JPWO2012081420A1

JPWO2012081420A1 - カンキツグリーニング病の治療液及びこれを用いた治療方法

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Publication number: JPWO2012081420A1
Application number: JP2012548729A
Authority: JP
Inventors: 淑邦正岡; 臼井　誠; 誠臼井; 倫也松山
Original assignee: Hiroshima University NUC; Aichi Steel Corp
Current assignee: Hiroshima University NUC; Aichi Steel Corp
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2014-05-22
Anticipated expiration: 2031-12-01
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Abstract

カンキツグリーニング病に罹った柑橘類の樹木を治療できるカンキツグリーニング病の治療液及びこれを用いた治療方法を提供する。カンキツグリーニング病の治療液は、Ｆｅイオンを含有し、少なくともその一部がＦｅ２＋イオンとして存在する。この治療液は、所定量のＦｅイオンと酸とを含有する。この治療液をカンキツグリーニング病に感染した柑橘類の樹木の葉面に散布することや、根本に灌水することにより、カンキツグリーニング病を治療することができる。

Description

本発明は、カンキツグリーニング病の治療液及びこれを用いた治療方法に関する。

カンキツグリーニング病（Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ：以下、ＨＬＢ病とも記す）は、柑橘類の最重要病害のひとつである。ＨＬＢ病は、ＨＬＢ菌が柑橘類等の樹木に感染して起こる植物病である。

ＨＬＢ病に罹った柑橘類の果実は小さく、また熟しているにもかかわらず、その大部分が緑色のままであり、その味も相当苦い。従って、ＨＬＢ病に罹った柑橘類の果実の商品価値はほとんどない。また、ＨＬＢ病に罹った樹木は落葉し、やがて枯死する。このため、ＨＬＢ病は、園芸農業に対して大打撃をもたらす深刻な病害である。

現状におけるＨＬＢ病の対処方法は、罹病樹の早期発見及び伐採、媒介虫であるカンキツキジラミの防除が最善策とされている。ＨＬＢ病を発見する方法として、特許文献１にカンキツグリーニング病の検出方法、及び検出キットが開示されている。

特開２００６−２６７０９２号公報

特許文献１の発明では、ＨＬＢ病に罹った樹木を簡易的に検出することができるが、ＨＬＢ病に罹った樹木は伐採せざるをえなかった。

本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、カンキツグリーニング病に罹った柑橘類の樹木を治療できるカンキツグリーニング病の治療液及びこれを用いた治療方法を提供することにある。

本発明の第１の態様に係るカンキツグリーニング病の治療液は、Ｆｅイオンを含有し、該Ｆｅイオンの少なくとも一部がＦｅ^２＋イオンであることを特徴とする。

総Ｆｅイオン濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。

また、前記治療液は総Ｆｅイオンに加えさらに酸を含有することが好ましい。

また、前記酸が有機酸であることが好ましい。

また、前記有機酸がカルボキシル基及びヒドロキシル基のうち少なくとも一方を有し、該カルボキシル基及びヒドロキシル基の合計が２つ以上であることが好ましい。

また、前記有機酸がクエン酸、リンゴ酸、酒石酸及びアスコルビン酸のうち少なくとも１種であることが好ましい。

前記治療液を施用する植物が、柑橘類植物であることが好ましい。

前記治療液を施用する植物が、ラフレモン、タンカン又はシークワーシャーであることが好ましい。

本発明の第２の態様に係るカンキツグリーニング病の治療方法は、上記いずれかに記載の治療液をカンキツグリーニング病に感染した柑橘類植物の葉面、根圏、又は葉面及び根圏の両方に施用して、該柑橘類植物中の病原菌を減少又は消滅させることでカンキツグリーニング病を治療することを特徴とする。

本発明に係るカンキツグリーニング病の治療液をカンキツグリーニング病に罹った樹木に施用することでカンキツグリーニング病を治療することができ、樹木を伐採する必要がない。

Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。治療液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は治療液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。治療液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。治療液を施用した検体の枝の伸長を示す図である。（ａ）（ｂ）は治療液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。治療液を施用した検体のＰＣＲ診断結果を示す図である。ルミノール反応による活性酸素の測定結果を示す図である。ルミノール反応による活性酸素の測定結果を示す図である。（ａ）（ｂ）はルミノール反応による活性酸素の測定結果を示す図である。

（カンキツグリーニング病の治療液）
本実施の形態に係るカンキツグリーニング病の治療液（以下、単に治療液ともいう）は、Ｆｅ^２＋イオンを含有する。この治療液は、Ｆｅ^２＋イオンを安定に保持している。

本実施の形態に係る治療液は、Ｆｅ^２＋イオンを供給することができる鉄化合物を水に溶解して得ることができる。本実施の形態に係る治療液において、Ｆｅ^２＋イオンを供給することができる鉄化合物としては、水溶液中でＦｅ^２＋イオンを含有することができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ＦｅＯ、ＦｅＳＯ_４等の二価の鉄化合物を用いることができる。また、クエン酸鉄のように粉末では三価の鉄を含む鉄化合物であっても、水に溶けるとＦｅ^３＋イオンとＦｅ^２＋イオンとの平衡により、水溶液中でＦｅ^２＋イオンを含有することができるものであればよい。

