JPWO2014080997A1 - ミッドカインに対するアプタマー及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、式（Ｉ）で表される潜在的２次構造を形成できる、ミッドカインと結合するアプタマー（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、Ｘ１およびＸ６、ならびにＸ２およびＸ５は、それぞれワトソン−クリック塩基対を形成し、そしてＸ３およびＸ４は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴから選択されるヌクレオチドである。）を提供する。

Description

本発明は、ミッドカインに対するアプタマー及びその用途に関する。

ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ：以下、必要に応じて「ＭＫ」と省略する場合がある）は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである。

ＭＫはその立体構造がＮＭＲにより決定され、報告されている。ＭＫは、構造上の特徴より２つのドメインから主として構成されている。具体的には、ＭＫは、１〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ末端側のフラグメント（以下、「Ｎ−フラグメント」という）、６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ末端側のフラグメント（以下、「Ｃ−フラグメント」という）及びそれらを結合するループ領域（５３〜６１番目のアミノ酸）よりなる。ＭＫ分子中で、Ｎ−フラグメント及びＣ−フラグメントのそれぞれは、主として３本の逆βシート構造からなる立体構造（以下、「ドメイン」といい、１５〜５２番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のドメインを「Ｎ−ドメイン」、６２〜１０４番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のドメインを「Ｃ−ドメイン」という）、及び、自由に動き特定の構造をとらない構造（以下、「テイル」といい、１〜１４番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のテイルを「Ｎ−テイル」、１０５〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のテイルを「Ｃ−テイル」という）をもつ。それぞれのドメインの外側には、塩基性アミノ酸に富むテイルが結合している。

ＭＫの受容体としては、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰζ）、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）、インテグリン及びシンデカンなどが知られている。ＭＫは、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を多く含んだ、正の帯電が強いタンパク質である。Ｃドメインにヘパリン結合部位を持ち、ヘパリンやコンドロイチン硫酸Ｅなど負に帯電した分子と強く結合することで知られている。

ＭＫは発生過程において重要なタンパク質であり、中期胚において強く発現している。一方、成体での発現は限定的で、血管内皮及び特定の粘膜上皮にＭＫの発現が見られる。組織が損傷を受けると、当該部位でのＭＫの発現は増大し、又は新たに誘導される。そして、産生されたＭＫは、細胞の生存、移動を促進し、さらに細胞増殖、形態変化、ケモカイン発現等の様々な生物活性を発揮する。

ＭＫは癌とも関連しており、ヒト癌の多くでＭＫの発現が増大することが知られている。このような現象は、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍等の多様な癌で確認されている。各種癌で症例ごとに比較すると、約８０％のケースでＭＫの発現増大が起きている。ＷＴ１癌抑制遺伝子の欠失により発生するウィルムス腫瘍やＮＦ−１癌抑制遺伝子の欠失に起因する神経系の腫瘍においては、全ての症例でＭＫの発現増大が見られたことが報告されている。

発現増大したＭＫは、癌細胞の生存と移動とを促進し、血管新生を促し、癌の進展を助けると考えられている。ニューロブラストーマ、膀胱癌、グリオブラストーマ等では、ＭＫの発現が高い癌患者はＭＫ発現の低い癌患者よりも予後が悪いことが知られている。また、ヒト胃癌由来の細胞株では、抗癌剤抵抗性とＭＫの高発現との間に強い関連がある。さらに、ヒト肝臓癌由来の細胞では、ＭＫがその細胞増殖に深く関与しており、当該細胞のアポトーシスを阻害することも知られている。

このようなＭＫと癌との関連性から、ＭＫの腫瘍マーカーへの利用と同時に、ＭＫを標的にした癌の治療薬の開発が注目されている。癌の治療薬にはＭＫの発現増大を抑制するものが企図され、ＭＫに対する抗体、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴＤＮＡ等が検討されている（非特許文献1〜3）。

ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）を用いて作製することができる。ＳＥＬＥＸとは、１０^１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。ＭＫに対するアプタマーについて既にいくつかの報告がある（特許文献１〜３、非特許文献４）。

アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外因子を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも結合力と特異性が高い場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こらない。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度のサイズであるので、目的の部位まで薬物を送達させることはより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、各種修飾を容易に入れることができ、大量生産によるコストダウンが可能である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。

ＷＯ２００７／０５５３７８ ＷＯ２００８／０５９８７７ ＷＯ２００９／０６３９９８

Maehara, H. et al., (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 358: p.757-762 Takei, Y. et al., (2006) Cancer. 107: p.864-873 Dai, L. C. et al., (2007) Acta Pharmacol. Sin. 28: p.453-458 Wang, J. et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 105: p.3915-3920

本発明は、ミッドカインに対するアプタマー及びその利用方法等を提供することを目的とする。特に、癌治療薬等の医薬品用途に適したアプタマーを提供し、さらには短鎖長でもミッドカイン活性（癌細胞結合活性）阻害作用を有し、しかもミッドカインに対する特異性の高いアプタマーを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ミッドカインの癌細胞結合活性の阻害効果が顕著に高い新規アプタマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下に関する。
［１］式（Ｉ）で表される潜在的２次構造を形成できる、ミッドカインと結合するアプタマー。

（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
Ｘ１およびＸ６、ならびにＸ２およびＸ５は、それぞれワトソン−クリック塩基対を形成し、そして
Ｘ３およびＸ４は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴから選択されるヌクレオチドである。）
［２］Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６が、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つのヌクレオチドである、［１］に記載のアプタマー。
［３］Ｘ３が、ＡまたはＵであり、Ｘ４が、Ｃである、［１］または［２］に記載のアプタマー。
［４］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を一部または全部として含む、１５から１００ヌクレオチド長の核酸：
（ａ）配列番号１〜１２および２０のいずれかとして定義される核酸；
（ｂ）上記（ａ）の核酸において、１ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された核酸であり、かつミッドカインと結合する核酸；
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の核酸において、１又は複数個のヌクレオチドのリボースの２’位の基が他の基で置換されている、核酸。
［５］ヌクレオチド長が４５以下である、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［６］少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［５］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［７］ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールで修飾されている、［５］または［６］に記載のアプタマーまたは核酸。
［８］ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールが、アプタマーまたは核酸の５’末端または３’末端に結合している、［７］に記載のアプタマーまたは核酸。
［９］各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、［５］〜［８］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［１０］各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、［５］〜［８］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［１１］ミッドカインの癌細胞への結合を阻害する、［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［１２］ミッドカイン依存性の細胞増殖を阻害する、［１］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸。
［１３］［１］〜［１２］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸を含む、医薬組成物。
［１４］［１］〜［１２］のいずれか一に記載のアプタマーまたは核酸を含む、癌の治療薬。

