TWI530254B - 用於柑橘綠化疾病之治療液及使用其之治療方法 - Google Patents

Description

用於柑橘綠化疾病之治療液及使用其之治療方法

本發明係關於一種用於柑橘綠化疾病之治療液及使用其之治療方法。

柑橘綠化疾病(Huanglongbing：以下亦稱作HLB病)係柑橘類最重要的病害之一。HLB病係HLB菌感染柑橘類等樹木而引起之植物疾病。

患有HLB病之柑橘類之果實小，此外，儘管已成熟，但其大部分仍呈綠色，其味道亦相當苦。因此，患有HLB病之柑橘類之果實幾乎無商品價值。此外，患上HLB病之樹木會落葉，不久便枯死。因此，HLB病係對園藝農業帶來大打擊之嚴重病害。

目前對於HLB病之對付方法係以對於患病樹之早期發現及砍伐、作為媒介蟲之柑橘木蝨之防除作為最佳對策。作為發現HLB病之方法，於專利文獻1中揭示有柑橘綠化疾病之檢測方法及檢測套組。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開第2006-267092號公報

於專利文獻1之發明中，可簡易地檢測患有HLB病之樹木，但不得不砍伐患有HLB病之樹木。

本發明係鑒於上述事項而完成者，其目的在於提供一種可治療患有柑橘綠化疾病之柑橘類樹木的用於柑橘綠化疾病之治療液及使用其之治療方法。

本發明之第一態樣之用於柑橘綠化疾病之治療液的特徵在於：含有Fe離子，且該Fe離子之至少一部分為Fe²⁺離子。

總Fe離子濃度較佳為10毫克/公升至100毫克/公升。

此外，上述治療液較佳為除了總Fe離子以外，進一步含有酸。

此外，上述酸較佳為有機酸。

此外，上述有機酸較佳為具有羧基及羥基之至少一者，且該羧基及羥基合計為兩個以上。

此外，上述有機酸較佳為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸及抗壞血酸之至少一種。

施用上述治療液之植物較佳為柑橘類植物。

施用上述治療液之植物較佳為粗皮檸檬、桶柑或扁實檸檬。

本發明之第二態樣之用於柑橘綠化疾病之治療方法的特徵在於：將上述任一者中所記載之治療液施用於感染有柑橘綠化疾病之柑橘類植物之葉面、根圈、或葉面及根圈兩者，使該柑橘類植物中之病原菌減少或消失，藉此治療柑橘綠化疾病。

[發明之效果]

藉由將本發明之用於柑橘綠化疾病之治療液施用於患有柑橘綠化疾病之樹木，可治療柑橘綠化疾病，從而無需砍伐樹木。

(用於柑橘綠化疾病之治療液)

本實施形態之用於柑橘綠化疾病之治療液(以下亦簡稱為治療液)係含有Fe²⁺離子。該治療液穩定地保持Fe²⁺離子。

可使能夠供給Fe²⁺離子之鐵化合物溶解於水而獲得本實施形態之治療液。於本實施形態之治療液中，作為能夠供給Fe²⁺離子之鐵化合物，只要為可於水溶液中含有Fe²⁺離子者，則並無特別限定。例如可使用FeO、FeSO₄等二價之鐵化合物。此外，即便如檸檬酸鐵般含有三價之鐵之粉末狀鐵化合物，只要為溶解於水時可藉由Fe³⁺離子與Fe²⁺離子之平衡而可於水溶液中含有Fe²⁺離子者即可。

本實施形態之治療液中所含有之總Fe離子之濃度較佳為10毫克/公升至100毫克/公升。更佳為12毫克/公升至50毫克/公升。尤佳為15毫克/公升至30毫克/公升。當低於10毫克/公升時，則無法獲得充分之HLB病之治療效果。此外，當高於100毫克/公升時，則有可能會損傷罹患HLB病之樹木本身。通常，當將鐵作為營養成分施用於植物時，在1毫克/公升至1.5毫克/公升之濃度範圍內使用。相對於此，本實施形態之治療液藉由含有10毫克/公升至100毫克/公升之高濃度總Fe離子，而具有優異之HLB病之治療效果。

於本說明書中，所謂「總Fe離子」，包括二價之鐵離子(Fe²⁺離子)及三價之鐵離子(Fe³⁺離子)。

Fe²⁺離子濃度可藉由例如使用鄰啡啉之習知方法而測定。鄰啡啉與Fe²⁺離子選擇性地形成錯合物，因此藉由測定該錯合物之吸光度，可選擇性地對Fe²⁺離子進行定量。此外，可事先將溶液中所含有之Fe³⁺離子還原而將所有Fe離子變成二價鐵後，使用鄰啡啉法進行定量，藉此對總Fe離子量進行定量。

