JPWO2012070679A1 - 高強度コラーゲン線維膜及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、これらの成形体は、コラーゲンの架橋を行っているにもかかわらず、多孔質体であるため、十分な強度(力学的特性)が得られていなかった。
本発明者らは、細胞培養基材、再生医療用の足場材料、又は移植用材料として、十分な強度を有するコラーゲン線維膜について、鋭意研究した結果、魚類由来コラーゲン、特には魚鱗由来コラーゲンを用い、水/低級アルコール階段混合液を用いた脱塩を行い、側面のみから脱媒を行い、均一な膜厚を実現することで、コラーゲン線維膜の密度を高め、強度を驚異的に上昇させることができることを見出した。より具体的には、魚類由来コラーゲン線維膜は、乾燥前に精製水/エタノールの階段混合液で処理するため、塩の残存を極めて低くすることが可能である。コラーゲンゲルの上面と下面を覆い、側面からのみ脱媒させることで高密度・高強度なコラーゲン線維膜を作製できることを見出した。魚類由来コラーゲン線維膜の製造において、膜厚のバラツキを抑えることは、魚類由来コラーゲン線維膜の強度を上昇させるために必須であった。更には、乾燥させたコラーゲン線維膜に、低真空中での蒸発法による化学架橋処理を行うことにより、強度を更に向上させた魚類由来コラーゲン線維膜を得ることが可能になった。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の好ましい態様においては、コラーゲンが魚鱗由来である。
更に、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の別の好ましい態様においては、コラーゲンが架橋されている。
本発明の架橋された魚類由来コラーゲン線維膜の別の好ましい態様においては、自由アミノ基の定量による架橋度が、5%以上である。
本発明の魚類由来コラーゲンの別の好ましい態様においては、コラーゲンの変性温度が線維化前のコラーゲンの変性温度を5℃以上超えるものであり、更に架橋された魚類由来コラーゲンの好ましい態様においては、コラーゲンの変性温度が線維化前のコラーゲンの変性温度を10℃以上超えるものである。
更に、本発明の架橋された魚類由来コラーゲン線維膜の別の好ましい態様においては、膨潤率が、300%以下である。
更に本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の好ましい態様においては、骨芽細胞分化誘導能を示すものである。
また、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法の好ましい態様においては、コラーゲンが魚鱗由来コラーゲンである。
更に、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法の好ましい態様においては、前記魚類由来コラーゲン線維膜を架橋する工程を更に含む。
更に、本発明の高強度コラーゲン線維膜は、人獣共通感染症のほとんど存在しない魚類由来のコラーゲンを用いているため、ウシ(牛海綿状脳症(BSE))由来、ブタ(口蹄疫)由来、又は鳥(インフルエンザ)由来のコラーゲンを用いた成形体(材料)よりも、安全に再生医療用の足場材料、又は移植用材料として、使用することができる。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜は、(1)引張強度が30MPa以上であり、(2)重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして(3)平均膜厚が1μm〜2mmで、且つ膜厚のバラツキが平均膜厚の±30%以内である。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜に含まれる魚類由来コラーゲンは、魚類のI型コラーゲンであれば、特に限定されるものではないが、好ましくは魚鱗由来コラーゲンである。魚類の鱗由来のコラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速いからである。更に、魚鱗由来コラーゲンから得られたコラーゲン線維膜は線維間の相互作用が強いため、特に高い機械強度が得られると考えられる。魚類由来コラーゲンを取得する魚類の種類としては、例えば、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケなどを挙げることができるが、後述の変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば日本や中国で食用として養殖されているナイルテラピア(Oreochromis niloticus)は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。
