CN114845741A - 用于肾中血管和管状结构的3d离体成像的造影剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适于离体成像的造影剂，特别是血管结构和肾小管结构的造影剂，以及一种离体成像的方法。造影剂是包括单体M的聚合物。该单体包括具有2至6个单元的骨架，其中至少一个单元是–CH(R)–或–N(R)–。R是–E–H、–L–(NH₂)_m部分或式1部分，

其中E、L、R¹和R²如本说明书中所述定义。单体包括至少一个–I以允许通过X射线检测，和至少一个–NH₂以允许交联。此外，单体包括有助于水溶性的极性官能团。为了避免外渗和肾小球过滤，在组织、器官或整个动物的脉管系统被灌注之前，聚合物被预交联。灌注后，预交联的造影剂进一步交联，以永久保留在组织、器官或动物内。

Description

用于肾中血管和管状结构的3D离体成像的造影剂

技术领域

本发明涉及一种适于对例如是在小鼠全鼠和大脑中的血管结构以及例如是在肾脏中的血管和管状结构进行离体成像的造影剂。造影剂可通过使用X射线的成像方法，如X射线微型计算机断层扫描(微CT)，来检测。

背景技术

对如各种类型的癌症、心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化、脉管炎和炎症中的血管生理学、病理学和血管生成的定性和定量评估，需要精确的三维(3D)结构数据。三维(3D)成像提供形态测量参数，包括血管体积、连通性、数量、厚度分布、分离和各向异性程度。这些参数不仅可用于研究影响脉管系统的疾病，而且对于在临床前模型中正确评价促血管生成疗法和抗血管生成疗法也是至关重要的。2D成像技术仅提供这些测量中的一些，并且限于对子体积进行采样和外推到整个器官的尺度。

例如，肾脉管系统的结构成像可用于研究多种肾功能。例如，它用于评价局部缺血－再灌注中的毛细血管稀薄化、单侧输尿管梗阻和肾病的Alport模型、测量不同肾区中的血管体积、肝硬化的慢性胆管结扎模型中肾皮质血管体积的变化、测量允许氧分流的缠绕的动脉－静脉对的血管面积、以及分析血管分级结构和分叉。

有许多方法可用于研究血管结构，即组织学、连续切片、组织清理和对血管铸型的X射线微计算机断层扫描(微CT)。

在组织学中，在代表性数量的二维组织切片样品上评价结构，并统计外推至各个器官的总体积。这种方法不仅劳动密集，而且如果没有严格遵守正确的立体过程，则还存在各种潜在的陷阱。例如，参考陷阱是指如果参考体积确定不正确，例如不考虑石蜡包埋过程中的样品收缩，则评估特征的错误外推。或者，各向同性均匀随机采样可能导致对具有优先方向的特征的错误估计，例如内髓质中的高度平行的直肠血管。

另一方面，整个器官成像不仅提供整个器官的无偏各向同性采样，而且提供诸如血管的三维(3D)结构排列的非统计信息。这些数据还可以用于获得其他难以获得的信息，例如扩散距离图或连通性分析，并且可以用于计算化合物例如氧的传输和分布。这种建模依赖于血管、主要的氧供应者和主要的氧消耗者的精确的3D结构信息。在肾脏中，小管是主要的氧消耗者。

体内血管3D成像技术如磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和临床X射线计算机断层扫描(CT)不能提供足够使直径为约4至10μm的毛细血管可视化的空间分辨率。除了这些成像方法的技术限制之外，分辨率还受到呼吸和心动周期期间的运动的体内限制。因此，这些方法不适于在毛细血管尺度成像。

相反，体外高分辨率X射线成像不受麻醉耐受性或电离辐射剂量的限制。此外，可以在较小的视场提取器官并对其成像，导致锥形束μCT中的分辨率的相应增加。

然而，血液和软组织之间的密度差太小，以至于不能使用实验室源利用标准吸收造影剂来捕获。必须将以重原子元素为特征的不透射线的X射线造影剂注射到脉管系统中以提供必要的造影。

材料切片将组织学方法扩展到第三维，但是仍然存在各种样品制备伪影，特别是在脱水期间的收缩和在切片期间的切割伪影。这些伪影使部分的重新对准和虚拟重组复杂化，如果需要保存结构数据，则需要非刚性配准算法。

近年来，已经引入了大量的组织清除方法。这些允许在完整的、未切割的组织上通过经由多种方法例如折射率匹配或脂质去除减少光散射来进行光片显微术。然而，反向光散射降低了在深度处可实现的分辨率并导致光学畸变，并且清除过程通常引入20％长度的样品的膨胀或收缩。因此，用光片显微术进行的组织清除非常适合于肾脏表面处的大的、良好分离的特征，例如肾小球，但不适合于捕获肾脏深度中的密集毛细血管网。

与可见光相比，X射线以可忽略的吸收或折射穿透软组织，这允许X射线微计算机断层扫描(微CT)提供具有各向同性质量和分辨率的3D数据，而不管样本内的深度如何。器官在其天然湿润状态下可以完全完整地成像，防止在通过膨胀、收缩或切割固定之后的任何额外的样品变形。在锥束μCT中使用的几何放大允许连续可变的像素尺寸，并且允许在单个设备中在低分辨率动物尺度和高分辨率器官尺度上进行分级成像。整个小动物和器官可以在其天然水合状态下被整体成像，使通过样品制备伪影、脱水、重新排列伪影或光学畸变的样品畸变最小化。

表1现有肾血管成像方法及其限制

为了在血管中获得足够的吸收以用于造影，必须将X射线造影剂注射到脉管系统中。虽然这确保了仅测量功能性的、主动灌注的血管，但是填充造影剂是可靠的并且代表血管网络。标准临床血管造影对比剂如碘帕醇和碘海醇不适合于血管成像，因为它们是能够快速穿过血管壁的低分子量化合物，导致几分钟内血管腔和周围组织之间的对比度损失。此外，它们通过肾小球过滤而被清除，这是防止它们在患者体内积聚所必需的。然而，这降低了它们对肾成像的适用性，因为造影剂也被引入肾小管腔，阻止了血管和管状结构的清晰分离。

血池造影剂被设计用于以小时为尺度的更长循环时间，并且表面功能化的金属纳米颗粒的尺寸可避免肾小球过滤。然而，它们在离体环境中沉降、聚集和扩散出脉管系统的趋势使得它们不适合用于肾中的毛细血管成像(图9，也参见Kuo et al.2019)。

用于血管铸型的塑性树脂如Microfil(马萨诸塞州Carver的Flow Tech的Microfil)、PU4ii(瑞士苏黎世的vasQtec)和μAngiofil(瑞士Muri的Fumedia AG)是疏水性的，并且不扩散通过水合内皮细胞。它们在注射后聚合，因此永久地保留在脉管系统中。然而，由于它们的疏水性，脉管系统中存在的任何水基流体必须在注射期间物理移位。如果水没有完全除去，则水的夹杂物可导致可见的气泡，而不是完全充满的大容器(Ehling etal.2016和Vasquez et al.2011)。为了减少这个问题，通常增加流速并因此增加灌注压，这可能导致血管的过度膨胀。在肾脏中，增加的灌注压可能导致出血进入肾包膜，这可视为肾脏表面的形状变形。在灌注疏水性物质期间，在没有肾小球过滤的情况下，肾小管腔也可能由于缺乏肾小管反压而塌陷(Hlushchuk et al.2018)。除了那些潜在的伪影之外，现有X射线微CT仅能够捕获造影剂(而不是天然组织)，在该方法中造影剂仅存在于脉管系统中。与其它方法不同，其因此不能直接提供肾小管组织的结构数据。

因此，需要良好优化的注射技术、经由结扎的血管闭合以便将所有流动转向到感兴趣器官和高灌注压力以获得一致的灌注结果。虽然这些问题中的一些可归因于聚合性塑料树脂的高粘度，但它们是疏水性浇铸材料所共有的固有限制。即使是低粘度的气态二氧化碳也不能填充直径小于8μm的毛细血管。虽然塑性树脂可提供合理的血管填充，但需要广泛的实践以可靠地防止频繁的样品制备失败和不完全的血管填充。然而，可靠的血管填充对于病理过程的定量表征和血管表型的比较是绝对需要的，因为否则所得到的结构数据由样品制备假象支配并且不代表真实的血管结构。

因此，仍然需要一种成像规程，其提供无伪影和无失真的3D血管成像，并且特别是用于在整个肾脏中同时进行血管和管状3D成像。由于上述方法中只有X射线微CT能够无失真成像，解决了先前X射线造影剂的缺点。为此，发明人开发了一种新的碘基X射线造影剂，其特别用于体外X射线微CT。它是一种水溶性聚合物，其足够大以避免肾小球过滤，并且可以与戊二醛交联以永久保留在脉管系统中。它将亲水性造影剂的可靠、低阻力的填充与血管铸型树脂的永久保留相结合。这不仅允许在不泄漏造影剂的情况下提取器官，而且能够实现高分辨率离体成像或同一样品的多次扫描所需的更长扫描时间，例如分层成像或双能量微CT应用。

在此，发明人报告了使用这种新造影剂的肾脏特异性方案，其不仅提供血管3D成像，而且还提供管状成像。发明人还提供了一种图像处理和量化工作流，其不需要专门的图像处理专业知识，并且仅依赖可自由获得的Fiji/ImageJ软件平台。

基于上述现有技术，本发明的目的是提供通过使用水溶性、醛可固定的和长期稳定的造影剂对血管和管状结构进行离体成像的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。

发明内容

术语和定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、生物化学、组织学、放射学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。分子、遗传和生物化学方法使用标准技术(一般见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th Ed.,JohnWiley&Sons,Inc.)和化学方法。