本発明のアプタマーまたは核酸は、上記の構成をとることにより優れたＭＫ活性阻害作用、特にＭＫの癌細胞への結合活性の阻害において優れた作用を有するので、癌の治療薬として有用であり得る。

図１は、配列番号１で表されるオリゴヌクレオチドの２次構造予測を示す。 図２は、配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドの２次構造予測を示す。 図３は、ＡＰ−ＭＫとＴＮＢ１細胞の結合阻害実験の結果を示す。１）ＡＰのみ、２）ＡＰ−ＭＫのみ、３）ＡＰ−ＭＫと配列番号７−１で表されるアプタマー、４）ＡＰ−ＭＫと配列番号１９で表されるネガティブコントロール。 図４は、配列番号８で表されるオリゴヌクレオチドの２次構造予測を示す。 図５は、ＴＮＢ１細胞を用いたソフトアガーアッセイの結果を示す。１）アプタマー無添加群、２）配列番号２４で表されるネガティブコントロールを添加した群、３）配列番号７−１で表されるアプタマーを添加した群。 図６は、ＴＮＢ１細胞を用いた担癌マウスモデル実験の結果を示す。四角（■）：溶媒投与群、三角（△）：配列番号１９で表されるネガティブコントロール投与群、丸（○）：配列番号７−１で表されるアプタマー投与群。

本発明は、式（Ｉ）で表される潜在的２次構造：

（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
Ｘ１およびＸ６、ならびにＸ２およびＸ５は、それぞれワトソン−クリック塩基対を形成し、そして
Ｘ３およびＸ４は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴから選択されるヌクレオチドである。）
を形成できる、ミッドカインと結合するアプタマー（以下、「本発明のアプタマー」と称する場合がある）を提供する。

アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＭＫに対して結合活性を有するアプタマーである。好ましい態様によれば、本発明のアプタマーはＭＫに結合し、ＭＫとＭＫ受容体との結合を阻害することによってＭＫの活性を阻害し得る。

本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物などの核酸であり得る。従って、以下において、本発明のアプタマーは「本発明の核酸」と読み替えて表される場合もあり得る。
一本鎖核酸は種々の２次構造をとることができる。「潜在的２次構造」とは、ある一本鎖核酸が、その１次構造からみて熱力学的にとり得る２次構造を意味するが、特に本発明のアプタマーにおける潜在的２次構造は、後述の実施例１に記載のＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測することができる２次構造である。従って、上記式（Ｉ）で表される２次構造をとり得る１次構造を有する限り、現に当該２次構造をとっていない核酸であっても、本発明のアプタマーに包含される。
よって好ましくは、本発明のアプタマーは、その１次構造からみて、コンセンサス配列である（Ｘ１）（Ｘ２）ＵＧ（Ｘ３）ＧＵＧＧＵＵＵＡＵ（Ｘ４）ＣＧ（Ｘ５）（Ｘ６）（配列番号２０）が熱力学的に安定に上記式（Ｉ）で表される２次構造をとり得る核酸分子である。

式（Ｉ）で表される潜在的２次構造は、いわゆる「ステム−ループ構造」であり、特にX1-X2-U-G-X3-G-U-GとU-A-U-X4-C-G-X5-X6との組合せにより形成され得るステム構造と、そのヌクレオチド配列の末端塩基であるGとUとの間に両ヌクレオチド配列をつなぐループ構造を有することを特徴とする。
「ステム構造」とは、核酸分子内の相補性を有する部分ヌクレオチド配列同士がワトソン−クリック塩基対（G-CもしくはA-U/T）を形成した構造をいうが、本明細書においては、上記両ヌクレオチド配列は完全相補的である必要はなく、ミスマッチおよび／またはG-U/Tのwobblingを許容するものである。すなわち、ステム構造を形成するヌクレオチド配列の一部のヌクレオチド同士がワトソン−クリック塩基対を形成していれば、必ずしもそれ以外のヌクレオチド同士の全てがワトソン−クリック塩基対を形成している必要はない。

式（Ｉ）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合を示す。Ｘｉ（ｉは１、２、５及び６から選ばれる整数）が「２つのヌクレオチド」である場合、当該２つのヌクレオチドは同一であっても異なっていてもよい。また、Ｘｉが「２つのヌクレオチド」もしくは「結合」である場合、好ましくはX1-X2およびX5-X6の各部分配列中に１個以下の頻度で含まれる。なお、上記「結合」とは、単結合を意味し、式（Ｉ）中の任意のＸｉが「結合」という場合は、当該ヌクレオチドに隣接するヌクレオチド同士がホスホジエステル結合によって連結していることを示す。

特に好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選ばれる１つのヌクレオチドである。

また、Ｘ１およびＸ６、ならびにＸ２およびＸ５は、それぞれワトソン−クリック塩基対（G-CもしくはA-U/T、またはその逆）を形成する。Ｘ１またはＸ２が結合の場合、Ｘ６またはＸ５も結合である。Ｘ２およびＸ５からなる塩基対は、Ｇ−ＣもしくはＣ−Ｇの関係にあることが好ましい。ステム構造は、ループ構造と対向する側の末端の領域において、少なくとも２塩基の塩基対を形成していることが好ましい。このステム構造が上記式（Ｉ）の構造を有するために重要であり、本発明のアプタマーにおいては、上記式（Ｉ）部分に限定されることなく、当該部分の両端に結合するヌクレオチド配列同士がワトソン−クリック塩基対を形成する（但し、ミスマッチおよび／またはG-U/Tのwobblingを許容する）ことにより、さらに長いステム長を有することが好ましい。

式（Ｉ）中、Ｘ３およびＸ４は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴから選択されるヌクレオチドを示す。Ｘ３およびＸ４は、ワトソン−クリック塩基対を形成していてもよく、或いは形成していなくてもよい。Ｘ３は、好ましくはＡまたはＵである、Ｘ４は、好ましくはＣである。