本発明のコラーゲン線維膜の引張強度は30MPa以上であり、好ましくは40MPa以上であり、より好ましくは50MPa以上であり、最も好ましくは55MPa以上である。30MPa未満では、生体材料として使用した場合に、十分な強度を得ることができないからである。
また、引張強度の上限は、特に限定されるものではないが、200MPa以下が好ましく、150MPa以下がより好ましく、120MPa以下が最も好ましい。200MPaを超えると、移植した際に周辺組織と結合しないことや周辺組織を損傷してしまうことがある。
試験片の形態は、例えば幅10mm×長さ20mmの長方形でもよく、図7に示したように、幅10mm×長さ20mmで、中央部分において幅を10mmから5mmに狭くした形状でもよい。引張強度は、試験片の厚み、及び幅から計算することができる。
ヤング率は、弾性範囲において単位ひずみあたり、どれだけの応力が必要かの値を決める定数であり、単位は応力と同じ、例えばGPaで表すことができる。
本発明のコラーゲン線維膜のヤング率は、特に限定されないが、下限は好ましくは0.1GPa以上、より好ましくは0.5GPa以上であり、上限は好ましくは5.0GPa以下、より好ましくは2.0GPa以下である。0.1GPa未満であると自律的に保持できない膜となり5.0GPaを超えると硬すぎるため生体との適合性の低下が予想されるためである。
本発明のコラーゲン線維膜は、重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、好ましくは0.5g/cm3以上であり、より好ましくは0.6g/cm3以上であり、更に好ましくは0.65g/cm3以上であり、最も好ましくは0.70g/cm3以上である。密度が0.4g/cm3未満であると機械的強度が不足するからである。また、密度の上限は、特に限定されるものではないが、1.2g/cm3以下が好ましく、1.15g/cm3以下がより好ましく、1.1g/cm3以下が最も好ましい。1.2g/cm3を超えると、乾燥工程における不純物が混入していることがある。重量法による密度は、コラーゲン線維膜の重量を体積で割ることによって計算することができる。
本発明のコラーゲン線維膜の平均膜厚は、1μm〜2mmであり、好ましくは5μm〜1mmであり、より好ましくは10〜500μmである。1μm未満であると、強度が著しく低下したり、均一な膜が得られないことがあり、2mmを超えると乾燥工程に時間がかかったり、均一な膜成形が困難であったりすることがある。
平均膜厚は、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて作製した膜厚を計測する。最低5点を計測してその平均値を出すことで平均膜厚を測定できる。
本発明のコラーゲン線維膜の膜厚のバラツキは、平均膜厚の±30%以内である。膜厚のバラツキが30%を超えると、コラーゲン線維膜に強度の強い部分と強度の弱い部分とが混在し、引張強度などの機械的強度が低下する原因となることがある。
膜厚のバラツキは、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて、作製した膜の厚さを最低5点計測して、その標準偏差を算出することでバラツキを数値化できる。
本発明のコラーゲン線維膜は、図4に示すように、複合化線維を含むことが好ましい。前記複合化線維は、魚鱗コラーゲンから線維化した、直径80〜150nmのコラーゲン細線維が、更に螺旋巻きのコラーゲン複合化線維を形成しているものである。この螺旋巻きコラーゲン複合化線維の機能は、明確に解明されているわけではないが、線維同士の相互作用が高いコラーゲンで起きる現象で、力学的特性の向上に貢献しているものと考えられる。しかしながら、螺旋巻き複合化線維を含まないコラーゲン線維膜も、本発明に含まれる。更に、螺旋巻きコラーゲン複合化線維が、仮に力学的特性に影響を与えないとしても、本発明の範囲に影響を与えるものではない。
本発明のコラーゲン線維膜は、架橋されていてもよい。架橋により力学特性を更に向上させることが可能である。架橋は、コラーゲン線維膜内の、コラーゲン分子(3重らせん構造)の間で起こってもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細線維の間で起こってもよい。架橋方法は特に限定されるものはなく、例えばγ線、紫外線、熱処理(熱脱水)、電子線等を用いた物理的架橋、又は架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋によって架橋することができるが、大規模な装置が必要ないことから、熱処理又は架橋剤などを用いるものが好ましい。
熱処理は、例えば、真空炉を使って減圧下で、加熱処理を行う。この熱処理により、コラーゲン線維のカルボキシル基とアミノ基に脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができる。