本说明书上下文中的术语RAFT涉及可逆加成－断裂链转移(ReversibleAddition–Fragmentation chain Transfer，RAFT)。

在本说明书的上下文中，术语RAFT剂涉及在可逆加成－断裂链转移(RAFT)反应中的聚合引发剂。例如，2–(十二烷硫基硫代羰基硫基)–2–甲基丙酸(CAS 461642-78-4)是合适的RAFT剂。

在本发明的上下文中，血管结构的成像或血管的成像涉及填充有根据本发明的造影剂的血管的内部体积的可视化。为此，使用根据本发明的造影剂，特别是预交联聚合物，灌注脉管系统。在进一步交联后，使用X射线检测造影剂，特别是交联的聚合物。

肾小管结构的成像或肾小管的成像涉及包括根据本发明的造影剂的肾小管细胞的可视化。染色通过使用如上所述的造影剂灌注脉管系统来实现，并且可以通过使用X射线来检测。

发明说明

本发明旨在提供对器官的内部结构，特别是血管和肾小管结构进行离体成像的手段和方法。该目的通过如本发明第一至第四方面中所述的造影剂和如本发明第五方面中所述的成像方法来实现。

血管和肾小管结构的成像，例如小鼠肾脏的成像，分几个步骤进行。取决于实验步骤，造影剂可以作为聚合物、作为预交联聚合物或交联聚合物存在。该聚合物包括几种单体M。

本发明的第一方面涉及单体M或其盐。该单体包括具有2至6个单元B的骨架，其中

每个B独立于任何其它B，选自–CH₂–、–NH–、–C(＝O)–、–CH(R)–和–NR–，其中B可任选被C_1-4烷基，特别是被乙基或甲基，更特别是被甲基取代，且其中–CH(R)–和–NR–部分中的至少一个存在于骨架中，

R独立地选自–E–H、–L–(NH₂)_m和式1部分，

其中

E是包括一个或多个，特别是1至3个，独立地选自–C(＝O)–、–NH–C(＝O)–、–O–、–C_1-4烷基–部分，的部分，

L是包括一个或多个，特别是1至3个，独立地选自–C(＝O)–、–C(＝O)–NH–、–NH–C(＝O)–、–O–、–C_1-4烷基–部分，的连接基，

其中L可任选被–E–H取代，

R¹是–I，

R²是–E–H或–L–(NH₂)_m，

p独立地选自0、1、2或3，

q独立地选自0、1、2、3或4，特别是0、1或2，

其中，式1中的p和q的和≤5，

m独立地选自1或2，其中

单体中所有m的总和≥1，特别是≥2，和

单体中所有p的总和≥1，特别是总和是2或3，更特别是总和是3。

根据本发明第一方面的单体可以包括2至6个形成骨架的单元B。一些单元B可以起到间隔基的作用，例如–CH₂–、–NH–、–C(＝O)–，而其它单元B包括残基R(–CH(R)–和–NR–)。

残基R可以包括线性(–E–H、–L–(NH₂)_m)或环状支架成分(式1部分)，其包括官能团如–C(＝O)–、–C(＝O)–NH–、–NH–C(＝O)–、–O–，有助于造影剂的水溶性。水溶性造影剂允许可靠的、低电阻填充而不形成水夹杂物。与此相反，当使用疏水性造影剂如塑料树脂时，存在导致可见气泡的水夹杂的风险。为了降低这种风险，对于疏水性造影剂，通常增加流速并因此增加灌注压，这可能导致塑性树脂的出血、血管的扩张和周围组织的压缩。在肾脏中，这种压缩可能导致管状腔的塌陷。

根据本发明的高水溶性X射线造影剂固有地避免了与水夹杂和疏水性血管铸型树脂的高流阻有关的问题，以及纳米颗粒悬浮液的沉降和聚集问题。

为了允许通过X射线检测，至少一个残基R包括至少一个–I。因此，单体中所有p的总和≥1。单体中存在的取代基–I越多，图像的对比度越好。

在某些实施方案中，单体中所有p的总和是2或3。

在某些实施方案中，单体中所有p的总和是3。

高分子量造影剂，例如分子量高于65kDa，不能通过血管壁。本发明单体例如通过RAFT聚合形成聚合物。通常，聚合物的分子量大于30000Da。为了获得分子量大于65kDa的高分子量造影剂，将聚合物交联。为了允许交联，单体包括至少一种游离胺，即单体中所有m的总和≥1。

在某些实施方案中，单体中所有m的总和≥2。

在某些实施方案中，单体中所有m的总和在1和6之间。

在某些实施方案中，单体中所有m的总和在1和4之间。

在某些实施方案中，单体中所有m的总和在2和4之间。

在交联之前，游离胺可以通过形成盐，例如HCl加成盐(–NH₃ ⁺Cl^-)活化。

在某些实施方案中，每个B独立于任何其它B，选自–CH₂–、–NH–、–C(＝O)–和–CH(R)–。

单体的骨架可以是肽骨架或脂族骨架，例如丙烯酰胺衍生的骨架或甲基丙烯酰胺衍生的骨架。肽骨架可以通过标准蛋白质化学使用具有游离氨基的氨基酸如赖氨酸和用碘修饰的氨基酸如二碘酪氨酸获得。丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺衍生的骨架通过自由基聚合如可逆加成－断裂链转移(RAFT)获得。丙烯酰胺衍生的骨架的合成如方案1所示(参见下文“造影剂合成”部分中化合物3的合成)。

–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–、–CH₂–CH(R′)–是丙烯酰胺衍生骨架的例子。

–CH₂–C(CH₃)(R′)–CH₂–C(CH₃)(R″)–或–CH₂–C(CH₃)(R′)–是甲基丙烯酰胺衍生骨架的例子。

在某些实施方案中，骨架是

-肽骨架–C(＝O)–CH(R′)–NH–C(＝O)–CH(R″)–NH–或–C(＝O)–CH(R′)–NH–，或

-脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–、–CH₂–CH(R′)、–CH₂–C(CH₃)(R′)–CH₂–C(CH₃)(R″)–或–CH₂–C(CH₃)(R′)–，其中

R′和R″由选自如对于R所定义的部分组成，其中R′和R″彼此不同，特别是R′和R″之一是式1部分、另一是–E–H或–L–(NH₂)_m，更特别是R′是式1部分、R″是–E–H或–L–(NH₂)_m。

在一个骨架中，为R′选择的特定部分，例如赖氨酸，不同于为R″选择的特定部分，例如二碘酪氨酸。

在某些实施方案中，骨架是

-肽骨架–C(＝O)–CH(R′)–NH–C(＝O)–CH(R″)–NH–或–C(＝O)–CH(R′)–NH–，或

-脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–或–CH₂–CH(R′)–。

在某些实施方案中，骨架是

-肽骨架–C(＝O)–CH(R′)–NH–C(＝O)–CH(R″)–NH–或–C(＝O)–CH(R′)–NH–，或

-脂族骨架–CH₂–CH(R′)–。

在某些实施方案中，骨架是脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–、–CH₂–CH(R′)–、–CH₂–C(CH₃)(R′)–CH₂–C(CH₃)(R″)–或–CH₂–C(CH₃)(R′)，其中R′和R″如上定义。

在某些实施方案中，骨架是脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–或–CH₂–CH(R′)–，特别是–CH₂–CH(R′)–，其中R′和R″如上定义。

为了提高单体的水溶性，其可包括亲水部分如–OH和–COOH。

在某些实施方案中，–E–H独立选自–OH、–C_1-4烷基–OH、–C(＝O)–OH、–C_1-4烷基–C(＝O)–OH、–OC_1-4烷基和–C_1-4烷基–OC_1-4烷基。

在某些实施方案中，–E–H独立地选自–OH和–C(＝O)–OH。

在某些实施方案中，R独立地选自–L–(NH₂)_m和式1部分。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C_1-4烷基–NH₂、–C_1-4烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH–C_1-4烷基–NH₂、–NH–C(＝O)–C_1-4烷基–NH₂和–O–C_1-4烷基–NH₂。

为了提高水溶性，烷基部分是短的。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C_1-2烷基–NH₂、–C_1-2烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH–C_1-2烷基–NH₂、–NH–C(＝O)–C_1-2烷基–NH₂和–O–C_1-2烷基–NH₂。

在某些实施方式中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C(＝O)–NH₂或–C_1-4烷基–NH₂。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m是–C(＝O)–NH₂。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m是–C_1-4烷基–NH₂。例如，–L–(NH₂)_m是–C₄烷基–NH₂，例如赖氨酸，的侧链。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C_1-4烷基–NH₂、–C_1-4烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH–C_1-4烷基–NH₂、–NH–C(＝O)–C_1-4烷基–NH₂和–OC_1-4烷基–NH₂。

为了提高水溶性，烷基部分是短的。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C_1-2烷基–NH₂、–C_1-2烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH–C_1-2烷基–NH₂、–NH–C(＝O)–C_1-2烷基–NH₂和–OC_1-2烷基–NH₂。

在某些实施方案中，在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立选自–C(＝O)–NH–C_1-2烷基–NH₂。