本実施の形態に係る治療液に含有される総Ｆｅイオンの濃度は、好ましくは１０ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌである。より好ましくは１２ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌである。さらに好ましくは１５ｍｇ／Ｌから３０ｍｇ／Ｌである。１０ｍｇ／Ｌよりも低い場合は、十分なＨＬＢ病の治療効果を得ることができない。また、１００ｍｇ／Ｌよりも高い場合は、ＨＬＢ病を罹患した樹木自体を痛めてしまう恐れがある。通常、栄養成分として鉄を植物に施用する場合、１〜１．５ｍｇ／Ｌの濃度範囲で用いる。これに対し、本実施の形態に係る治療液は１０〜１００ｍｇ／Ｌの高濃度で総Ｆｅイオンを含有することにより、ＨＬＢ病の治療に優れた効果を有する。

本明細書において、「総Ｆｅイオン」とは、二価の鉄イオン（Ｆｅ^２＋イオン）及び三価の鉄イオン（Ｆｅ^３＋イオン）を含む。
Ｆｅ^２＋イオン濃度は、例えばｏ−フェナントロリンを用いた既存の方法によって測定することができる。ｏ−フェナントロリンはＦｅ^２＋イオンと選択的に錯体を形成するため、この錯体の吸光度を測定することにより、Ｆｅ^２＋イオンを選択的に定量することができる。また、溶液中に含まれるＦｅ^３＋イオンをあらかじめ還元して全Ｆｅイオンを二価鉄とした後にｏ−フェナントロリン法を用いて定量することにより、総Ｆｅイオン量を定量することができる。

一般に、Ｆｅ^２＋イオンは酸化されてＦｅ^３＋イオンになりやすいが、本実施の形態に係る治療液は、好ましくは酸を含むことによってＦｅ^２＋イオンを安定に保持することができる。治療液に含まれる酸は、Ｆｅ^２＋イオンを安定に保持することができれば、有機酸であってもよいし、無機酸であってもよい。Ｆｅ^２＋イオンをより安定に保持できるので、有機酸が好ましい。

有機酸は、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を備える、カルボキシル基とヒドロキシル基との合計が２つ以上の酸であり、水中で上記の鉄化合物から生じるＦｅ^２＋イオンとキレートを形成する。これにより、Ｆｅ^２＋イオンが水中で安定して存在する。カルボキシル基を備える有機酸として、クエン酸（無水クエン酸）、リンゴ酸、酒石酸及びシュウ酸等が挙げられる。ヒドロキシル基を備える有機酸として、アスコルビン酸等が挙げられる。また、カルボキシル基とヒドロキシル基を両方備える有機酸として、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等が挙げられる。これらは１種のみを用いても、２種以上を併用してもよい。

これらのなかでも、治療液中におけるＦｅ^２＋イオンの安定性が優れるため、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸及びアスコルビン酸が好ましい。更に、これら有機酸と鉄化合物とを含有する水溶液を調整した場合に、有機酸濃度に対するＦｅ^２＋イオン濃度が高いため、クエン酸及び酒石酸が好ましい。また、これらのなかでも、有機酸と鉄化合物とを含有する水溶液を調製した場合に、有機酸濃度に対するＦｅ^２＋イオン濃度が特に高いため、クエン酸が最も好ましい。また、クエン酸は柑橘類自身が生成する有機酸でもあるので、柑橘類に害を与えることもない。

また、この治療液に用いられる水は、特に限定されず、種々の水を用いることができる。純水及びイオン交換水等の高度に精製された水であってもよく、水道水、工業用水、農業用水及び地下水等の通常使用される水であってもよい。

また、治療液には、有機酸及び鉄化合物のほか、例えばマグネシウムやカルシウムといった他の栄養成分等が含まれていてもよい。

また、本実施の形態に係る治療液は、以下の製造方法によって得ることもできる。
有機酸粉末とＦｅ^２＋イオンを供給することができる鉄化合物粉末とを水に加熱溶解して得ることができる。

また、予め全量の有機酸粉末を水に溶解させて得られた有機酸水溶液にＦｅ^２＋イオンを供給する鉄化合物粉末を添加して加熱して得ることもできる。

また、クエン酸第一鉄等の有機酸第一鉄の粉末を水に添加し加熱して得ることもできる。

また、加熱せず有機酸粉末とＦｅ^２＋イオンを供給する鉄化合物粉末と水とを混合して得ることもできる。

本実施の形態に係る治療液は、ＨＬＢ病に罹った柑橘類の樹木に施用されることで、ＨＬＢ病の治療をすることができる。柑橘類には、例えば、ラフレモン（Ｃｉｔｒｕｓｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、タンカン（Ｃｉｔｒｕｓｔａｎｋａｎ）、シークワーシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨａｙａｔａ）、温州みかん（Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ）等が含まれる。その中でも特に、ラフレモン（Ｃｉｔｒｕｓｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、タンカン（Ｃｉｔｒｕｓｔａｎｋａｎ）及びシークワーシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨａｙａｔａ）が好ましい。

ＨＬＢ菌は、師部局在性かつ難培養性の多様性グラム陰性の細菌様微生物であり、アジア型、アフリカ型、アメリカ型と呼ばれる３系統に類別され、それぞれＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｉａｔｉｃｕｓ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒａｆｒｉｃａｎｕｓ、及び、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓの３系統に類別される。本実施の形態に係る治療液は、いずれの系統のＨＬＢ菌による感染にも用い得る。