また、架橋剤を使用することによっても、前記の真空熱処理と同様に効率よくコラーゲンに架橋を導入させることができる。架橋剤は、タンパク質を架橋でき、水溶性又は気化能を有するものであれば特に限定されるものではなく、カルボキシル基とアミノ基を架橋するもの、アミノ基同士を架橋するものでもよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が、経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−4−エチル)カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
架橋の程度は、架橋度によって特定することができる。架橋度の特定方法は限定されるものではないが、例えば、コラーゲンをグルタルアルデヒドで架橋した場合、アミノ基が架橋に使用されるため、自由アミノ基を測定することにより、架橋度を測定することができる。具体的には、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いたTNBS法により、自由アミノ基量を定量することができる。
本発明の架橋されたコラーゲン線維膜の架橋度は、特に限定されないが、下限は好ましくは5%以上、より好ましくは15%以上であり、最も好ましくは30%以上である。上限は好ましくは90%以下、より好ましくは80%以下、最も好ましくは75%以下である。5%未満であるとコラーゲン素材が酵素により分解されやすく、90%を超えると生体内で分解が殆んどされなくなるからである。
コラーゲンは一般的に、温度が上昇するとコラーゲンの3重らせん構造が破壊されて、ゼラチンとなるが、この3重螺旋構造が破壊される温度を変性温度と言う。
本発明のコラーゲン線維膜は、その構造により線維化する前のコラーゲンの変性温度と比較すると有意に上昇しているものである。すなわち、本発明のコラーゲン線維膜は、温度に対しても耐性を有している。
本発明のコラーゲン線維膜の変性温度は、特に限定されるものではないが、線維化する前のコラーゲンの変性温度より、好ましくは3℃以上、より好ましくは5℃以上、更に好ましくは8℃以上高いものである。更に架橋されたコラーゲン線維膜は、線維化する前のコラーゲンの変性温度より、好ましくは10℃以上、より好ましくは15℃以上、更に好ましくは20℃以上、最も好ましくは25℃以上高いものである。変性温度が、高いことにより熱への耐性が高まり、本発明の用途が広がるからである。上限は特に限定されないが、200℃以下が好ましく、90℃以下がより好ましい。
本発明のコラーゲン線維膜は膨潤率が低く、水分に対しても耐性を有するものである。
本発明のコラーゲン線維膜の膨潤率は、特に限定されないが、上限は好ましくは300%以下、より好ましくは250%以下である。なお、下限は100%以上であり、本明細書で膨潤率100%は、全く膨潤しないことを意味する。300%を超えると急速に膨潤して膜の強度が低下し、生体内で急速な分解が起きる。
本発明のコラーゲン線維膜は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。具体的には、コラーゲン線維膜を間葉系幹細胞と接触させること、又はコラーゲン線維膜を用いて間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導することができ、特に初期誘導能において優れている。コラーゲン線維膜を細胞培養用の培養基材として用いる場合、ある程度の強度を有することが好ましく、この点からも本願発明の高強度コラーゲン線維膜は、骨芽細胞分化誘導用のコラーゲン線維膜として有用である。
間葉系幹細胞としては、髄骨芽細胞に分化誘導することのできる細胞であれば、限定されないが、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞を挙げることができる。また、前記間葉系幹細胞の由来する動物種も、特に限定されず、哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを挙げることができる。また、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、及びホロホロチョウを挙げることができ、爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲを挙げることができ、両生類としては、カエル、及びイモリを挙げることができ、魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケを挙げることができる。更に、無脊椎動物としては、カニ、貝類、クラゲ、及びエビを挙げることができる。
前記間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、又は軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能を持つ細胞であり、骨、血管、又は心筋を構成することのできる細胞となるものである。
骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。また、骨芽細胞はアンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよく、アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激する。間葉系幹細胞から、骨芽細胞への分化誘導は、アルカリホスファターゼの活性を測定することによって確認することができる。アルカリホスファターゼの測定は、後述の実施例に示すように、常法に従って行うことができる。
本発明のコラーゲン線維膜と、間葉系幹細胞との接触又は培養に用いる培地は、間葉系幹細胞が維持できる培地であれば限定されないが、通常その間葉系幹細胞の培養に用いる培地を用いればよい。例えば、MEM培地、α−MEM培地、又はD−MEM培地等の公知の培地を、培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。
接触又は培養時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、実質的には、下限は10分以上であり、好ましくは1時間以上であり、より好ましくは1日以上である。接触又は培養時間の上限も限定されないが、30日以下であり、好ましくは15日以下であり、より好ましくは7日以下である。
接触又は培養温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができる。例えば、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、30℃〜40℃であり、35℃〜37℃が好ましい。しかしながら、培養温度よりも高い温度、又は低い温度で接触させることも可能である。例えば、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、培養温度よりも低い接触温度で、細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触を行い、最適な培養温度に上昇させて、間葉系幹細胞の培養を行うことも可能である。
本発明のコラーゲン線維膜と、間葉系幹細胞との接触又は培養において、骨芽細胞誘導因子を添加することもできる。骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、FK−506又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7又はBMP9等の骨形成タンパク質(BMP:Bone Morphogenic Proteins)、TGFβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される1種又は2種以上を、培地に添加することができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、1〜100nMの濃度で用いることができ、特には10nMが好ましい。
間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導することのできるコラーゲン線維膜は、魚類由来のコラーゲンを用いることが重要であり、特に魚鱗由来のコラーゲンであることが好ましい。すなわち、例えばブタ又はウシ由来のコラーゲンでは、間葉系幹細胞を骨芽細胞に誘導することができない。
更に、後述の実施例に示すように、線維を形成していないコラーゲン透明膜では、骨芽細胞の分化誘導が弱い。このことは、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導するためには、コラーゲンが線維化していることが重要であることを示している。
本願発明の高強度コラーゲン線維膜を用いて、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導することのできる機構は、詳細に解明されたわけではないが、魚類由来コラーゲン(特には、魚鱗由来コラーゲン)を用いたコラーゲン線維膜を、間葉系幹細胞と接触させることによって、間葉系細胞の骨芽細胞への分化が誘導、特に初期分化誘導が起きるものと考えられる。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法は、(1)可溶化コラーゲン溶液のコラーゲンを線維化させ、0.3重量%以上のコラーゲン線維ゲルを得る、コラーゲン線維化工程(以下、コラーゲン線維化工程と称する)(2)前記コラーゲン線維ゲルから、精製水/エタノール階段混合液により、塩を除去する工程(以下、塩除去工程と称する)、(3)前記コラーゲン線維ゲルの上面及び下面を覆い、側面から脱媒することにより、乾燥させる工程(以下、脱媒・乾燥工程と称する)を含む。