通常，Fe²⁺離子容易被氧化而成為Fe³⁺離子，但本實施形態之治療液較佳為藉由含有酸而可穩定地保持Fe²⁺離子。治療液中所含有之酸只要可穩定地保持Fe²⁺離子，則既可為有機酸，亦可為無機酸。就可更穩定地保持Fe²⁺離子而言，較佳為有機酸。

有機酸係包含羧基及/或羥基、且羧基與羥基合計為兩個以上之酸，其於水中與自上述鐵化合物所生成之Fe²⁺離子形成螯合物。藉此，Fe²⁺離子穩定地存在於水中。作為包含羧基之有機酸，可列舉如檸檬酸(無水檸檬酸)、蘋果酸、酒石酸及草酸等。作為包含羥基之有機酸，可列舉如抗壞血酸等。此外，作為包含羧基與羥基二者之有機酸，可列舉如檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等。該等有機酸可僅使用一種，亦可併用兩種以上。

於該等有機酸中，就治療液中之Fe²⁺離子之穩定性的優異性而言，較佳為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸及抗壞血酸。再者，當調製含有該等有機酸與鐵化合物之水溶液時，就相對於有機酸濃度之Fe²⁺離子濃度高而言，較佳為檸檬酸及酒石酸。此外，於該等有機酸中，當製備含有有機酸與鐵化合物之水溶液時，就相對於有機酸濃度之Fe²⁺離子濃度特別高而言，尤佳為檸檬酸。此外，檸檬酸亦為柑橘類本身所生成之有機酸，因此不會對柑橘類造成損害。

此外，該治療液中所使用之水並無特別限定，可使用各種水。可為純水及離子交換水等經高度精製之水，亦可為自來水、工業用水、農業用水及地下水等通常所使用之水。

此外，於該治療液中，除了有機酸及鐵化合物以外，亦可含有例如鎂或鈣等其他營養成分等。

此外，本實施形態之治療液亦可藉由以下之製造方法而獲得。

可使有機酸粉末與能夠供給Fe²⁺離子之鐵化合物粉末加熱溶解於水中而獲得治療液。

此外，亦可將供給Fe²⁺離子之鐵化合物粉末添加至事先使全部有機酸粉末溶解於水中而獲得之有機酸水溶液中，並進行加熱而獲得治療液。

此外，亦可將檸檬酸亞鐵等有機酸亞鐵之粉末添加至水中並進行加熱而獲得治療液。

此外，亦可不進行加熱，將有機酸粉末與供給Fe²⁺離子之鐵化合物粉末及水加以混合而獲得治療液。

藉由將本實施形態之治療液施用於患有HLB病之柑橘類之樹木，可治療HLB病。柑橘類例如包括：粗皮檸檬(Citrus verrucosa)、桶柑(Citrus tankan)、扁實檸檬(Citrus depressa Hayata)、溫州蜜橘(Citrus unshiu)等。其中，尤佳為粗皮檸檬(Citrus verrucosa)、桶柑(Citrus tankan)及扁實檸檬(Citrus depressa Hayata)。

HLB菌係韌皮部侷限性且難培養性之多様性革蘭氏陰性之細菌様微生物，可分類為稱為亞洲型、非洲型、美洲型之三個系統，且可分別分類為Candidatus Liberobacter asiaticus(柑橘黃龍病亞洲菌系)、Candidatus Liberobacter africanus(柑橘黃龍病非洲菌系)、及Candidatus Liberobacter americanus(柑橘黃龍病美洲菌系)之三個系統。本實施形態之治療液可用於由任何系統之HLB菌所引起之感染。

治療液之施用只要藉由例如散布於樹木之葉面、或者對樹木之根部及根圈灌注來進行即可。

對用於柑橘類之樹木之治療液的施用頻率、以及一次所施用之治療液的量並無特別限制。舉例言之，如後述之實施例，以5日1次、每次50毫升之方式施用Fe²⁺離子濃度為15毫克/公升至50毫克/公升之治療液，藉此可治療患有柑橘綠化疾病之柑橘類樹木。

雖然柑橘綠化疾病之治療機制並不明確，但如後述之實施例中之說明，推測係藉由施用於樹木之治療液所產生之羥基自由基而發揮影響。

一般而言，已知細胞對於病原體等侵入物之耐性係與活性氧有關。活性氧具有於細胞內保護細胞免受病原性壓力之作用，細胞內之活性氧濃度係經由細胞內所產生之過氧化氫與二價鐵進行反應而生成羥基自由基之費頓反應(Fenton Reaction)來控制。

本實施形態之治療液可穩定地保持Fe²⁺離子，且如後述之實施例所示可持續地產生羥基自由基。因此，一般認為若將該治療液施用於樹木，則可於柑橘類之細胞內產生反應性高之羥基自由基，該羥基自由基直接使HLB菌滅絕，或者，於細胞內促進某種反應性，利用二次作用使HLB菌滅絕，藉此可治療柑橘綠化疾病。