治療液の施用は、例えば、樹木の葉面に散布することや、樹木の根本、即ち根圏に灌水することで行えばよい。

柑橘類の樹木への治療液の施用頻度、及び、１回に施用する治療液の量について、特に制限はない。一例として、後述の実施例のように、Ｆｅ^２＋イオン濃度１５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌの治療液を、１回につき５０ｍＬで、５日に１回施用することによりカンキツグリーニング病に罹った柑橘類の樹木を治療することができる。

カンキツグリーニング病の治療メカニズムは定かではないが、後述の実施例にて説明するように、樹木に施用された治療液によって発生するヒドロキシラジカルが影響していると推察される。
一般に、病原体等の侵入物に対する細胞の耐性には活性酸素が関与していることが知られている。この活性酸素は細胞内において病原性ストレスから細胞を保護する働きを有し、細胞内の活性酸素濃度は、細胞内で発生した過酸化水素が二価鉄と反応してヒドロキシラジカルを生成するフェントン反応を介して制御される。
本実施の形態に係る治療液は、Ｆｅ^２＋イオンを安定に保持し、後述の実施例に示すようにヒドロキシラジカルを持続的に発生することができる。そのため、この治療液を樹木に施用すると、柑橘類の細胞内で反応性の高いヒドロキシラジカルを生じ、このヒドロキシラジカルが直接的にＨＬＢ菌を死滅させる、或いは、細胞内で何らかの反応性を促して、二次的作用でＨＬＢ菌を死滅させることにより、カンキツグリーニング病を治療することができると考えられる。

また、カンキツグリーニング病に罹った柑橘類の樹木では、正常な樹木に比べ鉄分が減少していることがわかっている。通常、植物は根からＦｅ^３＋イオンを還元してＦｅ^２＋イオンを摂取しているが、本実施の形態に係る治療液ではＦｅ^２＋イオンが安定して存在している水溶液であるので、Ｆｅ^２＋イオンをそのまま摂取することができる。そして、この治療液はＦｅ^２＋イオンを多量に含んでいるので、柑橘類の樹木が多くのＦｅ^２＋イオンを直接摂取でき、不足した鉄分を補充し、治療効果が高められていることも考えられる。

（試験用Ｆｅ水溶液の調整）
以下の試験用のＦｅ水溶液をそれぞれ調整した。
１．Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液
２．治療液Ａ（水溶液）
３．治療液Ｂ（水溶液）
４．クエン酸鉄水溶液
５．硫酸鉄水溶液

（１．Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液）
Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液は、Ｆｅ−ＥＤＴＡ（シグマアルドリッチジャパン製、商品名：エチレンジアミン四酢酸（ＩＩＩ）ナトリウム）を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌになるように脱塩蒸留水で溶解することにより調整した。

（２．治療液Ａ（水溶液））
治療液Ａは、水１００ｍＬあたりのクエン酸が１４ｇであり、水１００ｍＬあたりのＦｅが、クエン酸の含有量を１００質量部とした場合に、４０質量部である治療液Ａ原液を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌになるよう脱塩蒸留水で希釈することにより調整した。
治療液Ａ原液を希釈した水溶液は、各々Ｆｅ^２＋イオンとＦｅ^３＋イオンとを含有し、Ｆｅ^２＋イオンとＦｅ^３＋イオンとの合計量を１００質量％とした場合に、Ｆｅ^２＋イオンが２０〜４０質量％である。但し、この各イオン濃度は、後述する測定方法により測定された値である。

（３．治療液Ｂ（水溶液））
治療液Ｂは、水１００ｍＬあたりのクエン酸が１４ｇであり、水１００ｍＬあたりのＦｅが、クエン酸の含有量を１００質量部とした場合に、１３質量部である治療液Ｂ原液を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌになるよう脱塩蒸留水で希釈することにより調整した。
治療液Ｂ原液を希釈した水溶液は、各々Ｆｅ^２＋イオンとＦｅ^３＋イオンとを含有し、Ｆｅ^２＋イオンとＦｅ^３＋イオンとの合計量を１００質量％とした場合に、Ｆｅ^２＋イオンが５０〜９０質量％である。但し、この各イオン濃度は、後述する測定方法により測定された値である。

（４．クエン酸鉄水溶液）
クエン酸鉄水溶液は、クエン酸鉄（昭和化工株式会社）を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌとなるように脱塩蒸留水で溶解することにより調整した。

（５．硫酸鉄水溶液）
硫酸鉄水溶液は、硫酸鉄を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌとなるように脱塩蒸留水で溶解することにより調整した。

（総Ｆｅイオン濃度の測定）
治療液Ａ、治療液Ｂ、クエン酸鉄水溶液、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液及び硫酸鉄水溶液について、これらの水溶液中に含まれるＦｅ^２＋イオンを確認するため、各Ｆｅ水溶液におけるＦｅ^２＋イオン濃度を測定した。なお、本測定は、総Ｆｅイオン濃度が約５０ｍｇ／Ｌになるように調整されたＦｅ水溶液を用いて行った。
まず、上記と同様にして、治療液Ａ原液を総Ｆｅイオン濃度が約５０ｍｇ／Ｌとなるようにイオン交換水で希釈して治療液Ａ水溶液を調整した。その後、すぐにＲＱｆｌｅｘ多項目水質検査器（Ｍｅｒｃｋ社製）とリフレクトクァント鉄イオン試験紙（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて、得られた水溶液に含有されるＦｅ^２＋イオンと総Ｆｅイオンとを測定した。測定は、リフレクトクァント鉄イオン試験紙に添付のプロトコールに従って行った。また、総Ｆｅイオン量からＦｅ^２＋イオン量を差し引いた量をＦｅ^３＋イオン量として換算した。尚、この測定では常に直射日光の差し込まない室内において作業を行った。

