JPWO2013111799A1 - 脳機能改善剤 - Google Patents

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Abstract

本発明により、式（Ｉ）で表される化合物を含む、脳機能改善に使用される医薬組成物が提供される。

Description

本発明は、脳機能の改善に有用な薬剤、およびそれを用いた脳機能の改善方法、特に認知機能障害の治療方法または予防方法に関する。また本発明は、脳機能改善に有用な薬剤のスクリーニング方法に関する。
アルツハイマー病などの脳機能に関わる疾患は世界的な問題となっており、高齢化社会を迎える日本ではその克服は早急な解決が求められる課題である。世界のアルツハイマー型認知症の患者数は約２０００万人といわれており、日本では約１５０万人の認知症患者のうちの４割以上がアルツハイマー型認知症と推定されている。
アルツハイマー病の治療の有力な手段として、コリンエステラーゼ阻害剤であるドネペジル塩酸塩（アリセプト（登録商標））が広く使用されており、新たなアセチルコリンエステラーゼ阻害剤についても製造承認がされている。しかし、ドネペジル塩酸塩の臨床成績の有効率は５０％程度であり、更に強力かつ安全な薬剤が必要とされている。
新規な作用機作による脳機能改善を目標として新規薬剤の探索研究も行われている。例えば、アセチルコリン遊離促進作用を有するＺＳＥＴ１４４６や、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体活性化作用を有するネフィラセタムなどについて報告がされており、臨床試験も行われている（特許文献１および２、非特許文献１〜４）。しかしながら現時点においてはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤以外の薬剤についての新たな製造承認はなく、特に既存の薬剤と異なる作用機作を有する新規薬剤の開発が強く望まれている。
さらに、精神疾患（統合失調症、双極性障害、うつ病、恐怖症、睡眠障害、薬物依存症など）、広汎性発達障害（自閉症、アスペルガー症候群、精神遅滞、多動性障害、チック障害など）などの高次脳機能障害には認知機能障害が主な随伴症状である。療育による認知機能改善療法は疾患の予後を改善することが知られているが、有効な認知機能改善薬の開発が強く望まれている。
国際公開ＷＯ２００３／０８００４６ 国際公開ＷＯ２００２／０６０９０７

The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics Vol. 326, No. 1, 127-134, 2008; The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics Vol. 317, No. 3, 1079-1087, 2006; Yakugaku Zasshi Vol. 130, No. 5, 717-721, 2010; Journal of Neurochemistry Vol. 110, 170-181, 2009;
本発明は、脳機能の改善に有用な新たな薬剤の提供、およびそれを用いた脳機能改善方法の提供を目的とする。さらに本発明は、脳機能改善に有用な薬剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、ヘテロスピロ環構造を有する一群の化合物が脳機能改善効果を有することを見いだし、本発明を完成させた。
本発明の１つの側面によれば、以下の（１）〜（７）に記載する医薬組成物が提供される。
（１）式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、シアノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３を表し；
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、−Ｘ１−Ｒ１４、または−ＮＲ１５Ｒ１６を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１７Ｒ１８、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１９から選択され；
Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；または
Ｒ１１およびＲ１２はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し、該含窒素ヘテロ環基は、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アミノＣ１−６アルキル、（Ｃ１−６アルキルアミノ）Ｃ１−６アルキル、［ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ］Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４、−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、または−ＳＯ２−を表し；
Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；
Ｒ１５は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２１を表し、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、または５〜１０員ヘテロアリールを表し、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ１５およびＲ１６はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し、該含窒素ヘテロ環基は、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アミノＣ１−６アルキル、（Ｃ１−６アルキルアミノ）Ｃ１−６アルキル、［ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ］Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４、−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；またはＲ１７およびＲ１８はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し；
Ｒ１９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；
Ｒ２１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで該アルキル基およびアルコキシ基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、またはＲ２２およびＲ２３はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し；
Ｒ２４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択される］
で表される化合物または医薬として許容なその塩を含有する、脳機能改善に使用される医薬組成物。
（２）Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、上記（１）に記載の組成物。
（３）Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が上記（１）に定義されたとおりである、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、上記（３）に記載の組成物。
（５）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が
２’，３’−ジヒドロ−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−８−メチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−８−メチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
および医薬として許容なそれらの塩；
から選択される、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）認知機能障害の治療または予防に使用される、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）認知機能障害が、神経変性疾患、精神疾患、および広汎性発達障害から選択される疾患である、上記（７）に記載の組成物。
（９）認知機能障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、およびハンチントン病、統合失調症、双極性障害、うつ病、恐怖症、睡眠障害、薬物依存症、自閉症、アスペルガー症候群、精神遅滞、多動性障害、およびチック障害から選択される疾患である、上記（７）に記載の組成物。
本発明の別の側面によれば、以下の（１０）〜（１５）に記載する脳機能改善方法が提供される。
（１０）有効量の式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、上記（１）に定義されたとおりである］で表される化合物を対象に投与することを含む、脳機能改善方法。
（１１）Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、上記（１）に定義した１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、上記（１０）に記載の方法。
（１２）Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が上記（１）に定義されたとおりである、上記（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、上記（１２）に記載の方法。