在骨架是肽骨架–C(＝O)–CH(R′)–NH–C(＝O)–CH(R″)–NH–的情况下，R′和R″的一个部分可以是式1部分，并且R′和R″的另一个部分可以是–L–NH₂。在某些实施方案中，R′和R″部分的一个，特别是R′，是式1部分，其中p是2或3、特别是2，q是1或2、特别是1，R²是–E–H，特别是R²是–OH、–C_1-4烷基–OH、–COOH，更特别是–OH。在某些实施方案中，R′和R″部分的一个，特别是R″，是–L–NH₂，且L是C_1-4烷基，特别是C_3-4烷基。在某些实施方案中，R′和R″部分的一个，特别是R′，是式1部分，其中p是2或3、特别是2，q是1或2、特别是1，R²是–E–H，特别是R²是–OH、–C_1-4烷基–OH、–COOH，更特别是–OH，而R′和R″部分的另一个，特别是R″，是–L–NH₂，其中L是C_1-4烷基，特别是C_3-4烷基。

在骨架是脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–的情况下，R′和R″部分的一个，特别是R′，选自式1部分，其中p是2或3、特别是3，q是1或2、特别是2，R²是–E–H，其中E是–C(＝O)–O–或C_1-4烷基–COO–，特别是–COO–。在某些实施方案中，R′和R″部分的一个，特别是R″，是–L–(NH₂)，其中L是–C(＝O)–或–C_1-4烷基–，特别是–C(＝O)–。在某些实施方案中，R′和R″部分的一个，特别是R″，选自式1部分，其中p是2或3、特别是3，q是1或2、特别是2，R²是–E–H，其中E是–C(＝O)–O–或C_1-4烷基–COO–，特别是–COO–，而R′和R″部分的另一个，特别是R″，是–L–(NH₂)，其中L是–C(＝O)–或–C_1-4烷基–，特别是–C(＝O)–。

在骨架是脂族骨架–CH₂–CH(R′)–的情况下，R′选自式1部分，其中p是2或3、特别是3，q是1或2、特别是2，R²是–L–(NH₂)，其中L是–C(＝O)–NH–C_1-4烷基–。

本发明的第二方面涉及聚合物P。该聚合物P包括根据本发明第一方面的单体M。

聚合物P可以通过自由基聚合如可逆加成－断裂链转移(参见“造影剂合成”部分和方案1中所示的反应)或通过肽合成获得。

聚合物长度通常在70和600个单体之间变化。

在某些实施方案中，聚合物P包括70至600个本发明第一方面的单体。

在某些实施方案中，聚合物P包括100至300个本发明第一方面的单体。

在某些实施方案中，聚合物P包括100至200个本发明第一方面的单体。

在某些实施方案中，聚合物P包括120至170个本发明第一方面的单体。

在某些实施方案中，聚合物P包括平均150个根据本发明第一方面的单体。

在某些实施方案中，聚合物P包括150个根据本发明第一方面的单体。

聚合物P可以通过肽合成或自由基聚合如可逆加成－断裂链转移(RAFT)获得。因此，聚合物的起点和终点或者由衍生自自由基引发剂/RAFT试剂的部分形成，或者它们分别是N末端和C末端，即–NH₂和–COOH。N末端和C末端可以进一步修饰，例如C末端可以是酰胺–CONH₂。

RAFT反应由自由基源启动。例如，自由基引发剂AIBN(2,2′–偶氮双(2–甲基丙腈)，2–(偶氮(1–氰基–1–甲基乙基))–2–甲基丙腈)可分解形成第一自由基RI·。随后，自由基片段可与n种包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺部分的单体离析物(例如“造影剂合成”部分方案1中的化合物2、式5的中间体M′)反应，形成传播自由基RI–[M]_n·(引发和传播)。

在RAFT试剂(也称为链转移剂，CTA)存在下，传播自由基RI–[M]_n·与RAFT试剂反应形成RAFT加成自由基RI–[M]_n–RAFT·。该反应是可逆的，即RAFT加成自由基可再次形成传播自由基和RAFT试剂。或者，RAFT加成自由基RI–[M]_n–RAFT可以释放新的自由基FT并形成休眠链RI–[M]_n–RA。这些反应被称为RAFT预平衡。

新的自由基FT·可以产生新的增长自由基FT–[M]_n·(再引发)。

在主要的RAFT平衡反应中，休眠链，例如RI–[M]_n–RA，可以与新的增长自由基以可逆反应进行反应，形成中间自由基RI–[M]_n–RA·–[M]_n–FT。该中间体自由基可以释放传播自由基RI–[M]_n或FT–[M]_n，并分别形成休眠链RA–[M]_n–FT和RI–[M]_n–RA。可以形成的其它中间体自由基包括RI–[M]_n–RA–[M]_n–RI和FT–[M]_n–RA–[M]_n–FT。取决于RAFT试剂、单体离析物、增长自由基和休眠链的可用性，休眠种和增长自由基之间将形成平衡。

RAFT反应的产物包括聚合物RI–[M]_n–RA、FT–[M]_n–RA、RI–[M]_n–RI和FT–[M]_n–FT。

含硫RA加合物可以在聚合后从聚合物链上裂解。这些聚合物提供比包含RA加合物的实施方案更低的自身荧光，因此更适合荧光显微镜成像。

在某些实施方案中，聚合物是式2、式2a或式3的化合物，特别是式2和式2a的化合物，更特别是式2的化合物，

X–[M]_n–Y(2)，Z–[M]_n–R^S(2a)，R^N–[M]_n–R^C(3)，其中

X和Y彼此独立地选自RA、FT和RI，

Z选自FT和RI，其中

RI是衍生自自由基引发剂，特别是衍生自选自过氧化物、过酸酯或偶氮引发剂的自由基引发剂，更特别是衍生自AIBN、1,1′–偶氮双(环己烷甲腈)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊酸)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊烷–1–醇)、2,2′–偶氮双(异丁酸甲酯)、2,2′–偶氮双(2–氰基–2–丁烷)、2–(叔丁基偶氮)–2–氰基丙烷、2,2′–偶氮双(N,N′–二亚甲基异丁胺)、2,2′–偶氮双[2–甲基–(N)–(1,1)–双(羟甲基)–2–羟乙基]丙酰胺、2,2′–偶氮双[2–甲基–N–羟乙基)]丙酰胺、2,2′–偶氮双(2,2,4–三甲基戊烷)、2,2′–偶氮双(2–甲基丙烷)、过氧化异丁酸叔丁酯、过氧化二苯甲酰、过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化二叔丁基、次亚硝酸二叔丁酯、亚硝酸二枯酯，的部分，

RA是没有均裂离去基团的RAFT(可逆加成－断裂链转移)试剂，

M是根据权利要求1的单体或其盐，

n是70至600，特别是100至300，更特别是120至170，

FT是RAFT试剂的均裂离去基团或被–E–H或–L–(NH₂)_m修饰的RAFT试剂的均裂离去基团，其中–E–H和–L–(NH₂)_m如上定义，

R^S是H或OH，

R^N是–NH₂，

R^C是–COOH或–CONH₂。

在某些实施方案中，聚合物是式2或式3的化合物，特别是式2的化合物，X–[M]_n–Y(2)，RN–[M]_n–RC(3)，其中

X和Y彼此独立地选自RA、FT和RI，其中

RI是由自由基引发剂衍生的部分，

RA是没有均裂离去基团的RAFT(可逆加成－断裂链转移)试剂，

M是根据权利要求1的单体或其盐，

n是70至600，特别是100至300，更特别是100至200，甚至更特别是120至170，

FT是RAFT试剂的均裂离去基团或被–E–H或–L–(NH₂)_m修饰的RAFT试剂的均裂离去基团，其中–E–H和–L–(NH₂)_m如上定义，

RN是–NH₂，

RC是–COOH或–CONH₂。

在某些实施方案中，式2化合物选自RI–[M]_n–RA、FT–[M]_n–RA、RI–[M]_n–RI和FT–[M]_n–FT。

在某些实施方案中，聚合物是式2a的化合物，选自RI–[M]_n–R^S或FT–[M]_n–R^S，其中R^S是H或OH。

在某些实施方案中，RI是衍生自选自过氧化物、过酸酯、偶氮引发剂的自由基引发剂的部分。

在某些实施方案中，RI是衍生自自由基引发剂，特别是衍生自选自过氧化物、过酸酯或偶氮引发剂的自由基引发剂，更特别是衍生自AIBN、1,1′–偶氮双(环己烷甲腈)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊酸)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊烷–1–醇)、2,2′–偶氮双(异丁酸甲酯)、2,2′–偶氮双(2–氰基–2–丁烷)、2–(叔丁基偶氮)–2–氰基丙烷、2,2′–偶氮双(N,N′–二亚甲基异丁胺)、2,2′–偶氮双[2–甲基–(N)–(1,1)–双(羟甲基)–2–羟乙基]丙酰胺、2,2′–偶氮双[2–甲基–N–羟乙基)]丙酰胺、2,2′–偶氮双(2,2,4–三甲基戊烷)、2,2′–偶氮双(2–甲基丙烷)、过氧化异丁酸叔丁酯、过氧化二苯甲酰、过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化二叔丁基、次亚硝酸二叔丁酯、亚硝酸二枯酯，的部分。

在某些实施方案中，

RI是式5或式6的部分，

–O–SO₂–O^-T⁺(6)，其中

-R⁶选自–C_1-6烷基、–H，

R⁷选自–C_1-6烷基、–苯基、–C_1-6烷基–OH、–C_1-6烷基–COOH、–C(＝O)–O–C_1-4烷基、–C(＝O)–NH–R⁹，其中R⁹是–C_1-6烷基–(OH)_r，其中R是0、1、2或3，

