JPWO2013137302A1 - リジンオリゴマー誘導体及びそれからなる軟骨組織マーカー - Google Patents

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Abstract

リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されてなり、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基及び／又はα−アミノ基に、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合されてなることを特徴とする、リジンオリゴマー誘導体である。このリジンオリゴマー誘導体は、軟骨基質に特異的に集積する性質を有するとともに、電磁波を発生又は吸収することができるので、軟骨組織マーカーとして有用である。

Description

本発明は、リジンオリゴマー誘導体に関する。また本発明は、軟骨基質に特異的に結合する性質を有するリジンオリゴマー誘導体からなる軟骨組織マーカーに関する。
軟骨組織は、膝関節等の関節において、骨相互の間に生じる摩擦を緩和し、衝撃を吸収するために存在する、軟骨細胞とそれを取り囲む基質からなる支持組織である。様々な原因によって軟骨組織を形成する軟骨基質が変性すると、含水率が低下して、その機能を維持することが難しくなり、慢性の関節炎を伴う関節疾患である変形性関節症（ＯＡ：osteoarthritis）を発症する。これは、関節の構成要素の変性により軟骨の破壊と骨及び軟骨の増殖性変化を来たす疾患である。日本における変形性関節症の総患者数は、約８００万人とされており、人口の高齢化とともに数はさらに増加することが予想されている。
変形性関節症により軟骨及び骨の損傷・破壊が進行するとその後の段階ではそれらを元どおりに戻すことはできない。しかしながら、早期に発見して適切な治療を施せば、症状の進行を遅らせることは可能である。変形性関節症の症状の現れ方や進み方は人により千差万別であるため、適切な治療を選択するには、患者個々の関節軟骨の状態を早期に精密に検査し、異常を把握することが極めて重要である。これと同様に、臨床以前の問題としても、関節組織の変性に対する効果の高い治療剤を開発する上で、少なくとも実験動物の関節軟骨の変性を定性的及び定量的に、また可能な限り生きた状態（in vivo）で経時的に、評価できることも、極めて重要である。
現在、ヒト患者における関節の検査には、単純Ｘ線撮影、関節液検査、関節鏡検査などが一般的に行われている。単純Ｘ線検査は安価でありどの医療機関でも実施可能ではあるものの、関節軟骨の主要成分がコンドロイチン硫酸とケラタン硫酸側鎖を含有するプロテオグリカンであるアグリカンと、コラーゲンとであるため、Ｘ線検査では関節軟骨自体は写らない。実験動物においても同様である。従って、Ｘ線撮影では、関節裂隙（関節における向かい合った２個の骨端間の間隙）の狭小化その他、関節周囲の骨の変化を見ることで関節破壊の程度を調べることはできても、軟骨自体の変化については間接的な評価に止まる。すなわち、Ｘ線撮影では、軟骨が現に受けている損傷や変性の程度を直接検出はできず、したがって、その定量化もできない上、症状の進んでいない状態での関節軟骨の損傷の発見が困難である。一方、他の方法である関節液検査では、関節軟骨の状態を、生理学的ないし生化学的変化を指標として用いて捉えることはできても、関節軟骨の厚みや変形等の物理的状態を知るには無力である。また、直接に関節軟骨を画像診断する方法として、関節鏡を用いた方法がある。それらは、例えば関節鏡の先端からレーザー光を照射し、軟骨組織から発生する超音波を検出することで軟骨の物性を測定する方法（特許文献１参照）、軟骨の圧縮変形に伴う吸光度の時間的変化を近赤外線水分計を用いて測定することによって、軟骨の変性の程度を初期段階から客観的に評価する方法（特許文献２参照）等であるが、何れも高度に侵襲性であり、大きな身体的負担や感染などのリスクを患者に強いるという欠点がある。このためそれらの方法をヒト患者に適用するには場合が限定され、実験動物においても、そのような侵襲の影響は関節疾患に対する薬物評価に必要な経時的検査に行うのを困難にするため、利用に適さない。
これらに対し、近年、ヒト患者では軟骨イメージングにＭＲＩが利用されるようになりつつあり、軟骨自体の質的評価を可能にする検査手段として期待されているが、ＭＲＩ装置は極めて高価であるためこれを導入できる医療機関はごく限られ、しかも解像度には未だ問題を残しており、その点からも利用は困難である。
このような状況にあって、軟骨の状態を早期に診断する方法やそのための正確な疾患マーカーの開発が進められている（特許文献３及び４参照）。
一方、近年、生体内部組織の３次元画像を選択的に作成する技術として、蛍光分子を用いてex vivoで生体組織の光学投影断層撮影（Optical Projection Tomography：ＯＰＴ）を行う蛍光イメージング装置が開発されている。これによれば、蛍光染色された生体組織に対して、励起光としてパルスレーザを照射して個々のパルス照射毎に生体組織の照射部位より発生するフォトンを光電子増倍管によって増幅して検出し、これを時間相関単一光子計数法で処理して得られたデータを画像化処理に付すことにより、目的組織の任意の断面画像やその組織全体の画像（３次元画像、断面画像）を作成することができる。また、生きたラットやマウス等の小動物の体内の蛍光標識物質の位置を外部から検出して画像化することができるin vivo蛍光イメージングシステムも、近年開発され市販されている（例えばGE HEALTHCARE社製「eXplore Optix」）。これによれば、目的とする組織に特異的に集積する蛍光標識を動物に投与し、その３次元的分布を経時的に測定して画像化することができる。in vivo 蛍光イメージングは非侵襲性で行われるため安全であり、しかも高感度であることから、生きた実験動物の特定の組織やその成分をマークして経時的に画像化し、タンパク質の動態や、病変の状態変化を評価することに利用され始めており、将来的にはヒト組織について同様な利用が期待されている。
近年、下記式で示される構造を有するポリアルギニンペプチド（ａ）又はポリリジンペプチド（ｂ）が、軟骨組織に特異的に結合することを利用した軟骨マーカーが報告された（特許文献５参照）。これらのポリペプチドは、下記式に示されるように、アルギニン又はリジンのα−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されたものである。特許文献５記載の化合物は、そのＮ末端もしくはＣ末端に対して、蛍光団やＸ線吸収性基を結合させた軟骨組織マーカーである。
Figure 2013137302
特許文献５記載の化合物について、蛍光物質を導入する場合においては、高感度な蛍光団を導入することにより、所望の軟骨組織の可視化が可能である。一方、Ｘ線吸収物質を用いるには、Ｘ線吸収性の原子団、たとえばヨウ素原子等を多く含ませる必要がある。しかし、ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドは分子量が大きいため、オリゴマー１分子あたりに導入しなければならないヨウ素原子数が多く必要になる。この場合、当該ポリアルギニンペプチド又はポリリジンペプチドの溶解性、また軟骨組織における当該化合物の浸透性などに影響を及ぼしうるため、その改善が要求されている。
特許文献６には、アミノ基がウレタン結合で保護されたε−ポリリジンが記載されている。ここで、ε−ポリリジンは、リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されたものである。特許文献６にはこのようなε−ポリリジンを、トイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料などに用いることについて記載されている。しかしながら、このようなε−ポリリジンを生体組織のマーカーに用いることについては何ら記載されておらず、ε−ポリリジンに蛍光団やＸ線造影用の基を導入することについても何ら記載されていない。
特開２００４−０２４８５５号公報 特開２００５−０５５２２４号公報 特開２００３−２２５０９３号公報 特表平１０−５０２８０７号公報 特開２００９−０２３９９３号公報 特開２００３−３３５８５７号公報
本発明の目的は、軟骨組織に特異的に結合するリジンオリゴマー誘導体を提供することである。また、そのようなリジンオリゴマー誘導体からなる軟骨組織マーカーを提供することである。そして、蛍光団やＸ線造影用の基を結合させた軟骨組織の可視化用試薬（組成物）を提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されたオリゴペプチドであるリジンオリゴマーが軟骨組織マーカーとなりうることを見出した。そして、該リジンオリゴマーに電磁波を発生又は吸収し得る基を結合させることにより、軟骨を可視化することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されてなり、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基及び／又はα−アミノ基に、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合されてなることを特徴とする、リジンオリゴマー誘導体である。
このとき、３〜１２個のリジンが連結されてなることが好ましい。また、前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、蛍光団又はＸ線造影用の基であることが好ましく、前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、ヨウ素原子を含むＸ線造影用の基であることがより好ましい。本発明の好適な実施態様は、このようなリジンオリゴマー誘導体からなる軟骨組織マーカーである。
複数のリジンが、ε−アミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合により連結されてなるオリゴペプチドは、軟骨基質に特異的に集積する性質を有する。したがって、このようなオリゴペプチドに電磁波を発生又は吸収し得る基を結合させてなる本発明のリジンオリゴマー誘導体は、軟骨組織マーカーとして有用である。
本発明の軟骨組織マーカーによれば、実験動物における蛍光イメージング装置やＸ線撮影装置などによる軟骨組織の可視化システムの構築が達成される。当該システムを用いることで、軟骨の基質量の経時的且つ定量的な評価も可能となる。したがって、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、あるいは外傷等における軟骨基質の減少や、軟骨腫瘍等における軟骨基質の増加の検出に有用である。軟骨疾患の治療後の経過観察にも有用である。また、軟骨疾患の治療剤の開発において、軟骨の状態を評価する手段としても有用である。
化合物Ａ〜Ｃを用いたときの軟骨の染色像である。 化合物２６〜２９を用いたときの軟骨の染色像である。 化合物Ｄを用いたときの軟骨のＸ線ＣＴ撮像写真である。