あるいは本発明のアプタマーは、上記式（Ｉ）からさらにステム構造を１塩基対延ばした、式（Ｉ’）で表される潜在的２次構造：

（式中、Ｘ１〜Ｘ６は上記のとおりであり、Ｘ０およびＸ７はワトソン−クリック塩基対を形成するヌクレオチドである）を形成できる、ミッドカインと結合するアプタマーであり得る。この場合、ワトソン−クリック塩基対を形成する限りＸ０およびＸ７は特に限定されないが、Ｇ−ＣもしくはＣ−Ｇの関係にあることが好ましい。

本発明はまた、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を一部または全部として含む、１５から１００ヌクレオチド長の核酸：
（ａ）配列番号１〜１２および２０のいずれかとして定義される核酸；
（ｂ）上記（ａ）の核酸において、１ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された核酸であり、かつミッドカインと結合する核酸；
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の核酸において、１又は複数個のヌクレオチドのリボースの２’位の基が他の基で置換されている、核酸
を提供する。

これらの核酸は、上記式（Ｉ）で表される潜在的２次構造を形成することができる。
なお、配列上のいずれのウラシルもチミンへ置き換えることができるが、置き換えられるウラシルは、本発明のアプタマーが有する活性を保つべく、好ましくは、前記潜在的２次構造におけるループ構造以外の部分におけるウラシルであり得る。

本願明細書において「配列番号」で特定される配列とは、各アプタマー又は核酸のヌクレオチド配列を意味し、例えば「配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸」とは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む天然の核酸、修飾核酸またはその両方で構成される核酸を意味する。一方、「配列番号１として定義される核酸」とは、後述の実施例に記載のとおりの特定のリボース２’位の修飾を有する核酸を意味する（他の糖部またはジヌクレオチド結合の修飾は任意である）。配列番号２０として定義される核酸は、配列番号２０のヌクレオチド配列からなり、配列番号１〜１２として定義される核酸の一部として含まれるすべての核酸を意味する。尚、本明細書に添付の配列表には、各アプタマーの配列番号の塩基配列を記載している。

上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、例えば１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個もしくは２個であり得る。
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチドの位置は特に限定されないが、本発明のアプタマーが有する活性を保つべく、好ましくは前記潜在的２次構造におけるループ構造以外の部分におけるヌクレオチドであり得る。あるいは、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチドの位置は、配列番号１〜１２および２０に共通するコンセンサス配列：ＵＧＸＧＵＧＧＵＵＵＡＵＣＣＧ（Ｘ＝Ａ ｏｒ Ｕ；配列番号２１）以外の部分であり得る。

上記（ｃ）において、１又は複数個のヌクレオチドのリボースの２’位において置換される他の基は特に限定されないが、本発明のアプタマーが有する活性を保つあるいは向上すべく、好ましくはヒドロキシル基、水素原子、フッ素原子及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる基であり得る。リボースの２’位の基が他の基で置換されるヌクレオチド数は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり得る。但し、配列番号１〜１２および２０に共通するコンセンサス配列：ＵＧＸＧＵＧＧＵＵＵＡＵＣＣＧ（Ｘ＝Ａ ｏｒ Ｕ；配列番号２１）中の修飾ヌクレオチド数は、１〜５個であることが望ましい。

本発明のアプタマーまたは核酸のヌクレオチド長は特に制限されず、通常、１５〜約１００ヌクレオチドであるが、好ましくは１５〜約８０ヌクレオチドであり、より好ましくは１８〜６０ヌクレオチドであり、さらに好ましくは２０〜４５ヌクレオチドである。上記式（Ｉ）で表される潜在的２次構造を形成できる範囲で総ヌクレオチド数を少なくすることにより、アプタマーの化学合成及び大量生産がより容易となり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、このようなアプタマーは化学修飾が容易であり、生体内安定性を向上させやすく、毒性が低いと考えられる。

本発明のアプタマーはまた、上記（ａ）の核酸の複数の連結物、上記（ｂ）の核酸の複数の連結物、上記（ｃ）の核酸の複数の連結物並びに上記（ａ）の核酸、上記（ｂ）の核酸及び上記（ｃ）核酸から選ばれる２種以上の核酸の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。
これらの連結物も、ＭＫに結合し且つ／又はＭＫの活性（ＭＫ受容体との結合活性等）を阻害し得る。
ここで連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ_２）_ｎ−リンカー、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ_３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。

本発明のアプタマー及び核酸においてはまた、アプタマーを安定化し、その活性を向上させる目的で、１又は数個、例えば、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個のヌクレオチドが架橋化核酸Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）で置換されていてもよい。ここで、「架橋化核酸」とは、核酸の自由度を分子内架橋で拘束することにより、相補配列に対する結合親和性を高め、かつヌクレアーゼ耐性を獲得する構造を持つものをいい、例えば、２’，４’−ＢＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＮＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明のアプタマー及び核酸は、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てが、任意の置換基で修飾もしくは置換されていてもよい。例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合等に置換され得る。

本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置き換えられているヌクレオチドであり得る。

このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ_２基）で置き換えられているヌクレオチドが挙げられる。以下にリボースの２’位において、ヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−Ｍｅ基で置き換えられた場合をそれぞれ示す。

本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。

本発明のアプタマーはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、フッ素原子で置換されているヌクレオチドであるか、あるいは、同一または異なって、フッ素原子が、上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。特に本発明のアプタマーの製造方法として、後述するＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いた製造方法を適用した場合、全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の水酸基がフルオロ化したアプタマーが得られる。その他の上記原子または基で置換されている本発明のアプタマーは、後述の方法で製造することができる。

本発明のアプタマーはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が置換されていないヌクレオチドであるか、あるいは、同一または異なって、ヒドロキシル基が、上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。これらの本発明のアプタマーは、後述の方法で製造することができる。

尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置き換えは、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置き換えとして読み替えられる。
本発明のアプタマーにおいて、ウラシルをチミンに置換することによって、ＭＫに対する結合性、ＭＫとＭＫ受容体との結合阻害活性、ＭＫの癌細胞結合活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることが可能である。

