JPWO2011099576A1 - Ｆｇｆ２に対するアプタマー及びその使用 - Google Patents

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Abstract

ＦＧＦ２に対する阻害活性を有するアプタマー；ＦＧＦ２に対する結合活性又は阻害活性を有するアプタマー及び機能性物質（例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体、又は薬物など）を含む複合体；ＦＧＦ２に対する結合活性又は阻害活性を有するアプタマー、又は当該アプタマー及び機能性物質を含む複合体を含む医薬、診断薬及び標識剤；などを提供する。

Description

本発明は、ＦＧＦ２に対するアプタマー及びその利用方法などに関する発明である。
塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２またはｂＦＧＦ）は種々の細胞から分泌される増殖因子であり、発生段階では細胞増殖や分化に深く関与し、成体では組織修復時や癌組織において高い発現が認められる。
ヒトＦＧＦ２は複数のアイソフォームを有するが、そのうち最も分子量の小さいアイソフォームのみが細胞外に分泌される。このアイソフォームは１５４アミノ酸から構成される約１８ｋＤａのタンパク質で、糖鎖は持たず、等電点は９．４と塩基性に傾いている。読み取り枠の異なるＦＧＦ２の高分子量アイソフォーム（２２、２２．５、２４、３４ｋＤ）の機能はまだ明らかではないが、核内移行シグナルを持ち、核内で機能すると考えられている。
ヒトＦＧＦファミリータンパク質は、ＦＧＦ１からＦＧＦ２３までの２２種類が知られている（ＦＧＦ１５とＦＧＦ１９は同一分子であるため、現在はＦＧＦ１９に統一されている）。系統発生学的解析により、ＦＧＦ２はＦＧＦ１とともにＦＧＦ１サブファミリーに分類される。ＦＧＦ１とのアミノ酸配列の相同性は全ＦＧＦの中で最も高く、その値は５５％である。ＦＧＦの受容体（ＦＧＦＲ）はチロシンキナーゼ型受容体であり、４つのサブタイプに分類される。ＦＧＦＲ１〜３は、それぞれｂとｃのアイソフォームが知られているが、ＦＧＦ２はこのうちのＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃおよびＦＧＦＲ３ｃ、ならびにＦＧＦＲ４と２量体を形成して結合する。
マウス線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）は細胞膜表面にＦＧＦＲ１を発現している細胞である。このＦＧＦＲ１はヒトＦＧＦ２の結合により活性化されることが知られている。ＦＧＦ２がＦＧＦＲ１に結合すると、ＦＲＳ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ２）、Ｇｒｂ２（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ＳＯＳを介してＭＡＰキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路やＰＩＫ３（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ）／ＡＫＴ１（ａｃｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ １）経路などが活性化され、最終的にＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ−α（ｐｌａｔｅｌｅｔ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−α）など各種サイトカインや受容体遺伝子が発現誘導される。
ＦＧＦ２はヘパリン結合領域を持ち、他のＦＧＦと同様、ヘパリンやヘパラン硫酸と結合する。細胞から分泌されたＦＧＦ２は一般に細胞外マトリックスのヘパラン硫酸に結合し、濃縮され、プロテアーゼからの保護を受けると考えられている。リガンドとして機能する際は、結合した細胞外マトリックスからの遊離が必要だが、これにはＦＧＦ−ＢＰ（ＦＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が関与し、ＦＧＦＲへの誘導を補助するとの報告がなされている。
ＦＧＦ２は血管内皮細胞に対する強い増殖、遊走促進作用を持ち、腫瘍組織の血管新生にも深く関与していることがわかっている。例えば腎臓がんなど、血管の多い腫瘍において特にＦＧＦ２の血清濃度が高いことが報告されており、その他前立腺がん、乳がん、肺がん等、様々な腫瘍にも存在する。
血管新生にはＦＧＦ２のほか、ＦＧＦ１、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎなどの因子が関与している。これらの因子は腫瘍や血管芽細胞、支持細胞などから分泌され、オートクラインやパラクラインの成長因子として血管新生に寄与する。ただしＦＧＦ２は血管内皮細胞だけでなく、平滑筋細胞など、内皮細胞を取り囲む間葉系の細胞にも作用する点が他の因子と異なる。つまりＦＧＦ２は間葉系細胞を刺激してＰＤＧＦやＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等の発現を亢進させ、これらの因子が直接的な血管内皮細胞の増殖を促進すると考えられている。
現在、腫瘍組織における異常型血管新生を阻害し、腫瘍組織への栄養供給経路の遮断を目的とした薬の開発が多く試みられている。実際に臨床の場で用いられている薬も存在し、例えばジェネンティック社により開発されたヒト型ＶＥＧＦモノクローナル抗体（アバスチン（登録商標））は、大腸癌及び非小細胞肺癌に対する有効性が認められている。しかしながら、未だ強力な抗腫瘍薬は開発されていない。これらの薬の多くはＶＥＧＦやＰＤＧＦを標的としたものであるが、より上流で機能するＦＧＦ２を標的とすることで、異常血管新生の初期段階をブロックすることが期待される。
また、異常血管新生は腫瘍のほか、歯周病、強皮症、新生血管性緑内障、関節炎等の慢性炎症、乾癬、加齢性黄班変性症などの疾患にも関与している。
一方、ＦＧＦ２の強い血管新生作用を、閉塞性血管障害に対する治療や創傷治癒に用いる試みがなされている。実際に、科研製薬株式会社によるヒトＦＧＦ２製剤（フィブロブラストスプレー（登録商標））は、創傷治癒の促進薬として既に認可、販売されている。
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には、世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢性黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献１〜３参照）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみを回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
特許文献２には、ＳＥＬＥＸ法により得られたｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）に対する核酸リガンド（この項において、「アプタマー」を含む）が記載されている。また特許文献４には、腫瘍転移または血管新生の阻害を目的として、ＨＧＦに対する核酸リガンドがｂＦＧＦを阻害する核酸リガンドと共に使用できることが記載されており、ｂＦＧＦを阻害する核酸リガンドとしては、特許文献５および６に記載の核酸リガンドが挙げられている。しかしながら、これらの文献に記載のアプタマーは、本明細書中に具体的に示されるアプタマーとは配列が異なる。またこれらの文献には、本明細書中に具体的に示されるアプタマーについて、記載も示唆もない。