此外，已知患有柑橘綠化疾病之柑橘類樹木與正常之樹木相比，鐵成分減少。通常，植物自根將Fe³⁺離子還原來攝取Fe²⁺離子，但因本實施形態之治療液係Fe²⁺離子穩定地存在之水溶液，故植物可直接攝取Fe²⁺離子。此外，亦可理解因該治療液大量地含有Fe²⁺離子，故柑橘類之樹木可直接攝取較多之Fe²⁺離子來補充不足之鐵成分，從而提高治療效果。

[實施例]

(試驗用Fe水溶液之調製)

分別調製以下試驗用之Fe水溶液。

1.Fe-EDTA水溶液

2.治療液A(水溶液)

3.治療液B(水溶液)

4.檸檬酸鐵水溶液

5.硫酸鐵水溶液

(1.Fe-EDTA水溶液)

Fe-EDTA水溶液係藉由將Fe-EDTA(Sigma-Aldrich日本製造，商品名：乙二胺四乙酸(III)鈉)以總Fe離子濃度為15毫克/公升之方式溶解於除鹽蒸餾水中來調製。

(2.治療液A(水溶液))

治療液A係藉由將如下之治療液A原液以總Fe離子濃度為15毫克/公升之方式於除鹽蒸餾水中進行稀釋來調製，該治療液A原液為每100毫升水中之檸檬酸為14公克、且以檸檬酸之含量為100質量份計，每100毫升水中之Fe為40質量份的溶液。

稀釋治療液A原液所得之水溶液分別含有Fe²⁺離子與Fe³⁺離子，當將Fe²⁺離子與Fe³⁺離子之合計量設為100質量%時，Fe²⁺離子為20質量%至40質量%。其中，該各離子濃度係藉由後述之測定方法所測定之值。

(3.治療液B(水溶液))

治療液B係藉由將如下之治療液B原液以總Fe離子濃度為15毫克/公升之方式於除鹽蒸餾水中進行稀釋來調製，該治療液B原液為每100毫升水中之檸檬酸為14公克、且以檸檬酸之含量為100質量份計，每100毫升水中之Fe為13質量份的溶液。

稀釋治療液B原液所得之水溶液分別含有Fe²⁺離子與Fe³⁺離子，當將Fe²⁺離子與Fe³⁺離子之合計量設為100質量%時，Fe²⁺離子為50質量%至90質量%。其中，該各離子濃度係藉由後述之測定方法所測定之值。

(4.檸檬酸鐵水溶液)

檸檬酸鐵水溶液係藉由將檸檬酸鐵(昭和化工股份有限公司)以總Fe離子濃度成為15毫克/公升之方式溶解於除鹽蒸餾水中來調製。

(5.硫酸鐵水溶液)

硫酸鐵水溶液係藉由將硫酸鐵以總Fe離子濃度為15毫克/公升之方式溶解於除鹽蒸餾水中來調製。

(總Fe離子濃度之測定)

對於治療液A、治療液B、檸檬酸鐵水溶液、Fe-EDTA水溶液及硫酸鐵水溶液，測定各Fe水溶液中之Fe²⁺離子濃度，以確認該等水溶液中所含之Fe²⁺離子。再者，本測定係使用以總Fe離子濃度為約50毫克/公升之方式所調製之Fe水溶液來進行。

首先，如上所述，將治療液A原液以總Fe離子濃度為約50毫克/公升之方式於離子交換水中進行稀釋來調製治療液A水溶液。之後，立刻使用RQflex多項目水質檢査器(Merck公司製造)與Reflectoquant鐵離子試驗紙(Merck公司製造)測定所獲得之水溶液中所含有之Fe²⁺離子與總Fe離子。測定係根據所附之規定於Reflectoquant鐵離子試驗紙上進行。此外，將總Fe離子量減去Fe²⁺離子量所得之量換算成Fe³⁺離子量。再者，該測定始終於直射陽光不射入之室內進行作業。

該測定之結果，Fe²⁺離子濃度為10.4毫克/公升，Fe³⁺離子濃度為36.6毫克/公升，當將Fe²⁺離子與Fe³⁺離子之合計設為100質量%時，Fe²⁺離子為22質量%。

如上所述，以總Fe離子濃度為約50毫克/公升之方式調製治療液B、檸檬酸鐵、Fe-EDTA及硫酸鐵，並測定各個水溶液中之Fe²⁺離子濃度與總Fe離子濃度、Fe²⁺離子於總Fe離子中所占之比例。其結果顯示於表1。

由此，確認治療液A水溶液、治療液B水溶液、檸檬酸鐵水溶液及硫酸鐵水溶液均以規定之比例含有Fe²⁺離子。另一方面，確認Fe-EDTA水溶液穩定地保持Fe³⁺離子。

(柑橘綠化疾病之治療效果之驗證)