この測定の結果、Ｆｅ^２＋イオン濃度は１０．４ｍｇ／Ｌであり、Ｆｅ^３＋イオン濃度は３６．６ｍｇ／Ｌであり、Ｆｅ^２＋イオンとＦｅ^３＋イオンとの合計を１００質量％とした場合にＦｅ^２＋イオンは２２質量％であった。

上記と同様に、治療液Ｂ、クエン酸鉄、Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び硫酸鉄を総Ｆｅイオン濃度が約５０ｍｇ／Ｌになるように調整して各々の水溶液におけるＦｅ^２＋イオン濃度と総Ｆｅイオン濃度、総Ｆｅイオンに占めるＦｅ^２＋イオンの割合を測定した。その結果を表１に示す。

このように、治療液Ａ水溶液、治療液Ｂ水溶液、クエン酸鉄水溶液及び硫酸鉄水溶液は、何れもＦｅ^２＋イオンを所定の割合で含有することが確認された。一方、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液は、Ｆｅ^３＋イオンを安定に保持していることが確認された。

（カンキツグリーニング病の治療効果の検証）
カンキツグリーニング病に感染した柑橘類の樹木に、上記のＦｅ水溶液を施用し、Ｆｅ^２＋イオンを含有する治療液のカンキツグリーニング病に対する治療効果について検証した。

１．ラフレモンにおける効果
検体としてラフレモン（ＣｉｔｒｕｓｖｅｒｒｕｃｏｓａＬｕｓｈ．）の樹木を用いた。まず、ラフレモンの種子を発芽させ、約１Ｌのポット植、野菜育苗用培土（タキイ種苗株式会社製）で育成した。育成１年後に、接ぎ木によって病原木から病原菌を摂取させて、カンキツグリーニング病を感染させた。病原木は、石垣島から採取され「Ｉｓｈｉ−１」と命名された病原菌株を感染させたものである。感染後、更に１年育成した検体を試験に供した。同様にして、カンキツグリーニング病を感染させた検体を１０検体（検体Ａ〜検体Ｊ）準備した。

なお、栽培はグロスキャビネット内で行った。昼間温度３２℃、夜間温度２８℃の条件で行った。１０日おきに栄養分を土壌に施用した。施用した栄養分は、１０ｍＭ硝酸カルシウム、２．５ｍＭリン酸二水素一カリウム、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム７水和物、１ｍＭ硫酸カリウムを含む水溶液であり、これを１ポットにつき５０ｍＬ／１回与えた。

１−１．Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液の施用
以上のように準備した１０検体（検体Ａ〜検体Ｊ）を育成し、まず、育成６０日目までは、５検体（検体Ａ〜検体Ｅ）に対して、総Ｆｅイオン濃度１５ｍｇ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液を施用した。また、他の５検体（検体Ｆ〜検体Ｊ）に対して、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液の代わりに蒸留水を施用した。

上記のＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液、及び、蒸留水の施用は、検体の葉に散布すること、及び、検体の根本に灌水することにより行った。葉への散布、及び根本への灌水は、それぞれ５日に１回行った。葉へ散布したＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液、及び蒸留水の量は、１回につき５０ｍＬである。また、根本へ灌水したＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液、及び蒸留水の量は、１回につき５０ｍＬである。

Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液処理開始後（育成）６０日目に、それぞれの検体の葉を３〜５枚ほど採取してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて増幅して、カンキツグリーニング病の診断（以下、ＰＣＲ診断という）を行った。具体的には、以下のように行った。

（１）ＤＮＡの抽出
採取した各葉（３〜５ｇ）を蒸留水で洗浄して水分を除き、中肋を切り取った後、液体窒素を用いて凍結させた。これを蒸気滅菌・乾熱滅菌した乳鉢・乳棒でホモジナイズして、５ｍＬの１×ＣＴＡＢバッファー（１％ＣＴＡＢ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．７ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、６５℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした後、クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）を５ｍＬ加え、３０分間転倒混和し３０００ｒｐｍ×１５分遠心分離し、上澄みをスポイドで新しい遠心チューブに移した。以上の除タンパク質処理を３回行った。上澄みの１／１０量の１０％ＣＴＡＢ溶液（１０％ＣＴＡＢ、０．７ＭＮａＣｌ）を加え転倒混和し除タンパク質処理によって失われたＣＴＡＢを補充した。その上澄みに等量のＣＴＡＢ沈殿液（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、０．１０ｍＭＥＤＴＡ）をゆっくり加え、静かに転倒混和した。上澄みにある核酸は低濃度（０．３５M以下のＮａＣｌ）でＣＴＡＢと結合し沈殿する。一晩静置、沈殿させ、１８００ｒｐｍ×１５分で遠心分離し、デンプンを含む上澄みを捨てた。沈殿に１ｍＬの沈殿溶解液（１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）を加え、核酸・ＣＴＡＢ複合体を分離し、核酸を溶かした。この核酸溶液に等量のイソアミルアルコールをゆっくり加えて、核酸を沈殿させた。１８００ｒｐｍ×１０分で遠心分離し、ＣＴＡＢを含む上澄みを捨てた。７０％エタノールで沈殿及び遠心管側面のＣＴＡＢを洗浄し、同様に遠心してＣＴＡＢを除去した。最後に１／１０ＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）で核酸を溶解した。核酸溶液の純度は分光光度計で２６０ｎｍ／２３０ｎｍでデンプン混入度を、２６０ｎｍ／２８０ｎｍでタンパク質の混入度を評価し、両値とも１．８以上のものを次の実験に使用した。また、アガロース電気泳動によりλＤＮＡ（４７．５ｋｂ）以上の高分子の核酸溶液を次の実験に使用した。ＤＮＡ量は蛍光分光光度計で測定した。