本発明のアプタマーが結合するＭＫは、塩基性アミノ酸及びシステインに富む公知のタンパク質であり、傷害を受けた組織の保存及び修復に重要な役割を果たす分泌タンパク質である。ヒトＭＫのアミノ酸配列はGenBank Accession Number BC011704で表されるものであり、分泌タンパク質は２３番目のリジンから１４３番目のアスパラギン酸の１２１アミノ酸で構成されている。一般に２３番目のリジンを１番目のアミノ酸として表示する。ヒトＭＫは、１〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ−フラグメント、６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ−フラグメント及びそれらを結合するループ領域よりなるが、Ｎ−フラグメントとＣ−フラグメントとの境界はＭＫのループ部分（５３−６１）であればいずれでもよく、厳密に定義できるものではない。本発明におけるＭＫは、上記タンパク質において変異の入ったものや、その機能ドメイン、ペプチド断片であってもよい。また、モノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。さらにヒト以外の哺乳動物、例えば、霊長類（例、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）由来のＭＫも含まれる。

本発明のアプタマーは、ＭＫの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＭＫのＮ−フラグメント、Ｃ−フラグメント又はその両方に結合することにより、ＭＫの活性を阻害し得る。

本明細書中、「ＭＫ活性の阻害作用」とは、ＭＫが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＭＫがＭＫ受容体に結合することを阻害する作用、ＭＫがＭＫ受容体に結合することによって生じる、ＭＫ受容体の下流のシグナル伝達（ＰＩ３キナーゼ経路、ＭＡＰキナーゼ経路）の阻害、ＭＫの生物活性（細胞の増殖、生存、形態変化、移動、ケモカイン発現、血管新生等）の阻害、さらに、ＭＫの癌細胞への結合活性の阻害、炎症性細胞の遊走の抑制、子宮内膜間質細胞の増殖抑制、血管内膜肥厚活性の阻害などが挙げられる。本発明のアプタマーが有する好ましい「ＭＫ活性の阻害作用」は、ＭＫの癌細胞への結合活性の阻害などである。

本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液（例えば溶液Ａ：実施例１参照）中で、ＭＫへ結合する。本発明のアプタマーは、例えば以下の試験により検出可能な程度の強度で、ＭＫへ結合する。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。センサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は１０００ＲＵとする。生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例１参照）によりＭＫ溶液（０．５μＭ）を調製する。このＭＫ溶液を７０μＬ注入し、ＭＫのアプタマーへの結合を検出する。得られた波形データから結合シグナルが観察された場合、該アプタマーはＭＫへの結合能を有すると判定する。

本明細書中、「ＭＫ受容体」とは、ＭＫが結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＭＫ受容体としては、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰζ）、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）、インテグリン及びシンデカンなどが知られている。本発明でいうＭＫ受容体とは、天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここで「その変異体」とは、「ＭＫ受容体」のアミノ酸が数個置換されたものやその一部分のアミノ酸配列であって、ＭＫに対して結合活性を有するタンパク質またはペプチドを意味する。本発明においてＭＫ受容体は、癌細胞の表面にあるタンパク質であることが好ましい。

本発明のアプタマーは、ＭＫの癌細胞への結合活性を阻害することができるアプタマーである。ＭＫの癌細胞への結合活性を本発明のアプタマーが阻害するか否かは、例えば、実施例５に記載の試験により評価することができる。

本発明のアプタマーは、ＭＫに対する結合性、ＭＫとＭＫ受容体との結合阻害活性、ＭＫの癌細胞結合活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなど、特にリボース２’位の水酸基を他の原子に置き換えたものが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ_２）が挙げられる。他にも、４’位の酸素を硫黄に置き換えた４’−ＳＲＮＡ、２’位と４’位とをメチレンを介して架橋したＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、３’位の水酸基をアミノ基に置き換えた３’−Ｎ−ホスホロアミデート核酸などを例として挙げることができる。本発明のアプタマーは、その製造方法からピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の酸素原子が一定の修飾をもって製造される場合があり、後述するＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いた製造方法を適用した場合、好ましくは全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の水酸基がフルオロ化したアプタマーが製造される。したがって、得られたアプタマーに対しその後このような糖残基の改変を加えることで、塩基配列は同じであるが活性が高められた様々なバリエーションのアプタマーを製造することが可能である。以上のことから、本発明のアプタマーは、好ましくは少なくとも一つのヌクレオチドの糖残基が修飾されたアプタマーであり得る。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl.Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145参照）。具体的には、全てのピリミジンヌクレオチドのリボース２’位の水酸基がフルオロ基に置換されたアプタマーをベースに、リボース２’位における水酸基を、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換したアプタマーを製造することができる。

本発明のアプタマーは、後述の実施例でも示されるように少なくとも一つのヌクレオチドの糖残基が修飾されたものであり得るが、なかでも、本発明のアプタマーにおいて、式（Ｉ）

（式中、Ｘ１〜Ｘ６は上記と同義である。）、
もしくは式（Ｉ’）

（式中、Ｘ０〜Ｘ７は上記と同義である。）
および上記各式に含まれる本発明のアプタマーのコンセンサス配列

における、５’側から２番目のＵ（Ｘ１〜Ｘ３を除く；太字下線で示す）におけるリボース２’位の水酸基がフルオロ化されたアプタマーが、活性維持の上では望ましい。また、当該コンセンサス配列の５’側から３、４および５番目のＧ（Ｘ１〜Ｘ４を除く；丸囲み文字で示す）におけるリボース２’位の水酸基がメトキシ化していることが、活性の向上の上で好ましい場合があり、それらに加えて３’側から２番目のＵ（Ｘ４〜Ｘ６を除く；丸囲み文字で示す）におけるリボース２’位の水酸基がさらにメトキシ化していることが、好ましい場合もある。一方、当該コンセンサス配列の５’側から１番目のＧおよび／またはＡ（Ｘ１〜Ｘ３を除く；四角囲み文字で示す）におけるリボース２’位の水酸基がメトキシ化していないことが、活性の向上の上で好ましい場合もある。

本発明のアプタマーはまた、ＭＫに対する結合性、ＭＫとＭＫ受容体との結合阻害活性、ＭＫの癌細胞結合活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変（Ｏ−メチル修飾など）、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換、５−アミノ酸タイプの修飾、５−トリプトファン側鎖の修飾が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、アプタマーのホスフェート部分が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ_２（ホルムアセタール）、Ｐ（Ｏ）ＢＨ_３（ボラノホスフェート）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）で置き換えられていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。

改変はさらに、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と記載する場合がある）、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、Myristoyl、Lithocolic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第5,660,985号、同第5,756,703号を参照のこと。