（１４）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が、上記（６）に記載の化合物および医薬として許容なそれらの塩から選択される、上記（１０）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の（１６）〜（２１）に記載する治療方法または予防方法が提供される。
（１６）有効量の式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、上記（１）に定義されたとおりである］で表される化合物を対象に投与することを含む、認知機能障害の治療方法または予防方法。
（１７）Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、上記（１６）に記載の方法。
（１８）Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が上記（１）に定義されたとおりである、上記（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、上記（１８）に記載の方法。
（２０）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が、上記（６）に記載の化合物および医薬として許容なそれらの塩から選択される、上記（１６）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の（２２）〜（３１）に記載するスクリーニング方法が提供される。
（２２）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルのカルシウムイオン流入量を増加させる作用を有する化合物を選抜する工程を含む、脳機能改善活性を有する化合物のスクリーニング方法。
（２３）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルが、Cav3.1、Cav3.2、およびCav3.3から選択される、上記（２２）に記載の方法。
（２４）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルが発現した細胞を用いたアッセイ系に被検化合物を添加し、添加による細胞内カルシウムイオンレベルの変化を測定する工程を含む、上記（２２）または（２３）に記載の方法。
（２５）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの遺伝子を細胞に導入することにより、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルを発現させた細胞を使用する、上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）Neuro2A細胞、PC12細胞、HEK293細胞、およびCOS7細胞から選択される細胞に電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの遺伝子を導入する、上記（２５）に記載の方法。
（２７）脳機能改善活性を有する化合物のスクリーニング方法であって
（ａ）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が異なる２種類の神経細胞を調製する工程；
（ｂ）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が低い細胞（細胞Ａ）を用いたアッセイ系（アッセイ系Ａ）に被検化合物を添加し、添加による細胞内のカルシウムイオンレベルの変化を測定する工程；
（ｃ）電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が高い細胞（細胞Ｂ）を用いたアッセイ系（アッセイ系Ｂ）に被検化合物を添加し、添加による細胞内のカルシウムイオンレベルの変化を測定する工程；
（ｄ）アッセイ系Ｂにおけるカルシウムレベルの上昇がアッセイ系Ａにおける上昇よりも大きい化合物を選抜する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
（２８）細胞Ｂが電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル遺伝子を導入した細胞である、上記（２７）に記載の方法。
（２９）アッセイ系ＡおよびＢの両方において、ニコチンの添加により細胞内のカルシウムレベルが上昇することを確認する工程を更に含む、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（３０）細胞ＡがNeuro2A細胞、PC12細胞、HEK293細胞、およびCOS7細胞から選択される細胞である、上記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の方法。
（３１）細胞Ｂが、細胞ＡにCav3.1、Cav3.2、またはCav3.3の遺伝子を導入した細胞である、上記（２７）〜（３０）のいずれかに記載の方法。
本発明の別の側面によれば、以下の（３２）〜（３７）に記載する電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤が提供される。
（３２）有効量の式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、上記（１）に定義されたとおりである］で表される化合物を含む、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
（３３）Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、上記（３２）に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
（３４）Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が上記（１）に定義されたとおりである、上記（３２）または（３３）に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
（３５）基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は上記（１）に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、上記（３４）に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
（３６）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、上記（３２）〜（３５）のいずれかに記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
（３７）式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が、上記（６）に記載の化合物および医薬として許容なそれらの塩から選択される、上記（３２）〜（３６）のいずれかに記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
本発明によれば、新たな脳機能改善に用いることができる医薬組成物、特にアルツハイマー病などの認知機能障害の処置方法となる治療剤または予防剤が提供される。さらに本発明は、脳機能改善に有用な化合物の効率なスクリーニング方法が提供される。
図１は、海馬でのシナプス伝達長期増強におけるＳＴ１０１（１００ｐＭ）の影響を表すチャートである。縦軸はシナプス後集合電位（fEPSP）の振幅を表し、横軸は経過時間を表す。 図２は、海馬でのシナプス伝達長期増強におけるＳＡＫ１（１００ｐＭ）の影響を表すチャートである。縦軸はシナプス後集合電位（fEPSP）の振幅を表し、横軸は経過時間を表す。 図３は、海馬でのシナプス伝達長期増強におけるＳＡＫ３（１００ｐＭ）の影響を表すチャートである。縦軸はシナプス後集合電位（fEPSP）の振幅を表し、横軸は経過時間を表す。 図４は、ＳＴ１０１、ＳＡＫ１およびＳＡＫ３の各投与群における１分後および６０分後のＬＴＰ強度を表すグラフである。図中の＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）はコントロールと被検化合物群の間の有意性を示す。 図５は、抗リン酸化ＣａＭＫＩＩ抗体及び抗ＣａＭＫＩＩ抗体を用いてブロッティングを行った結果を示す図であり、ＬＴＰの６０分後に海馬ＣＡ１領域を摘出して、免疫ブロットによるＣａＭＫＩＩの自己リン酸化をコントロールと被検化合物（ＳＴ１０１、ＳＡＫ１およびＳＡＫ３）を処置した群で比較した。 図６は、図５のブロッティングによる免疫反応物の定量解析結果に基づく、マウスの海馬ＣＡ１領域のＣａＭＫＩＩの自己リン酸化レベル（phosphorylation）を示すグラフである。グラフの縦軸は、対照（コントロール）の自己リン酸化レベルを１００％として、被検化合物の刺激効果を計算した値を示す。図中の＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）はコントロール群と被検化合物処置の間の有意性を示す。 図７は、遺伝子導入を行っていない（non-transfected）マウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルにおける、ＳＡＫ３添加およびニコチン刺激の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度変化を示し、横軸は経過時間を示す。また、カルシウム濃度変化の程度を表すために、インセットにおいて高カリウム（脱分極）刺激による細胞内カルシウム濃度変化を合わせて示す。 図８は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入した（transfected）マウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルにおける、ＳＡＫ３添加およびニコチン刺激の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度変化を示し、横軸は経過時間を示す。 