R⁸是–C_1-6烷基、–H、–CN，或

R⁶和R⁷形成C_3-8环烷基，特别是C_5-6环烷基，且R⁸是–C_1-6烷基、–H、–CN，

-Q是–O–、–O–C(＝O)–或–C(＝O)–O–，其中s是0或1，

-T⁺是一价阳离子，特别是Na⁺，K⁺，NH₄ ⁺、H⁺，选自–C(CH₃)₂(CN)(衍生自AIBN)或–O–C(＝O)–苯基(衍生自过氧化二苯甲酰)，和/或

RA是–S–C(＝S)–Z，其中Z选自苯基和–S–C_6-20烷基，特别是苯基和–S–C_10-16烷基，更特别是–S–C_10-16烷基，和/或

FT是式4部分，

其中

R³选自–H和–C_1-4烷基，特别是–H和–C_1-2烷基，

R⁴选自–H、–C_1-4烷基、–C_1-4烷基–COOH、–C_1-4烷基–C(＝O)–R⁶，其中R⁶是–E–H或–L–(NH₂)_m，特别是–H、–C_1-2烷基、–C_1-2烷基–COOH、–C_1-2烷基–C(＝O)–R⁵，其中R⁵是–E–H或–L–(NH₂)_m，

R⁵选自–CN和–COOH，特别是R⁵是–COOH。

在某些实施方案中，RI选自–C(CH₃)₂(CN)(衍生自AIBN)或–O–C(＝O)–苯基(衍生自过氧化二苯甲酰)。

由于聚合物本身不足以大到避免肾小球过滤、进入间质空间和外渗，因此它可以是预交联的。用于交联的合适官能团是胺基，特别是没有空间位阻的伯胺。游离胺基允许与包括一个或多个醛部分的交联剂如戊二醛交联。通过调节戊二醛与胺的比例，例如1:20，获得分子量大于或等于65kDa的预交联聚合物。预交联聚合物仍然具有低粘度，但分子量足够大以避免外渗、进入间质间隙或肾小球过滤。预交联聚合物足够小以填充小容器如毛细血管。

在某些实施方案中，甲醛用于交联。甲醛的使用提供了在注射后低的自身荧光。另外，组织的抗原掩蔽的作用，导致将组织用于随后的免疫组织化学的有限能力，被降低。

本发明的第三方面涉及一种预交联聚合物。预交联聚合物包括两种或多种根据本发明第二方面的互连聚合物P。

在某些实施方案中，聚合物通过亚胺键互连，所述亚胺键通过聚合物的胺部分与二醛或三醛的反应形成，或者聚合物通过衍生自甲醛的亚甲基桥互连。

使用二醛或三醛进行交联，在聚合物的胺部分与二醛或三醛的醛部分之间形成亚胺键。

使用甲醛进行交联，甲醛与聚合物的氨基反应形成席夫碱(亚胺)。随后，亚胺与聚合物的亲核部分反应，在亚胺的N原子和亲核部分之间形成亚甲基桥(–CH₂–)。

在某些实施方案中，聚合物通过亚胺键互连，所述亚胺键通过聚合物的胺部分与二醛或三醛的反应形成。

在某些实施方案中，聚合物通过亚胺键互连，亚胺键通过聚合物的胺部分和H–C(＝O)–C_1-8烷基–C(＝O)–H或苯–1,3,5–三醛的反应形成，或者聚合物通过衍生自甲醛的亚甲基桥互连。

在某些实施方案中，聚合物通过亚胺键互连，亚胺键通过聚合物的胺部分与H–C(＝O)–C_1-8烷基–C(＝O)–H或苯–1,3,5–三醛的反应形成。

在某些实施方案中，聚合物通过亚胺键互连，亚胺键通过聚合物的胺部分与H–C(＝O)–C_3-8烷基–C(＝O)–H或苯–1,3,5–三醛，特别是H–C(＝O)–C_3-8烷基–C(＝O)–H的反应形成。

在某些实施方案中，预交联聚合物的分子量≥65kDa。

在某些实施方案中，预交联聚合物的分子量≥100kDa。

另一方面涉及交联聚合物。交联聚合物通过进一步交联预交联聚合物而获得。参考在此描述的实施例，特别是本发明的第一至第三方面的实施例。

本发明的第四方面涉及中间体M′。中间体M′是式5化合物，

D–CH(R)(5)，其中D是H₂C＝且R是式1部分，

如上所定义。

中间体(H₂C＝CH–R)的双键可以在自由基聚合反应如RAFT聚合中反应。

特别是关于式1的R1和R²，参考本发明第一方面的实施方案。

在某些实施方案中，中间体M′是化合物M1

中间体M′可以如以下方案1所述或根据方案2，特别是如方案1所述合成。

方案2：M1单体前体的合成。

5–氨基–2,4,6–三碘间苯二甲酸与丙烯酰氯反应。由于丙烯酰氯也与羧基反应，因此所期望产物的产率与根据方案1反应的产率相比是较低的。

当用预交联聚合物灌注整个动物或器官如小鼠肾时，预交联聚合物可以进一步与交联剂交联，所述交联剂包括一个或多个醛部分如戊二醛以永久保留在脉管系统内。血管内永久固定的造影剂产生在长时间段内保持造影的稳定样本。

根据本发明的高分辨率造影剂不仅允许对脉管系统成像，而且允许对肾的皮质和外髓质中的小管成像。避免了肾小球过滤、进入间质空间和外渗(见图11)。

本发明的第五方面涉及一种用于离体成像的方法，特别是血管成像，更特别是血管和肾小管成像。该方法包括以下步骤：

-提供包括根据权利要求12的预交联聚合物的造影剂溶液，和包括交联剂，特别是选自甲醛、二醛或三醛的交联剂的交联溶液，

-使用造影剂溶液灌注血管，特别是灌注组织、器官或整个动物的脉管系统，

-加入所述交联溶液以产生交联聚合物，

-使用X射线检测所述交联聚合物。

在某些实施方案中，肾或脑的脉管系统被灌注。

在某些实施方案中，肾的脉管系统被灌注。通过灌注肾的脉管系统，不仅内部体积可以被填充造影剂，并因此被检测。而且肾小管细胞也被造影剂染色。

在某些实施方案中，所述交联剂选自二醛或三醛。

在某些实施方案中，所述二醛选自H–C(＝O)–C_1-8烷基–C(＝O)–H，特别是H–C(＝O)–C_3-8烷基–C(＝O)–H，和/或三醛是苯–1,3,5–三醛。

在某些实施方案中，将组织、器官或整个动物浸入交联溶液中。

在某些实施方案中，所述方法包括图像处理和量化步骤。在使用X射线检测交联聚合物之后进行图像处理和量化。

附图说明

图1A：3.3μm体素尺寸数据集的单个切片显示大血管、毛细血管、管状腔和流体填充结构。B：相同切片的假彩色图像，近似组织切片的外观。比例尺：1mm。C、D：上排中方框区域的放大图，包含皮质、外髓质和内髓质部分。比例尺：0.5mm。

图2A：苏木精和伊红染色的组织学切片的概观。比例尺：1mm。B：肾皮质部分，包含肾小球和动静脉对。造影剂将与组织相同的紫色染色。比例尺：200μm。C：外髓质的内条纹，在中间包含一个填充嗜酸性粒细胞蛋白的结构，在血管束中填充有造影剂。D：内髓质，含有填充造影剂的直肠血管。

图3计算机绘制的X射线微CT数据集的图像，该数据集是用3.3μm像素尺寸采集的，仅在顶部段有管状腔(蓝色)，在底部段有脉管腔(红色)，而在中间两者都有。A：概览图像，包括放大倍率较高的右侧所示的正方形，指示感兴趣区域的来源。比例尺：1mm。B：皮质中的小管。C：髓质中的小管。D：髓质中的流体填充结构。E：髓质中的血管。F：皮质中的血管。

图4A：单个切片示出了肾脏内的每个体素到最近的血管的扩散距离。B：单个切片显示每个体素到肾乳头的最短路径的长度。比例尺：1mm。C：扩散距离的累积分布函数。D：到乳头的血管路径长度的累积分布函数。

图5化合物6，XlinCA，的合成途径，使用RAFT聚合。

图6用PU4ii(A)和XlinCA(B)灌注的小鼠头部的常规μCT图像。在PU4ii填充的小鼠中，眶上静脉(白色箭头)被部分填充至鼻前静脉和面部前静脉的分叉处，图中未显示。相反地，在XlinCA灌注的小鼠中，这些血管以及面部前静脉被完全填充。C：更高分辨率的XlinCA灌注的整个小鼠数据集的最大强度投影。体素尺寸：20μm，比例尺：1cm。D：在小肠(I)、肾(K)、肾上腺(AG)、肝和脑中显示的μCT数据集的虚拟切片清晰可见。比例尺：1cm。

图7用XlinCA灌注的脑半球脉管系统的3D示意图。A：外部视图。B：内部视图。C：图4A中由黑色正方形表示的区域的放大图。由白色箭头指示的血管直径：70μm。D：图4B的放大视图。由白色箭头指示的血管直径：15μm。

图8XlinCA(6)的洗脱图和分子量分布图

图9示出了用ExiTron Nano12000进行的血管铸型的代表性切片。比例尺：1mm。通过腹主动脉灌注肾，灌注10mL的PBS、100mL的4％PFA/1％GA的PBS溶液、15mL的PBs和400μLExiTron Nano12000的1.6mL PBS溶液。之后立即结扎肾动脉和静脉，切除肾并包埋在含1％GA的PBS的6％明胶中。然后在具有4.4μm体素尺寸的General Electric Nanotom上扫描肾。图9示出了外髓质中的良好的血管铸型。然而，在皮质和内髓质毛细血管中的几个区域中，填充不足。肾小球中的显著聚集表明作为病因的传入小动脉的阻塞。通过将ExiTron nano12000溶解在等渗摩尔甘露醇溶液中并将其挤压通过1.2μm孔灌注器过滤器来尝试减少聚集，没有除去所有的聚集体，并且产生了不足用于毛细血管成像的对比度。