本発明のリジンオリゴマー誘導体は、リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されてなるものである。汎用のポリリジンのようにα−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されているのではなく、ε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されていることに大きな特徴がある。リジンオリゴマー誘導体がこのような構造を有することによって、軟骨組織に対して特異的に結合することができる。そのメカニズムは必ずしも明らかではないが、ペプチド結合に関与していないα−アミノ基が適当な間隔で配置されることによって、軟骨基質を構成するコンドロイチン硫酸中に含まれているスルホン酸基との相互作用が大きくなるためであると推定される。
本発明のリジンオリゴマー誘導体を構成するリジンの数は特に限定されないが、３〜１２個のリジンが連結されてなることが好ましい。リジンの数が３個未満である場合には、軟骨組織への結合性が低下するおそれがある。一方、リジンの数が１２個を超える場合には、合成が困難になるし、分子量が大きくなりすぎて組織内にスムーズに拡散することが困難になるおそれがある。
そして、本発明のリジンオリゴマー誘導体は、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基及び／又はα−アミノ基に、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合されてなるものである。このような基を結合させることによって、軟骨組織を可視化することができる。
本発明のリジンオリゴマー誘導体の好適な化学構造は、下記式（Ｉ）に示されている通りである。
Figure 2013137302
上記式（Ｉ）中、ｎは、１〜１０の整数である。すなわち、オリゴマーを構成するリジン単位が３〜１２個含まれているということである。Ｗは、電磁波を発生又は吸収し得る基であり、蛍光団又はＸ線造影用の基であることが好ましい。またＲは、それぞれ独立に、アミノ基又は電磁波を発生又は吸収し得る基である。したがって、Ｒが、全てアミノ基であってもよいし、一部がアミノ基で一部が電磁波を発生又は吸収し得る基であってもよいし、全て電磁波を発生又は吸収し得る基であってもよい。Ｒは、蛍光団又はＸ線造影用の基であることが好ましい。
本発明において「電磁波を発生又は吸収し得る基」とは、電磁波（電波、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線、ガンマ線など）を発生又は吸収することができ、その結果、肉眼、顕微鏡、イメージング装置などにより、その存在をイメージングできる基のことをいう。ここで、電磁波を吸収し得る基としては、例えばＸ線造影用の基が例示され、外部から照射された電磁波の減少分によってイメージングが可能である。また、電磁波を発生する基としては、例えば蛍光団が例示され、より高いエネルギーを吸収して蛍光を発生することによってイメージングが可能である。
Ｘ線造影用の基としては、Ｘ線を多く吸収するヨウ素原子を含む基の利用が考えられ、造影能を向上させるために、ヨードベンゼン、特にトリヨードベンゼン誘導体が好適に利用される。本発明においては、軟骨組織をなすコンドロイチン硫酸のスルホ基などのアニオン性側鎖を認識するために、リジンオリゴマーに対し導入されるヨウ素含有基が、グアニジノ基やアミノ基等のカチオン性基を含むことも望ましい。
蛍光団としては、軟骨周囲の他の組織に強い親和性のない蛍光物質（蛍光色素等）由来のものであればよい。したがって、骨が染色されるカルセインや、細胞核のＤＮＡが染色されるヘキストなどは避けるべきであるが、当業者に周知の他の蛍光色素を、適宜選択してよい。特に限定されるものではないが、そのような蛍光物質のうち蛍光色素の例としては、ＮＢＤなどのベンゾフラザン系色素、ローダミン系色素（例えば、ローダミン、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カルボキシローダミン、テトラエチルローダミン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、ローダミングリーン等）のほか、フルオレセイン系色素（例えば、フルオレッセイン、カルボキシナフトフルオレッセイン、テトラクロロフルオレッセイン、テトラブロモスルホンフルオレッセイン等）、シアニン系色素（例えば、Cy7、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3その他のCy色素：GE Healthcare）、Alexa Fluor類（例えば、Alexa Fluor 790、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 405等：INVITROGEN）、VivoTag（例えば、VivoTag S750、VivoTag 680、VivoTag S680：VisEn Medical）、Atto系色素（例えば、Atto 740、Atto 725、Atto 700、Atto 680、Atto 655、Atto 647、Atto 637、Atto 635、Atto 633、Atto 620、Atto 611X、Atto 610、Atto 594、Atto 590、Atto 565、Atto 550、Atto 532、Atto 520、Atto 495、Atto 488、Atto 465、Atto 425等：ATTO-TEC GmbH）、BODIPY系色素（例えば、BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY-530/550、BODIPY-FL-X）、CAL Fluor系色素（例えば、CAL Fluor-Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635等）、カスケード（Cascade）ブルー、オレゴングリーン系色素（例えば、Oregon Green 488、Oregon Geen 500、Oregon Green 514等）ロードル（Rhodol）グリーン、テキサスレッド等が挙げられる。また色素以外の蛍光物質の例として、Qdot［量子ドットの光子放出を利用したナノクリスタル蛍光体（数百〜数千個の半導体物質の原子、例えば、セレンまたはテルルと混合したカドミウムを、硫化亜鉛のシェルで被覆したもの、更にポリマーで、次いで生体高分子でコーティングしたものが入手可能）：INVITROGEN］等が挙げられる。
本発明のリジンオリゴマー誘導体の化学合成方法は特に限定されない。例えば、Biopolymers，1980，19，219-229に記載された方法で、又はこれに準じて適宜変更を加えた方法にしたがって行うことができる。以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）リジンオリゴマーの調製
例えば、ε−アミノ基をＺ基（ベンジルオキシカルボニル基）などで保護し、かつα−アミノ基をＢｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）で、さらにカルボキシル基をメチルエステルなどの保護したリジン誘導体を原料に、ペプチド結合形成を可能にする縮合剤を用いてペプチド形成することなどにより、ε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されたリジンオリゴマーを得ることができる。そして、得られたカルボン酸エステルを水酸化リチウム等を用いたけん化により脱保護することで、リジンオリゴマーのカルボン酸体を得ることができる。
（２）電磁波を発生又は吸収し得る基の導入
得られたカルボン酸体に、蛍光団やＸ線造影用の基などを導入し、Ｂｏｃ基を酸を用いて脱保護することで、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合されてなるリジンオリゴマー誘導体を得ることができる。
（３）Ｘ線造影用の基の導入
（１）記載の脱Ｂｏｃリジンオリゴマーに対し、３−ヨードもしくは３，５−ジヨード−４−（２−グアノジノエチルアミノ）安息香酸、３−ヨードもしくは３，５−ジヨード−４−（２−アミノエチルアミノ）安息香酸、２，３，５−トリヨード安息香酸などの含ヨウ素安息香酸誘導体、もしくはこれらの含ヨウ素安息香酸誘導体とジアミンとがペプチド結合してなるアミノ基含有アミドなどのＸ線造影剤を、一般的なペプチド合成用縮合剤の存在下で反応させ、Ｘ線撮像可能なリジンオリゴマー誘導体を得ることが出来る。また、ここで用いられるカチオン性Ｘ線造影剤は、アミノ安息香酸エステルを原料に、そのアミノ基への還元的アミノアルキル化、さらに、末端アミノ基のグアニジノ化を経て、硫酸銀存在下、メタノール中、ヨウ素と反応させることで得ることが出来る。
本発明のリジンオリゴマー誘導体は薬学的に許容される塩であってもよい。また、異性体（例えば光学異性体、幾何異性体及び互換異性体）などが存在する場合は、本発明はそれらの異性体を包含し、また溶媒和物、水和物及び種々の形状の結晶を包含するものである。本発明において、薬学的に許容される塩としては、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩、特に、酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩を挙げることができる。
リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されてなるリジンオリゴマーは、軟骨組織に特異的に結合することから、軟骨組織に対するマーカーとして機能することができる。したがって、蛍光団やＸ線造影用の基など、電磁波を発生又は吸収し得る基が導入された、本発明のリジンオリゴマー誘導体は、蛍光顕微鏡や光学投影断層撮影、Ｘ線撮影などの方法によって、容易に検出できる軟骨組織可視化用試薬として用いることができる。
本発明の軟骨組織マーカーを、滅菌された水性媒質（特に水又は生理食塩水、緩衝生理食塩水等）中に溶解させてなる組成物とすることにより、軟骨組織の可視化用試薬として使用することができる。組成物中の濃度は適宜であってよいが、例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭの濃度のものを適当量だけ、例えば関節腔内に投与するようにすることができるが、これに限定されない。
以上説明したように、ε−アミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合により連結されてなるリジンオリゴマーは、軟骨に選択的に集積する。この点は、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合したリジンオリゴマー誘導体を用いて、後の実施例に示されるように実証された。したがって、このリジンオリゴマーは、軟骨を標的化してこれに薬剤を運搬するための担体として使用することができる。すなわち、ε−アミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合により連結されてなるリジンオリゴマーに対して、軟骨の治療に用いられる薬剤成分を結合させた医薬は、それを投与（例えば関節腔内に）することによって、薬剤成分を効率よく軟骨に集積させることができる。この場合、当該医薬の軟骨への集積状態を確認するために、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合していても構わないが、そのような基を有さなくてもよい。
本発明の、ε結合で連結されたリジンオリゴマーは、軟骨組織に特異的に結合することから、これに蛍光団やＸ線造影用の基等の、電磁波を発生又は吸収し得る基を結合させることにより、軟骨組織を可視化することが可能となり、軟骨疾患の治療剤の開発において、軟骨の状態を評価する手段として有用である。また、当該リジンオリゴマーは軟骨に治療薬を選択的に送達するための手段としても有用である。