図９は、カルシウムイオンの細胞内流入量を示すグラフであり、白色の棒グラフは遺伝子導入を行っていないマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞での結果を、黒色はＴ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞における結果を表す。また、「mibe」はミベフラジルの添加を意味する。縦軸はＳＡＫ３添加によるカルシウム濃度変化（Ｒａｔｉｏ）の変化の割合（Δ値）（図７における添加後の最大値から添加前の最小値を差し引いた値）を示す。図中の＊＊は遺伝子を導入した細胞でのコントロールとＳＡＫ３処置の間の有意性（ｐ＜０．０１）を示し、＃＃は遺伝子導入した細胞でのＳＡＫ３処置とミベフラジル存在下でのＳＡＫ３処置の間の有意性（ｐ＜０．０１）を示す。 図１０は、カルシウムイオンの細胞内流入量を示すグラフであり、白色の棒グラフは遺伝子導入を行っていないマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞での結果を、黒色はＴ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞における結果を表す。また、「mibe」はミベフラジルの添加を意味する。。縦軸はＳＡＫ３添加によるカルシウム濃度変化（Ｒａｔｉｏ）の変化の割合（Δ値）（図８における添加後の最大値から添加前の最小値を差し引いた値）を示す。図中の＊＊はＳＡＫ３存在下と非存在下の間の有意性（ｐ＜０．０１）を示し、＃＃はＳＡＫ存在下でのミベフラジル非存在下と存在下の間の有意性（ｐ＜０．０１）を示し、＋は遺伝子導入なしと遺伝子導入した細胞間の有意性（ｐ＜０．０５）を示す。 図１１は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルのＡＴＰ添加による変動について、ＳＡＫ３添加の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度変化を示し、横軸は経過時間を示す。 図１２は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞におけるＡＴＰ刺激後のカルシウムイオンの細胞内流入量を示すグラフである。図中の＊＊＊はＳＡＫ３非存在下（Ｎｏｎ）と存在下（ＳＡＫ３）の間の有意性（ｐ＜０．００１）を示す。 図１３は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルの代謝型グルタミン酸受容体アゴニスト（ＤＨＰＧ）添加による変動について、ＳＡＫ３添加の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度を示し、横軸は経過時間を示す。 図１４は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞におけるＤＨＰＧ刺激後のカルシウムイオンの細胞内流入量を示すグラフである。 図１５は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルについて、ＳＡＫ３添加の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度変化を示し、横軸は経過時間を示す。 図１６は、Ｔ型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を導入したマウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞の細胞内カルシウムイオンレベルについて、ＳＴ１０１添加の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光顕微鏡により測定した細胞内カルシウムイオン濃度変化を示し、横軸は経過時間を示す。 図１７は、嗅球摘出マウスを用いたＹ字迷路試験におけるＳＡＫ３投与の影響を示すグラフである。縦軸にマウスが測定時間内に各アームに侵入した回数（total arm entries）（自発運動量）を示す。図中の＊はSham群との間の有意性（ｐ＜０．０５）を示し、＊＊はSham群との間の有意性（ｐ＜０．０１）を示す。 図１８は、嗅球摘出マウスを用いたＹ字迷路試験におけるＳＡＫ３投与の影響を示すグラフであり、縦軸は正常の交替行動の指標（空間作業記憶の正解率）であるalternation（％）を示す。図中の＊はSham群との間の有意性（ｐ＜０．０５）を示し、＊＊はSham群との間の有意性（ｐ＜０．０１）を示し、＃＃は溶剤のみを投与したＯＢＸマウス群（Ｖｅｈ．＋ＯＢＸ）との間の有意性（ｐ＜０．０５）を示す。 図１９は、嗅球摘出マウスを用いた新奇物体認識試験におけるＳＡＫ３投与の影響を示すグラフであり、既知オブジェクトと新奇オブジェクトの接触回数の割合 (%) を判別指数 (Discrimination index)として縦軸に示す。図中の＊＊は既知と新規オブジェクト接触回数の割合の有意性（ｐ＜０．０１）を示す。 図２０は、海馬内で遊離するアセチルコリンの量（２０分ごとに定量）におけるＳＡＫ３投与の影響を示すグラフである。縦軸は刺激前（−１００〜−１２０分）のアセチルコリン遊離量を１００％として表した。 図２１は、偽手術マウス（Sham）と嗅球摘出マウス（OBX）における海馬内で遊離するアセチルコリンの量におけるＳＡＫ３投与の影響を示すグラフであり、縦軸は、図２０の経過時間：２０〜８０分の間に遊離したアセチルコリンの量をＳｈａｍ群を１００％として算出した値を示す。図中の＊はＳｈａｍとＯＢＸの間の有意性（ｐ＜０．０５）を示し、＃はＯＢＸとＯＢＸ＋ＳＡＫ３投与の間の有意性（ｐ＜０．０５）を示す。 図２２は、培養マウス大脳皮質細胞を用いて自己リン酸化を指標にしてＣａＭＫＩＩの活性化反応を示した免疫ブロットである。被検化合物（ＳＡＫ３、ＳＡＫ８およびＳＡＫ９）を添加したマウス大脳皮質細胞での活性化レベルを確認するために、抗リン酸化CaMKII抗体及び抗CaMKII抗体を用いてブロッティングを行った結果を示す図である。ＢＥ（Ｂｒａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ）はＣａＭＫＩＩのタンパク質の泳動位置を確認するために電気泳動して、免疫ブロットをおこなった。 図２３は、ブロッティングによる免疫反応物の定量解析結果に基づく、マウス大脳皮質細胞のＣａＭＫＩＩアルファ（５０ｋＤａのアルファサブユニット）の自己リン酸化レベルを示すグラフの一例である。グラフの縦軸は、コントロール（無刺激）時のリン酸化ＣａＭＫＩＩの割合を、１００％として計算した値を示す。図中の＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）はコントロールと被検化合物の間の有意性を示す。 図２４は、ブロッティングによる免疫反応物の定量解析結果に基づく、マウス大脳皮質細胞のＣａＭＫＩＩベータ（６０ｋＤａのベータサブユニット）の自己リン酸化レベルを示すグラフの一例である。グラフの縦軸は、コントロール（無刺激）時のリン酸化ＣａＭＫＩＩの割合を、１００％として計算した値を示す。図中の＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）はコントロールと被検化合物の間の有意性を示す。
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明の１つの側面によれば、上記式（Ｉ）により表される化合物または医薬として許容なその塩を含有する、医薬組成物、特に脳機能改善に用いられる医薬組成物、脳機能改善剤、または認知機能障害の治療剤または予防剤が提供される。
式（Ｉ）の定義に関して「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−３アルキルなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルオキシ基［−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）］を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、３−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１−メチルブトキシ、１−エチルプロポキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、４−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、２−メチルペントキシ、１−メチルペントキシ、３−エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、およびシクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−３アルコキシなども含まれる。