特に、改変がＰＥＧの末端付加によって行われる場合、ＰＥＧの分子量は特に限定されないが、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは３００００〜９００００である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよいし、二つ以上の鎖に分岐したもの（マルチアームＰＥＧ）であってもよい。
このようなＰＥＧとしては特に限定されず、当業者であれば市販あるいは公知のＰＥＧを適宜選択して用いることができる（例えば、http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.htmlを参照のこと）が、本発明のアプタマーに適用するＰＥＧの好適例として具体的には、分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＧＳ２ 日油社製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＴＳ 日油社製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−４００ＴＳ 日油社製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−８００ＴＳ 日油社製）、または分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−８００ＴＳ 日油社製）などが挙げられる。

この場合、本発明のアプタマーは、ＰＥＧが末端に直接付加されていてもよいが、その末端にＰＥＧと結合可能な基を有するリンカーなどが付加され、それを介してＰＥＧを本発明のアプタマーに付加することがより好ましい。

ＰＥＧと本発明のアプタマーのリンカーとしては特に限定されず、炭素鎖数や官能基などを結合部位やＰＥＧの種類などに応じて適宜選択することができる。このようなリンカーとしては、例えばアミノ基を有するリンカーが挙げられ、具体的には、５’末端に付加する場合は、ssH Linker（SAFC）またはDMS(O)MT-AMINO-MODIFIER（GLENRESEARCH）が、３’末端に付加する場合は、TFA Amino C-6 lcaa CPG（ChemGenes）などが例示される。このリンカーを選択した場合、ＰＥＧには、例えばN-hydroxysuccinimideの活性基を付加した上で、これをリンカー側のアミノ基と反応させることで、本発明のアプタマーとＰＥＧとをリンカーを介して結合することができる。

なおＰＥＧやリンカーとしては、市販のものを好ましく用いることができる。またＰＥＧ、リンカーおよび本発明のアプタマーの結合に関する反応条件などは、当業者であれば適宜設定することが可能である。

本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。

アプタマーは、ＳＥＬＥＸ及びその改良法（例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸにはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＭＫはＮ末端とＣ末端のテイル部分にリジンリッチな部分が存在し、核酸が非特異的に結合すると考えられる。このテイル部分はヘパリンやコンドロイチン硫酸との結合において重要であるとは考えられていない。そのような環境の中でＭＫの活性を有効に阻害するアプタマーを作製することは容易ではない。

このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するために取得されたアプタマーの配列を基にしたＳＥＬＥＸを行うことができる。具体的な方法としては、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。

ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる約６０ヌクレオチド以下、より好ましくは約５０ヌクレオチド以下、最も好ましくは４５ヌクレオチド以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。

アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて２次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。

得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。そしてこのような新しい配列の長さは特に限定されるものではない。

修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。

以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。

例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：

〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチドからなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。

本発明のアプタマーとして好ましくは、配列番号７〜１２で表される配列を含み、かつヌクレオチド長が４５以下であることを特徴とする、ＭＫに結合するアプタマーである。
配列番号７〜１２で表される配列は、本発明のアプタマーがＭＫに結合し、ＭＫの活性、特に癌細胞への結合活性を阻害するなど、本発明のアプタマーとして機能する上で重要な部分であるが、これらの配列の両端に新しい配列を付加しても本発明のアプタマーとしての機能が損なわれることはない。またこれらの配列は、前記した糖残基の修飾・核酸塩基やリン酸基の改変などを受けていてもよい。

すなわち本発明のアプタマーとして、
配列番号７〜１２で表される配列を含み、かつヌクレオチド長が４５以下であることを特徴とする、ＭＫに結合するアプタマーであって、
（ｉ）少なくとも１種のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基またはアミノ基で置き換えられている、アプタマー；
（ｉｉ）ＰＥＧ、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、Myristoyl、Lithocolic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質またはビオチンが末端に付加されている、アプタマー；
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の要件を満足するアプタマー；
などを、好ましい具体例として挙げることができる。

本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。

本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬、飲料水や食品の添加剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。

本発明のアプタマー及び複合体は、ＭＫに結合し、ＭＫの癌細胞への結合を阻害することによって、ＭＫの機能を阻害する活性を有し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、癌を治療又は予防するための医薬として有用である。

ここで癌としては、例えば、ＭＫが関与する癌が挙げられ、特に限定されないが、具体的には食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍などが挙げられる。

ＭＫは、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰζ）、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）、インテグリン及びシンデカンなどの受容体に結合すると、下流のＰＩ３ＫやＭＡＰＫなどを活性化させ、細胞の生存や増殖等の生理的作用を発揮する。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬としても使用され得る。これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患としては、癌、炎症性疾患、子宮内膜症、血管閉塞性疾患、循環器疾患などが挙げられる。

本発明のアプタマー及び複合体が医薬、診断薬、検査薬、試薬などとして用いられる場合、それが投与される対象としては特に限定されないが、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。

本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。

非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤としては、人工骨や生体分解性もしくは非分解性スポンジ、バッグ、薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態、あるいは体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等が挙げられる。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Poly(lactic-co-glycolic)acid（PLGA）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。更に注射液剤や徐放製剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。

ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウレート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。

吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。

本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

アプタマーの表記方法は次の通りとする。小文字はＤＮＡ、大文字はＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を表す。例えばＧ（Ｍ）と記載された場合、２’位がＯ−メチル基で修飾されたＧを意味する。ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、８０ＰＥＧは分子量が約８００００のポリエチレングリコール、８０ＰＥＧ４ｔｓは日油社製のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−８００ＴＳ、８０ＰＥＧ４ｇｓはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４−８００ＧＳ２、４０ＰＥＧ２ｔｓはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＴＳを使用した場合を示す。

実施例１：ＭＫアプタマーの作製１
ＭＫに特異的に結合するアプタマー（ＭＫアプタマー）はＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸ法はＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，１９９０）を改良して行った。標的物質であるヒトＭＫはＭｕｒａｓｕｇｉらの方法（Ｍｕｒａｓｕｇｉ ａｎｄ Ｔｏｈｍａ−Ａｉｂａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７， ２４４−２５２，２００３）を参考にして、酵母を用いて作製した。以下、特記されていない場合、ＭＫはヒトＭＫを意味することとする。ＭＫはアミノカップリングによってアガロース樹脂（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に固定化した。アミノカップリングはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の仕様書にそって行った。固定化量は、固定化前のミッドカイン溶液と固定化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはＭＫのバンドは検出されず、使用したＭＫのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約１７５μｇのミッドカインが約７０μＬの樹脂に固定化されたことになる。