（２）ＰＣＲ診断
ＰＣＲ診断は、「ＭａｒｊｏｒｉｅＡ．Ｈｏｙ，ＡｙｙａｍｐｅｒｕｍａｌＪｅｙａｐｒａｋａｓｈ，ａｎｄＲｕＮｇｕｙｅｎ（２００１），ＬｏｎｇＰＣＲｉｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＬｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｉａｔｉｃｕｍｉｎＰａｒａｓｉｔｏｉｄｓＵｎｄｅｒｇｏｉｎｇＲｉｓｋＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｉｎＱｕａｒａｎｔｉｎｅ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ２２，２７８−２８７」に記載の方法に従って行った。
具体的には、４８ｍＭＭｇＣｌ_２１μＬ、ＴａｋａｒａＰｒｅｍｉｘｔａｇ２×ＰＣＲ溶液１０μＬ（Ｔａｋａｒａ，ＢｉｏＩｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、９０ｎｇ／μＬフォワードプライマーＭＨＯ０３５１μＬ、９０ｎｇ／μＬリバースプライマーＭＨＯ０３５４１μＬ、上記にて抽出したＤＮＡ試料２μＬ（２０ｎｇ）、及び滅菌水５μＬを混合してＰＣＲ反応液２０μＬを調整した。このＰＣＲ反応液を、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＴＣ−１１４８（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にセットし、以下の条件でＤＮＡを増幅した。
プライマー
フォワードプライマー（ＭＨＯ０３５３）：
5’-CACCGAAGATATGGACAACA-3’ （配列番号１）
リバースプライマー（ＭＨＯ０３５４）：
5’-CAGGTTCTTGTGGTTTTTCTG-3’ （配列番号２）
ＰＣＲ条件
９０℃ ３分１サイクル
｛９４℃ １分、６８．５℃ １分、７２℃ ３分｝３５サイクル
７２℃ ３分１サイクル
４℃で泳動まで保存

ポジティブコントロール（ＰＣ）には、病原菌株Ｉｓｈｉ−１が感染した病原木から採取した葉から上記のＤＮＡの抽出方法によって抽出されたＤＮＡ試料を用いた。

上記ＰＣＲ法にて増幅した試料１７μＬについて、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動し、臭化エチジウム染色により増幅されたＤＮＡを検出した。
Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液を施用した検体のＰＣＲ診断結果及び蒸留水を施用した検体のＰＣＲ診断結果を図１及び表２に示す。図中、ｍは分子量マーカーを流したレーンを示す。

図１に示されるように、ポジティブコントロール（ＰＣ）には所定の位置（図中、矢印で示す）に陽性バンドが検出された。この陽性バンドが検出された場合は、検体はカンキツグリーニング病に罹病しており、検出されない場合は罹病していないと判断することができる。また、表２には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。
電気泳動結果のバンド強度は、ＩｍａｇｅＪ（画像処理プログラム、ＮＩＨ）を用いて解析した。まず、ＰＣのバンド部分（図中、白い領域）を選択し、選択された領域の輝度（濃さ）を数値化した。各試料のバンド部分についても、ＰＣのバンドで選択された領域と同じ面積を有する領域内の濃さを数値化した。次にブランクになっている黒い部分の濃さも同様にして数値化し、各バンドの濃さの数値から差し引いた値を各バンドの元の数値とした。表２には、ポジテイブコントロール（ＰＣ）の濃さを１００％とした場合の各バンドの元の数値の相対値（％）を示している。
その結果、いずれの検体もＰＣと同じ位置にバンドが出現していることから、検体内にＨＬＢ菌遺伝子が存在していることがわかった。従って、いずれの検体もＨＬＢ病に感染したままである。Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液は、ＦｅがＦｅ^３＋イオンとして存在している水溶液であることから、Ｆｅ^３＋イオンを供給しても、ＨＬＢ病に感染した検体を治療する効果はないことが明らかとなった。また、後述の図８に示されるように、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液は活性酸素の発生量が著しく低い。Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液では活性酸素がほとんど発生しないことから、ＨＬＢ病の治療効果がないと推察される。

１−２．治療液Ａの施用
育成６１日目以降も、上記の検体をそのまま育成し続けた。そして、６１日目からはＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液に代えて、５検体（検体Ａ〜検体Ｅ）に治療液Ａを総Ｆｅイオン濃度１５ｍｇ／Ｌにて施用した。