また、本明細書において「Ｃ１−４アルコキシ」には、例えばＣ１−３アルコキシなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルチオ基［−Ｓ−（Ｃ１−６アルキル）］を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、３−メチルブチルチオ、２−メチルブチルチオ、１−メチルブチルチオ、１−エチルプロピルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、４−メチルペンチルチオ、３−メチルペンチルチオ、２−メチルペンチルチオ、１−メチルペンチルチオ、３−エチルブチルチオ、２−エチルブチルチオ、シクロプロピルチオ、シクロブチルチオ、シクロペンチルチオ、シクロヘキシルチオ、およびシクロプロピルメチルチオなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルチオおよびＣ１−３アルキルチオなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基［−ＳＯ−（Ｃ１−６アルキル）］を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、ｉ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｉ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニル、ｎ−ペンチルスルフィニル、３−メチルブチルスルフィニル、２−メチルブチルスルフィニル、１−メチルブチルスルフィニル、１−エチルプロピルスルフィニル、ｎ−ヘキシルスルフィニル、４−メチルペンチルスルフィニル、３−メチルペンチルスルフィニル、２−メチルペンチルスルフィニル、１−メチルペンチルスルフィニル、３−エチルブチルスルフィニル、２−エチルブチルスルフィニル、シクロプロピルスルフィニル、シクロブチルスルフィニル、シクロペンチルスルフィニル、シクロヘキシルスルフィニル、およびシクロプロピルメチルスルフィニルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルスルフィニルおよびＣ１−３アルキルスルフィニルなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基［−ＳＯ２−（Ｃ１−６アルキル）］を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｉ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニル、ｎ−ペンチルスルホニル、３−メチルブチルスルホニル、２−メチルブチルスルホニル、１−メチルブチルスルホニル、１−エチルプロピルスルホニル、ｎ−ヘキシルスルホニル、４−メチルペンチルスルホニル、３−メチルペンチルスルホニル、２−メチルペンチルスルホニル、１−メチルペンチルスルホニル、３−エチルブチルスルホニル、２−エチルブチルスルホニル、シクロプロピルスルホニル、シクロブチルスルホニル、シクロペンチルスルホニル、シクロヘキシルスルホニル、およびシクロプロピルメチルスルホニルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルスルホニルおよびＣ１−３アルキルスルホニルなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルキルアミノ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルアミノ基［−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキル）］を意味し、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ｓ−ブチルアミノ、ｉ−ブチルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、３−メチルブチルアミノ、２−メチルブチルアミノ、１−メチルブチルアミノ、１−エチルプロピルアミノ、ｎ−ヘキシルアミノ、４−メチルペンチルアミノ、３−メチルペンチルアミノ、２−メチルペンチルアミノ、１−メチルペンチルアミノ、３−エチルブチルアミノ、２−エチルブチルアミノ、シクロプロピルアミノ、シクロブチルアミノ、シクロペンチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、およびシクロプロピルメチルアミノなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルアミノおよびＣ１−３アルキルアミノなども含まれる。
本明細書において「ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ」とは、２つのアルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基［−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキル）２］を意味し、２つのアルキル部分は同一であっても異なっていてもよい。当該基の例には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ（ｎ−プロピル）アミノ、ジ（ｉ−プロピル）アミノ、ジ（ｎ−ブチル）アミノ、ジ（ｓ−ブチル）アミノ、ジ（ｉ−ブチル）アミノ、ジ（ｔ−ブチル）アミノ、ジ（ｎ−ペンチル）アミノ、ジ（３−メチルブチル）アミノ、ジ（２−メチルブチル）アミノ、ジ（１−メチルブチル）アミノ、ジ（１−エチルプロピル）アミノ、ジ（ｎ−ヘキシル）アミノ、ジ（４−メチルペンチル）アミノ、ジ（３−メチルペンチル）アミノ、ジ（２−メチルペンチル）アミノ、ジ（１−メチルペンチル）アミノ、ジ（３−エチルブチル）アミノ、ジ（２−エチルブチル）アミノ、ジシクロプロピルアミノ、ジシクロブチルアミノ、ジシクロペンチルアミノ、ジシクロヘキシルアミノ、およびジシクロプロピルメチルアミノなど、並びにエチル（メチル）アミノ、ｎ−プロピル（メチル）アミノ、ｉ−プロピル（メチル）アミノ、ｎ−ブチル（メチル）アミノ、ｓ−ブチル（メチル）アミノ、ｉ−ブチル（メチル）アミノ、ｔ−ブチル（メチル）アミノ、ｎ−ペンチル（メチル）アミノ、（３−メチルブチル）（メチル）アミノ、（２−メチルブチル）（メチル）アミノ、（１−メチルブチル）（メチル）アミノ、（１−エチルプロピル）（メチル）アミノ、ｎ−ヘキシル（メチル）アミノ、（４−メチルペンチル）（メチル）アミノ、（３−メチルペンチル）（メチル）アミノ、（２−メチルペンチル）（メチル）アミノ、（１−メチルペンチル）（メチル）アミノ、（３−エチルブチル）（メチル）アミノ、および（２−エチルブチル）（メチル）アミノ、シクロプロピル（メチル）アミノ、シクロブチル（メチル）アミノ、シクロペンチル（メチル）アミノ、シクロヘキシル（メチル）アミノ、および（シクロプロピルメチル）（メチル）アミノなどが含まれ、例えば、（Ｃ１−４アルキル）（メチル）アミノおよび（Ｃ１−３アルキル）（メチル）アミノなども含まれる。
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシカルボニル」とは、アルコキシ部分として既に定義したＣ１−６アルコキシ基を有するアルコキシカルボニル基を意味し、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニルの他、Ｃ１−３アルコキシカルボニルなどが含まれる。
本明細書における「ヒドロキシＣ１−６アルキル」には、例えばヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、１−ヒドロキシエチルなどが含まれる。
本明細書における「アミノＣ１−６アルキル」には、例えばアミノメチル、２−アミノエチル、１−アミノエチルなどが含まれる。
本明細書における「Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル」は式−（Ｃ１−６アルキル）−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）で表される基を意味し、例えばメトキシメチル、エトキシメチル、２−メトキシエチル、１−メトキシエチルなどが含まれる。
本明細書における「Ｃ１−６アルキルアミノＣ１−６アルキル」は式−（Ｃ１−６アルキル）−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキル）で表される基を意味し、例えば（メチルアミノ）メチル、（エチルアミノ）メチル、２−（メチルアミノ）エチル、１−（メチルアミノ）エチルなどが含まれる。
本明細書における「ジ（Ｃ１−６アルキルアミノ）Ｃ１−６アルキル」は式−（Ｃ１−６アルキル）−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２で表される基を意味し、ジアルキルアミノ部分の２つのアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。当該基の例には、（ジメチルアミノ）メチル、（ジエチルアミノ）メチル、２−（ジメチルアミノ）エチル、１−（ジメチルアミノ）エチルなどが含まれる。
本明細書における「−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３」は、Ｃ１−６アルキルの任意の炭素原子が基−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３により置換された基を意味し、ここでＣ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
本明細書における「−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４」は、Ｃ１−６アルキルの任意の炭素原子が基−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４により置換された基を意味し、ここでＣ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
本明細書において「Ｃ６−１０アリール」は、例えば、フェニル、１−ナフチルまたは２−ナフチルを意味する。
本明細書において「５〜１０員へテロアリール」とは、酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される１以上のヘテロ原子を含む、環原子が５〜１０の単環または縮合環の芳香族ヘテロ環基を意味する。具体例としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、フリル、チエニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、キノリニル、キノキサリル、キナゾリニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニルなどが含まれる。