图10A：10月龄雌性C57BL/6J小鼠的左肾。许多流体填充结构由绿色箭头指示。这些结构不能通过先前的血管铸型方案捕获，并且通过随后的组织学鉴定为嗜酸性粒细胞蛋白质填充的铸型。体素尺寸4.4μm。比例尺：1mm。B：同一小鼠右肾。C：独立的10月龄雌性C57BL/6J小鼠的左肾。流体填充结构由绿色箭头指示。左肾上腺的一部分未灌注，而其余的完全灌注(绿色圆圈)。该区域可能由肾动脉以外的血管提供，并且由于对腹主动脉和肠系膜上动脉进行结扎而没有灌注。体素尺寸4.4μm。比例尺：1mm。D：同一小鼠右肾。右肾上腺被充分灌注。

图11透射电子显微镜(TEM)图像证实滴注造影剂不会引起任何组织损伤。A：皮质。肾小球部分的非对比TEM图像。造影剂在肾小球膜毛细血管环(CL)的腔内作为粗糙的颗粒材料是可见的，并且在包曼氏空间中没有发现。毛细血管环由具有足细胞足突的基底膜勾勒出(箭头)。比例尺：10μm。B：皮质。包含精细颗粒造影剂的间质皮质毛细血管(Cap)的对比TEM图像。PCT——具有完整纤毛上皮细胞的近曲小管。C：髓质。包含具有可变电子密度的中等颗粒造影剂的间质皮质毛细血管(Cap)的对比TEM图像。具有完整的非纤毛线粒体丰富上皮细胞的小管。比例尺：10μm。

图12A：包含不适当灌注区域的HE染色组织切片的概览图像。像素尺寸：下采样8×至1.8μm。比例尺：1mm。B：来自X射线微CT数据集的类似切片。像素尺寸：4.4μm。比例尺：1mm。C：不适当灌注区域的放大视图。肾小球显示相当数量的红细胞，表明肾小球的初始冲洗不足作为塌陷的肾小管的原因。在组织学和X射线微CT数据集中，可见造影剂在一些肾小球中与红细胞在一起，这表明血管仍被填充，尽管通过剩余的红细胞而阻塞。像素尺寸：227nm。比例尺：100μm。

具体实施方式

实施例1：小鼠全肾的血管和小管体外联合成像

新的方案允许发明人在比用塑料树脂基材料可靠填充所需的压力更低的压力下用造影剂填充小鼠肾的脉管系统。即使在由于不完美的手术而以低流速灌注的肾中，也没有观察到水的夹杂物伪影或断开。发明人获得了具有3.3μm和4.4μm体素尺寸的微CT数据集，其具有足够的对比度以区分血管腔和管状腔(图1)。在血管腔和皮层管状组织内的保留是永久性的。在存储一个月后采集3.3μm体素尺寸数据集，而没有显著的对比度降低。

一个出乎意料的发现是，在所有小鼠中出现了几种流体填充的结构，尽管使用了具有非转基因背景的健康小鼠(图10)。这些用先前的血管铸型方法不会捕获到，其无法提供识别组织的直接手段。组织学检查将其鉴定为嗜酸性粒细胞蛋白填充的结构，可能是管状来源的。在苏木精和伊红染色的切片上没有发现组织损伤。细胞超微结构在透射电子显微图像中得到良好保存(图2或图11)。没有发现由于造影剂引起的细胞渗透膨胀或收缩的迹象。发现毛细血管膨胀，这可由固定期间150mmHg的灌注压来解释。虽然这远高于静息血压，但它代表身体活动期间血压的上限。发明人可以识别聚合造影剂水凝胶中的微观气泡，其在X射线微CT数据集中是不可见的，因为它们通常小于分辨率极限。因此，它们对最终数据没有显著的影响，并且比基于塑料－树脂的血管铸型中常见的气泡小得多。然而，如果计划更高分辨率的扫描，则在灌注之前应当对造影剂溶液进行大量脱气。发明人还评价了具有不完美灌注手术的肾，其中肾皮质的区域未填充造影剂。红细胞在不良灌注区域中的存在(图12)表明，缺乏填充是由在造影剂注射之前血管的不充分冲洗引起的，因此不是造影剂相关的问题。

发明人能够在半自动工作流程中利用Fiji/ImageJ作为二进制掩模从3.3μm体素大小的X射线微CT数据集中提取脉管和管状腔。发明人利用商业软件来可视化这些二进制掩模(图3)。它们进一步允许各种自动量化。例如，发明人通过计算掩模的体素数目来评估血管密度(用于量化毛细血管稀疏的度量(Ehling et al.2016)。分段血管腔的体积为65.6mm³，管状腔的体积为58.5mm³，组织的体积为42.6mm³，整个肾脏的体积为166.7mm³，结果血管密度为39％。

线探针相交可以用于体视学中以测量表面积。本发明人在13个方向上使用MorpholibJ来完全自动地进行这一操作。分段的血管和小管的表面积分别为8433mm²和8775mm²。该信息可以用于例如量化氧跨血管壁的扩散，其与表面积成比例(Ngo et al.,2014)。发明人确定低估了表面积，因为它们由于成像的有限分辨率，不包括肾小球内的表面积或血管束的全部面积。因此，所报告的数字表示了偏差的量值，其可能仍然可用于比较量化。

然后，发明人计算了每个体素到最近血管的3D欧几里得距离，其表示肾脏的给定位置到氧和营养物的最近源的最小扩散距离(Borgefors,1996)。这可以用于量化供应不足的组织的量(Prommer et al.2018)。发明人对没有血管的肾脏的整个空间评估了这些距离，从而创建了距离图(图4A)。然后，发明人通过考虑整个非血管空间或仅考虑肾组织，来评估肾内的距离分布。如果评估包含管状腔的整个空间，则所考虑的非血管空间的43％包含在邻近血管的第一相邻体素内。然而，如果排除管状腔并且仅考虑组织，则83％的组织被包含在第一体素内。该结果证明了当仅基于血管数据评估氧气或其它营养物的扩散距离时可能误解。

然后，发明人在血管段中的肾脏的乳头处手动选择标记点，并计算沿着血管的每个体素到该标记的最短路径的长度。在所得的伪彩色映射图(图4C)中，发明人可以识别4mm为血管离开内髓质并进入外髓质的路径距离的近似截止点。计算累积分布函数揭示了仅1.5％的血管体积包含在内髓质中。原则上，这种量化允许测量任意血管或小管的路径长度(Lantuejoul and Beucher,1981)。由于发明人的血管和管状掩模包含由有限分辨率引入的各种人工捷径，因此这里所示的路径长度超出内髓质是不可靠的。

方法

X射线造影剂的合成

将丙烯酰基加到5–氨基–2,4,6–三碘间苯二甲酸的胺中。通过可逆的加成－断裂链转移聚合(Chiefari et al.,1998；Lai et al.,2002)将所得化合物聚合至约20000g/mol的分子量。乙二胺与聚合物的羧酸基团偶联以添加游离胺基团，从而能够固定醛。为了增加聚合物的尺寸，用少量戊二醛进行预交联，并用100000MW膜进行透析。(也参见实施例2)

养鼠方法

雌性C57BL/6J小鼠购自Charles River Laboratories和Janvier Labs，并饲养至7个月大，随意接触水和标准啮齿动物食物(Kliba Nafag 3436)。

腹主动脉灌注

用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，用21G蝴蝶针经腹主动脉逆行灌注肾(Czogalla etal.,2016)，所述蝴蝶针经2.5m长的硅管与提供150mmHg静水压的储器连接。用大约10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗肾，并用100mL4％甲醛/1％戊二醛/PBS固定。用20mL PBS冲洗剩余的醛，并用50mL甘氨酸溶液(5mg/mL在PBS中)淬灭，然后再次用另外的40mL PBS冲洗。所有灌注的溶液保持在37℃。

用10mL注射器灌注4mL X射线造影剂溶液(75mg I/mL)，用恒重驱动以提供150mmHg压力。然后用4％戊二醛/PBS填充腹腔以交联造影剂，然后取出肾脏并保存在4％戊二醛/PBS中。将这些溶液保持在室温下。

将肾置于标准1.5mL Eppendorf管或0.5mL PCR管中的1％琼脂/PBS中，根据其大小进行扫描。

X射线微CT图像采集

X射线微CT图像是用装备有钨靶和金刚石窗的General Electric PhoenixNanotom m获得的。加速电压设定为60kV，电流设定为310μA。在每个高度步长，用GE DXR d检测器以3052×2400像素阵列和0.5秒曝光时间获得1440个投影。每个肾脏需要四个高度步骤。用4.4μm各向同性体素尺寸扫描固定在Eppendorf管中的肾。记录每个投影3帧并取平均值，得到每个肾脏约3小时的扫描时间。用3.3μm各向同性体素尺寸扫描固定在PCR管中的肾，平均每个投影12帧，得到10小时扫描时间。

用制造商的GE phoenix datos|x软件进行重建。

组织学检查

修整固定的肾(中线纵向或横截面)并包埋石蜡。连续切片(3–5μm)用苏木精–曙红(HE)染色，高碘酸席夫反应用于组织学检查，或脱蜡并保持未染色用于荧光评估。载玻片用带有数码相机的Nikon Eclipse Ni-U显微镜照相，并使用放大40倍的数字载玻片扫描仪(日本滨松NanoZooomer-XR C12000)扫描。