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法によって、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜を製造することができる。しかしながら、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜は、本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法以外の方法によっても製造することが可能である。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法に用いる魚類由来コラーゲンとしては、前記の「[1]魚類由来コラーゲン線維膜」の項に記載の魚類由来コラーゲンを用いることができる。
コラーゲン線維化工程において、可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化させる。例えば、可溶化コラーゲン溶液は、魚類由来コラーゲンを酸性の水性溶媒に溶解して得ることができる。すなわち、水性の溶媒に、無機酸又は有機酸を混合し、コラーゲンを溶解させて調製することができる。無機酸としては、塩酸、リン酸、硝酸、及び硫酸を挙げることができ、有機酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシュウ酸を挙げることができる。可溶化コラーゲン溶液のpHは、pH2.0〜4.0が好ましい。
また、可溶化コラーゲン溶液として、二酸化炭素をバブリングなどによって溶解し、pHを4以下に低下させた二酸化炭素溶液を用いることもできる。すなわち、酸性の二酸化炭素溶液に、魚類由来コラーゲンを溶解させ、可溶化コラーゲン溶液として用いることができる。
塩除去工程において、精製水/低級アルコールの混合溶液を用いて、コラーゲン線維ゲルから塩を除去する。具体的には、精製水/低級アルコールの混合比率を変化させた水/低級アルコール階段混合液を用いて、コラーゲン線維ゲル中の塩を含む溶媒を、低級アルコールに置換する。低級アルコールとしては、炭素数1〜4の低級アルコール(すなわち、メタノール、エタノール、n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、sec−ブチルアルコール、又はtert−ブチルアルコール)を用いることができる。また、精製水/低級アルコール階段混合液における、精製水と低級アルコールとの混合比は、適宜決定することができる。例えば、精製水/低級アルコール階段混合液として、50容量%エタノール水溶液、70容量%エタノール水溶液、90容量%エタノール水溶液及び100%エタノールを用いることができ、最終的にコラーゲン線維ゲルの溶媒を、100%エタノールに置換する。
溶媒を低級アルコールに置換することによって、以下の脱媒・乾燥工程において、速やかに乾燥を行うことが可能である。
脱媒・乾燥工程において、コラーゲン線維ゲルからの精製水及び/又は低級アルコールの除去、及び乾燥を行う。この脱媒・乾燥工程によって、魚類由来コラーゲン線維膜の密度が上昇し、機械的強度を向上させることができる。
脱媒及び乾燥は、ゲルの上面及び下面を、水及びアルコール等が通過しない平滑なプレートなどで覆い、側面からのみ徐々に脱媒させることにより行う。また、平滑なプレートで覆うことによって、得られる魚類由来コラーゲン線維膜の膜厚を均一にすることができ、機械的強度を上昇させることが可能である。プレートは、特に限定されるものではないが、ポリスチレン、シリコーン、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル又はガラスを挙げることができるが、得られた魚類由来コラーゲン線維膜との解離性がよいことから、ポリスチレンが好ましい。
脱媒及び乾燥の時間は、精製水及びアルコールが90%以上除去される時間であれば、特に限定されないが、1時間〜13日が好ましく、3時間〜7日がより好ましく、5時間〜24時間が最も好ましい。
本発明の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法は、更に魚類由来コラーゲン線維膜を架橋する工程を含むことができる。架橋は、コラーゲン線維膜内の、コラーゲン分子(トポコラーゲン)の間で起こってもよく、コラーゲン分子(トポコラーゲン)によって形成されたコラーゲン細線維の間で起こってもよい。
テラピアの鱗からのコラーゲンの製造方法を以下に記載する。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に10%塩化ナトリウム溶液で十分洗浄し、鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥した。含水率は18.5%であった。
このテラピア鱗1kgをpH2の塩酸溶液9kgに分散し、1Mの塩酸溶液を添加しながらpHを2に保った状態で、25℃、2時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶かし出した。これをザルにあげて、十分水洗した後、総重量が4kgとなるようにpH2の塩酸溶液を添加した。