本明細書において「含窒素ヘテロ環基」とは、１つの窒素原子を含み、更に酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される１以上のヘテロ原子を含んでいてもよい、環原子が５〜１０の単環または縮合環の飽和、部分飽和または不飽和のヘテロ環基を意味する。具体例としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、インドリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、モルホリニルなどが含まれる。
上記式（Ｉ）で表される化合物に関する本発明には、互変異性体、幾何異性体、光学異性体などの各種の立体異性体、およびそれらの混合物が含まれる。例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、下記の式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物を包含する。
式（Ｉ）の化合物の「医薬として許容な塩」とは、医薬品として使用可能な塩であれば特に限定されない。本発明化合物が塩基と形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどの無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩などが挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；および、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸などの有機酸酸との酸付加塩が挙げられる。
更に、式（Ｉ）で表される化合物には、水和物、各種溶媒和物や結晶多形等も含まれる。
式（Ｉ）で表される化合物に含まれる原子（例えば、水素原子、炭素原子、酸素原子、窒素原子、および硫黄原子など）は、それぞれの天然に最も多く存在する同位体以外の同位体原子であってもよく、当該同位体原子は放射性同位体原子であってもよい。すなわち、本発明の１つの側面によれば、同位体原子で標識化された本明細書で既に定義された式（Ｉ）の化合物、またはその塩が提供される。ここで、同位体原子による標識化は、例えば、放射性同位体による標識化（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐなど）であってもよく、化合物の調製の容易さの側面からは、３Ｈによる標識化が好ましい。
本発明の１つの態様において、式（Ｉ）の化合物は、プロドラッグとして投与され、生体内において活性化合物に変換される。
式（Ｉ）の化合物は、例えばHeterocycles, Vol.81, No.9, 2010, 2075-2086に記載の製造方法により調製することができる。例えば、式（Ｉ）の化合物は以下のスキームに示す工程により合成することができる。
［式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、およびＲ１６は、本明細書において既に定義したとおりである］
式（ＩＩ）の化合物は、塩基存在下、例えば室温下、クロロホルムなどの適当な溶媒中で、クロロアセト酢酸エステル（例えば、クロロアセト酢酸エチルエステルなど）と反応させることにより、式（ＩＩＩ）の化合物に変換することができる。式（ＩＩＩ）の化合物は、例えば過熱下（例えば溶媒還流下）、適当な溶媒（例えばクロロホルムなど）の溶媒中で、アミンと反応させることにより、式（ＩＶ）の化合物に変換することができる。所望の化合物に対応する式（ＩＩ）の化合物を用いることにより、または式（ＩＩＩ）もしくは式（ＩＶ）の化合物の置換基を変換することのより、所望の式（Ｉ）の化合物を合成することができる。また必要に応じて保護基の導入および脱離を行ってもよい。
本発明における脳機能改善には、脳機能障害の改善、例えば、脳血管障害、脳外傷、脳腫瘍、ウイルス性脳炎、低酸素脳症、アルコール中毒などに起因する脳機能障害の改善が含まれる。本発明は特に、記憶障害、注意障害、遂行機能障害、社会的行動障害などの認知機能障害に適用することができる。認知機能障害には、例えば、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、およびハンチントン病など）、精神疾患（統合失調症、双極性障害、うつ病、恐怖症、睡眠障害、薬物依存症など）、広汎性発達障害（自閉症、アスペルガー症候群、精神遅滞、多動性障害、チック障害など）などが含まれる。
本発明の医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。
当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
本発明の治療剤、予防剤、または医薬組成物の投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の上記式（Ｉ）の化合物を含むことができる。本発明において上記式（Ｉ）の化合物は、一般に１〜１００００ｍｇ／日／成人の用量で使用されうる。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよい。
本発明の治療剤または予防剤は、必要に応じ、従来公知の着色剤、保存剤、香料、風味剤、コーティング剤、抗酸化剤、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、およびミネラル分（鉄、亜鉛、マグネシム、ヨードなど）などの成分を含有していてもよい。本発明の治療剤または予防剤は、医薬組成物、機能性食品、健康食品、飲料、サプリメントなどに適した形態、例えば顆粒剤（ドライシロップを含む）、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（チュアブル剤などを含む）、散剤（粉末剤）、丸剤などの各種の固形製剤、または内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液状製剤などの形態で調製してもよい。また、本発明の治療剤または予防剤は、そのまま、医薬組成物、機能性食品、健康食品、サプリメントなどとして使用することもできる。
製剤化のための添加物としては、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤が挙げられる。また、液剤の形態にする場合は、ペクチン、キサンタンガム、グアガムなどの増粘剤を配合することができる。また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にしたり、ペースト状の膠剤とすることもできる。さらに、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
本発明の１つの側面によれば、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルのカルシウムイオン流入量を増加させる作用を有する化合物を選抜する工程を含む、脳機能改善活性を有する化合物のスクリーニング方法が提供される。上記工程においては、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル発現細胞を用いたアッセイにより化合物を選抜してもよい。
本発明の別の側面によれば、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が異なる２種類の神経細胞を使用する、脳機能改善活性を有する化合物のスクリーニング方法が提供される。スクリーニング対象となる被検化合物としては特に限定されず、有機化合物および無機化合物（特に、低分子化合物）、タンパク質、ペプチドなどが例として挙げられる。
スクリーニングで使用される電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル発現細胞は、特に限定されない。好ましくは、下記式で表される化合物（ＳＡＫ３）：
の添加によりカルシウムイオンレベルの有意な上昇が観察される神経細胞を用いることができる。
スクリーニングで使用される、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が異なる２種類の神経細胞は、発現量が有意に異なれば特に限定されない。好ましくは、上記式で表される化合物（ＳＡＫ３）の添加によりカルシウムイオンレベルが実質的に上昇しない神経細胞を、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が低い細胞（細胞Ａ）として使用することができる。また、上記化合物の添加によりカルシウムイオンレベルの有意な上昇が観察される神経細胞を、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が高い細胞（細胞Ｂ）として好ましく用いることができる。
本発明のスクリーニングにおいては、哺乳動物由来の細胞を使用することができ、ヒト由来細胞、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることができる。
本発明のスクリーニングにおいては、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの発現量が低い天然の細胞を使用することができ、その具体例としては、神経芽腫細胞（例えば、Neuro2A細胞、PC12細胞）、HEK293細胞、COS7細胞などが挙げられる。または電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル遺伝子のノックアウト細胞を使用することもできる。これらの細胞は、細胞Ａとして使用することができる。