［リジンオリゴマー誘導体の合成］
１）中間体２の合成
Nα−(tert−ブトキシカルボニル)−L−リジン（１）（９８５ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を無水１，４−ジオキサン（３ｍＬ）、水（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６１５μＬ、４．４ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、二炭酸ジ−tert−ブチル（９６０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を滴下し、１８時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝５：１）で反応終了を確認し、反応液を０．５規定塩酸水溶液（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水（８０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１→２：１）を行い、白色固体の中間体２（１．２９ｇ、９３％）を得た。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ： 5.21(br s, 1H), 4.62(br s, 1H), 4.28(br s, 1H), 3.14(d, 2H, J = 6.0Hz), 1.88(br s, 1H), 1.76(br s, 1H), 1.45-1.23(m, 22H), 0.92-0.88(m, 1H)。
Figure 2013137302
２）中間体４の合成
Ａｒ雰囲気下、Nα−（tert−ブトキシカルボニル）−Nε−（ベンジルオキシカルボニル）−L−リジン（３）（８１０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）、無水メタノール（１ｍＬ）に溶解し、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（３９０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（４９０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチルのみ）で反応終了を確認し、反応液を水にあけ、酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７０ｍＬ）、水（７０ｍＬ）、飽和食塩水（７０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：４→１：２）を行い、無色油状の中間体４（８３９ｍｇ、９９％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.36-7.33(m, 5H), 5.09(s, 2H), 5.06(s, 1H), 4.81(s, 1H), 3.73(s, 3H), 3.20(q, 2H, J = 6.5 Hz), 1.77-1.67(m, 2H), 1.53-1.51(m, 2H), 1.42-1.37(m, 11H)。
Figure 2013137302
３）中間体５の合成
中間体４（８３９ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（触媒量）を加え、水素雰囲気下、室温で４０分撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ ２：１）で反応終了を確認し、反応液をセライト濾過し、減圧下で溶媒留去後、無色油状の中間体５（５６３ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得、そのまま次の反応に用いた。
Figure 2013137302
４）中間体６の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体５（５６０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）、Nα−（tert−ブトキシカルボニル）−Nε−（ベンジルオキシカルボニル）−L−リジン（８３７ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）（３）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（３３７ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（４２３ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、５．５時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ ３：１）で反応終了を確認し、反応液を水にあけ、酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７０ｍＬ）、水（７０ｍＬ）、飽和食塩水（７０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、白色固体の中間体６（５９６ｍｇ、４４％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.36(br s, 5H), 6.18(br s, 1H), 5.19(br s, 2H), 5.10(s, 2H), 4.90(br s, 1H), 4.25(br s, 1H), 4.00(br s, 1H), 3.73(s, 3H), 3.21(br s, 4H), 1.83(br s, 2H), 1.44(d, 18H, J = 3.0Hz)。
Figure 2013137302
５）中間体７の合成
中間体６（７９０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：水＝３：２（３２ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（１６１ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、無色粘性の中間体７（８４０ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得、そのまま次の反応に用いた。
Rf = 0.48 (CH2Cl2 : MeOH = 1 : 2)； 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.34(br s, 5H), 5.14(br s, 1H), 5.09(s, 2H), 4.16-3.84(m, 3H), 3.18(br s, 3H), 1.97-1.90(m, 1H), 1.77(br s, 2H), 1.63-1.21(m, 5H), 1.51(s, 4H), 1.44-1.40(m, 18H)。
Figure 2013137302
６）中間体８の合成
中間体６（５９５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をメタノール（１３ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ/Ｃ（触媒量）を加え、水素雰囲気下、室温で７．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液をセライト濾過し、減圧下で溶媒留去後、白色固体の中間体８（４６９ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得、そのまま次の反応に用いた。
Figure 2013137302
７）中間体９の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体８（３７６ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、Nα−（tert−ブトキシカルボニル）−Nε−（ベンジルオキシカルボニル）−L−リジン（３）（２９３ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１４１ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）、1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１７６ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、４時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチルのみ）で反応終了を確認し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝１：３）を行い、白色泡状固体の中間体９（５０４ｍｇ、７７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.35(br s, 5H), 6.47(br s, 2H), 5.37-5.05(m, 6H), 4.23(br s, 1H), 4.00(br s, 2H), 3.73(s, 3H), 3.21(t, J = 6.5 Hz, 6H), 1.80(br s, 3H), 1.71-1.24(m, 13H), 1.43(d, J = 3.5 Hz, 27H)。
Figure 2013137302
８）中間体１０の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体８（２５５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、中間体７（３１９ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（９６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、１−(３−ジメチルアミノプロピル) −３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１１９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ ９：１）を行い、白色固体の中間体１０（４６４ｍｇ、８３％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.42-7.29(m, 5H), 6.59(br s, 1H), 6.50(br s, 1H), 5.61-5.17(m, 4H), 5.10(s, 2H), 4.24(br s, 1H), 4.00(br s, 3H), 3.73(s, 3H), 3.32(br s, 2H), 3.27-3.17(m, 6H), 1.79-1.35(m, 24H), 1.45-1.41(m, 36H)。
Figure 2013137302
９）中間体１１の合成