治療液Ａの施用は、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液の施用と同様、検体の葉に散布すること、及び、検体の根本に灌水することにより行った。葉への散布、及び、根本への灌水は５日に１回行った。葉へ散布した治療液は１回につき５０ｍＬである。また、根本へ灌水した治療液Ａの量は１回につき５０ｍＬである。

用いた治療液Ａは、上記と同様に治療液Ａ原液を総Ｆｅイオン濃度が１５ｍｇ／Ｌになるように脱塩蒸留水で希釈することにより調整した。

他の５検体（検体Ｆ〜検体Ｊ）については、６１日目以降も継続して上記と同条件で蒸留水を施用した。

育成１１４日目（治療液Ａを施用して５４日目）の各検体の葉を３〜５枚程度採取し、上記と同様に、それぞれＰＣＲ診断を行った。治療液Ａを施用した検体及び蒸留水を施用した検体のＰＣＲ診断結果を図２及び表３に示す。また、表３には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。なお陽性バンドの強度が０％を示した場合、その検体はＨＬＢ病に感染していないことを示している。

蒸留水の施用を続けた検体（検体Ｆ〜検体Ｊ）では、いずれもＰＣと同じ位置（図中、矢印で示す）にバンドが出現しており、病状が改善することはなかった。

一方、治療液Ａを施用した検体（検体Ａ〜Ｅ）では、３つの検体（検体Ａ，Ｂ，Ｄ）で陽性バンドが消失し、病状が改善していた。

更に、１１５日目以降も同条件でそれぞれの検体を育成した。そして、育成２５２日目（治療液を施用して１９２日目）に、各検体の上部、中部、下部の葉をそれぞれ５枚程度採取し、ＰＣＲ診断を行った。治療液を施用した検体及び蒸留水を施用した検体のＰＣＲ診断結果を図３（ａ）〜（ｄ）及び表４（ａ）〜（ｄ）に示す。

図３（ａ）〜（ｄ）中、検体Ａの上部の葉、中部の葉、下部の葉のＰＣＲ診断結果について、それぞれＡａ、Ａｂ、Ａｃと記しており、図３（ａ）〜（ｄ）中の他の検体Ｂ〜検体Ｊについても同様に記している。また、図中、ＮＣはネガティブコントロールを示し、非感染の樹木の葉から抽出されたＤＮＡ試料を用いた。また、表４（ａ）〜（ｄ）には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。

蒸留水の施用を続けた検体（検体Ｆ〜検体Ｊ）では、検体Ｆのみ、ＰＣと同じ位置にバンドが出現しなかったが、他の検体Ｇ〜検体Ｊでは、いずれもＰＣと同じ位置（図中、矢印で示す）に陽性バンドが出現した。

一方、治療液を施用した検体（検体Ａ〜検体Ｅ）では、全てにおいて陽性バンドは出現しなかった。従って、検体Ａ〜検体Ｅではカンキツグリーニング病が完治していることがわかる。

更に２５３日目以降も同条件でそれぞれの検体を育成した。そして、育成１年９ヶ月（治療液を施用して１年７ヶ月）後の各検体の葉を３〜５枚程度採取し、上記と同様に、それぞれＰＣＲ診断を行った。治療液Ａ又は蒸留水を施用した検体のＰＣＲ診断結果を図４に示す。また、表５には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。

蒸留水の施用を続けた検体（検体Ｆ〜検体Ｊ）では、４検体（検体Ｇ〜検体Ｊ）でＰＣと同じ位置（図中、矢印で示す）にバンドが出現しており、病状が改善することはなかった。また、１検体（検体Ｆ）において陽性バンドが消失していた。原因は不明であるが、カンキツグリーニング病においては、希に菌が検出されなくなる個体があることが知られており、この個体もその一つであると考えられる。

一方、治療液Ａを施用した検体（検体Ａ〜Ｅ）では、全てにおいてＰＣ（図中、Ｃｏｎと示す）と同じ位置にバンドは検出されず、検体Ａ〜検体Ｅではカンキツグリーニング病が完治していることが確認された。

このように、Ｆｅ^２＋イオンを含有する治療液Ａを、カンキツグリーニング病に罹ったラフレモンの樹木に施用することにより、カンキツグリーニング病を完治させられることが立証された。

さらに、上記の治療液Ａの施用によるラフレモンの枝の伸長への影響を調べた。６７日間に伸長した枝の長さを図５に示す。カンキツグリーニング病に罹病した樹木に治療液Ａを施用しない場合、枝の伸長は２５ｃｍ程度であるのに対し、治療液Ａを施用した場合、枝の伸長は３５ｃｍ以上であり、罹病していない健康な樹木の枝の伸長と同程度又はそれ以上であることが分かった。
以上の結果から、Ｆｅ^２＋イオンを含有する治療液Ａの施用は、枝の伸長を促進する効果も有することが立証された。
このように、本実施の形態に係る治療液は、柑橘類樹木の成長を損なうことなく、カンキツグリーニング病を治療できるという驚くべき効果を有することが明らかとなった。