国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット 国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット 国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／００９１５９号パンフレット 米国特許５，６３９，８６８号 米国特許６，７５９，３９２号
本発明は、ＦＧＦ２に対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ＦＧＦ２に対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである。
［１］ＦＧＦ２に結合するアプタマー。
［２］ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［１］記載のアプタマー。
［３］ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合は阻害するが、ＦＧＦ１と受容体との結合は阻害しない、［２］記載のアプタマー。
［４］下記式：
ＡＧＵＡＣＵＡＣＵＮＧＵＵＡＣＣ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される６または７個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
［５］ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［４］記載のアプタマー。
［６］下記式：
ＧＡＧＧＧＵＧＡＣＧＧＵＮ’ＧＣＵＧＵＵＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される７または１０個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
［７］ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［６］記載のアプタマー。
［８］下記式：
ＵＡＧＧＧＣＮ’’ＣＡＧＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される１０〜１８個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
［９］ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［８］記載のアプタマー。
［１０］配列番号４２で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
［１１］ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［１０］記載のアプタマー。
［１２］配列番号３６または３８の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
［１３］ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、［１２］記載のアプタマー。
［１４］以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、［１］記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［１５］ヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマー。
［１６］［１］〜［１５］のいずれか一に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
［１７］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１６］に記載の複合体。
［１８］［１］〜［１５］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１６］又は［１７］に記載の複合体を含む、医薬。
［１９］［１］〜［１５］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１６］又は［１７］に記載の複合体を含む、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、あるいは心臓の形成異常、血管の形成異常または骨格の形成異常の治療用または予防用の医薬。
［２０］［１］〜［１５］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１６］又は［１７］に記載の複合体を含む、診断薬。
［２１］［１］〜［１５］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１６］又は［１７］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＦＧＦ２の検出方法。
本発明のアプタマーまたは複合体は、癌、歯周病、強皮症、新生血管性緑内障、関節炎等の慢性炎症、乾癬、加齢性黄班変性症などの疾患用治療薬または予防薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマーまたは複合体はまた、ＦＧＦ２の精製及び濃縮、ＦＧＦ２の標識、並びにＦＧＦ２の検出及び定量に有用であり得る。
配列番号１〜５で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造をそれぞれ示す図である。共通配列を黒丸で示す。 配列番号７および８で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造をそれぞれ示す図である。共通配列を黒丸で示す。 配列番号１０〜１３で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造をそれぞれ示す図である。共通配列を黒丸で示す。 配列番号９で表されるアプタマー（Ａｐｔ９）がヒトＦＧＦ２に結合することを示すセンサーグラムである。 配列番号９で表されるアプタマー（Ａｐｔ９）がヒトＦＧＦ１に結合しないことを示すセンサーグラムである。 配列番号９で表されるアプタマー（Ａｐｔ９）がヒトＦＧＦ２とヒトＦＧＦ２受容体の結合を阻害することを示すセンサーグラムである。 配列番号１、６、７、９〜１１で表されるアプタマーがヒトＦＧＦ２の生理活性を阻害することを示す、ウエスタンブロッティングの結果である。 配列番号３６と３８で表される短小化アプタマーのＭＦＯＬＤプログラムによる二次構造予測である。 配列番号３６と３８で表されるアプタマーがヒトＦＧＦ２の生理活性を阻害することを示す、ウエスタンブロッティングの結果である。 配列番号３６および４３〜４６で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。また本発明のアプタマーは、直鎖状又は環状の形態であり得る。
本発明は、ＦＧＦ２に対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の活性を阻害し得る。すなわち、本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２に対する阻害活性を有する。
ＦＧＦ２に対する阻害活性とは、ＦＧＦ２が保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＦＧＦ２はＦＧＦ受容体発現細胞に作用して、シグナル伝達を活性化し、各種細胞増殖因子やその受容体の産生を誘導する。従って、ＦＧＦ２に対する阻害活性とは、ＦＧＦ受容体を介した細胞内シグナル伝達を阻害する活性のことでありうる。また、これら各種細胞増殖因子やその受容体の発現は、結果的に細胞の増殖活性や遊走活性の亢進を導くので、ＦＧＦ２の阻害活性とはそれらの活性の阻害を意味する。