中間体９（５０４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ/Ｃ（触媒量）を加え、水素雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液をセライト濾過し、減圧下で溶媒留去後、白色泡状固体の中間体１１（４２１ｍｇ、９９％）を得、そのまま次の反応に用いた。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 6.57(br s, 1H), 6.50(br s, 1H), 5.44(br s, 1H), 5.26(br s, 2H), 4.23(br s, 1H), 4.07-3.93(m, 2H), 3.73(s, 3H), 3.24(d, J = 5.0 Hz, 4H), 2.71(t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.81(br s, 3H), 1.65(br s, 3H), 1.59-1.46(m, 7H), 1.44-1.43(m, 27H), 1.40-1.39(m, 7H)。
Figure 2013137302
１０）中間体１２の合成
中間体１０（４４６ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、Ｐｄ/Ｃ（触媒量）を加え、水素雰囲気下、室温で０．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液をセライト濾過し、減圧下で溶媒留去後、白色泡状固体の中間体１２（３９２ｍｇ、９５％）を得、そのまま次の反応に用いた。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 6.97(br s, 1H), 5.60-5.49(m, 3H), 4.22(br s, 1H), 4.16-3.98(m, 3H), 3.73(s, 3H), 3.23(br s, 5H), 2.74(br s, 2H), 1.82(br s, 20H), 1.70-1.22(m, 7H), 1.44-1.43(m, 36H)。
Figure 2013137302
１１）中間体１３の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体８（４６９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、中間体２（３６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１７６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（２２０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、１３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を水にあけ、酢酸エチル（３×９０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（２×９０ｍＬ）、飽和食塩水（９０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝２：１→１：０）を行い、黄色固体の中間体１３（１６６ｍｇ、２１％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 6.45-6.37(m, 2H), 5.27(br s, 1H), 4.71(br s, 1H), 4.25(br s, 1H), 4.90(br s, 1H), 4.25(br s, 1H), 4.01(br s, 2H), 3.74(s, 3H), 3.25(br s, 3H), 3.12(br s, 2H), 1.80(br s, 3H), 1.69-1.64(m, 4H), 1.45(s, 36H)。
Figure 2013137302
１２）中間体１４の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１１（１４３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、中間体２（６９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（３７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、１４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（７０ｍＬ）、飽和食塩水（７０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール ＝ １９：１）を行い、白色固体の中間体１４（１１８ｍｇ、５６％）を得た。
Rf = 0.57 (CH2Cl2 : MeOH = 9 : 1); 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 5.47(br s, 1H), 4.24(br s, 1H), 4.00(br s, 2H), 3.31-3.17(m, 7H), 1.81(br s, 4H), 1.61-1.43(m, 14H), 1.43(d, J = 3.5 Hz, 45H)。
Figure 2013137302
１３）中間体１５の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１２（１８９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、中間体２（６９．３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（３６．８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４６．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の順に加え、氷冷し、２０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）を行い、白色固体の中間体１５（２３５ｍｇ、９２％）を得た。
Rf = 0.51 (CH2Cl2 : MeOH = 9 : 1); 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 7.14(s, 1H), 6.79(s, 1H), 6.58(s, 1H), 5.75(br s, 1H), 5.51(br s, 2H), 5.41(br s, 1H), 4.89(br s, 1H), 4.21(br s, 3H), 4.01(br s, 2H), 3.41(br s, 3H), 3.22(br s, 3H), 3.11(d, J = 6.0 Hz), 1.77-0.90(m, 35H), 1.43(t, J = 2.0 Hz, 36H), 1.42(s, 18H)。
Figure 2013137302
１４）中間体１６の合成
中間体１３（９０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：水＝３：１（５．５ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（２８ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を 飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、無色粘性の中間体１６（８３ｍｇ、９４％）を得、そのまま次の反応に用いた。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 5.45(br s, 2H), 4.84(br s, 1H), 4.23-3.84(m, 3H), 3.17(br s, 5H), 1.94-0.19(m, 14H), 1.80(br s, 2H), 1.43(s, 36H). FAB-MS m/e:804[M+H]+
Figure 2013137302
１５）中間体１７の合成
中間体１４（１８０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：水＝３：２（１ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（４３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を０．５規定塩酸水溶液（４０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（２×４０ｍＬ）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、白色固体の中間体１７（１６０ｍｇ、９２％）を得、そのまま次の反応に用いた。
Rf = 0.49 (CH2Cl2 : MeOH = 9 : 1); 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 5.39(br s, 2H), 4.05(br s, 2H), 3.10(d, J = 5.0 Hz, 2H), 1.80(br s, 5H), 1.56(br s, 7H), 1.44-1.24(m, 9H), 1.44(d, J = 4.0 Hz, 45H)。
Figure 2013137302
１６）中間体１８の合成
中間体１５（１９０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：水＝３：２（１８ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（８９ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、無色粘性の中間体１８（２１０ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得、そのまま次の反応に用いた。
Rf = 0.48 (CH2Cl2 : MeOH = 1 : 2); 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 5.61-5.50(m, 2H), 4.36-3.68(m, 6H), 3.48(d, J = 5.0 Hz, 2H), 3.09(br s, 6H), 2.26-0.86(m, 29H), 1.43(br s, 54H)。
Figure 2013137302
１７）中間体２０の合成
Ａｒ雰囲気下、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（NBD-Cl：１９）（９９．４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６９μＬ、０．５ｍｍｏｌ）、N−(tert−ブトキシカルボニル)−1，2−ジアミノエタン（８７μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、茶緑色油状の中間体２０（１７１ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.51(d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.70(br s, 1H), 6.17(d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.08(br s, 1H), 3.61(br s, 4H), 1.47(s, 9H)。