２．タンカンにおける効果
次に検体としてタンカン（ＣｉｔｒｕｓｔａｎｋａｎＨａｙａｔａ）の樹木を用いて評価を行った。まず、沖縄県恩納村の樹園地にて、複数のタンカンの樹木の中からカンキツグリーニング病に罹病している樹木を特定するため、各樹木の古葉を用いて上記のＰＣＲ診断を行った。その結果を図６（ａ）（ｂ）、及び表６（ａ）（ｂ）に示す。表６（ａ）（ｂ）には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。

その結果、図６（ａ）に示すように、１，２及び３で示す検体（検体１〜３）において、ＰＣと同じ位置にバンドが検出され、カンキツグリーニング病に罹病していることが分かった。また、検体５についても、図６（ｂ）に示すように、カンキツグリーニング病の陽性バンドが検出されたため、カンキツグリーニング病に罹病した検体として以下の実験に供した。

これら罹病した検体１〜３に対して、総Ｆｅイオン濃度３０ｍｇ／Ｌの治療液Ｂを施用した。また、罹病した検体５に対しては、総Ｆｅイオン濃度３０ｍｇ／Ｌの治療液Ａを施用した。各治療液の施用は、治療液Ｂ又は治療液Ａを検体の葉に散布することにより行った。葉への散布は７日に１回行った。葉へ散布した治療液の量は、検体1本１回につき１．５Ｌである。このように多量の治療液を葉へ散布することにより、散布された治療液の一部が土壌へと落ちるため、根本への灌水と同様の効果が得られる。

用いた治療液Ｂは、治療液Ｂ原液を総Ｆｅイオン濃度が３０ｍｇ／Ｌになるように脱塩蒸留水で希釈することにより調整した。治療液Ａは、治療液Ａ原液を総Ｆｅイオン濃度が３０ｍｇ／Ｌになるように脱塩蒸留水で希釈することにより調整した。

治療液処理開始後４６日目に、それぞれの検体から新葉及び古葉を３〜５枚採取して、上記と同様にＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ診断を行った。その結果を図７及び表７に示す。表７には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度を示す。

図７において、Ａは古葉、Ｂは新葉を示す。治療液を施用した検体（検体１〜３，５）の全てにおいてＰＣ（図中、Ｃｏｎと示す）と同じ位置にバンドは検出されず、これら検体１〜３及び５ではカンキツグリーニング病が完治していることがわかった。
従って、Ｆｅ^２＋イオンを含有する治療液Ｂ及び治療液Ａは、タンカンにおいてもカンキツグリーニング病の治療に有効であることが立証された。

３．シークワーシャーにおける効果
次に検体としてシークワーシャー（ＣｉｔｒｕｓｄｅｐｒｅｓｓａＨａｙａｔａ）の樹木を用いて評価した。上記のラフレモンと同様に接ぎ木によって病原木から病原菌を接種させ、カンキツグリーニング病に感染した検体を準備した。

栽培はグロスキャビネット内で行った。昼間温度３２℃、夜間温度２８℃の条件で行った。１０日おきに栄養分を土壌に施用した。施用した栄養分は、１０ｍＭ硝酸カルシウム、２．５ｍＭリン酸二水素一カリウム、２．５ｍＭ硫酸マグネシウム７水和物、１ｍＭ硫酸カリウムを含む水溶液であり、これを１ポットにつき５０ｍＬ／１回与えた。

以上のように準備した検体に対して、総Ｆｅイオン濃度１５ｍｇ／ＬのＦｅ−ＥＤＴＡ水溶液、治療液Ｂ、クエン酸鉄水溶液、硫酸鉄水溶液、及び蒸留水をそれぞれ施用した。各Ｆｅ水溶液について２〜３検体を用いて評価した。

上記のＦｅ水溶液等の施用は、検体の葉に散布すること、及び、検体の根本に灌水することにより行った。葉への散布、及び根本への灌水は、それぞれ５日に１回行った。葉へ散布したＦｅ水溶液等の量は、１回につき５０ｍＬである。また、根本へ灌水したＦｅ水溶液等の量は、１回につき５０ｍＬである。

各Ｆｅ水溶液処理開始後３０９日目に、それぞれの検体の葉を３〜５枚ほど採取してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて増幅して、カンキツグリーニング病のＰＣＲ診断を行った。表８には、ＰＣの陽性バンドの強度を１００％としたときの各検体のバンド強度の平均値を示す。

表８に示すように、Ｆｅ−ＥＴＤＡ水溶液を施用した検体では、バンド強度の低下は認められなかった。これに対し、治療液Ｂ、クエン酸鉄水溶液、及び硫酸鉄水溶液を施用した検体では、バンド強度が大幅に低下していることから、ＨＬＢ菌が減少し、病状が改善していることが分かった。
このように、本実施の形態に係る治療液は、シークワーシャーにおいてもカンキツグリーニング病の治療に有効であることが立証された。

（活性酸素の発生の検証）
上述したように、本実施の形態に係る治療液はＦｅ^２＋イオンを含有する。そのため、治療液を樹木に施用すると、細胞内で発生した過酸化水素と反応して活性酸素を生じると考えられる。そこで、上記の各種Ｆｅ水溶液による活性酸素の発生量及びその安定性について評価した。
上述の試験用Ｆｅ水溶液の調整においてそれぞれ調整した各種Ｆｅ水溶液を蒸留水に添加した際に発生する活性酸素をルミノール反応により測定した。なお、蒸留水中には一定量の割合で過酸化水素が含まれるため、Ｆｅ^２＋イオンを含有する水溶液を添加することによって活性酸素が発生する。
各Ｆｅ水溶液を１００μＬずつとり、蒸留水５０μＬ及びルミノール液を５０μＬ添加して、ルミネッセンサー（アトー株式会社製）を用いて化学発光量を１０秒間の積算にて測定した。各試料について３反復で測定した。溶液中の活性酸素の量が多いほど発光強度は高い値を示す。