ＦＧＦ２とは、発生初期や分化、増殖、再生時に強く発現するタンパク質であり、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ ＥＡＸ０５２２２やＮＰ００１９９７で表されるアミノ酸配列を持つタンパク質である。ＦＧＦ２は、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦＢまたはＨＢＧＦ−２と呼ばれることもある。本発明におけるＦＧＦ２は、動物体内で作られる他、マウスなどの哺乳細胞、昆虫細胞、大腸菌などの培養細胞を用いても作製することができ、更に、化学合成によっても作ることができる。培養細胞や化学合成によって作製する場合は、自体公知の方法で容易に変異体を作製することができる。ここでＦＧＦ２の「変異体」とは、公知のＦＧＦ２のアミノ酸配列からアミノ酸が１〜数個置換、欠失、付加等されたものや、公知のＦＧＦ２のアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列からなるものであって、本来ＦＧＦ２が有している活性の少なくとも一つ以上の活性を有しているタンパク質またはペプチドを意味する。アミノ酸が置換、付加される場合、当該アミノ酸は天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよい。本発明におけるＦＧＦ２はこれらの変異体を含む。
ＦＧＦ２受容体とは、ＦＧＦ２が結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＦＧＦ２受容体としては、ＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ４が知られている。本発明におけるＦＧＦ２受容体とは、天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここでＦＧＦ２受容体の「変異体」とは、アミノ酸が１〜数個置換、欠失、付加等されたものや、公知のＦＧＦ２のアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列からなるものであって、ＦＧＦ２に対して結合活性を有するタンパク質またはペプチドを意味する。本発明は、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するＦＧＦ２に対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、下記式：
ＡＧＵＡＣＵＡＣＵＮＧＵＵＡＣＣ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される６または７個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）
で表される共通配列（以下、「共通配列１」と記載する場合がある）を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい。この配列は、後述する配列番号１、２、３、４および５で表されるヌクレオチド配列の共通配列であって、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測される二次構造が同じ形状であるものを含む（図１参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、下記式：
ＧＡＧＧＧＵＧＡＣＧＧＵＮ’ＧＣＵＧＵＵＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される７または１０個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）
で表される共通配列（以下、「共通配列２」と記載する場合がある）を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい。この配列は、後述する配列番号７および８で表されるヌクレオチド配列の共通配列であって、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測される二次構造が同じ形状であるものを含む（図２参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、下記式：
ＵＡＧＧＧＣＮ’’ＣＡＧＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される１０〜１８個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）
で表される共通配列（以下、「共通配列３」と記載する場合がある）を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい。この配列は、後述する配列番号１０、１１、１２および１３で表されるヌクレオチド配列の共通配列であって、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測される二次構造が同じ形状であるものである（図３参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ａａｇｃ（Ｆ）ａｇｇａｇｇｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇｇｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ（配列番号７）の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい（図７参照）。
また本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ（配列番号９）；ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ（配列番号１０）；またはｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ（配列番号１１）の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい（図７参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、ｇｇｇｇｃ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）（配列番号３６）の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマーであることが好ましい（図９参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、ｇｇｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）（配列番号３８）の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害し、細胞に対してもＦＧＦ２シグナリングの阻害活性を有しているアプタマーであることが好ましい（図９参照）。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２の任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎａｇｇｇｃ（Ｆ）（配列番号４２）の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害し、細胞に対してもＦＧＦ２シグナリングの阻害活性を有しているアプタマーであることが好ましい。この配列は、後述する配列番号４３〜４６で表されるヌクレオチド配列の共通配列（以下、「共通配列４」と記載する場合がある）であって、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測される二次構造が同じ形状であるものである（図１０参照）。