Figure 2013137302
１８）中間体２１の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２０（９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を４．０規定塩化水素１，４−ジオキサン溶液（２ｍＬ）に溶解し、遮光し、５．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（塩化メチレン：メタノール ＝ ２９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、赤褐色固体の中間体２１（６８ｍｇ、９４％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.56(d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.46(d, 1H, J = 9.0 Hz), 3.87(t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.34(br s, 2H)。
Figure 2013137302
１９）中間体２２（Kε1-Boc）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦに溶解し、氷冷下、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（５５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（６９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、中間体２１（７８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の順に加え、遮光し、室温に戻し２時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を０．５Ｍ 塩酸水溶液（４０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（２×４０ｍＬ）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：５）を行い、黄色固体の中間体２２（１１０ｍｇ、６７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 6.43(d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.90(br s, 1H), 3.66(br s, 2H), 3.55(br s, 2H), 2.97(t, J = 5.5 Hz, 2H), 1.63(br s, 1H), 3.66(br s, J = 2.0 Hz, 18H).
Figure 2013137302
２０）中間体２３（Kε3-Boc）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１６（７３．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦに溶解し、トリエチルアミン（２６μＬ、０．１８４ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１６．８ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（２１．１ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）、中間体２１（２３．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）の順に加え、遮光し、室温に戻し２０時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：メタノール ＝ ９：５：４：１）を行い、橙色泡状固体の中間体２３（７４．８ｍｇ、８１％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.51(d, 1H, J = 8.5 Hz), 8.12(br s, 1H), 7.66(br s, 1H), 6.65(br s, 1H), 6.44(br s, 1H), 6.21(d, 1H, J = 8.5 Hz), 5.60(br s, 1H), 5.48(br s, 2H), 4.75(br s, 1H), 4.00(br s, 2H), 3.67(br s, 3H), 3.26(br s, 1H), 1.82(br s, 3H), 1.43(s, 36H)。
Figure 2013137302
２１）中間体２４（Kε4-Boc）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１７（１１９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、中間体２１（３１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３３μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（２１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（２７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の順に加え、遮光し、室温に戻し８時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ １９：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール＝２９：１→９：１）を行い、橙色泡状固体の中間体２４（１１３．４ｍｇ、７９％）を得た。
Rf = 0.55 (CH2Cl2: MeOH = 9 : 1); 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.49(d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.13(br s, 1H), 6.90(br s, 1H), 6.49(br s, 1H), 6.19(d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.78(br s, 1H), 5.41(br s, 1H), 4.76(br s, 1H), 4.23-4.02(m, 1H), 3.67(br s, 3H), 3.48(br s, 3H), 3.10(br s, 3H), 1.79(q, J = 12.5 Hz, 45H), 1.71-1.17 (m, 32H), 1.41(br s, 2H) ; [α]D +14.4o (c = 1.0083, MeOH)。
Figure 2013137302
２２）中間体２５（Kε5-Boc）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１８（１６８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、中間体２１（３４．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３６μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（２４．５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（３０．７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の順に加え、遮光し、室温に戻し１７．５時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ １９：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール ＝ ２９：１→９：１）を行い、橙色泡状固体の中間体２５（７７．４ｍｇ、４１％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.49(d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.22(br s, 1H), 6.19(d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.81(br s, 1H), 4.05(br s, 5H), 3.68(br s, 4H), 3.49(br s, 4H), 3.10(br s, 6H), 1.83-1.11(m, 28H), 1.42(t, J = 5.0 Hz, 54H); [α]D +21.7o (c = 1.0108, MeOH)。
Figure 2013137302
２３）目的化合物２６（Kε1-NBD）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２２（８３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（２ｍＬ）に溶解し、遮光し、２時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、赤色固体の目的化合物２６（Kε１-NBD）（２５ｍｇ、４０％）を得た。
m.p. 151.4-153.9℃; 1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.55(d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.49(d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87(t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.68-3.58(m, 4H), 2.91(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.89-1.78(m, 2H), 1.71-1.61(m, 2H), 1.50-1.41(m, 2H); 13C-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 170.7, 146.5, 145.8, 145.3, 138.4, 123.3, 100.3, 54.3, 52.1, 40.3, 39.0, 32.0, 28.0, 23.0; Absmax/Emmax(PBS): 475 nm/539 nm; [α]23 D = +21.1 cm3 g-1 dm-1 (c = 1.0 g cm-3 in MeOH); Elemental Anal. calcd (%) for C14H23Cl2N7O4・1/2H2O・1/2CH3OH: C 38.76, H 5.83, N 21.82, found: C 38.46, H 5.50, N 21.59; MALDI-TOFMS m/z: 352 [M+H] +.