將上述Fe水溶液施用於感染有柑橘綠化疾病之柑橘類樹木，對含有Fe²⁺離子之治療液對於柑橘綠化疾病的治療效果進行驗證。

1.粗皮檸檬中的效果

使用粗皮檸檬(Citrus verrucosa Lush.)之樹木作為樣本。首先，使粗皮檸檬之種子發芽，利用約1公升之盆栽、蔬菜育苗用培土(Takii Seed股份有限公司製造)來培育。培育1年後，藉由接枝而自病原樹攝取病原菌，從而感染柑橘綠化疾病。病原樹係自石垣島選取之感染有經命名為「Ishi-1」之病原菌株的樹。以感染後經培育1年之樣本供於試驗。以相同方式，準備10個感染有柑橘綠化疾病之樣本(樣本A至樣本J)。

再者，栽培係於人工生長箱內進行。於晝間溫度32℃、夜間溫度28℃之條件下進行。每10日將營養成分施用於土壤中。所施用之營養成分包含10毫莫耳濃度硝酸鈣、2.5毫莫耳濃度磷酸二氫鉀、2.5毫莫耳濃度硫酸鎂七水合物、1毫莫耳濃度硫酸鉀之水溶液，將其以每罐50毫升/每次之方式施加。

1-1.Fe-EDTA水溶液之施用

對如上準備之10個樣本(樣本A至樣本J)進行培育，首先，對5個樣本(樣本A至樣本E)施用總Fe離子濃度為15毫克/公升之Fe-EDTA水溶液，直至培育至第60日為止。此外，針對其他5個樣本(樣本F至樣本J)，施用蒸餾水來代替Fe-EDTA水溶液。

上述Fe-EDTA水溶液、及蒸餾水之施用係藉由散布於樣本之葉子上、及對樣本之根部灌注來進行。朝葉子之散布、及朝根部之灌注分別於5日內進行1次。朝葉子散布之Fe-EDTA水溶液、及蒸餾水之量係每次50毫升。此外，朝根部灌注之Fe-EDTA水溶液、及蒸餾水之量係每次50毫升。

於Fe-EDTA水溶液處理開始後(培育)第60日，選取3至5片左右之各個樣本之葉子並萃取DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)，利用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶連鎖反應)法加以放大，從而進行柑橘綠化疾病之診斷(以下稱為PCR診斷)。具體而言，如以下般進行。

(1)DNA之萃取

利用蒸餾水清洗所選取之各葉子(3公克至5公克)並將水分去除，切取中脈後，利用液體氮使其凍結。利用經蒸氣殺菌‧乾熱殺菌之乳鉢‧杵使其均勻化，然後溶解於5毫升之1×CTAB緩衝液(1%CTAB、50毫莫耳濃度Tris-HCl(pH8.0)、0.7莫耳濃度NaCl、10毫莫耳濃度EDTA)中，一面於65℃進行攪拌同時培養30分鐘後，添加氯仿‧異戊醇(24：1體積/體積)5毫升，顛倒混和30分鐘並進行3000轉/每分鐘×15分鐘離心分離，然後利用吸液管將上清液轉移至新的離心管中。將上述除蛋白質處理進行3次。添加上清液之1/10量的10%CTAB溶液(10%CTAB、0.7莫耳濃度NaCl)並進行顛倒混和來補充因除蛋白質處理而失去之CTAB。向該上清液中緩慢地添加等量之CTAB沈澱液(1%CTAB、50毫莫耳濃度Tris-HCl(pH8.0)、0.10毫莫耳濃度EDTA)，並輕輕地進行顛倒混和。上清液中之核酸以低濃度(0.35莫耳濃度以下之NaCl)與CTAB結合並沈澱。靜置一晚，使其沈澱，然後以1800轉/每分鐘×15分鐘進行離心分離，丟棄含有澱粉之上清液。添加1毫升之沈澱物溶解液(1莫耳濃度NaCl、50毫莫耳濃度Tris-HCl、10毫莫耳濃度EDTA)至沈澱物，將核酸‧CTAB複合物分離，並溶解核酸。緩慢地添加等量之異戊醇至該核酸溶液，使核酸沈澱。以1800轉/每分鐘×10分鐘進行離心分離，丟棄含有CTAB之上清液。利用70%乙醇清洗沈澱及離心管側面之CTAB，然後同様地進行離心來去除CTAB。最後利用1/10 TE溶液(10毫莫耳濃度Tris-HCl、1毫莫耳濃度EDTA)溶解核酸。核酸溶液之純度係利用分光光度計以260奈米/230奈米評估澱粉汙染程度，以260奈米/280奈米評估蛋白質之汙染程度，將兩值均為1.8以上者用於其後之實驗。此外，藉由瓊脂糖電泳將λDNA(47.5千鹼基)以上之高分子之核酸溶液用於後續之實驗。DNA量係利用螢光分光光度計來測定。