電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル発現細胞の具体例としては、中枢神経細胞（例えば、海馬錐体細胞、視床感覚関連細胞、小脳プルキンエ細胞、嗅球顆粒細胞など）末梢運動神経細胞（脊髄後根感覚神経、副腎髄質細胞など）などが挙げられる。または電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル遺伝子を導入した遺伝子組み換え細胞を使用することもできる。遺伝子を導入する電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの例としては、Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3などが挙げられる。これらの細胞を、細胞Ｂとして使用することができる。遺伝子を導入する細胞の具体例としては、神経芽腫細胞（例えば、Neuro2A細胞、PC12細胞）、HEK293細胞、COS7細胞などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法のアッセイ系において、特に細胞Ａを使用するアッセイ系Ａと細胞Ｂを使用するアッセイ系Ｂの両方において、ニコチンを添加することによりカルシウムイオンレベルが上昇することを確認する工程を含んでいてもよい。当該工程により、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル以外のＣａ２＋流入路が双方のアッセイ系に存在することを確認することができ、本スクリーニング方法のバリデーションとすることができる。
細胞の培養、遺伝子組み換え細胞の調製などは公知の方法に基づいて行うことができる。また、被検化合物の投与は、例えば、細胞が保持される溶液などに被検化合物を含ませることなどにより、対象に被検化合物を作用させることにより行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルにおけるＣａ２＋流入量増加により、アセチルコリン遊離を促進する作用を有する化合物のスクリーニングに利用することができる。このような化合物は、アセチルコリン遊離促進による脳機能改善効果を有するのに加え、例えばＺＳＥＴ１４４６といった臨床試験に供せられる化合物と同様の特性を有し、副作用のリスクなどの観点から医薬として好ましい特性を有すると考えられる。
本発明のさらに別の側面によれば、式（Ｉ）の化合物を含む、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤が提供される。ここで式（Ｉ）の化合物は本明細書において既に定義された通りである。本発明の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤は、例えば、試験用の試薬として使用することができる。本発明の別の態様によれば、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルを含む系に式（Ｉ）の化合物を添加する工程を含む、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルの活性化方法が提供される。
以下、実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試薬および統計処理
試験において以下の試薬を使用した：
ＺＳＥＴ１４４６（以下、ST101と称する）は公知の方法で合成することができる。Sonexa Therapeutics Inc (San Diego, USA) から供与を受けた化合物を本試験においては使用した。上記式（Ｉ）の化合物であるSAK 誘導体（SAK1, 3, 8, および9）は、Heterocycles, Vol.81, No.9, 2010, 2075-2086に記載の方法により調製することができる。本試験においては、国立大学法人信州大学・筧昭一教授から供与を受けた化合物を使用した。ミベフラジル２塩酸塩（Mibefradil dihydrocholoride）は、Sigma-Aldrich より購入した。
全てのデータは平均値 ± 標準誤差で算出した。統計上有意な差に関して、多群間の比較は一元配置分散分析 (one-way analysis of variance) 後に、Dunnett の多重比較法を用いて行った。また、危険率5%未満をもって統計上有意差ありと判定した。
［試験例１］マウス海馬ＣＡ１領域におけるシナプス伝達長期増強（ＬＴＰ）に対する影響
雄性マウスC57BL/6（10-12週齢）の脳を矢状断で切断し、海馬 CA1 領域を含む冠状断脳スライス (400 μm) を作製した。海馬スライスを95% O2/5% CO2 ガスで飽和させた人工脳脊髄液 (126 mM NaCl, 5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.3 mM MgSO4-7H2O, 1.26 mM KH2PO4, 2.4 mM CaCl2-2H2O, 10 mM グルコース) 中において、34 ℃で2時間回復させた。海馬スライスを測定チャンバーに移し、ST101 (100 pM)、SAK1 (100 pM)、SAK3 (100 pM) を人工脳脊髄液に添加して、灌流適用した。その後、海馬CA1領域に入力するSchaffer 側枝と交連線維を刺激電極で刺激し、それにより惹起される CA1 領域における シナプス後集合電位（fEPSP） の測定を行った。測定後、スライス切片から海馬 CA1 領域のみを切り出し、免疫ブロットによる測定用に、-80 ℃にて凍結保存した。
結果を図１〜４に示す。海馬におけるシナプス伝達長期増強（ＬＴＰ）は哺乳動物における記憶の素過程である。臨床治験中のST101にはＬＴＰ増強作用が見られないが、SAK1、SAK3には強い増強作用が確認された。本実験結果より、本発明の脳機能改善剤がシナプス伝達長期増強を誘導し、記憶に関する脳機能を改善することが予想される。
［試験例２］海馬CA1領域におけるCaMKIIの自己リン酸化反応（活性化反応）に対する影響
上記の凍結マウス脳スライス切片 (海馬 CA1 領域) を用いて、ホモジナイジングバッファー (50 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 % Triton X-100、4 mM EGTA、0.5 M NaCl、10 mM EDTA、1 mM Na3VO4、30 mM ピロリン酸ナトリウム、50 mM NaF、1 mM DTT、100 nM カリクリンＡ、50 μg/mL ロイペプチン、25 μg/mL ペプスタチンＡ、50 μg/mL トリプシン阻害剤) を1サンプルあたり150 μL 添加し、氷上でホモジナイズした。その後、冷却遠心分離機 (14,000×g、10 分、4 ℃) で遠心分離後に、上清100 μL を採取し、6×Laemmli buffer を20 μL 加え100 ℃ で3分間煮沸し、免疫ブロット用のサンプルとした。なお、上清の一部を用いてBradford法により蛋白質濃度を測定した。同量の蛋白質を含む試料を、10% SDS- ポリアクリルアミド電気泳動ゲル (SDS-PAGE gel) へ添加し、ゲル1枚当たり80 mA で180分間、SDS-PAGE を行った。泳動分離後、PVDF メンブレンに70 V で120分間転写を行った。抗体の非特異的結合を防ぐために、スキムミルクを5 % の濃度で溶解した Tween、Tris-bufferd saline (TTBS:50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl および 0.1 % Tween 20) 中にメンブレンを浸し、常温でブロッキングを 1 時間行った後、次に示す一次抗体を4 ℃で一晩反応させた。一次抗体には、抗リン酸化CaMKII抗体 (1:5000, Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 267, 22527-22533, 1992) 及び 抗CaMKII抗体 (1:5000, Fukunaga et al., J. Neurochem. 51, 1070-1078, 1988) を用いた。TTBS 溶液で洗浄後、メンブレンを 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)-標識化抗ウサギ IgG 抗体 (1:5000, GE healthcare, Buckinghamshire, UK) の二次抗体と常温で 60分間反応させた。TTBS 溶液による洗浄後、二次抗体に標識された HRP を ECL detection system (GE healthcare) により発光させ、X 線フィルム (Fuji Medical X-ray Film, Fuji Film) に感光させることによりバンドの検出を行った。免疫反応物の定量解析には NIH image 解析ソフトを用いた。
抗リン酸化CaMKII抗体及び抗CaMKII抗体を用いてブロッティングを行った結果を図５に示し、免疫反応物の定量解析結果を図６のグラフに示す。海馬におけるシナプス伝達長期増強 (LTP) には記憶形成に必須のカルシウム／カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) の活性化（自己リン酸化）が必須である。LTP増強作用のある SAK1およびSAK3の投与マウスにおいてはリン酸化されたCaMKIIが増加しており、CaMKII の活性化が増強されていることが確認された。
［試験例３］Ｔ型カルシウムチャネル非発現細胞と発現細胞での効果
マウス神経芽腫細胞株 Neuro2A 細胞は、Human Science Research Resources Bank (#IFO50081, Osaka, Japan) から購入した。Neuro2A 細胞は、10% 牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) に、37 ℃/5% CO2の条件下で培養した。その後 Neuro2A 細胞を、ガラスボトムディッシュに1〜2 x 106 cell/φ35-mm ディッシュの濃度で播種し標準培地に24時間培養した後、Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carsbad, CA, USA) を用いてT型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子を含んだプラスミドベクター (Lipofectamine 2000 : DNA=1μl : 1μg、1.5 ml の無血清培地) を用いてトランスフェクト（遺伝子導入）した。T型カルシウムチャネル（Cav3.1）遺伝子はOriGene Technologies, Inc.から、プラスミドベクターpCMV-SPORT6 は、Thermo Fisher Scientific Ltd.から、Lipofectamine 2000はInvitrogenから購入し、前述のLipofectamine 2000とプラスミドベクターとの比率調整以外は、Lipofectamine 2000に添付のプロトコルに従いトランスフェクトした。トランスフェクトから6時間後に無血清培地を標準培地に置換し、さらに48時間培養した後、Cav3.1発現を確認後に、カルシウムイメージング（カルシウム濃度測定）を行った。