これらの配列は、前述した特許文献２、特許文献５および特許文献６に記載の核酸リガンドとは配列が異なる。
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１０〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約３５ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチド（即ち、無置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシ基が、任意の原子又は基で置換（修飾）されているヌクレオチド（本発明において、「置換ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」と記載する場合がある）であり得る。
このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシ基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含む修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシ基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシ基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。
本発明のアプタマーはまた、ＦＧＦ２の活性を阻害し得るが、ＦＧＦ１の活性を阻害し得ないという特徴を有し得る。また本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合は阻害するが、ＦＧＦ１とＦＧＦ１受容体との結合は阻害しないという特徴を有し得る。ＦＧＦ１はＦＧＦファミリータンパク質であり、最もＦＧＦ２に類似している。
本発明のアプタマーはまた、（ａ）共通配列１〜４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；（ｂ）共通配列１〜４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；（ｃ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ａ）及び（ｂ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物；であり得る。
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、置換、欠失、挿入又は付加後も依然としてＦＧＦ２に結合する限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。上記（ｃ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
上記（ａ）〜（ｃ）に含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシ基が、任意の原子または基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
例えば、上記（ａ）〜（ｃ）に含まれる各ヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されており；
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシ基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されている；
アプタマーであってもよい。本発明は、上記アプタマーも提供する。
本発明のアプタマーはまた、
（ａ’）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ’）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；
（ｃ’）上記（ａ’）の複数の連結物、上記（ｂ’）の複数の連結物、上記（ａ’）及び（ｂ’）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物；
であり得る。
上記（ａ’）〜（ｃ’）のうち、好ましいものは、配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列が、配列番号３６または３８の配列である、（ａ’）〜（ｃ’）である。
上記（ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、置換、欠失、挿入又は付加後も依然としてＦＧＦ２に結合する限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。上記（ｃ’）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
上記（ａ’）〜（ｃ’）に含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシ基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシ基が、任意の原子または基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
例えば、上記（ａ’）〜（ｃ’）に含まれる各ヌクレオチドにおいて、
（ｉ’）各ピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されており；
（ｉｉ’）各プリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシ基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されている；アプタマーであってもよい。本発明は、上記アプタマーも提供する。
本発明のアプタマーは、ＦＧＦ２に対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２，５１３８−５１４５参照）。
本発明のアプタマーはまた、ＦＧＦ２に対する結合性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＦＧＦ２は塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、コントロールで用いたＲＮＡはＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合を阻害しなかった。
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーは、最適化ＳＥＬＥＸを行うことで、更に高性能化することが可能である。最適化ＳＥＬＥＸとは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では４１ヌクレオチド（配列番号３６）や３５ヌクレオチド（配列番号３８）でも活性を保持しているアプタマーを得ることができ、これらの配列がＦＧＦ２と結合するために特に重要であることがわかった。