(2)PCR診斷

PCR診斷係根據「Marjorie A.Hoy、Ayyamperumal Jeyaprakash、及Ru Nguyen(2001)，Long PCR is a sensitive Method for Detecting Liberobacter asiaticum in Parasitoids Undergoing Risk Assessment in Quarantine. Biological Control 22，278至287」中所記載之方法進行。

具體而言，將1微升48毫莫耳濃度MgCl₂、10微升Takara Premix tag2×PCR溶液(Takara,Bio公司，Shiga，日本)、1微升90奈克/微升前置引子(forward primer)MHO035、1微升90奈克/微升反置引子(reverse primer)MHO0354、2微升上述萃取之DNA樣本(20奈克)、以及5微升殺菌水加以混合，以調製20微升PCR反應液。將該PCR反應液設置於DNA Thermal Cycler PTC-1148(Bio-Rad Laboratories公司)中，按以下條件將DNA放大。

引子

前置引子(MHO0353)：

5'-CACCGAAGATATGGACAACA-3'(排列號1)

反置引子(MHO0354)：

5'-CAGGTTCTTGTGGTTTTTCTG-3'(排列號2)

PCR條件

90℃ 3分鐘1個循環

{94℃ 1分鐘、68.5℃ 1分鐘、72℃ 3分鐘}35個循環

72℃ 3分鐘1個循環

於4℃下保存至電泳為止

於陽性對照組(PC，Positive Control)中，使用藉由上述DNA萃取方法自選取自經病原菌株Ishi-1感染之病原樹之葉子中所萃取的DNA樣本。

針對17微升之藉由上述PCR法而放大之樣本，使用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測藉由溴化乙錠染色之經放大之DNA。

將施用了Fe-EDTA水溶液之樣本之PCR診斷結果及施用了蒸餾水之樣本之PCR診斷結果顯示於第1圖及表2。圖中m表示分子量標記物流動之泳道。

如第1圖所示，於陽性對照組(PC)中在規定之位置(圖中由箭頭表示)檢測出陽性條帶。當檢測出該陽性條帶時，可判斷樣本已患有柑橘綠化疾病，當未檢測出該陽性條帶時，可判斷樣本未患病。此外，於表2中，表示將PC之陽性條帶之強度設為100%時之各樣本的條帶強度。

電泳結果之條帶強度係使用ImageJ(圖像處理程式，NIH)進行分析。首先，選擇PC之條帶部分(圖中白色區域)，並將所選擇之區域之亮度(濃度)數值化。針對各樣本之條帶部分，亦將具有與PC之條帶中所選擇之區域相同面積之區域內的濃度數值化。再者，亦同様地將變黑之黑色部分之濃度數值化，將自各條帶之濃度之數值減去的值設為各條帶原來的數值。於表2中，顯示將陽性對照組(PC)之濃度設為100%時之各條帶之原來數值的相對值(%)。

其結果，因所有樣本均在與PC相同之位置出現帶，故可知樣本內存在HLB菌基因。因此，所有樣本均維持感染有HLB病之狀態。因Fe-EDTA水溶液係Fe作為Fe³⁺離子而存在之水溶液，故即便供給Fe³⁺離子，亦無治療感染有HLB病之樣本之效果這一點變得明確。此外，如後述之第8圖所示，Fe-EDTA水溶液之活性氧之產生量明顯低。因Fe-EDTA水溶液中幾乎不產生活性氧，故推測無HLB病之治療效果。

1-2.治療液A之施用

於培育第61日後，仍繼續培育上述樣本。並且自第61日起，以總Fe離子濃度為15毫克/公升之條件將治療液A施用於5個樣本(樣本A至樣本E)來代替Fe-EDTA水溶液。

治療液A之施用與Fe-EDTA水溶液之施用相同，藉由散布於樣本之葉子上、及對樣本之根部灌注來進行。朝葉子之散布、及朝根部之灌注係於5日內進行1次。朝葉子散布之治療液係每次50毫升。此外，朝根部灌注之治療液A之量係每次50毫升。

所使用之治療液A與上述相同，藉由將治療液A原液以總Fe離子濃度為15毫克/公升之方式於除鹽蒸餾水中進行稀釋來調製。

關於其他5個樣本(樣本F至樣本J)，第61日以後亦繼續以與上述相同之條件施用蒸餾水。

選取3至5片左右之培育第114日(施用治療液A後第54日)之各樣本之葉子，與上述相同地分別進行PCR診斷。將施用了治療液A之樣本及施用了蒸餾水之樣本之PCR診斷結果顯示於第2圖及表3。此外，於表3中，顯示將PC之陽性條帶之強度設為100%時之各樣本的條帶強度。再者，當陽性條帶之強度顯示0%時，表示該樣本未感染HLB病。