その結果を図８に示す。図８では、上記の各水溶液を１００μＬずつとり、蒸留水５０μＬを添加し、０，６０，１８０及び３６０分経過後にルミノール液を５０μＬ添加して化学発光量を測定した。Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液では、図８に示されるように、活性酸素はほとんど検出されなかった。一方、治療液Ａ、治療液Ｂ、クエン酸鉄水溶液、及び硫酸鉄水溶液をそれぞれ蒸留水に添加した場合には強い発光強度が検出され、活性酸素を発生していることが分かった。これらの結果から、治療液Ａ、治療液Ｂ、クエン酸鉄水溶液、及び硫酸鉄水溶液中には、Ｆｅ^２＋イオンが存在することが確認された。
さらに、活性酸素は蒸留水の添加後３時間以上継続して検出されたことから、これらＦｅ^２＋イオンを含有する水溶液は、安定にＦｅ^２＋イオンを保持できることが明らかとなった。

二価鉄によって生じた活性酸素種を特定するために、上記のＦｅ水溶液１００μＬに０ｍＭ〜２０ｍＭのクロロゲン酸を含有する蒸留水５０μＬ及びルミノール液５０μＬを添加し、上記と同様に発光強度を測定した。

その結果、図９に示されるように、高濃度のクロロゲン酸が添加された試料では、発光強度の値が著しく低下していた。クロロゲン酸はヒドロキシラジカルを捕捉する特性を有することから、Ｆｅ水溶液を蒸留水に添加することで発生した活性酸素の主要成分は、ヒドロキシラジカルであることが確認された。
また、所定の濃度のクロロゲン酸存在下でも、Ｆｅ−ＥＤＴＡ水溶液以外のＦｅ水溶液では発光強度がある程度維持されていた。従って、これらのＦｅ水溶液は、ヒドロキシラジカルを捕捉、除去するような物質の存在下でも、安定に且つ持続的に活性酸素を供給できることが分かった。

次に、硫酸鉄水溶液及び治療液Ｂについて、総Ｆｅイオン濃度と活性酸素の発生量との関係を調べた。その結果、図１０に示されるように、硫酸鉄水溶液及び治療液Ｂのいずれも、総Ｆｅイオン濃度が１．５ｍｇ／Ｌの場合、発光強度が低く、活性酸素をほとんど発生しないことが分かった。１．５ｍｇ／Ｌの総Ｆｅイオン濃度は、植物に肥料として通常施用される濃度であり、カンキツグリーニング病には効果がない。一方、総Ｆｅイオン濃度が１５０ｍｇ／Ｌ以上の場合、発光強度が１×１０^７以上であり、活性酸素の発生量が非常に高いことが分かった。このことから、１５０ｍｇ／Ｌ以上の総Ｆｅイオン濃度では、過剰の活性酸素により植物を痛めてしまうと考えられる。

以上の結果から、本実施の形態に係る治療液は、Ｆｅ^２＋イオンを含有し、且つＦｅ^２＋イオンを安定に保持できることが確認された。

このように、本実施の形態に係る治療液は、Ｆｅ^２＋イオンを含有し、カンキツグリーニング病に罹った柑橘類の樹木に施用されることにより、カンキツグリーニング病を完治させることができるという驚くべき効果を有することが明らかとなった。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

本出願は、２０１０年１２月１４日に出願された日本国特許出願２０１０−２７８６５４号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１０−２７８６５４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

以上説明したように、本発明に係るカンキツグリーニング病の治療液を用いることで、カンキツグリーニング病に罹った柑橘類を治療することができる。従って、柑橘類を栽培する農業分野での利用が期待される。

Claims

Ｆｅイオンを含有し、該Ｆｅイオンの少なくとも一部がＦｅ^２＋イオンであることを特徴とするカンキツグリーニング病の治療液。
総Ｆｅイオンの濃度が１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
前記総Ｆｅイオンに加えさらに酸を含有することを特徴とする請求項２に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
前記酸が有機酸であることを特徴とする請求項３に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
前記有機酸がカルボキシル基及びヒドロキシル基のうち少なくとも一方を有し、該カルボキシル基及びヒドロキシル基の合計が２つ以上であることを特徴とする請求項４に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
前記有機酸がクエン酸、リンゴ酸、酒石酸及びアスコルビン酸のうち少なくとも１種であることを特徴とする請求項４又は５に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
施用する植物が、柑橘類植物であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
施用する植物が、ラフレモン、タンカン又はシークワーシャーであることを特徴とする請求項７に記載のカンキツグリーニング病の治療液。
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の治療液をカンキツグリーニング病に感染した柑橘類植物の葉面、根圏、又は葉面及び根圏の両方に施用して、該柑橘類植物中の病原菌を減少又は消滅させることでカンキツグリーニング病を治療することを特徴とするカンキツグリーニング病の治療方法。