタボリックシンドロームの改善・予防剤。
- 前記アルカロイドはセファランチン,ベルバミン,イソテトランドリン,テトランドリン,シクレアニン,E6−ベルバミンのうちいずれか1種以上である請求項8記載のメタボリックシンドロームの改善・予防剤。
- 請求項1〜9に記載の活性阻害剤、治療又は予防剤及び改善・予防剤のうち、いずれかを含有する飲食品。
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JAPANESE JOURNAL OF INFLAMMATION, vol. 14, no. 5, JPN6015010606, 1994, pages 425 - 429 * |
THE JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY, vol. 56, no. 5, JPN6015010594, 2004, pages 643 - 648 * |
中薬大辞典 第四巻, JPN6018035275, 1985, pages p.2264-2265 [4553ビャクヤクシ] * |
日本集中治療医学会雑誌, vol. Vol.17 Supplement, JPN6015010588, 2010, pages p.287 D0-30-4 * |
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