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかを既存のアッセイ系により確認することができる。
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。そして、新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
さらに、既に述べたように、修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能である、アプタマーの製造方法を提供する。
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００、好ましくは１〜約５０、より好ましくは１〜約３０、さらにより好ましくは１〜約２０又は１〜約１０であり得る〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は、共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のアプタマーまたは複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。特に、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、あるいは心臓の形成異常、血管の形成異常、骨格の形成異常といった疾患の治療用または予防用の医薬、あるいは診断薬、検査薬、試薬として有用である。
上記医薬の対象疾患としては、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューログラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌、歯周病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、炎症性腸炎（クローン病など）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病など）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、乾癬、喘息、好中球機能異常、好酸球性肺炎、突発性肺線維症、過敏性肺炎、移植時の拒絶反応、移植片対宿主病、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、術後癒着、子宮内膜症、成人性歯周炎、気管支炎、ＣＯＰＤ、感染症、頭蓋骨癒合症，軟骨無形成症，軟骨低形成症などの骨・軟骨疾患、低リン酸血症性くる病・骨軟化症など挙げられる。
また本発明のアプタマーまたは複合体は、薬物送達剤、インビボイメージング用プローブ、ＦＧＦ２の血中濃度測定用プローブ、組織染色用プローブ、ＥＬＩＳＡ用プローブ、ＦＧＦ２の分離精製用リガンドとしても使用され得る。
ＦＧＦ２は、線維芽細胞、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経前駆細胞、骨髄由来間質細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、造血系細胞、腫瘍細胞などの各種細胞に作用することが知られている。ＦＧＦ２はこれらの細胞に受容体を介して作用することで下流のＭＡＰＫカスケードや、ＰＬＣγカスケード、ＰＩ３キナーゼカスケードなどを活性化させ、更に下流の遺伝子の発現を制御する。従って、本発明のアプタマーまたは複合体は、これらの細胞およびシグナル伝達経路などに関係した疾患の治療用または予防用医薬、あるいは診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放性製剤の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名Ｓｐａｎ（スパン）２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）８０）、天然資源由来のレシチン（商品名Ｅｐｉｃｌｏｎ（エピクロン））、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名Ｂｒｉｊ（ブリジ）３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名Ｇｅｎａｐｏｌ（ゲナポル）０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（シンペロニック））等が挙げられる。Ｓｐａｎ（スパン）、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）、Ｅｐｉｃｌｏｎ（エピクロン）、Ｂｒｉｊ（ブリジ）、Ｇｅｎａｐｏｌ（ゲナポル）およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（シンペロニック）は商標である。
油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマーまたは複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマーまたは複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
本発明はまた、本発明のアプタマーまたは複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコーン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＦＧＦ２の精製、及びＦＧＦ２の検出、定量に有用であり得る。
本発明のアプタマーまたは複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマーまたは複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、本発明のアプタマーまたは複合体を固相担体に固定する方法、およびそうして得られる固相担体を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
本発明はまた、ＦＧＦ２の精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明の精製方法はＦＧＦ２を他のＦＧＦファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＦＧＦ２を吸着させ、吸着したＦＧＦ２を溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＦＧＦ２の吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＦＧＦ２を含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＦＧＦ２の溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。
本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＦＧＦ２の吸着後、洗浄液を用いて当該固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ（ツイーン）２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、当該固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、当該固相担体の再生、滅菌が可能である。