Figure 2013137302
２４）目的化合物２７（化合物Ａ）（Kε3-NBD）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２３（７１．５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（１ｍＬ）に溶解し、遮光し、５．５時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、橙色固体の目的化合物２７（化合物Ａ）（Kε3-NBD）（４６．３ｍｇ、８７％）を得た。
Mp 183.3-184.7℃; 1H-NMR(300 MHz,CD3OD)δ： 8.56(d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.51(d, 1H, J = 9.0 Hz), 3.94-3.77(m, 6H), 3.54-3.49(m, 2H), 3.24-3.10(m, 3H), 2.97(t, 2H, J = 7.75 Hz), 1.96-1.81(m, 5H), 1.76-1.68(m, 4H), 1.65-1.60(m, 2H), 1.55-1.38(m, 9H）。MALDI-TOF/MS; 608.319 [M+H]（化合物２７：C26H45N11O6= 607.36）
Figure 2013137302
２５）目的化合物２８（Kε4-NBD）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２４（１０２．８ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（２ｍＬ）に溶解し、遮光し、２時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、橙色固体の目的化合物２８（Kε4-NBD）（６６．２ｍｇ、８７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.56(d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.50(d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.87-3.78(m, 7H), 3.55-3.52(m, 1H), 3.21-3.10(m, 5H), 2.96(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.94-1.37(m, 26H); Absmax/Emmax(PBS): 476 nm/540 nm; Anal. calcd for C32H62Cl5N13O7・3H2O: C 39.53, H 7.05, N 18.73, found: C 39.57, H 6.82, N 18.58。
Figure 2013137302
２６）目的化合物２９（Kε5-NBD）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体２５（７６．４ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（２ｍＬ）に溶解し、遮光し、１時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、橙色固体の目的化合物２９（Kε5-NBD）（４１．４ｍｇ、７３％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.56(d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.51(d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.00-3.68 (m, 8H), 3.57-3.48(m, 1H), 3.34-3.07(m, 7H), 2.97(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.92-1.82(m, 8H), 1.79-1.68(m, 4H), 1.61(t, J = 6.5 Hz, 7H), 1.46(br s, 12H); Absmax/Emmax(PBS): 476 nm/539 nm; Anal. calcd for C38H69N15O8・4H2O・CH3OH: C 39.46, H 7.39, N 17.70, found: C 39.44, H 7.00, N 17.55。
Figure 2013137302
２７）中間体３１の合成
無水メタノール（６０ｍＬ）に、活性化したモレキュラーシーブス４Ａと４−アミノ安息香酸エチル（３０）（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ）、酢酸（０．６３ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）、N−tert−ブトキシカルボニル−2−アミノアセトアルデヒド（１．９ｇ、１２ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下室温で２９時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン：塩化メチレン ＝ １：２：３）で反応終了を確認した後、シアノ水素化ほう素ナトリウム（０．６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン：塩化メチレン ＝ １：２：３）で反応終了を確認後、反応液に水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチルでセライト濾過し、濾液を２規定塩酸水溶液（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン：塩化メチレン ＝ １：５：４）を行い、白色固体の中間体３１（２．３８ｇ、７７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz,CDCl3)δ： 7.88(d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.56(d, 2H, J = 9.0 Hz), 4.81(s, 1H), 4.68(s, 1H), 4.32(q, 2H, J = 7.0 Hz), 3.40(t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.31(br s, 2H), 1.46(s, 9H), 1.36(t, 3H, J = 7.0 Hz)。
Figure 2013137302
２８）中間体３２の合成
中間体３１（８０６ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１，３２ｇ、５．２ｍｍｏｌ）、硫酸銀（１．７８ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１０ｍＬ）に溶解し、遮光、Ａｒ雰囲気下室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：３）で反応終了を確認した後、反応液に飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を過剰量加え、酢酸エチルでセライト濾過した。濾液を水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：７）を行い、白色固体の中間体３２（１．１４ｇ、７８％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.41(s, 2H), 4.84(br s, 1H), 4.35(q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.07(br s, 1H), 3.41(br s, 4H), 1.45(s, 9H), 1.38(t, 3H, J = 7.1 Hz)。
Figure 2013137302
２９）中間体３３の合成
中間体３２（５６２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加え、遮光、室温下１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：１）で反応終了を確認し、反応液を水（１０ｍＬ）にあけ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、黄色粘性の中間体３３（３６４ｍｇ、７９％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.41(s, 2H), 4.35(q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.40(br s, 2H), 3.04(br s, 2H), 2.05(br s, 2H), 1.38(t, 3H, J = 7.1 Hz)。
Figure 2013137302
３０）中間体３４の合成
中間体３２（５６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３．０ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（６２．９ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１３時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：３）で反応終了を確認し、反応液に０．１規定塩酸水溶液（２０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取し、水で洗浄し、白色固体の中間体３４（４９８ｍｇ、９４％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.38(s, 2H), 6.72(br s, 1H), 3.41(t, 2H, J = 6.0 Hz), 1.43(s, 9H)。
Figure 2013137302
３１）中間体３６の合成
グアニジン塩酸塩(３５)（１．４５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を無水１，４−ジオキサン（２５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、４．５規定水酸化ナトリウム水溶液（１２．５ｍＬ）を滴下した後、二炭酸ジ−tert−ブチル（７．２ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）を滴下し、２４時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：４）で反応終了を確認し、反応液 を水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（２×５０ｍＬ）、飽和食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン：塩化メチレン ＝ １：６：１）を行い、白色固体の中間体３６（１．９３ｇ、４９％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ： 10.45(br s, 1H), 8.48(br s, 2H), 1.40(s, 18H)。
Figure 2013137302
３２）中間体３７の合成
中間体３６（１．９３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．１ｍＬ、１４．８ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下、無水塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶かし、−７８℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．９ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下し、室温にて２０時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：４）で反応終了を確認し、反応液 を飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）にあけ、塩化メチレン（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：１０）を行い、白色固体の中間体３７（７８６ｍｇ、２７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ： 11.09(br s, 2H), 1.45(s, 18H)。
Figure 2013137302
３３）中間体３８の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体３７（３６４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、中間体３３（３１８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．４４ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：２）で反応終了を確認し、反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン：塩化メチレン ＝ ２：７５：５０）を行い、白色泡状固体の中間体３８（５２４ｍｇ、９４％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 11.49(s, 1H), 8.63(br s, 1H), 8.41(s, 2H), 4.34 (q, 2H, J = 7.25 Hz), 3.72(q, 2H, J = 5.75 Hz), 3,54(q, 2H, J = 5.75 Hz), 1.51(s, 9H), 1.49(s, 9H), 1.38(t, 3H, J = 7.25 Hz)。
Figure 2013137302
３４）中間体３９の合成