最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ−ＲＮＡ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列（４０ｎ）の両端にプライマー配列を持った長さ９４ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した（Ｏｐｅｒｏｎ社製）。
ＤＮＡ鋳型：５’−ｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｃｃｔｃｔａ−４０ｎ−ｔｔｃｃｔｃｔｔｃｔｃｃｔｃｔｃｃｃ−３’（配列番号１３）
プライマーＦｗｄ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｇｇａｇａａｇａｇｇａａ−３’（配列番号１４）
プライマーＲｅｖ：５’−ｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｃｃｔｃｔａ−３’（配列番号１５）
ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのいずれか一つを示す。プライマーＦｗｄはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０^１４であった。

ＭＫが固定化された樹脂にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した。３０分後、ＭＫに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。ＭＫに結合したＲＮＡは、溶出液を加えて９５℃で１０分間加熱することで回収した。溶出液として７Ｍ尿素、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭトリスの混合溶液をｐＨ６．６に調整したものを用いた。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ^ＴＭ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を７ラウンド行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）にトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００，ＡＢＩ社製）で４８クローンの塩基配列を決定した。

ＳＥＬＥＸを７ラウンド行った後に配列を調べたところ、３クローンが収束しており、７クローンがシングル配列であった。そのうちの一つのシングル配列を以下に示す。
配列番号１
ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＧＡＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＧＧＡＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＧＡ

このオリゴヌクレオチドの２次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測した。その結果を図１に示す。

実施例２：ＭＫアプタマーの作製２
実施例１と同様のＳＥＬＥＸをＤＮＡ鋳型とプライマー配列を変えて行った。
ＤＮＡ鋳型：５’−ｃｔｃｔｃａｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａ−４０ｎ−ｔａａｃｇｇｃｃｇａｃａｔｇａｇａｇ−３’（配列番号１６）
プライマーＦｗｄ：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｃａｃａａｔｇｇａｃｇ−３’（配列番号１７）
プライマーＲｅｖ：５’−ｃｔｃｔｃａｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｔａ−３’（配列番号１８）
ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔのいずれか一つを示す。

ＳＥＬＥＸを１３ラウンド行った後に４８クローンの配列を調べたところ、配列番号２で表される配列が３３配列、その１塩基置換体が３配列、２塩基置換体が１配列存在した。以下に、得られたアプタマーの配列（配列番号２〜６）を示す。それらは全て配列番号１に見られたＵＧＸＧＵＧＧＵＵＵＡＵＣＣＧ（Ｘ＝Ａ ｏｒ Ｕ；配列番号２１）のコンセンサス配列を含んでいた。その配列を下線で示した。また、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて２次構造を予測したところ、コンセンサス配列は全て同じ２次構造を示した。２次構造の一例として配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドの２次構造予測の結果を図２に示す。
配列番号２
ＧＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＡＧ
配列番号３
ＧＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＡＧ
配列番号４
ＧＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＡＧ
配列番号５
ＧＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＡＧ
配列番号６
ＧＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＡＧＡＧ

実施例３：表面プラズモン共鳴法による結合活性の評価
実施例１および２で得られた配列番号１〜６で表されるオリゴヌクレオチドのＭＫに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ ｄＴを１０００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなるＲＮＡは、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ Ａを付加し、ｄＴとＡの結合によりＳＡチップに固定化した。固定化量は約１０００ＲＵとした。アナライト用のＭＫは０．５μＭに調製したものを７０μＬインジェクトした。ＢＩＡｃｏｒｅのランニングバッファーには溶液Ａを用いた。測定の結果、全てのオリゴヌクレオチドがＭＫに強く結合することがわかった。

実施例４：ＭＫアプタマーの短鎖化と安定化
配列番号１および２で表されるアプタマーを基に、コンセンサス配列を残すようにして短鎖化を行い、配列番号１および２からそれぞれ配列番号７および８で表わされるアプタマーを得た。また、これらの短鎖化アプタマーに対し、ヌクレアーゼ耐性を向上させる目的でリボースの２’位にＯ−メチル修飾や３’末端にｉｄＴ修飾を加えた。更に、薬物体内動態を向上させる目的でポリエチレングリコールを５’末端に付加した。
それらのアプタマーを実施例３と同様に表面プラズモン共鳴法で評価し、ＭＫに対して結合活性を有していることを確認した。

短鎖化および安定化したアプタマーはホスホロアミダイト法により化学合成した。この合成法は一般的によく使われる方法であり、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｅｄｉｔｏｒ：Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）などに記載のとおりである。実際にはアプライドバイオシステムズ社製の核酸合成機（ＡＢＩ３９４）を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）により精製した。最終合成物はＨＰＬＣを用いて純度決定し、８５％以上の場合合格とした。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより分子量が理論分子量と一致することを確認した。

ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）が５’末端に付加されたアプタマーは次のようにして合成した。まず初めに５’末端にアミノ基が付加されたアプタマーを上記核酸合成機を用いて合成した。ＨＰＬＣで精製後、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析し、８５％以上の純度であることを確認した。次にこれらのアプタマーをＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基が付加したＰＥＧと混合し、室温でカップリング反応させた。反応後、ＨＰＬＣで精製および純度分析を行った。最終純度８５％以上で合格とした。

以下に実際に作製した配列番号７および８で表されるアプタマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７
ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＧＧＣ（Ｆ）
配列番号７−１
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）
配列番号８
ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）
配列番号８−１
Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）
配列番号８−２
８０ＰＥＧ４ｔｓ−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ−ｉｄＴ
配列番号８−３
８０ＰＥＧ４ｇｓ−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ−ｉｄＴ
配列番号８−４
８０ＰＥＧ４ｔｓ−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号８−５
８０ＰＥＧ４ｇｓ−Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ

実施例５：ＡＰ−ＭＫアッセイによる結合阻害活性の確認
ＭＫが癌細胞に結合することをＭＫアプタマーが阻害できるかどうか検討した。ＭＫと癌細胞の結合を検出するためにアルカリホスファターゼが結合したＭＫタンパク質（ＡＰ−ＭＫ）を用いた。