透射电子显微镜检查

修整固定肾切片(中线横截面)并包埋在环氧树脂中。制备甲苯胺蓝染色的半薄(1.5μm)切片以选择感兴趣的区域用于制备超薄(75nm)切片，用Philips CM10显微镜直接观察、用Gatan Orius Sc1000数码相机操作(Digital Micrograph的Gatan MicroscopicalSuite)、或者与柠檬酸铅和乙酸双氧铀对比并随后观察。

实施例分割和量化

发明人使用安装了MorphoLibJ(Legaland et al.2016)和3D ImageJ套件插件(Ollion et al.2013)的免费Fiji/ImageJ(Schindelin et al.2012；Schneider etal.2012)软件将3.3μm数据集分段。发明人将σ＝1的3D高斯滤波器应用于剪裁的数据集，并通过设置手动阈值提取血管。对于扫描的第一和随后的高度步长必须应用不同的阈值。然后，发明人通过首先设置另一个较低阈值，并且通过用MorpholbJ插件执行侵蚀和连接成分分析来去除肾脏外部的对比区域，来创建粗略的肾脏掩模(Legaland et al.2016)。然后将该掩模应用于血管段。

然后通过扩张、使用3D ImageJ套件插件进行3D孔填充(Ollion et al.2013)和随后的侵蚀，将血管段转化为更精细的肾脏掩模。该掩模与肾脏水背景的阈值结合以接收管状腔。在掩模内的任何既不是血管的一部分也不是管状腔的一部分的剩余体积被宣布为肾组织。

发明人使用MorpholibJ插件通过简单的体素计数和通过13个方向上的线探针的交叉的表面来量化脉管和管状体积。然后，发明人手动选择血管区段中的肾的乳头处的标记点，并使用相同插件计算测地距离图。欧几里得距离图和所有直方图使用默认Fiji/ImageJ函数来计算。

在配备有256GB RAM和两个Intel Xeon E5-2670处理器的工作站上执行图像处理。在配备有128GB RAM和Intel Xeon E5-2620v3处理器的工作站上用VGStudioMax2.1(Volume Graphics)绘制3D计算机图形图像。

实施例2：小鼠大脑半球和整个小鼠的血管成像

新型可交联聚合物造影剂的设计

XlinCA被设计成满足一组特定的标准，以解决在使用现有造影剂的离体血管成像中遇到的问题：

-高度水溶性，以避免血管填充不完全和血管区段中断。

-高分子量，以防止通过血管壁直接渗漏。

-可交联，以防止随时间的泄漏。

-高X射线衰减系数，以降低所需的造影剂浓度并降低粘度和渗透压。

以下化学式表示可交联的聚合X射线造影剂XlinkCA：

高水溶性X射线造影剂固有地避免了疏水性血管铸型树脂的与水夹杂及高流阻有关问题，以及纳米颗粒悬浮液的沉降和聚集问题。

高分子量血池造影剂不能通过血管壁，并且比标准血管造影剂在长得多的时间段内保持造影。因此，XlinCA被设计成提供分子量超过65kDa的聚合物，对应于血清白蛋白，血液中最丰富的蛋白质，的分子量。

可交联的造影剂通过将造影剂共价连接到其自身和组织上而避免了在甚至更长的时间尺度上的对比度损失。醛用于组织固定以交联蛋白质，因此与组织制备方案良好相容。XlinCA被设计成含有游离伯胺基团作为戊二醛固定的靶标，其能够通过亚胺形成而交联(Cheung et al.,1982和Migneault et al.,2004)。

通过包含重原子如碘、钡、钆、金或铅来增加电子密度，从而获得高的X射线衰减系数。选择碘是因为其成本低、合成易得且毒性低。造影剂中碘的含量越高，则为获得给定的对比噪声比所需的造影剂浓度越低。由于高分子量的聚合物造影剂可导致高粘度，降低所需的造影剂浓度对于保持最终的造影剂溶液易于灌注通过血管系统是至关重要的。

在考虑了所有上述标准之后，本发明人设计了可交联聚合物造影剂XlinCA，如图5中示意性表示。理论碘含量为49.5％，与标准小分子血管造影术碘造影剂相当，并且在增加分子量方面显著高于通过其它典型方法，例如与聚乙二醇(PEG)连接，所能达到的。

造影剂的合成

通过多步骤方法合成造影剂，参见方案1。由可商购的5–氨基–2,4,6–三碘间苯二甲酸1开始，通过与典型的酰化剂即丙烯酸酐在催化量的硫酸存在下反应来添加丙烯酰基。反应是直接的，以良好的产率得到丙烯酰胺2。在较便宜的丙烯酰氯试剂的帮助下合成化合物1的多次尝试是不成功的。

该合成中的关键步骤是通过可逆加成－断裂链转移(RAFT)聚合使2聚合得到聚合物3。与常规的自由基聚合相比，RAFT聚合使用链转移剂(RAFT试剂或CTA)，其可逆地终止链增长并可引发新链的生长。这导致活性自由基聚合，通过减少同时增长的链的数量而降低链终止的可能性，并且平衡不同链之间的生长。这些性能允许合成具有受控的高分子量和低多分散性的聚合物。

合适的RAFT剂的选择对于成功的聚合是至关重要的。对于大多数所有类型的通过自由基机理聚合的单体，存在各种各样的RAFT剂。由于所报道的与各种丙烯酰胺衍生物的相容性，选择三硫代碳酸酯8用于聚合2。

本发明人发现二甲基甲酰胺(DMF)是2的RAFT聚合的最合适的溶剂。它提供了起始材料和聚合产物的高溶解度，并允许单体的高转化度。二甲亚砜(DMSO)也提供良好的溶解性，但不允许2至3的良好转化。

最佳反应温度为70℃。降低该温度显著减慢反应，并且较高温度导致聚合物产率较低。

方案1：化合物6，XlinCA，的合成途径，使用RAFT聚合。

发明人的目的是获得分子量高于65000g/mol(血清白蛋白的分子量)的聚合物，以便防止其扩散通过血管壁。合成的聚合物的平均分子量随着单体与RAFT试剂的比率的增加而增加。发现单体：RAFT剂：自由基引发剂的最佳比例为400:2:1。将该比例提高进一步使反应极易受到搅拌或机械振动的影响，导致在反应完成之前更倾向于产物的沉淀和聚集。

在反应结束时测量质子核磁共振(NMR)谱，以计算聚合过程的转化率，结果为78％。其是通过2.54至2.60ppm的次甲基质子信号的积分与13.4至14.5ppm的羧基质子信号的积分的一半的比率来测定的。

用凝胶渗透色谱法(GPC)不能测量3的分子量，因为低溶解度，即使是在DMF中，以及聚合物聚集的倾向。然而，3的分子量和多分散性指数可以由最终产物6的GPC结果间接估计，最终产物6是水溶性的并且由于在聚合物的侧链中存在离子电荷而对聚集稳定。基于单体的分子量与6的平均分子量的比率(图8)，我们计算3的平均分子量是30400Da。

在用草酰氯活化羧基后，将乙二胺加入到聚合物3中。使用大大过量的乙二胺来防止酰基的交联。得到的5轻易地溶解在稀盐酸溶液中，得到造影剂XLinCA(6)，它是水溶性的，并且由于胺基的存在可以与醛交联。

造影剂的预交联

交联的能力不仅能够使XlinCA在注射入脉管系统后聚合，而且允许通过与戊二醛预交联合成任意大的造影剂分子(图5)。为了将分子量从30kDa增加到高于所需的65kDa阈值，在灌注到小鼠中之前，用不同量的25％戊二醛对XlinCA进行预交联。发现最佳量是每1g溶解在4mL水中的XlinCA加入30L的25％戊二醛溶液。该比例导致粘度的有限增加，这表明通过预交联，聚合物的分子量增加。较高量的戊二醛导致造影剂立即或在透析过程中胶凝。用100kDa透析膜透析预交联的造影剂，冻干并储存直至准备灌注到血管中。预交联后，造影剂应在冻干后一周内使用，因为它随时间推移缓慢变得不溶。这可能是由透析后残留的醛进一步交联引起的。

在将造影剂施用到脉管系统中之后，造影剂与戊二醛的进一步交联导致造影剂的凝胶化，防止任何泄漏和对比度随时间的损失(图5)。

小鼠血管系统整体成像

基于体素尺寸为80μm的低分辨率μCT扫描，比较用血管铸型树脂PU4ii和聚合造影剂XlinCA灌注的小鼠。在灌注PU4ii的小鼠中，在降主动脉、腔静脉和肾和肝中的较大血管中可观察到大量的水包含物和气泡。相应地，一个肝叶、肾上腺和部分的肾仅部分地填充有PU4ii。某些大血管，如鼻前静脉和前静脉，保持完全没有PU4ii(图6A)，而其在灌注XlinCA的小鼠中的对应部分被完全填充(图6B)。为了进一步评价血管填充的完成性，用20μm的体素尺寸扫描XlinCA灌注的小鼠。脑、心脏、肺、肝、肾和肾上腺看起来灌注良好，参见图6C和图6D。没有发现不连续的血管片段，如对于水溶性化合物所预期的。

XlinCA的血管填充不完全。肾后的小血管似乎没有被很好地限定。在肾和脾的肾髓质中缺少部分毛细血管。组织学检查中看到的剩余血液表明这是由于在造影剂注射之前血液的不完全冲洗所引起的，因此不是由于任何造影剂相关的性质。

脑脉管系统的成像

移除XlinCA灌注的小鼠的脑，并用4.4μm的体素尺寸扫描右脑半球，因为与全脑相比，较小的视野允许以大约两倍的分辨率进行扫描。没有如关于优化的Microfil灌注所报道的大面积的缺失脉管系统(Ghanavati et al.,2014)。由于填充不足或气泡而不能识别血管不连续，如同在整个小鼠中的结果一样。