T 型カルシウムチャネル発現 Neuor2A 細胞が撒かれたガラスボトムディッシュを灌流液（Krebs-Hepes緩衝液；KRH）中で、2.5 μM の Fura-2-AM (Sigma, St Louis, MO, USA) を添加し、37 ℃ で30分間インキュベートした。Fura-2-AMを含まないKRHに灌流液を置き換え、蛍光顕微鏡で細胞内カルシウムを測定しながら、Neuro2A 細胞を、SAK3 (100 pM)で刺激し、その後必要に応じて、ニコチン (1 μM)、ATP (0.1 μM)、DHPG (20 μM) でさらに刺激した。T型カルシウムチャネル阻害剤であるミベフラジル（mibefradil、１０μM）を添加する系においては、還流液（外液）に添加した。
経時的なカルシウム濃度変化を図７および図８に示す。Cav3.1 非発現細胞（図７）では、SAK3を添加してもカルシウム濃度に変化が無く、ニコチンの添加後にカルシウム濃度の上昇が確認された。Cav3.1 発現細胞（図８）では、SAK3添加後にカルシウム濃度の上昇が確認されたが、ミベフラジルを加えた系ではSAK3によるカルシウム濃度の上昇が確認されなかった。
SAK3により誘発されるカルシウムイオンの細胞内流入量を図９に示す。Cav3.1 非発現細胞（non-transfected cells)ではSAK３はカルシウムイオン流入量の変化は見られないのに対し、Cav3.1 発現細胞（transfected cells）ではカルシウムイオン流入量の上昇が確認された。この上昇はT型電位依存性カルシウムチャネル阻害剤であるミベフラジル（mibe）の添加によってほぼ消失した。図１０はニコチンにより誘導されるカルシウムイオン流入量を示す。非発現細胞に比べて、発現細胞ではSAK3存在下でニコチン誘発のカルシウムイオン流入量の上昇が２倍に亢進する。一方で、ミベフラジル（mibe）の添加によりSAK3の効果は消失した。
Ｔ型カルシウムチャネル発現細胞でのATP誘発と代謝型グルタミン酸受容体アゴニスト誘発に対する SAK3の効果を図１１〜１４に示す。図１１はカルシウムイオン濃度の経時的変化を、図１２はATP添加により誘発されるカルシウムイオン流入量を示す。図１３はカルシウムイオン濃度の経時的変化を、図１４は、代謝型グルタミン酸受容体アゴニストである３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）の添加により誘発されるカルシウムイオン流入量を示す。ATPまたはDHPGの添加により誘発されるカルシウムイオン流入量は、SAK3の存在下で増強されることはなく、SAK3はATP受容体および代謝型グルタミン受容体を解するカルシウム流入には影響しないことが示された。
Ｔ型カルシウムチャネル非発現細胞と発現細胞でのSAK3とST101の効果の比較試験結果について、SAK3の添加による影響の経時変化を図１５に、ST101の添加による経時変化を図１６にそれぞれ示す。Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルに対してSAK3はST101に比較して10倍以上の活性化を示す。この結果は海馬神経細胞においてCaMKII活性化作用の違いと相関している。即ち、海馬神経細胞においてもSAK3はT型電位依存性カルシウムチャネルの活性化反応を介して、LTPを増強していると考えられる。
［試験例４］認知機能改善効果
実験には、10週齢のDDY 雄性マウス (Nippon SLC, Hamamatsu, Japan) を使用した。動物は東北大学大学院薬学研究科の動物実験施設において一定条件下 (温度22±2 ℃、12h:12h明暗サイクル) で、水・飼料を自由に与えて飼育を行った。尚、本論文中に記載した動物の取り扱い及び動物実験は、東北大学実験動物委員会の承認を得て、東北大学動物実験指針に基づいて行った。
嗅球摘出マウス（OBXマウス）は、DDY 雄性マウスを用いて作製した。嗅球摘出手術は、ペントバルビタールナトリウム (50mg/kg i.p.; Dainippon, Osaka, Japan) で麻酔した条件で施行した。マウスを脳固定器に固定し、嗅球上の頭蓋骨をドリルで穿孔し、直径1mmの穴をあけた。嗅球を、吸引ポンプにて前頭前皮質を傷つけないように吸引除去した。Sham 群では、嗅球の吸引除去を除いて OBX 群と同一の操作を行った。
SAK3 は、5% ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解して用いた。行動薬理試験開始30分前に、SAK3 (0.1-3.0 mg/kg) を腹腔内に投与し、対照群のマウスには同量の溶剤（Veh.）を投与した。
Y 字型迷路試験：マウスの自発運動量と空間作業記憶を評価する Y 字迷路試験を行った。マウスを Y 字迷路のいずれかのアームの先端に置き、8分間にわたって迷路内を自由探索させ、マウスが移動したアームの位置を選択した順に記録した。マウスが測定時間内に各アームに移動した回数をカウントし、これを total arm entries とした。さらに、この中で連続して異なる三つのアームを選択した組み合わせをカウントし、この数を交替行動回数 (No. of alternation) とした。No. of alternation の total arm entries から 2 を引いた数に対する割合を、正常の交替行動の指標 (空間作業記憶の正解率) として alternation (%) で表した。total arm entries と alternation (%)を図１７と１８にそれぞれ示す。
新奇物体認識試験：本試験はマウスの新奇性を好む特性を利用したもので、2つのオブジェクトを置いた装置内で10分間自由に探索させた (訓練試行、training session)。訓練試行の1時間後、片方を新奇オブジェクトに置換した装置内でさらに5分間自由に探索させた (保持試行、trial session)。訓練試行及び保持試行では、2つのオブジェクトに対するそれぞれの接触回数を測定した。保持試行における総接触回数に対する新奇オブジェクトの接触回数の割合 (%) を判別指数 (Discrimination index) として算出した。結果を図１９に示す。図１９の白抜きのグラフは訓練試行から存在した既知オブジェクトへの保持試行における総接触回数の割合で、黒カラムは新奇オブジェクトの接触回数の割合［判別指数 (Discrimination index)］を表示する。
図１７および１９に示されるY字迷路試験および新奇物体認識試験の結果より、嗅球摘出による認知機能障害が 1 mg/kg の投与によりほぼ改善されることが確認された。
［試験例５］海馬内アセチルコリン遊離促進効果
海馬内で遊離するアセチルコリンの量をマイクロダイアリス法により測定した。ガイドカニューレ及び透析プローブ (AG-4; Eicom, Kyoto, Japan) の設置は、1.5% ハロタン (Takeda Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) で麻酔を維持した条件でマウスを脳定位固定装置に固定し、左側海馬 (AP=+3, L=+3, V=-1.8) にガイドカニューレを設置し、ガイドカニューレに透析プローブを挿入した。マウス海馬からの脳内 ACh 試料採取は、プローブ設置手術の翌日に行った。手術からの回復を確認したマウスを、無麻酔、自由行動下でプローブをマイクロポンプ (ESP-64; Eicom) に接続して、リンゲル液 (1.3 mM CaCl2, 3mM KCl, 146 mM NaCl および 1mM MgSO4) を毎分2μL の流速で流した。ダイアリシス試料は19.5分毎に採取し、オートインジェクター (EAS-20; Eicom) を用いてアセチルコリン分離用カラムに注入し、分析には微量生体資料分析システム (HTEC-500; Eicom) を用いた。SAK3は、試験開始４０分前（図８のグラフで−４０分の時点）に腹腔内投与した。ニコチン誘発性 ACh 遊離は、3mM ニコチンを含むリンゲル液をプローブから試験開始から２０分間（図２０のグラフの０〜２０分の間）灌流投与し、その後は通常のリンゲル液に置換え測定した。
上記の試験結果を図２０および図２１に示す。認知機能障害を示す嗅球摘出マウス（OBXマウス）をにおいて、SAK3を投与しない群ではニコチンによるアセチルコリンの遊離量は Sham群と比べて顕著に低下しているが、SAK投与群ではアセチルコリンの遊離量が上昇し、1.0 mg/kg 投与群では Sham 群を上回る遊離量が確認された（図２０および２１）。
［試験例６］マウス大脳皮質細胞におけるCaMKIIの自己リン酸化反応（活性化反応）に対する影響
マウス大脳皮質の分散培養は既報の方法（Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 267, 22527-22533, 1992）に従って行った。3週間培養後にインキュベーションメディウム（KRH）に 100pMのSAK3, SAK8, SAK9を添加して、30分間インキュベーションした。刺激後メディウムを除去、細胞は凍結保存した。凍結した大脳皮質細胞は試験例２における方法と同様の方法により、ホモジナイズ後に免疫ブロット法にて、CaMKIIの活性化状態（自己リン酸化反応）を定量分析した。
抗リン酸化CaMKII抗体及び抗CaMKII抗体を用いてブロッティングを行った結果を図２２に示し、免疫反応物の定量解析結果（２例）を図２３および２４のグラフに示す。SAK3、SAK8、およびSAK9の投与マウスにおいてはリン酸化されたCaMKIIが増加しており、CaMKII の活性化が増強されていることが確認された。