於繼續施用蒸餾水之樣本(樣本F至樣本J)中，皆在與PC相同之位置(圖中由箭頭表示)出現條帶，病狀未改善。

另一方面，於施用了治療液A之樣本(樣本A至E)中，在3個樣本(樣本A、B、D)中陽性條帶消失，病狀得到改善。

接著，於第115日後亦於相同條件下培育各個樣本。並且於培育第252日(施用治療液後第192日)，分別選取5片左右之各樣本之上部、中部、下部之葉子，進行PCR診斷。將施用了治療液之樣本及施用了蒸餾水之樣本之PCR診斷結果顯示於第3(a)至(d)圖及表4(a)至(d)。

第3(a)至(d)圖中，關於樣本A之上部之葉子、中部之葉子、下部之葉子之PCR診斷結果，分別記作Aa、Ab、Ac，第3(a)至(d)圖中之其他樣本B至樣本J亦同様地記述。此外，於圖中，NC表示陰性對照組，使用自非感染之樹木之葉子中所萃取的DNA樣本。此外，於表4(a)至(d)中，表示將PC之陽性帶之強度設為100%時之各樣本的帶強度。

於繼續施用蒸餾水之樣本(樣本F至樣本J)中，僅樣本F未在與PC相同之位置出現條帶，於其他樣本G至樣本J中，均在與PC相同之位置(圖中由箭頭表示)出現陽性條帶。

另一方面，於施用了治療液之樣本(樣本A至樣本E)中，均未出現陽性條帶。因此，可知於樣本A至樣本E中柑橘綠化疾病已治癒。

接著，於第253日後亦於相同條件下培育各個樣本。並且選取3至5片左右之培育1年9個月(施用治療液後1年7個月)後之各樣本之葉子，與上述同樣地分別進行PCR診斷。將施用了治療液A或蒸餾水之樣本的PCR診斷結果顯示於第4圖。此外，於表5中，顯示將PC之陽性帶之強度設為100%時各樣本的條帶強度。

於繼續施用蒸餾水之樣本(樣本F至樣本J)中，4個樣本(樣本G至樣本J)在與PC相同之位置(圖中由箭頭表示)出現條帶，病狀未改善。此外，於1個樣本(樣本F)中陽性條帶消失。雖然原因不明，但已知於柑橘綠化疾病中，存在稀少檢測不出菌之個體，可認為該個體亦為其中之一。

另一方面，於施用了治療液A之樣本(樣本A至E)中，均未在與PC(圖中表示為Con)相同之位置檢測出條帶，確認於樣本A至樣本E中柑橘綠化疾病已痊癒。

如此，證明藉由將含有Fe²⁺離子之治療液A施用於患有柑橘綠化疾病之粗皮檸檬之樹木，而使柑橘綠化疾病痊癒。

此外，調查由上述治療液A之施用所引起之對於粗皮檸檬之枝之伸長的影響。將伸長67日之枝的長度顯示於第5圖。可知當不對患有柑橘綠化疾病之樹木施用治療液A時，枝之伸長為25公分左右，相對於此，當施用了治療液A時，枝之伸長為35公分以上，伸長程度與未患病之健康之樹木之枝的伸長相同或更長。

根據以上之結果，證明含有Fe²⁺離子之治療液A之施用亦具有促進枝之伸長的效果。

如此，本實施形態之治療液具有無損柑橘類樹木之成長，且可治療柑橘綠化疾病之令人吃驚的效果這一點變得明確。

2.桶柑中的效果

接著，使用桶柑(Citrus tankan Hayata)之樹木作為樣本來進行評估。首先，於沖繩縣恩納村之樹園地中，自多棵桶柑之樹木中特別選定患有柑橘綠化疾病之樹木，從而使用各樹木之舊葉進行上述PCR診斷。將其結果顯示於第6(a)、(b)圖、及表6(a)、(b)。於表6(a)、(b)中，顯示將PC之陽性條帶之強度設為100%時之各樣本的條帶強度。

其結果如第6(a)圖所示，於由1、2及3所示之樣本(樣本1至3)中，在與PC相同之位置檢測出帶，可知已患有柑橘綠化疾病。此外，關於樣本5，如第6(b)圖所示，因檢測出柑橘綠化疾病之陽性條帶，故亦作為患有柑橘綠化疾病之樣本而供於以下之實驗。

針對該等已患病之樣本1至3，施用總Fe離子濃度為30毫克/公升之治療液B。此外，針對已患病之樣本5，施用總Fe離子濃度為30毫克/公升之治療液A。各治療液之施用係藉由將治療液B或治療液A散布於樣本之葉子上而進行。朝葉子之散布係於7日內進行1次。朝葉子散布之治療液之量係每個樣本每次1.5公升。如上述般朝葉子散布大量之治療液，藉此所散布之治療液之一部分落入土壤中，因此可獲得與朝根部灌注相同之效果。