中間体３８（５１８ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６．０ｍＬ）、水（２.０ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（１１１ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で２３時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン ＝ １：２）で反応終了を確認し、反応液を０．１規定塩酸水溶液（２０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、白色泡状固体の中間体３９（５０３ｍｇ、ｑ．ｙ．）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 11.49(br s, 1H), 8.62(br s, 1H), 8.45(s, 2H), 3.72(q, 2H, J = 5.75 Hz), 3.60(t, 2H, J = 5.75 Hz), 1.51(s, 9H), 1.49(s, 9H）。 FAB-MS m/e:675[M+H]+
Figure 2013137302
３５）中間体４０の合成
Ａｒ雰囲気下、遮光し、化合物２７（化合物Ａ）（１７．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、中間体３９（７４．５ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２９μＬ、０．２０７ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（１８．３ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（２２．３ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）の順に加え、室温に戻し２７．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：塩化メチレン ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を水（２０ｍＬ）にあけ、塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を 飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）を行い、褐色粘性の中間体４０（１６．３ｍｇ、２２％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 11.50(s, 4H), 8.46(d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.26(s, 2H), 8.21(s, 4H), 8.15(s, 2H), 6.11(d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.53(br s, 3H), 3.99(br s, 3H), 3.67-3.63(m, 7H), 3.44(br s, 10H), 1.49(s, 80H)。
Figure 2013137302
３６）中間体４１の合成
Ａｒ雰囲気下、遮光し、化合物２７（化合物Ａ）（１３．０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）、中間体３４（５１．０ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２１μＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１３．５ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（１６．３ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）の順に加え、室温に戻し２０時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：メタノール ＝ ９：５：４：１）を行い、橙色泡状固体の中間体４１（７４．８ｍｇ、８１％）を得た。
1H-NMR(300 MHz,CD3OD)δ： 8.42(d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.42-8.20(m, 8H), 8.16(br s, 1H), 8.10(br s, 1H), 6.71(br s, 3H), 6.33(d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.43-4.35(m, 3H), 3.63(br s, 3H), 3.56-3.53(m, 3H), 1.78(br s, 6H), 1.43(s, 36H)。
Figure 2013137302
３７）目的化合物４２（化合物Ｂ）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体４０（１５．７ｍｇ、４．１μｍｏｌ）を無水メタノール（０．５ｍＬ）、無水塩化メチレン（０．５ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン（１．０ｍＬ）に溶解し、遮光し、１１．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、橙色固体の目的化合物４２（化合物Ｂ）（４．２ｍｇ、４０％）を得た。
Mp 189.4-191.5℃; 1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.53-8.47(m, 6H), 8.36-8.31(m, 7H), 8.25-8.13(m, 10H), 6.33(d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.36(br s, 3H), 3.66-3.62(m, 4H), 3.48-3.40(m, 25H), 1.85-1.76(m, 9H), 1.65-1.43(m, 21H)； MALDI-TOF/MS m/e:2431.913[M+H]（化合物４２: C66H85I8N27O10=2430.93）
Figure 2013137302
３８）化合物４３（化合物Ｃ）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体４１（３．９ｍｇ、１．５μｍｏｌ）を無水メタノール（０．５ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（０．５ｍＬ）に溶解し、遮光し、１０．５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（塩化メチレン：メタノール ＝ １９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、橙色固体の化合物４３（化合物Ｃ）（２．５ｍｇ、６９％）を得た。
Mp 192.9-195.7℃; 1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.43-8.23(m, 9H), 6.33(d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.38(br s, 4H), 3.66(br s, 7H), 1.79(br s, 8H), 1.49(br s, 18H)；MALDI-TOF/MS; 2301.939 [M+HCl+H]（化合物４３: C62H77I8N19O10= 2262.85）
Figure 2013137302
３９）中間体４５の合成
Ａｒ雰囲気下、２，３，５一トリヨード安息香酸（４４）（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、N−(tert−ブトキシカルボニル) −１，２−ジアミノエタン（３２μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、氷冷し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（３７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、１−(３−ジメチルアミノプロピル) −３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の順に加え、室温で１３，５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ＝ １：１）で反応終了を確認し、反応液を水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、ｎ−ヘキサン/酢酸エチルで再結晶を行い、白色固体の中間体４５（１０６ｍｇ、８２％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.22(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.53(d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.50(br s, 1H), 4.91(br s, 1H), 3.53(q, J = 5.4 Hz, 2H), 3.40(br s, 2H), 1.44(s, 9H).
Figure 2013137302
４０）中間体４６の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体４５（４１５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１０ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（６ｍＬ）に溶解し、２時間撹拌した。ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル ＝ １：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、白色固体の中間体４６（３２６．２ｍｇ、８７％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.34(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.71(d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.60(t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 6.5 Hz, 2H); MALDI-TOFMS m/z: 543 [M+H]+.
Figure 2013137302
４１）中間体４７の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体１８（２８９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、中間体４６（１３３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（４３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の順に加え、室温に戻し２時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を水（７０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出し、有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン：メタノール ＝ １９：１）を行い、白色固体の中間体４７（１５８ｍｇ、３９％）を得た。
1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ： 8.30(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.63(d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.94(br s, 5H), 3.44(br s, 3H), 3.20-3.07(m, 10H), 3.02(d, J = 6.5 Hz, 2H), 1.71(br s, 5H), 1.51(d, J = 6.5 Hz, 21H), 1.44-1.42 (m, 54H).
Figure 2013137302
４２）目的化合物４８（化合物Ｄ）（Kε5-TIB）の合成
Ａｒ雰囲気下、中間体４７（１００ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２ｍＬ）、４．０規定塩酸１，４−ジオキサン溶液（１ｍＬ）に溶解し、１時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール ＝ ９：１）で反応終了を確認し、反応液を風乾し、減圧下で溶媒留去後、メタノール/酢酸エチルで再結晶を行い、白色固体の目的化合物４８（化合物Ｄ）（７４ｍｇ、９５％）を得た。
m.p. 208.0-209.5℃; 1H-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 8.32(d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.66(d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.96-3.85(m, 5H), 3.59-3.47(m, 1H), 3.24(br s, 6H), 2.97(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.87(br s, 10H), 1.74(br s, 2H), 1.60(d, J = 6.5 Hz, 9H), 1.48(br s, 11H); 13C-NMR(300 MHz, CD3OD)δ： 171.5, 170.6, 170.2, 170.1, 148.7, 147.9, 136.3, 113.2, 107.7, 97.2, 95.0, 61.6, 54.5, 54.3, 50.0, 40.4, 40.1, 32.3, 32.2, 29.8, 28.0, 23,4, 23.1, 20.9, 14.5.; [α]21 D =+19.9 cm3 g-1 dm-1 (c = 1.0 g cm-3 in MeOH); Elemental Anal. calcd (%) for C39H75Cl6I3N12O6・3/2H2O: C 32.79, H 5.50, N 11.77, found: C 33.01, H 5.52, N 11.41; MALDI-TOFMS m/z: 1183 [M+H]+.