本実施例では、5mmの厚さのコラーゲン線維ゲルを用いて、高強度コラーゲン線維膜を作製した。
前記製造例1で得られたテラピア鱗コラーゲン塩酸水溶液を、塩酸溶液(0.001mol/L、pH3.0)で、0.5重量%(実施例1)、0.4重量%(実施例2)、0.3重量%(実施例3)、0.2重量%(比較例1)、0.1重量%(比較例2)、0.05重量%(比較例3)に希釈した。この0.5重量%テラピア鱗コラーゲン塩酸水溶液9容量部に、10倍のダルベッコスPBS―(カルシウム・マグネシウムが含まれていない)を1容量部混合した。得られた混合液を、シリコーン製の成形槽(直径18mm、高さ5mm)に注ぎ、水分が蒸発しないようにスライドガラスで上面と下面を覆い、28度で3時間線維化させた。得られたコラーゲン線維ゲルを70容量%のエタノールを含む精製水/エタノールの混合溶液(70容量%エタノール水溶液)に浸漬させた。図1に、前記混合溶液に浸漬したコラーゲン線維ゲルの形態を示す。コラーゲン濃度0.3重量%以上で形態が維持されることを確認した。
実施例4〜6では、1.0重量%のコラーゲン塩酸水溶液を用いて、高強度コラーゲン線維膜を作製した。
0.4重量%テラピア鱗コラーゲン塩酸水溶液に代えて、1重量%テラピア鱗コラーゲン塩酸水溶液を用いたことを除いては、実施例2の操作を繰り返した。乾燥前のコラーゲンゲルの体積は1.271cm3であり、含まれるコラーゲンの重量は11.44mgである。乾燥されたコラーゲン線維膜は、52.5±7μmの均一な膜厚を有していた。従って、得られたコラーゲン線維膜の密度は、0.857g/cm3である。
5mmの高さのシリコーン製の成形槽に代えて、1mmの高さのシリコーン製の成形槽(直径18mm、高さ1mm)を用いたことを除いては、実施例4の操作を繰り返した。乾燥前のコラーゲンゲルの体積は0.254cm3であり、含まれるコラーゲンの重量は2.28mgである。乾燥されたコラーゲン線維膜は、11.5±3μmの均一な膜厚を有していた。従って、得られたコラーゲン線維膜の密度は、0.782g/cm3である。
5mmの高さのシリコーン製の成形槽に代えて、0.5mmの高さのシリコーン製の成形槽(直径18mm、高さ0.5mm)を用いたことを除いては、実施例4の操作を繰り返した。乾燥前のコラーゲンゲルの体積は0.127cm3であり、含まれるコラーゲンの重量は1.15mgである。乾燥されたコラーゲン線維膜は、6.7±1μmの均一な膜厚を有していた。従って、得られたコラーゲン線維膜の密度は、0.672g/cm3である。
前記コラーゲン線維ゲルの下面のみを、ポリスチレンで覆い乾燥させたことをのぞいては、実施例4の操作を繰り返して、コラーゲン線維膜を得た。得られたコラーゲン線維膜は膜厚が均一でなく、部分的に薄くなっており、引張強度が測定できなかった。
前記コラーゲン線維ゲルの下面のみを、ポリスチレンで覆い乾燥させたことをのぞいては、実施例5の操作を繰り返して、コラーゲン線維膜を得た。得られたコラーゲン線維膜は膜厚が均一でなく、部分的に薄くなっており、引張強度が測定できなかった。
前記コラーゲン線維ゲルの下面のみを、ポリスチレンで覆い乾燥させたことをのぞいては、実施例6の操作を繰り返して、コラーゲン線維膜を得た。得られたコラーゲン線維膜は膜厚が均一でなく、部分的に薄くなっており、引張強度が測定できなかった。
実施例5で得られたコラーゲン線維膜の表面の走査型電子顕微鏡像を図3に示す。形成されたコラーゲン線維が均一に絡み合った構造である。
また、図4に原子間力顕微鏡による線維構造の写真を示す。生体内に観測される線維であるコラーゲン原線維と類似した縞状の周期構造(約60nm)が観察された(図4A)。また、コラーゲン線維が螺旋巻きに複合化した線維が形成されていることがわかった(図4B)。
引張強度試験を行った。
シリコーン製の成形槽(直径18mm、高さ5mm)に代えて、ポリスチレン製の成形槽(幅45mm×長さ70mm×高さ1mm)を用いたことを除いては、実施例4の操作を繰り返し、コラーゲン線維膜を得た。
引張強度試験を行うため、コラーゲン線維膜を、幅10mm、長さ20〜30mmの短冊状の試験片に加工した。なお、作製した膜の厚さは、マイクロメータにより計測し、6.7±1.2μmであった。
引張試験は、試験片の両端をガラスに張り付け、引張試験機(Orientec;STA−1150)を用いて行った。測定条件は、ロードセル間の距離を10mmとし、0.5mm/分の速度で行った。図5にその結果を示す。
図5に示すように、応力が歪に対して徐々に向上し、約8.2%の歪で破断した。また、最大応力は59MPaであった。
本実施例では1.11重量%のコラーゲン塩酸酸性水溶液を用いて、高強度コラーゲン線維膜を作成した。