ＡＰ−ＭＫは次の通り作製した。ＡＰｔａｇ−５ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位に、シグナル配列を除いたＭＫ ｃＤＮＡ（Ｌｙｓ２３−ｓｔｏｐ）を挿入した。２９３Ｔ細胞を２．０ｘ１０^６個／１０ｃｍ ディッシュに播き、翌日ＡＰｔａｇ−５、及びＡＰｔａｇ−５−ＭＫプラスミド７．５μｇをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）１５μＬを用いてトランスフェクションした。培地はＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（１％ ＩＴＳＡ）を用い、ＦｕＧＥＮＥ６に添付のプロトコルに従った。５日後、培地をプロテオセーブＳＳ（住友ベークライト）に回収し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心の後、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターに通した。２μＬを取り、ＭｉｌｌｉＱ ４８μＬ、ＡＰ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）５０μＬを加え、３７℃で１０分間発色させた。０．５Ｎ ＮａＯＨを１００μＬ加えて発色を止めた後、ＭｉｌｌｉＱを８００μＬ加えてＯＤ_４０５を測定し、以下の公式を用いて活性を測定した。

上記ＡＰ−ＭＫを用いてヒト神経芽腫細胞であるＴＮＢ１細胞に対する結合阻害実験を行った。コラーゲンＩでコートした６穴プレートに１×１０^５個／ｗｅｌｌのＴＮＢ１細胞を播種した。翌日、１ｍＬのＨＢＨＡ（ＨＢＳＳ＋０．５ｍｇ/ｍＬ ＢＳＡ＋２０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０）で洗った後、１Ｕ/ｍＬのＡＰまたはＡＰ−ＭＫ、更に最終濃度１００ｎＭの配列番号７−１で表されるアプタマーを加えて室温で９０分保持した。１ｍＬのＨＢＨＡで５回洗い、２００μＬのＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）を加えて５分間攪拌した。スクレイパーでかき取りエッペンチューブに移し、１０秒間ボルテックスしてから１５０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を取り、６５℃で１０分間加熱して内在性ＡＰを不活化した。５０μＬを用いて上記と同様に発色を行い（１５分）、ＡＰの活性を計算した。

ＡＰ−ＭＫはＴＮＢ１細胞表面に結合し、その結合は配列番号７−１で表されるアプタマー１００ｎＭで８２％阻害された。一方、配列番号１９で表されるネガティブコントロールＲＮＡでは、配列番号７−１で表されるアプタマーと比較して阻害効果が有意に小さかったことから、配列番号７−１で表されるアプタマーの特異性が示された（図３）。
配列番号１９
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）

上記と同様の実験をマウス胎児線維芽細胞であるＭＥＦ−１細胞を用いて行った。その結果、配列番号７−１で表されるアプタマーはＡＰ−ＭＫとＭＥＦ−１細胞の結合を１００ｎＭで９０％以上阻害することがわかった。

上記と同様の実験をヒト肝臓癌由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。ＨｅｐＧ２細胞の増殖やアポトーシス阻害にＭＫが深く関わっていることは既に知られている（Ｏｈｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １００，２４３０−２４３６，２００４； Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１５，１９６６−１９７２，２００９）。アプタマーを系に添加するとＡＰ−ＭＫとＨｅｐＧ２の結合が阻害された（表１）。

配列番号７−１の改変体を作製し、上述と同様にＨｅｐＧ２とＴＮＢ１細胞を用いてＡＰ−ＭＫ結合阻害実験を行った。実際に作製した改変体の配列を以下に示す。配列番号９及び配列番号９−１〜５で表されるアプタマーの３’末端にはＢＩＡｃｏｒｅ測定用のポリｄＡが付加されているが、活性には影響しないと考えている。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた（表２）。
配列番号７−２
４０ＰＥＧ２ｔｓ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−３
４０ＰＥＧ２ｔｓ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−４
４０ＰＥＧ２ｔｓ−Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−５
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−６
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−７
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−８
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号７−９
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号９（配列番号７−１の末端にｐｏｌｙＡを付けたものである）
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号９−１
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号９−２
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号９−３
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号９−４
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号９−５
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）ａａａａａａａａａａａａａａａａ
配列番号１０（配列番号７−３から２塩基対（４ヌクレオチド）およびＰＥＧを除いたものである。）
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１１（配列番号７−６の末端１１ヌクレオチドを除き、Ｇ−Ｃ対を付加したものである。）
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１１−１
Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＧＡ（Ｍ）ＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１２（配列番号７−３の末端１１ヌクレオチドおよびＰＥＧを除いたものである。）
Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＧＡＧＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）−ｉｄＴ

２１ｍｅｒである配列番号８−１で表されるアプタマーは高い阻害活性を示した。その２次構造をMFOLDプログラムを用いて予測した結果を図４に示す。丸（○）で示した配列と２次構造は配列番号１〜１２で表されるアプタマーの全てに含まれており、活性と関係するコンセンサス配列であると考えられる。その配列は次のように表すことができる。
（Ｘ１）（Ｘ２）ＵＧ（Ｘ３）ＧＵＧＧＵＵＵＡＵ（Ｘ４）ＣＧ（Ｘ５）（Ｘ６）（配列番号２０）
ここで、末端部分のヌクレオチドＸ１とＸ６およびＸ２とＸ５はそれぞれ塩基対を作る。Ｘ１〜Ｘ６はＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕのいずれでもよい。また、ＵはＴであってもよい。

配列番号７−３や８−２で表されるアプタマーはリボースの２’位の修飾が配列番号７や８で表されるアプタマーと異なっているが高い阻害活性を示した。また、５’末端にポリエチレングリコール、３’末端にｉｄＴ修飾を加えても活性を保持していた。以上より、本アプタマーはリボースの２’位や末端に修飾を加えても活性を維持できることが分かった。

実施例６：ＴＮＢ１細胞を用いたソフトアガーアッセイ
まず初めに、ＴＮＢ１細胞がＭＫを産生しているかどうかウエスタンブロッティングにより確認した。ＴＮＢ１細胞を１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。得られた培養上清は、３０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を除いた後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ポリアクリルアミドゲル）に供した。電気泳動後のタンパク質はＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、メンブレンは、ブロッキング溶液（５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で１時間ブロッキングした後、ブロッキング溶液にマウス抗ＭＫ抗体を加えた溶液で室温にて２時間以上反応させた。その後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）でメンブレンを２回洗浄し、ブロッキング溶液にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を加えた溶液で室温にて1時間反応させた。反応後、洗浄液でメンブレンを３回洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ ＥＰＵＶ（富士フイルム社製）にて検出した。その結果、使用するＴＮＢ１細胞からＭＫが産生されていることが確認できた。