所使用之治療液B係藉由將治療液B原液以總Fe離子濃度為30毫克/公升之方式於除鹽蒸餾水中進行稀釋來調製。治療液A係藉由將治療液A原液以總Fe離子濃度成為30毫克/公升之方式於除鹽蒸餾水中進行稀釋來調製。

於治療液處理開始後第46日，自各個樣本選取3至5片新葉及舊葉，與上述同樣地萃取DNA，然後進行PCR診斷。其結果顯示於第7圖及表7。於表7中，顯示將PC之陽性條帶之強度設為100%時各樣本的條帶強度。

於第7圖中，A表示舊葉，B表示新葉。於施用了治療液之所有樣本(樣本1至3、5)中，均未在與PC(圖中表示為Con)相同之位置檢測出帶，可知於該等樣本1至3及樣本5中柑橘綠化疾病已痊癒。

因此，證明含有Fe²⁺離子之治療液B及治療液A於桶柑中亦對柑橘綠化疾病之治療有效。

3.扁實檸檬中的效果

其次，使用扁實檸檬(Citrus depressa Hayata)之樹木作為樣本來進行評估。準備與上述粗皮檸檬同様地藉由接枝而自病原樹接種病原菌，從而感染了柑橘綠化疾病之樣本。

栽培係於人工生長箱內進行。於晝間溫度32℃、夜間溫度28℃之條件下進行。每10日將營養成分施用於土壤中。所施用之營養成分係包含10毫莫耳濃度硝酸鈣、2.5毫莫耳濃度磷酸二氫鉀、2.5毫莫耳濃度硫酸鎂七水合物、1毫莫耳濃度硫酸鉀之水溶液，將其以每罐50毫升/每次之方式施加。

對以上準備之樣本分別施用總Fe離子濃度為15毫克/公升之Fe-EDTA水溶液、治療液B、檸檬酸鐵水溶液、硫酸鐵水溶液、及蒸餾水。針對各Fe水溶液，使用2至3個樣本進行評估。

上述Fe水溶液等之施用係藉由散布於樣本之葉子上、及對樣本之根部灌水來進行。朝葉子之散布、及朝根部之灌水分別於5日內進行1次。朝葉子散布之Fe水溶液等之量係每次50毫升。此外，朝根部灌注之Fe水溶液等之量係每次50毫升。

於各Fe水溶液處理開始後第309日，選取3至5片左右之各個樣本之葉子並萃取DNA，利用PCR法加以放大，從而進行柑橘綠化疾病之PCR診斷。於表8中，顯示將PC之陽性帶之強度設為100%時之各樣本之條帶強度的平均值。

如表8所示，於施用了Fe-ETDA水溶液之樣本中，未看到條帶強度之下降。相對於此，可知於施用了治療液B、檸檬酸鐵水溶液、及硫酸鐵水溶液之樣本中，條帶強度大幅度地下降，顯示HLB菌減少，病狀得到改善。

如此，證明本實施形態之治療液於扁實檸檬中亦對柑橘綠化疾病之治療有效。

(活性氧之產生之驗證)

如上所述，本實施形態之治療液含有Fe²⁺離子。因此，一般認為若將治療液施用於樹木，則可與細胞內所產生之過氧化氫進行反應而產生活性氧。因此，對利用上述各種Fe水溶液之活性氧之產生量及其穩定性進行評估。

藉由流明諾反應(luminol reaction)來測定將上述試驗用Fe水溶液之調製中分別調製之各種Fe水溶液添加至蒸餾水中時所產生的活性氧。再者，因於蒸餾水中以一定量之比例含有過氧化氫，故藉由添加含有Fe²⁺離子之水溶液而產生活性氧。

取各Fe水溶液各100微升，添加50微升蒸餾水及50微升流明諾液，使用Luminescenser(Atto股份有限公司製造)以10秒之累計測定化學發光量。對各樣本反覆進行3次測定。溶液中之活性氧的量越多，則發光強度顯示的值越高。

將其結果顯示於第8圖。於第8圖中，將上述各水溶液各取100微升，添加50微升蒸餾水，經過0、60、180及360分鐘後添加流明諾液50微升並測定化學發光量。於Fe-EDTA水溶液中，如第8圖所示，幾乎未檢測出活性氧。另一方面，可知當將治療液A、治療液B、檸檬酸鐵水溶液、及硫酸鐵水溶液分別添加至蒸餾水中時，檢測出較強之發光強度，且產生了活性氧。根據該等結果確認：於治療液A、治療液B、檸檬酸鐵水溶液、及硫酸鐵水溶液中存在Fe²⁺離子。