与血管造影剂的选择无关，非优化的经心脏灌注技术不能完全胜过特定器官中的优化灌注技术。然而，同样，XLinCA通过简单的经心注射在整个小鼠中提供了更完全和可靠的多个器官的填充，而不需要夹持或结扎降主动脉和腔静脉。因此，该方法的实施简单得多，并且允许多个器官被采集并用于脉管系统的分析，减少了所需动物的数量，并且减少了多器官相关研究中的差异。诸如注射体积和流速的因素不必优化，因为交联可以在灌注完成后的任何时间开始。相反，Microfil在约20分钟内聚合(Ghanavati et al.,2014)，限制了在粘度增加之前的灌注体积，从而增加流动阻力。随着时间限制的去除，流速和灌注压力不再是需要优化的因素。在我们的实验中，灌注压力是150mmHg，其与Chugh et al.2009报道的经心脏灌注中使用的压力一致，但是可以使用较低的压力，而没有过早聚合和导致不完全填充的风险。

然而，在冲洗脉管系统的剩余血液所需的先前灌注步骤中，较高的灌注压力仍然是有利的。

方法

通用

除非另有说明，所有化学品都是试剂级的，并购自Sigma-Aldrich。所有溶剂均为分析级。透析管购自Sigma-Aldrich(纤维素，截留分子量12kDa)和购自Spectrum(纤维素酯，截留分子量100kDa)。¹H NMR和¹³C NMR光谱在Bruker 400MHz光谱仪上记录。用WatersAQUITY-Bruker UPLC-MS系统进行低分辨率质谱分析。分析凝胶渗透色谱法通过PSSPolymer(德国美因茨)的分析服务使用柱PSS-NovemaMax_F 5μm进行：

具有UV/VIS和差示折光计RID检测器。0.1M的NaCl/0.1体积％的TFA的水溶液用作洗脱液。基于普鲁兰多糖的标准校准计算样品的平均分子量和分子量分布。

丙烯酸酐的合成和表征与文献(Jian et al.2015)一致。下面描述了中间体和终产物XlinCA6的一般合成方法和表征。

养鼠方法

C57BL/6J小鼠购自Charles River Laboratories和Janvier Labs，并在12小时的光/暗循环中饲养在单独通风的笼中，随意接触水和标准啮齿动物食物(Kliba Nafag3436)。所有动物实验都得到苏黎世州兽医办公室的批准。

造影剂的预交联

将造影剂XlinCA(5g)溶解在水(20mL)中，然后加入150L戊二醛水溶液(25％)并充分混合。将混合物在室温下静置20分钟。然后，加入30mL水，溶液通过100kDa透析膜对NaCl溶液(5L，0.2％)透析，3小时、8小时和24小时后更换溶液；然后对去离子水透析6小时。

离心以除去所有不溶性颗粒，并冻干，得到4g固体预交联的造影剂。

用聚合造影剂灌注心肌全周

用氯胺酮/甲苯噻嗪对9月龄的小鼠实施安乐死。打开胸腔，将钝头21G蝶形针插入左心室，并将右心房切开作为出口。用约10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗掉血液，用100mL4％甲醛和1％戊二醛的PBS溶液固定小鼠。用50mL PBS冲洗醛，并用50mL含0.5％甘氨酸的PBS猝灭。最后用25mL PBS冲洗小鼠，并灌注通过1.2μm孔针筒式过滤器过滤的14mL造影剂溶液(在过滤前，2.7g预交联的上述造影剂在14mL H₂O中，100mg碘/mL)。为了封闭出口，将4％戊二醛的PBS溶液滴到心脏上以引发交联。随后将整个小鼠浸入500mL的4％戊二醛的PBS溶液中。

全心肌灌注血管铸模树脂PU4ii

如上所述将左心室插管，并用约10mL PBS冲洗血液，用100mL的4％甲醛的PBS溶液固定小鼠。使用3.7g的1,3–二碘苯(美国Sigma-Aldrich)、以及由10g的2–丁酮、10g的PU4ii树脂和1.6g的PU4ii硬化剂组成的血管铸塑树脂PU4ii(瑞士VasQtec)，的混合物，进行血管铸塑。PU4ii混合物的最终造影剂浓度为110mg碘/mL。

X射线μCT扫描

对于低分辨率比较扫描，使用QuantumFX体内μCT扫描仪(美国PerkinElmer)，在70kV的加速电压和200μA的管电流下，用80μm体素尺寸扫描灌注PU4ii和灌注XlinCA的小鼠的头部。使用具有设定为60kV加速电压和310μA管电流的水冷钨靶的X射线管，在Nanotom mμCT扫描仪(美国General Electric)上进行高分辨率扫描。使用闪烁体耦合平板检测器以0.5秒曝光时间获取每高度步长1440个投影。将小鼠从固定溶液中移出，使用聚氨酯泡沫体固定在塑料杯中，并用20μm体素尺寸扫描。切除脑，用刀片在中间切开，将右脑半球包埋在1.5mL离心管中的1％琼脂中，并用4.4μm体素尺寸扫描。

使用Arivis4D 2.12.4(德国Arivis)使整个小鼠可视化，使用VGStudio Max 2.1(德国Volume Graphics)使大脑半球可视化。

2,4,6–三碘–5–(丙–2–烯酰氨基)苯–1,3–二羧酸(2)的合成(参见方案1)

向5–氨基–2,4,6–三碘苯–1,3–二羧酸(1)(20g，35.8mmol)和浓硫酸(0.04mL)的乙腈(40mL)悬浮液中滴加丙烯酸酐(12mL，107mmol)，同时将反应混合物在冰浴中冷却。将反应混合物在80℃搅拌36小时，直到通过UPLC检测不到5–氨基–2,4,6–三碘苯–1,3–二羧酸(1)。将混合物冷却至室温，然后真空过滤，用乙腈(20mL)洗涤。将固体在高真空中干燥两天，得到20.8g(95％)白色产物。UV-Vis光谱(甲醇,λ,nm):243；IR[KBr,cm^-1]:3247,3000,1725,609,508；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):5.83(dd,J²＝1.8Hz,J³cis＝10.2Hz,1H),6.32(dd,J²＝1.7Hz,J³trans＝17.2Hz,1H),6.44(dd,J³cis＝10.2Hz,J³trans＝17.1Hz,1H),10.22(s,1H),14.1(s,broad,1H).¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)：169.82,163.82,127.96,131.53,143.79,149.57,98.55,87.74.ESI-MS：m/z＝613.74[M+H]⁺；C₁₁H₆I₃NO₅的元素分析计算值(％)：C 21.56，H 0.99，N 2.29；实测：C 21.75，H 0.93，N2.36。

聚(2,4,6–三碘–5–(丙–2–烯酰氨基)苯–1,3–二羧酸)(3)的合成(参见方案1)

将2,4,6–三碘–5–(丙–2–烯酰氨基)苯–1,3–二羧酸(2)(25.12g，40mmol)溶于DMF(40mL)。然后，加入2–(十二烷硫基硫代羰基硫基)–2–甲基丙酸(7)(72.8mg，0.2mmol)和AIBN(16.4mg，0.1mmol)。通过三次冷冻－抽空－解冻循环将溶液脱气，并转移到在氮气流下70℃预热的油浴中。在缓慢搅拌下进行聚合96小时，然后通过在大气空气下冰浴中冷却30分钟来猝灭(转化率78％)。在旋转蒸发器上在10毫巴、50℃下除去DMF，并将产物在高真空下干燥2天，得到聚合物3(24.6g，95％)，为淡黄色固体。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：5.82(dd,J²＝1.8Hz,J³cis＝10.2Hz,0.22H),6.30(dd,J²＝1.7Hz,J³trans＝17.2Hz,0.26H),6.44(dd,J³cis＝10.2Hz,J³trans＝17.1Hz,0.22H),10.22(s,0.26H),14.01(s,broad,2H)。C_15.35H_16.15I₃N_2.45O_6.45(M+1.45DMF)的元素分析计算值(％)：C,25.65；H,2.26；N,4.77；实测：C,25.57；H,2.56；N,4.41。

XLinCA(6)的合成(参见方案1)

在少量加入草酰氯－DMF加合物之前，将聚合物3再溶解于40mL DMF中。在冰浴中冷却反应的同时，通过在15分钟内将草酰氯(15mL)滴加到40mL的DMF在300mL的DCM的溶液中，合成草酰氯－DMF加合物。15分钟后，蒸发DCM，得到加合物在DMF中的混合物，然后将整个混合物用于处理聚合物3。

将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后，将该溶液迅速加入500mL水中以沉淀产物。过滤沉淀，用100mL水洗涤，高真空干燥过夜，得到氯化聚合物4。

将氯化聚合物4溶解在DMF(100mL)中，并在剧烈搅拌下将该溶液迅速加入到冰冷的乙二胺(100mL)和水(100mL)的混合物中。30分钟后，真空蒸发溶剂。向残余物中加入水(50mL)，并将混合物在高真空下冻干，得到5(23.4g，95％)。将5溶于HCl溶液(100mL，2M)。用12kDa的膜对NaCl溶液(10L，0.2％)透析，3小时、8小时和24小时后更换溶液；然后对去离子水(10L)透析6小时。然后，通过加入NaOH 1M溶液将pH重新调节至7，并将溶液冻干，得到最终产物XLinCA6(19.2g，82％)，GPC(M_n＝33700，PDI＝3.16)。

造影剂XLinCA(6)的GPC测定(参见图8)

GPC测量由德国美因茨的PSS Polymer Standards Service GmbH进行。

样品制备。在分析天平上称量约2mg各样品。将2mL洗脱液加入样品中，并在室温下使其溶解。2小时后，样品完全溶解并可以测量。在测量前不过滤样品溶液，并通过自动进样器注入100μL。