Figure 2013137302
［正常マウス大腿骨遠位端の軟骨組織可視化用試薬溶液への浸漬及びex vivo検出］
正常なC57B6/J系マウス（８週齢、雌）２匹を用意し、エーテルにて深麻酔殺後大腿骨遠位端を得、これをリジンオリゴマー誘導体の０．１ｍＭ溶液１００μＬに室温１時間浸漬した。１時間後、緩衝生理食塩水にて２回洗浄した。これを４％ＣＭＣコンパウンド内に包埋し、液体窒素とヘキサンで凍結して、硬組織切片用のタングステンカーバイド製ブレードＴＣ−６５（Leica製）とCryofilm (Leica製)を用いて、脱灰せずにクライオスタットで７μｍの厚さに薄切した。切片を室温に１０秒置いて解凍し、１００％エタノールに約３０秒間浸漬し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）内にしばらく保存した後、水道水で洗浄し、蛍光顕微鏡撮影を行った。蛍光フィルターとしては、ＧＦＰフィルターを用いた。リジンペプチドは蛍光剤ＮＢＤで標識されているので、そのシグナルが検出された。
リジンオリゴマー誘導体として以下のＡ〜Ｃの３種類を用いたときの軟骨の染色像を図１に示す。このときのリジンオリゴマー誘導体溶液の溶媒は２５％のエタノールを含有する生理食塩水であった。図１は、大腿骨遠位端膝関節の矢状断面の関節軟骨部分の拡大写真である。破線は軟骨と石灰化軟骨層との境界面であるタイドマークを示す。蛍光シグナル（カラー写真では緑色）は、軟骨層の表層からタイドマークまで認められ、リジンオリゴマー誘導体は石灰化軟骨層には結合していないことがわかる。化合物Ａ及びＢには軟骨組織の染色が認められるが、化合物Ｃではその染色が表面組織に限定されることが分かる。
Ａ：化合物２７
Ｂ：化合物４２
Ｃ：化合物４３
また、リジンオリゴマー誘導体として、以下の４種類を用いたときの軟骨の染色像を図２に示す。このときのリジンオリゴマー誘導体溶液の溶媒は生理食塩水であった。図２は、大腿骨遠位端膝関節の矢状断面の関節軟骨部分の拡大写真である。蛍光シグナルは、軟骨層の表層からタイドマークまで認められ、リジンオリゴマー誘導体は石灰化軟骨層には浸入していないことがわかる。化合物２６〜２９のいずれにも軟骨組織の染色が認められた。しかしながら、リジン単位を１個しか含まない化合物２６の染色はわずかであった。一方、リジン単位を３個含む化合物２７は、十分に染色されることがわかり、リジン単位を４個又は５個含む化合物２８及び２９は、さらに濃く染色されることがわかった。軟骨層における白色（カラー写真では緑色）部分が化合物による染色部位である。また、円形白色部（カラー写真では青色）の一部は、ヘキストによる核染部位で、石灰化層にも見られる。
Ｋε１−ＮＢＤ：化合物２６
Ｋε３−ＮＢＤ：化合物２７
Ｋε４−ＮＢＤ：化合物２８
Ｋε５−ＮＢＤ：化合物２９
［豚膝関節軟骨のＸ線造影用試薬溶液への浸漬及びＸ線ＣＴ撮像評価］
農協にて購入した豚膝関節軟骨片を、カミソリを用いて、約１．０×０．５×０．２ｃｍの大きさにカットした。この軟骨片を化合物Ｄ（化合物４８：Ｋε５−ＴＩＢ）の２００ｍＭのリン酸緩衝液およびリン酸緩衝液のみに３０分間浸漬した。３０分後、いずれの軟骨片もリン酸緩衝液ですすぎ、洗浄した後、キムワイプで余分な水分を拭き取った。いずれの軟骨片サンプルもマイクロＣＴ分析システム（ＳｋｙＳｃａｎ １１７４，ＳｋｙＳｃａｎ，Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、１０．７μｍ等方ボクセルにて、撮像、画像再構築を行った。その電子データを容積測定再構築ソフトウェア（ＮＲｅｃｏｎ，ＣＴＡｎ，ＣＴｖｏｌ・ＣＴＶｏｘ，ＳｋｙＳｃａｎ）を用いてさらに精査し、ＣＴ撮像画像を得た。
得られたＸ線ＣＴ画像を図３に示す。図３中、「Ｋε５−ＴＩＢ」が化合物４８を含む水溶液に浸漬した試料であり、「ＰＢＳ」がリン酸緩衝液のみに浸漬した試料である。それぞれ２個ずつあるのは、向きを変えて撮影したものである。写真中、軟骨撮像画像の網目状部分は石灰化層であり、その上部に軟骨層が位置している。ＰＢＳのみのものは軟骨層が写っていないのに対し、化合物Ｄ溶液に浸漬したものは軟骨層が白く撮像された。濃淡も十分に観察されるので、軟骨層の厚さだけではなく、その中に含まれるコンドロイチン硫酸の濃度などについても知見を得ることができる。

Claims (8)

  1. リジンのε−アミノ基とカルボキシル基とがペプチド結合で連結されてなり、Ｃ末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基及び／又はα−アミノ基に、電磁波を発生又は吸収し得る基が結合されてなることを特徴とする、リジンオリゴマー誘導体。
  2. ３〜１２個のリジンが連結されてなる請求項１に記載のリジンオリゴマー誘導体。
  3. 前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、蛍光団又はＸ線造影用の基である請求項１又は２に記載のリジンオリゴマー誘導体。
  4. 前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、ヨウ素原子を含むＸ線造影用の基である請求項３に記載のリジンオリゴマー誘導体。
  5. 請求項１に記載のリジンオリゴマー誘導体からなる軟骨組織マーカー。
  6. ３〜１２個のリジンが連結されてなる請求項５に記載の軟骨組織マーカー。
  7. 前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、蛍光団又はＸ線造影用の基である請求項５又は６に記載の軟骨組織マーカー。
  8. 前記電磁波を発生又は吸収し得る基が、ヨウ素原子を含むＸ線造影用の基である請求項７に記載の軟骨組織マーカー。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101860117B1 (ko) 2013-12-13 2018-05-21 유겐가이샤 머큐리 에셋 매니지먼트 관절 연골 이미징 조성물
JP7545690B2 (ja) * 2019-07-02 2024-09-05 Ａｇｃ株式会社 ペプチド及びその製造方法
CN114845741A (zh) * 2019-12-04 2022-08-02 苏黎世大学 用于肾中血管和管状结构的3d离体成像的造影剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003335857A (ja) * 2002-05-22 2003-11-28 Chisso Corp ウレタン化ε−ポリリジン、化学修飾ウレタン化ε−ポリリジンおよび化学修飾ε−ポリリジン並びにこれらの製造方法。
JP2009023993A (ja) * 2007-06-19 2009-02-05 Okayama Univ 軟骨マーカー

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPM666894A0 (en) 1994-07-07 1994-07-28 University Of Melbourne, The Diagnostic methods and compositions
US5756066A (en) * 1995-06-07 1998-05-26 Schering Aktiengesellschaft Iodine-containing peptides
KR100721752B1 (ko) * 2000-01-24 2007-05-25 쿠라레 메디카루 가부시키가이샤 수팽윤성 고분자 겔 및 그 제조법
JP2003225093A (ja) 2001-11-30 2003-08-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 軟骨障害マーカー及びその利用
JP4311976B2 (ja) 2002-05-08 2009-08-12 クレストジャパン株式会社 軟骨組織の物性測定用の光励起音響波検出装置
JP2005055224A (ja) 2003-08-08 2005-03-03 Niigata Tlo:Kk 近赤外線水分計を利用した軟骨の含水量の測定装置及び測定方法
BE1015863A6 (nl) 2004-01-19 2005-10-04 Huybrechts Lucas Anticariogene proteinen & peptiden & sacchariden.
US20100278745A1 (en) 2006-12-21 2010-11-04 Norbert Lange Compounds for fluorescence imaging
EP2247314A4 (en) * 2008-02-01 2013-11-27 Univ Boston CATIONIC CONTRASTING AGENTS AND METHOD FOR THEIR USE
EP2277547A1 (de) * 2009-07-20 2011-01-26 Merck Patent GmbH Epsilon-Polylysin-Konjugate und deren Verwendung
GB201106742D0 (en) 2011-04-20 2011-06-01 Spheritech Ltd Cross-linked poly-e-lysine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003335857A (ja) * 2002-05-22 2003-11-28 Chisso Corp ウレタン化ε−ポリリジン、化学修飾ウレタン化ε−ポリリジンおよび化学修飾ε−ポリリジン並びにこれらの製造方法。
JP2009023993A (ja) * 2007-06-19 2009-02-05 Okayama Univ 軟骨マーカー

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
芳谷学, ET AL.: "関節軟骨に特異的に結合するＸ線造影化イメージングプローブの創出研究", 日本薬学会第１３２年会要旨集２, JPN6013024555, 5 March 2012 (2012-03-05), pages 271 - 30, ISSN: 0003436950 *

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