次にその細胞を用いてソフトアガーアッセイを実施した。６穴プレートに１．５ｍＬのｂｏｔｔｏｍ ａｇａｒ（０．５％ ａｇａｒ／ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ）を加え、室温に３０分保持した。ＴＮＢ１細胞（２０００個／ｗｅｌｌ）と最終濃度１００ｎＭのアプタマーを加えたｔｏｐ ａｇａｒ（０．３３％ ａｇａｒ／ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ）１ｍＬをｂｏｔｔｏｍ ａｇａｒの上に加えた。３週間培養の後、クリスタルバイオレットで細胞を染め、各ｗｅｌｌ当たり６視野について写真を撮影してコロニーを計数した。

配列番号７−１で表されるアプタマーの存在下では、非添加のコントロールと比較してＴＮＢ１細胞のコロニー数が有意に減少した（図５）。一方、配列番号１９で表されるネガティブコントロールを加えた場合には、コントロールと同程度だったことから、配列番号７−１で表されるアプタマーによる足場非依存性増殖の阻害作用が特異的であることが示された。

実施例７：細胞遊走阻害実験によるＭＫアプタマーの評価
ミッドカインは骨芽細胞前駆細胞の細胞浸潤作用を有することが知られている（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （１９）， １５８６８−１５８７５， ２００１）。そこで、作製したＭＫアプタマーがミッドカインの細胞遊走活性を阻害するかどうか、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるＵＭＲ１０６細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ１６６１）を用いて調べた。ケモタキセル（膜孔径８μｍ、クラボウ社製）の膜外面に１．５μＭのミッドカイン３０μＬを塗布し、膜外面にミッドカインを固定化した。ＲＮＡアプタマー１００ｎＭを含む５００μＬの培地（０．３％ウシ血清アルブミン添加、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を添加した２４穴カルチャープレートに、ミッドカインを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはＵＭＲ１０６細胞を１ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２００μＬ入れ、３７℃で４時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、ミッドカイン塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを１％クリスタルバイオレット水溶液に３０分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、２００μＬの１％ＳＤＳと１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００の混合液で色素を抽出した。抽出液の１５０μＬを９６穴マイクロプレートに移し、５９０ｎｍの吸光度を測定した。
測定の結果、配列番号７−１で表わされるアプタマーを５００ｎＭ添加しても顕著な細胞遊走の阻害は観察されなかった。一方、国際公開第２００８／０５９８７７号記載の配列番号４５−４−１のアプタマーを用いるとＩＣ５０値は４４ｎＭであった。また、国際公開第２００９／０６３９９８号記載の配列番号７を用いるとＩＣ５０値は１３ｎＭであった。以上より、本明細書記載のアプタマーは細胞遊走阻害能を有していない点で、国際公開第２００８／０５９８７７号や国際公開第２００９／０６３９９８号に記載されているアプタマーと異なることがわかった。

実施例８：TNB1細胞を用いた担癌マウスモデル
ＴＮＢ１細胞をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と等量ずつ混合し、２００μＬ（１００００ ｃｅｌｌｓ）をＫＳＮヌードマウスの腹部皮下に移植した。腫瘍が径５ｍｍ程度に達する３週間後から、腫瘍あたり１００μｇのアプタマーを週に２回、合計８回腫瘍内投与した。週に一度腫瘍の体積を測定し（幅×幅×長さ／２）、一回目の投与から４週間後に安楽死させ、腫瘍の重さを測定した。

溶媒投与群と配列番号１９で表されるネガティブコントロール投与群では、腫瘍の体積が急速に増大していったのに対して、配列番号７−１で表されるアプタマー投与群は腫瘍の体積はほぼ横ばいであり、増殖が顕著に抑制されていた（図６）。同様に、治療開始から４週間後の腫瘍の重さについても、溶媒投与群及び配列番号１９で表されるネガティブコントロール投与群と比較して、配列番号７−１で表されるアプタマー投与群では有意に小さくなっていた。以上より、本発明が提供するアプタマーはＭＫが関係する癌の治療薬として利用可能であることが示された。

本発明のアプタマーまたは核酸は、優れたＭＫ活性阻害作用、特にＭＫの癌細胞への結合活性の阻害において優れた作用を有するので、癌の治療薬として有用であり得る。

本出願は、２０１２年１１月２１日付で日本国に出願された特願２０１２−２５５５８８を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims (14)

1. 式（Ｉ）で表される潜在的２次構造を形成できる、ミッドカインと結合するアプタマー。
   （式中、
   Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つもしくは２つのヌクレオチド、または結合であり、
   Ｘ１およびＸ６、ならびにＸ２およびＸ５は、それぞれワトソン−クリック塩基対を形成し、そして
   Ｘ３およびＸ４は、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴから選択されるヌクレオチドである。）
2. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６が、それぞれ同一または異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴからなる群より選択される１つのヌクレオチドである、請求項１に記載のアプタマー。
3. Ｘ３が、ＡまたはＵであり、Ｘ４が、Ｃである、請求項１または２に記載のアプタマー。
4. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸を一部または全部として含む、１５から１００ヌクレオチド長の核酸：
   （ａ）配列番号１〜１２および２０のいずれかとして定義される核酸；
   （ｂ）上記（ａ）の核酸において、１ないし数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された核酸であり、かつミッドカインと結合する核酸；
   （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の核酸において、１又は複数個のヌクレオチドのリボースの２’位の基が他の基で置換されている、核酸。
5. ヌクレオチド長が４５以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
6. 少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
7. ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールで修飾されている、請求項５または６に記載のアプタマーまたは核酸。
8. ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴまたはポリエチレングリコールが、アプタマーまたは核酸の５’末端または３’末端に結合している、請求項７に記載のアプタマーまたは核酸。
9. 各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、請求項５〜８のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
10. 各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置き換えられている、請求項５〜８のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
11. ミッドカインの癌細胞への結合を阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
12. ミッドカイン依存性の細胞増殖を阻害する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸を含む、医薬組成物。
14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアプタマーまたは核酸を含む、癌の治療薬。