校准和计算。首先分析具有不同分子量的普鲁兰多糖标准物以得到校准曲线。样品的平均分子量和分子量分布的计算通过基于普鲁兰多糖校准的所谓的切片－切片(slice by slice)法进行。

表1平均分子量和分子量分布的计算。M_n：数均分子量，M_w：重均分子量，M_z：尺寸平均分子量，PDI：多分散指数，V_p：最大峰值时的洗脱体积，M_p：峰最大值处的分子量，面积：洗脱图下的总面积。

实施例3：其他单体

本发明的聚合物可以通过方案3所示的反应获得。

方案3：具有丙烯酰胺的可固化共聚物的替代设计。

本发明的具有增加的水溶性的聚合物是

具有肽骨架的聚合物是

RA加合物的裂解：

本发明聚合物的含硫RA加合物RI–[M]_n–RA和FT–[M]_n–RA可以使用Chong et al.(2007)、Moughton et al.(2009)或Jesson et al.(2017)所述的方法裂解。

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Claims (15)

1.一种单体M或其盐，包括具有2至6个单元B的骨架，其中

每个B独立于任何其它B，选自–CH₂–、–NH–、–C(＝O)–、–CH(R)–和–NR–，其中

B可任选被C_1-4烷基，特别是被乙基或甲基，更特别是被甲基取代，且其中

–CH(R)–和–NR–部分中的至少一个存在于骨架中，

R独立地选自–E–H、–L–(NH₂)_m和式1部分，

(1)，其中

E是包括一个或多个，特别是1至3个，独立地选自–C(＝O)–、–NH–C(＝O)–、–O–、–C_1-4烷基–部分，的部分，

L是包括一个或多个，特别是1至3个，独立地选自–C(＝O)–、–C(＝O)–NH–、–NH–C(＝O)–、–O–、–C_1-4烷基–部分，的连接基，

其中L可任选被–E–H取代，

R¹是–I，

R²是–E–H或–L–(NH₂)_m，

p独立地选自0、1、2或3，

q独立地选自0、1、2、3或4，特别是0、1或2，

其中，式1中的p和q的和≤5，

m独立地选自1或2，其中

单体中所有m的总和≥1，特别是≥2，和

单体中所有p的总和≥1，特别是总和是2或3，更特别是总和是3。

2.根据权利要求1的单体M，其中每个B独立于任何其它B，选自–CH₂–、–NH–、–C(＝O)–和–CH(R)–。

3.根据权利要求1或2中任一所述的单体M，其中所述骨架是

-肽骨架–C(＝O)–CH(R′)–NH–C(＝O)–CH(R″)–NH–或–C(＝O)–CH(R′)–NH–，或

-脂族骨架–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–、–CH₂–CH(R′)–、–CH₂–C(CH₃)(R′)–CH₂–C(CH₃)(R″)–或–CH₂–C(CH₃)(R′)–，特别是–CH₂–CH(R′)–CH₂–CH(R″)–或–CH₂–CH(R′)–，更特别是–CH₂–CH(R′)–，其中

R′和R″由选自如对于R所定义的部分组成，其中R′和R″彼此不同，特别是R′和R″之一是式1部分、另一是–E–H或–L–(NH₂)_m，更特别是R′是式1部分、R″是–E–H或–L–(NH₂)_m。

4.根据前述权利要求中任一所述的单体M，其中–E–H独立地选自–OH、–C_1-4烷基–OH、–C(＝O)–OH、–C_1-4烷基–C(＝O)–OH、–OC_1-4烷基和–C_1-4烷基–OC_1-4烷基，特别是选自–OH和–C(＝O)–OH。

5.根据前述权利要求中任一所述的单体M，其中R独立地选自–L–(NH₂)_m和式1部分。

6.根据前述权利要求中任一所述的单体M，其中在R是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立地选自–C_1-4烷基–NH₂、–C_1-4烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH–C_1-4烷基–NH₂、–NH–C(＝O)–C_1-4烷基–NH₂和–OC_1-4烷基–NH₂，特别是选自–C(＝O)–NH₂或–C_1-4烷基–NH₂。

7.根据前述权利要求中任一所述的单体M，其中在R²是–L–(NH₂)_m的情况下，–L–(NH₂)_m独立地选自–C_1-4烷基–NH₂、–C_1-4烷基–C(＝O)–NH₂、–C(＝O)–NH₂，–C(＝O)–NH–C_1-4烷基–NH₂，–NH–C(＝O)–C_1-4烷基–NH₂和–OC_1-4烷基–NH₂，特别是选自–C(＝O)–NH–C_1-2烷基–NH₂。

8.一种聚合物P，其包括根据权利要求1至7中任一所述的单体M，特别是70至600，特别是100至300，更特别是120至170个根据权利要求1至7中任一所述的单体M。

9.根据权利要求8的聚合物，其中所述聚合物是式2、式2a或式3的化合物，特别是式2和式2a的化合物，更特别是式2的化合物，

X–[M]_n–Y(2)、Z–[M]_n–R^S(2a)、R^N–[M]_n–R^C(3)，其中

X和Y彼此独立地选自RA、FT和RI，

Z选自FT和RI，其中

RI是衍生自自由基引发剂，特别是衍生自选自过氧化物、过酸酯或偶氮引发剂的自由基引发剂，更特别是衍生自AIBN、1,1′–偶氮双(环己烷甲腈)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊酸)、4,4′–偶氮双(4–氰基戊烷–1–醇)、2,2′–偶氮双(异丁酸甲酯)、2,2′–偶氮双(2–氰基–2–丁烷)、2–(叔丁基偶氮)–2–氰基丙烷、2,2′–偶氮双(N,N′–二亚甲基异丁胺)、2,2′–偶氮双[2–甲基–(N)–(1,1)–双(羟甲基)–2–羟乙基]丙酰胺、2,2′–偶氮双[2–甲基–N–羟乙基)]丙酰胺、2,2′–偶氮双(2,2,4–三甲基戊烷)、2,2′–偶氮双(2–甲基丙烷)、过氧化异丁酸叔丁酯、过氧化二苯甲酰、过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化二叔丁基、次亚硝酸二叔丁酯、亚硝酸二枯酯，的部分，

RA是没有均裂离去基团的RAFT(可逆加成－断裂链转移)试剂，

M是根据权利要求1的单体或其盐，

n是70至600，特别是100至300，更特别是120至170，

FT是RAFT试剂的均裂离去基团或被–E–H或–L–(NH₂)_m修饰的RAFT试剂的均裂离去基团，其中–E–H和–L–(NH₂)_m如上定义，

R^S是H或OH，

R^N是–NH₂，

R^C是–COOH或–CONH₂。

10.根据权利要求9所述的聚合物，其中

RI是式5部分或式6部分，

–O–SO₂–O^-T⁺(6)，其中

–R⁶选自–C_1-6烷基、–H，

R⁷选自–C_1-6烷基、–苯基、–C_1-6烷基–OH、–C_1-6烷基–COOH、–C(＝O)–O–C_1-4烷基、–C(＝O)–NH–R⁹，其中R⁹是–C_1-6烷基–(OH)_r，其中R是0、1、2或3，

R⁸是–C_1-6烷基、–H、–CN，或

R⁶和R⁷形成C_3-8环烷基，特别是C_5-6环烷基，且R⁸是–C_1-6烷基、–H、–CN，

–Q是–O–、–O–C(＝O)–或–C(＝O)–O–，其中s是0或1，

–T⁺是一价阳离子，特别是Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺，和/或

RA是–S–C(＝S)–Z，其中Z选自苯基和–S–C_6-20烷基，特别是苯基和–S–C_10-16烷基，更特别是–S–C_10-16烷基，和/或

FT是式4部分，

其中

R³选自–H和–C_1-4烷基，特别是–H和–C_1-2烷基，

R⁴选自–H、–C_1-4烷基、–C_1-4烷基–COOH、–C_1-4烷基–C(＝O)–R⁶，其中R⁶是–E–H或–L–(NH₂)_m，特别是–H、–C_1-2烷基、–C_1-2烷基–COOH、–C_1-2烷基–C(＝O)–R⁵，其中R⁵是–E–H或–L–(NH₂)_m,

R⁵选自–CN和–COOH，特别是R⁵是–COOH。

11.一种预交联聚合物，其包括二或更多种根据权利要求8至10中任一所述的互连聚合物P。

12.根据权利要求11所述的预交联聚合物，其中所述聚合物经由亚胺连接相互连接，所述亚胺连接通过所述聚合物的胺部分与二醛，特别是H–C(＝O)–C_1-8烷基–C(＝O)–H，更特别是H–C(＝O)–C_3-8烷基–C(＝O)–H，或三醛，特别是苯–1,3,5–三醛的反应形成，或者所述聚合物经由衍生自甲醛的亚甲基桥相互连接。

13.根据权利要求11或12中任一所述的预交联聚合物，其中所述预交联聚合物的分子量≥65kDa，特别是≥100kDa。

14.式5的中间体M′，

D–CH(R)(5)，其中D是H₂C＝且R是式1部分，

如上所定义。

15.一种用于离体成像、特别是血管和肾小管成像的方法，包括以下步骤：

–提供包括根据权利要求12的预交联聚合物的造影剂溶液，和包括交联剂，特别是选自甲醛、二醛或三醛的交联剂的交联溶液，

–使用造影剂溶液灌注血管，特别是灌注组织、器官或整个动物的脉管系统，

–加入所述交联溶液以产生交联聚合物，

–使用X射线检测所述交联聚合物。

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