接著，因於添加蒸餾水後3小時以上繼續檢測出活性氧，故使該等含有Fe²⁺離子之水溶液可穩定地保持Fe²⁺離子這一點變得明確。

為了確定由二價鐵所產生之活性氧種類，向上述Fe水溶液100微升中添加50微升含有0毫莫耳濃度至20毫莫耳濃度之綠原酸之蒸餾水及50微升流明諾液，並與上述相同地測定發光強度。

其結果如第9圖所示，於添加有高濃度之綠原酸之樣本中，發光強度的值明顯下降。因綠原酸具有捕捉羥基自由基之特性，故確認藉由將Fe水溶液添加至蒸餾水中而產生之活性氧之主要成分為羥基自由基。

此外，於規定之濃度之綠原酸存在下，Fe-EDTA水溶液以外之Fe水溶液亦在某種程度上維持發光強度。因此，可知該等Fe水溶液於如捕捉、去除羥基自由基之物質之存在下，亦可穩定地且持續地供給活性氧。

其次，針對硫酸鐵水溶液及治療液B，調查總Fe離子濃度與活性氧之產生量之關係。其結果，如第10圖所示，可知硫酸鐵水溶液及治療液B之任一者於總Fe離子濃度為1.5毫克/公升的情形下，發光強度均低，且幾乎不產生活性氧。1.5毫克/公升之總Fe離子濃度係一般作為肥料而施用於植物中之濃度，對於柑橘綠化疾病無效。另一方面，可知當總Fe離子濃度為150毫克/公升以上時，發光強度為1×10⁷以上，活性氧的產生量非常高。因此，可認為於150毫克/公升以上之總Fe離子濃度下，因過剩之活性氧而損傷植物。

根據以上之結果確認：本實施形態之治療液含有Fe²⁺離子，且可穩定地保持Fe²⁺離子。

如此，本實施形態之治療液含有Fe²⁺離子，且具有藉由施用於患有柑橘綠化疾病之柑橘類之樹木，而可使柑橘綠化疾病痊癒之令人吃驚的效果這一點變得明確。

本發明可不脫離本發明之廣義之精神與範圍，而實現各種實施形態及變化。此外，上述實施形態係用以說明本發明之實施形態，並不限定本發明之範圍。

本申請案係基於2010年12月14日所申請之日本專利申請第2010-278654號。於本說明書中，將日本專利申請第2010-278654號之說明書、專利申請之範圍、整個圖式併於此處以供參考。

[產業上之可利用性]

如以上所說明般，藉由使用本發明之用於柑橘綠化疾病之治療液，可治療患有柑橘綠化疾病之柑橘類。因此，可期待於栽培柑橘類之農業領域中之利用。

第1圖所示為施用了Fe-EDTA水溶液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第2圖所示為施用了治療液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第3(a)至(d)圖所示為施用了治療液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第4圖所示為施用了治療液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第5圖所示為施用了治療液之樣本之枝之伸長的圖；

第6(a)、(b)圖所示為施用了治療液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第7圖所示為施用了治療液之樣本之PCR診斷結果的圖；

第8圖所示為利用流明諾反應之活性氧之測定結果的圖；

第9圖所示為利用流明諾反應之活性氧之測定結果的圖；以及

第10(a)、(b)圖所示為利用流明諾反應之活性氧之測定結果的圖。

<110>　廣島大學愛知製鋼股份有限公司

<120>　用於柑橘綠化疾病之治療液及使用其之治療方法

<130>　11F075-PCT

<160>　2

<170>　PatentIn version3.1

<210>　1

<211>　20

<212>　DNA

<213>　柑橘黃龍菌

<400>　1

<210>　2

<211>　21

<212>　DNA

<213>　柑橘黃龍菌

<400>　2

Claims (7)

1. 一種用於柑橘綠化疾病之治療方法，其係包含將一治療液施用於感染了柑橘綠化疾病之柑橘類植物之葉面、根圈、或葉面及根圈二者，使該柑橘類植物中之病原菌減少或消失，藉此治療柑橘綠化疾病，其中該治療液係包含Fe離子，且該Fe離子之至少一部分係為Fe²⁺離子。
2. 如請求項1所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其中總Fe離子之濃度為10毫克/公升至100毫克/公升。
3. 如請求項2所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其除了該總Fe離子以外，進一步含有酸。
4. 如請求項3所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其中該酸為有機酸。
5. 如請求項4所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其中該有機酸具有羧基及羥基之至少一者，且該羧基及羥基合計為兩個以上。
6. 如請求項4或5所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其中該有機酸為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸及抗壞血酸之至少一者。
7. 如請求項1所述之用於柑橘綠化疾病之治療方法，其施用之植物為粗皮檸檬、桶柑或扁實檸檬。