Claims (15)

  1. 式（Ｉ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、シアノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３を表し；
    Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、−Ｘ１−Ｒ１４、または−ＮＲ１５Ｒ１６を表し；
    Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１７Ｒ１８、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１９から選択され；
    Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；または
    Ｒ１１およびＲ１２はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環を形成し、該含窒素ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アミノＣ１−６アルキル、（Ｃ１−６アルキルアミノ）Ｃ１−６アルキル、［ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ］Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４、−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、または−ＳＯ２−を表し；
    Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；
    Ｒ１５は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２１を表し、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    Ｒ１６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、または５〜１０員ヘテロアリールを表し、ここで該アルキル基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
    Ｒ１５およびＲ１６はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環を形成し、該含窒素ヘテロ環基は、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アミノＣ１−６アルキル、（Ｃ１−６アルキルアミノ）Ｃ１−６アルキル、［ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ］Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４、−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；またはＲ１７およびＲ１８はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し；
    Ｒ１９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され；
    Ｒ２１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで該アルキル基およびアルコキシ基は、Ｃ６−１０アリール、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ２４から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択され、またはＲ２２およびＲ２３はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、含窒素ヘテロ環基を形成し；
    Ｒ２４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから選択される］
    で表される化合物または医薬として許容なその塩を含有する、脳機能改善に使用される医薬組成物。
  2. Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、請求項１に定義された１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、請求項１に記載の組成物。
  3. Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が請求項１に定義されたとおりである、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は請求項１に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、請求項３に記載の組成物。
  5. Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が
    ２’，３’−ジヒドロ−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２−メチルチオ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２−メチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソ−２−（フェネチルアミノ）スピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−８−メチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−（エトキシカルボニルメチル）アミノ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−８−メチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２−ジメチルアミノ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−８−メチル−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    ２’，３’−ジヒドロ−６，８−ジメチル−２’，４−ジオキソ−２−ピペリジノスピロ［２−シクロペンテン−１，３’−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン］−３−カルボン酸エチルエステル；
    および医薬として許容なそれらの塩；
    から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 認知機能障害の治療または予防に使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 認知機能障害が、神経変性疾患、精神疾患、および広汎性発達障害から選択される疾患である、請求項７に記載の組成物。
  9. 認知機能障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、およびハンチントン病、統合失調症、双極性障害、うつ病、恐怖症、睡眠障害、薬物依存症、自閉症、アスペルガー症候群、精神遅滞、多動性障害、およびチック障害から選択される疾患である、請求項７に記載の組成物。
  10. 有効量の式（Ｉ）：
    ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、請求項１に定義されたとおりである］で表される化合物を含む、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
  11. Ｒ１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１３であり、Ｒ１３は、請求項１に定義した１以上の置換基により置換されていてもよいＣ１−６アルキルである、請求項１０に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
  12. Ｒ２が、Ｃ１−６アルキルチオまたは−ＮＲ１５Ｒ１６を表し、Ｒ１５およびＲ１６が請求項１に定義されたとおりである、請求項１０または１１に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
  13. 基−ＮＲ１５Ｒ１６が、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、［（Ｃ１−６アルコキシカルボニル）Ｃ１−６アルキル］アミノ、もしくは［（Ｃ６−１０アリール）Ｃ１−６アルキル］アミノを表し、または基−ＮＲ１５Ｒ１６が、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−モルホリニル、もしくは１−ホモピペリジニルから選択される含窒素ヘテロ環基を表し、ここで該含窒素へテロ環基は請求項１に定義された１以上の置換基により置換されていてもよい、請求項１２に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
  14. Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
  15. 式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容なその塩が、請求項６に記載の化合物および医薬として許容なそれらの塩から選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性化剤。
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