製造例1で得られたテラピア鱗コラーゲンを1.11重量%になるように塩酸酸性水溶液(0.0001mol/L、pH4.9)を用いて調整した。1.11重量%のコラーゲン塩酸酸性水溶液9容量部に10倍濃度のダルベッコスPBS―を1容量部混合した。これをシリコーン製の成形槽(直径20mm×高さ2.5mm:下面にはガラスプレートを設置)に注ぎ、水分が蒸発しないようにスライドガラスで上面を覆い、28℃で2時間線維化させた。得られたコラーゲン線維ゲルを50、70、90容量%エタノール水溶液にそれぞれ浸漬し、塩を除去した。最後に99.5%エタノールに浸漬させた。
本比較例では、脱媒・乾燥工程を、ポリスチレンン蓋を用いずに行い、コラーゲン線維膜を作製した。
脱媒・乾燥工程をポリスチレンンの蓋をせずに行ったことを除いて、実施例7の操作を繰り返した。乾燥後の膜の形状を図6Bに示す。作製したコラーゲン膜は、形態が歪であり、透明と不透明な部位からなる、不均一な膜であることが分かる。また、図6Cに示した走査型電子顕微鏡像のように、コラーゲン線維形態が維持されないことが明らかであった。
本実施例では、高強度コラーゲン線維膜に対し、化学架橋(グルタルアルデヒド架橋)を行った。テラピア鱗コラーゲンを1.11重量%になるように塩酸酸性水溶液(0.0001mol/L、pH4.9)を用いて調整した。1.11重量%のコラーゲン塩酸酸性水溶液9容量部に10倍濃度のダルベッコスPBS―を1容量部混合した。これを引張試験片用のシリコーン製の成形槽(図7:下面にはガラスプレートを設置)に注ぎ、水分が蒸発しないようにスライドガラスで上面と下面を覆い、28℃で2時間線維化させた。得られたコラーゲン線維ゲルを50、70、90容量%エタノール水溶液にそれぞれ浸漬し、塩を除去した。最後に99.5%エタノールに浸漬させた。作製したコラーゲン線維ゲルは、ポリスチレン(形状は、図7の成形槽の形状より1mm小さいもの)で上面と下面を覆い、側面から脱媒させた。
得られた架橋高強度コラーゲン線維膜の架橋度を測定した。架橋度は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いたTNBS法により、自由アミノ基量を定量することで行った。
実施例9〜13の作製したコラーゲン線維膜を10mg秤量し、1.0mLの炭酸水素ナトリウム(4重量体積%)/TNBS(0.5重量体積%)を加え、40℃で2時間処理した。更に、3mLの塩酸(6N)を加え、20から40分間80℃の浴槽で処理した。加水分解させた後、15mLの精製水を加え、1mLを分注し、室温まで冷却し、5mLの精製水で希釈した。345nmの波長で吸光度を計測した。自由アミノ基量(Ag−col;mol)/コラーゲン量(g)=(4×吸光度)/(1.46×106(L/mol・cm)・セルの長さ(cm))から算出した。何も処理しないコラーゲンを用いてTNBS法により自由アミノ基量(Acol)を計測した。架橋度(D;%)は(1−Ag−col/Acol)×100により計算した。架橋処理時間と架橋度の関係を図8Aに示す。図に示したように、架橋度は処理時間とともに直線的に上昇した。
得られた架橋高強度コラーゲン線維膜の変性温度を測定した。変性温度の測定は、示差走査熱量測定により行った。
実施例8〜13の作製したコラーゲン線維膜から、試料重量5−6mgを秤とり、ダルベッコスPBS―に24時間浸漬させた後、余剰の水分を拭き取り、アルミニウムパンにシールして計測を行った。3℃/分の昇温速度で―10℃から100℃の範囲を走査させた。架橋度と変性温度の関係を図8Bに示す。塩酸酸性水溶液に分散させたコラーゲン分子の変性温度(架橋度0の下点)は約36℃であり、線維化させた実施例8コラーゲン線維膜の変性温度(架橋度0の上点)は、約10℃上昇した。図に示すように変性温度は架橋度との直線的な相関があった。また、架橋度60%以上のコラーゲンの変性温度は、架橋度45%のコラーゲンと比較して変化しなかった。
得られた架橋高強度コラーゲン線維膜の膨潤率を測定した。膨潤率の測定は、以下のように行った。
実施例9〜13の作製したコラーゲン線維膜を、1時間、2時間、4時間、又は8時間、38℃でダルベッコスPBS―に浸漬し、その後溶液から取り出し、キムワイプで周りの水分を除去した重量変化から計測した。ここで、膨潤率(%)は(WPBS−WDRY)/WDRY×100の式から算出した。図8Cに浸漬時間による膨潤率の変化を示す。浸漬1時間後以降ではその膨潤率は変化しなかった。また、架橋度と浸漬1時間後の膨潤率は負の相関がみられた(図8D)。しかし、架橋度60%のコラーゲン膜の膨潤度は、架橋度45%のコラーゲン膜と比較して変化しなかった。
架橋したコラーゲン線維膜の引張強度及びヤング率を測定した。引張試験は、ギャップ間の距離を10mmとし、0.5mm/分の引張速さで計測を行った。試験片の形状は、図7に示したように、10mm×20mmで、中央部分の幅を10mmから5mmに狭くしたものである。
実施例8〜13の作製したコラーゲン線維膜の応力―歪曲線を図8Eに示す。また、架橋度と引張強度及びヤング率を図8Fに示す。応力−歪曲線から、未架橋の試料では最も高い歪を示した。架橋処理時間が15分〜1時間では、引張強度の変化が観測されなかったが、架橋時間を2時間及び3時間と長くなるにつれて、引張強度と歪の両方の増加が観測された。このような変化は、架橋処理時間が短い場合は、グルタルアルデヒドがコラーゲン線維内のコラーゲン分子同士を架橋させるが、架橋処理時間を長くすると、グルタルアルデヒドが線維間に架橋を形成するためと予想される。架橋度と引張強度及びヤング率の変化からは、架橋密度と材料物性は直線的な相関があると考えられる。
引張試験後にコラーゲン線維膜の線維形態が変化するか否かを走査型電子顕微鏡によって分析した。
白金コーティングを20nm行い、加速電5kVで観察した。電子顕微鏡写真を図9に示す。実施例8の未架橋のコラーゲン線維膜では、引張試験によって引張方向にコラーゲン線維が伸展し、線維方向が揃っている様子が観測された(図9b)。一方、実施例10の架橋処理時間30分を行ったコラーゲン線維膜(図9c)、及び実施例13の架橋処理を3時間行ったコラーゲン線維膜(図9d)では、コラーゲン線維方向には変化が観測されなかった。
本実施例では、実施例7と同様の条件で作製した高強度コラーゲン線維膜(直径20mm)を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の培養を行った。また、比較例8として、コラーゲン分子を溶解させた溶液をキャストフィルム法により透明膜を作製し、これを用いてhMSCの培養を行った。更に、コラーゲン膜を用いず、ポリスチレン製12ウェル細胞培養プレート(FALCON社製)を用い、hMSCの培養を行った。
ポリスチレン製12ウェル細胞培養プレートのウェルに、実施例7と同様の条件で得られた高強度コラーゲン線維膜、又は比較例8のコラーゲン透明膜を挿入した。それぞれのコラーゲン膜が挿入されたウェル、又はコラーゲン膜が挿入されていないウェルに、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで播種した。培地には、10%FBS添加D―MEM(High―Glucose)を用い、37℃、5%CO2雰囲気下で培養を行った。培養する際には、骨芽細胞分化誘導因子は未添加しなかった。1日培養した後、骨分化能を調べるためアルカリホスファターゼの測定を行った。細胞をPBS(−)(pH7.4)で洗浄後、スクレイパーで回収し、200μLの100mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、0.2%Triton X−100に懸濁して超音波破砕した。破砕後、6,000gで10分間遠心して上清を回収した。上清20μL(適宜100mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2にて希釈)を使用し、LabAssay ALP(Wako)を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
コラーゲンの膜を用いない培養では、骨芽細胞の誘導は起きなかった。また、コラーゲン透明膜を用いた培養では、骨芽細胞の誘導は弱かったが、魚類由来の高強度コラーゲン線維膜を用いることにより、ヒト間葉系幹細胞は骨芽細胞に誘導された。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (7)
- (1)引張強度が30MPa以上であり、
(2)重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして
(3)平均膜厚が1μm〜2mmで、且つ膜厚のバラツキが平均膜厚の±30%以内である、
ことを特徴とする、魚類由来コラーゲン線維膜。 - コラーゲンが魚鱗由来である、請求項1に記載の魚類由来コラーゲン線維膜。
- コラーゲンが架橋されている請求項1又は2に記載の魚類由来コラーゲン線維膜。
- 骨芽細胞分化誘導用である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲン線維膜。
- (1)可溶化コラーゲン溶液のコラーゲンを線維化させ、0.3重量%以上のコラーゲン線維ゲルを得る、コラーゲン線維化工程、
(2)前記コラーゲン線維ゲルから、精製水/エタノールにより、塩を除去する工程、
(3)前記コラーゲン線維ゲルの下面及び上面を覆い、側面から脱媒することにより、乾燥させる工程、
を含む、魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法。 - コラーゲンが魚鱗由来コラーゲンである、請求項5に記載の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法。
- 前記魚類由来コラーゲン線維膜を架橋する工程を更に含む、請求項5又は6に記載の魚類由来コラーゲン線維膜の製造方法。
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