本発明のアプタマーまたは複合体は、検出用プローブ、特にＦＧＦ２の検出用プローブとして利用することができる。アプタマーの標識方法としては特に限定されず、自体公知の方法が適用可能である。このような方法としては、例えば放射性同位元素による標識、蛍光色素や蛍光蛋白質による標識などが挙げられる。
本発明はまた、ＦＧＦ２の検出及び定量方法を提供する。特に本発明はＦＧＦ２を他のＦＧＦファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＦＧＦ２を測定することを含み得る。ＦＧＦ２の検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＦＧＦ２量の測定、ＦＧＦ２が関連する疾患の診断に有用であり得る。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：ＦＧＦ２に特異的に結合する核酸の作製
ＦＧＦ２に特異的に結合する核酸はＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５−５１０，１９９０）を改良して行った。標的物質としてヒトＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ＦＧＦ２はアミノカップリングによってアガロース樹脂（ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。アミノカップリングはＧＥヘルスケア社の仕様書にそって行った。固定化量は、固定化前のＦＧＦ２溶液と固定化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはＦＧＦ２のバンドは検出されず、使用したＦＧＦ２のほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約４００ｐｍｏｌのＦＧＦ２が約１０μＬの樹脂に固定化されたことになる。
最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ−ＲＮＡ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ９５ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。以下に用いたＤＮＡ鋳型とプライマーを示す。
ＤＮＡ鋳型：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｔｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｇｃ−４０Ｎ−ｇｇｃｇａｔｇｃｔｃａｇａａｇｃｇｇａｇ−３’（配列番号３９）
プライマーＦｗｄ：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｔｇｔｔｃｔｇｇａｔｃｇｃ−３’（配列番号４０）
プライマーＲｅｖ：
５’−ｃｔｃｃｇｃｔｔｃｔｇａｇｃａｔｃｇｃｃ−３’（配列番号４１）
ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれか一つを示す。プライマーＦｗｄはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。
ＦＧＦ２が固定化された樹脂にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した。３０分後、ＦＧＦ２に結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。ＦＧＦ２に結合したＲＮＡは、溶出液を加えて室温で１０分間攪拌することで回収した。溶出液として溶液Ａに、６Ｍグアニジン塩酸塩を加えｐＨ７．６に調整したものを用いた。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を８ラウンド行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）にトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）で９７クローンの塩基配列を調べた。
ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後に配列を調べたところ、配列に収束が見られた。
配列番号１で表される配列は１２配列存在し、１塩基置換体が４配列、存在した。配列番号１で表される配列に含まれる、共通配列１を含む配列が、５配列、４種類存在した（配列番号２〜５）。
配列番号６で表される配列は１２配列存在し、１塩基置換体が１配列、２塩基置換体が６配列、存在した。
配列番号７で表される配列は１２配列存在し、１塩基置換体が２配列、２塩基置換体が１配列、存在した。
配列番号７で表される配列に含まれる、共通配列２を含む配列が１配列存在した（配列番号８）。
配列番号９で表される配列は７配列存在し、１塩基置換体が１配列、２塩基置換体が２配列、存在した。
配列番号１０で表される配列は４配列存在した。配列番号１０で表される配列に含まれる、共通配列３を含む配列が他に３種類、８配列存在した（配列番号１１〜１３）。
配列番号１４で表される配列は４配列存在し、１塩基欠失体が１配列、存在した。配列番号１５〜１７で表される配列は３配列、存在した。配列番号１８で表される配列は３配列存在し、２塩基変異体が１配列、存在した。配列番号１９〜２０で表される配列は２配列、存在した。配列番号２１で表される配列は２配列存在し、１塩基変異体が１配列、存在した。配列番号２２で表される配列は２配列存在し、２塩基変異体が１配列、存在した。配列番号２３〜３４で表される配列は１配列であった。
共通配列１を含む、配列番号１〜５で表される配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分の形状に相似がみられた（図１参照）。
共通配列２を含む、配列番号７および８で表される配列の二次構造を、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、共通配列の部分がループの形状をとることがわかった（図２参照）。
共通配列３を含む、配列番号１０〜１３で表される配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラムによって予測したところ、共通配列の部分が同じ形状となった（図３参照）。
これらの配列は、前述した特許文献２、特許文献５および特許文献６に記載の核酸リガンドとは配列が異なっていた。
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。なお、各ヌクレオチドにおける括弧は、リボースの２’位の修飾を示す。またＦはフッ素原子を示す。具体的には、ｃ（Ｆ）はリボースの２’位がフッ素原子で置換されたシチジンを示し、ｕ（Ｆ）はリボースの２’位がフッ素原子で置換されたウリジンを示す。
また各配列の先頭は５’末端であり、終端が３’末端である。
配列番号１：
ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａａａｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ
配列番号２：
ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａａｕ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ａｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ
配列番号３：
ｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇａａａｇｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａａｇｃ（Ｆ）ｇｇａｇ
配列番号４：
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配列番号５：
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配列番号６：
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配列番号７：
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配列番号８：
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配列番号９：
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配列番号１０：
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配列番号１１：
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配列番号１２：
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配列番号１３：
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配列番号１４：
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配列番号１５：
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配列番号１６：
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配列番号１７：
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配列番号１８：
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配列番号１９：
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配列番号２０：
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配列番号２１：
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配列番号２２：
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配列番号２３：
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配列番号２４：
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配列番号２５：
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配列番号２６：
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配列番号２７：
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配列番号２８：
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配列番号２９：
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配列番号３０：
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配列番号３１：
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配列番号３２：
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配列番号３３：
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配列番号３４：
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配列番号１、６、７、９、１０、１４〜３４で表される核酸のＦＧＦ２に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製の２０００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ ｄＴを６００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ Ａを付加し、ｄＴとＡの結合によりＳＡチップに固定化した。固定化量は約１０００ＲＵとした。アナライト用のヒトＦＧＦ２は０．５μＭに調製し、非特異的吸着を軽減するために０．５ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを加えたものを２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。測定の結果、配列番号１、６、７、９、１０、１４〜３４で表される核酸の全てが、ネガティブコントロールの４０Ｎよりも有意にＦＧＦ２に結合することがわかった。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、ＳＥＬＥＸの１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。一例として配列番号１で表されるアプタマー（Ａｐｔ１）とヒトＦＧＦ２との結合の様子を示すセンサーグラムを図４に示す。以上より、配列番号１、６、７、９、１０、１４〜３４で表される核酸はＦＧＦ２に結合するアプタマーであることが示された。
配列番号１、６、７、９、１０、１４〜３４で表されるＦＧＦ２アプタマーが同じＦＧＦファミリーのＦＧＦ１に結合するかどうか表面プラズモン共鳴法で調べた。実験にはＲ＆Ｄ社製のＦＧＦ１（２３２−ＦＡ／ＣＦ）を用い、上述と同様にｔＲＮＡを加えて非特異的吸着を軽減させた状態でおこなった。その結果、配列番号１〜５および２６〜３３で表されるアプタマーの全てがＦＧＦ１に結合しないことがわかった。一例として、配列番号１１で表されるアプタマーがヒトＦＧＦ１に結合しないことを示すセンサーグラムを図５に示す。以上より、配列番号１、６、７、９、１０、１４〜３４で表されるアプタマーはＦＧＦ２に特異的に結合することがわかった。
実施例２：ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー
配列番号１、６、７、９〜１１で表されるアプタマーが、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体（ＦＧＦＲ１Ｃ）との結合を阻害するかどうかを、表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。
ＢＩＡｃｏｒｅ社のプロトコールに従って、ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化した。そこに、ＩｇＧのＦｃ部分が融合したヒトＦＧＦＲ１Ｃ−Ｆｃ（６５８−ＦＲ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を約５００ＲＵ固定化した。アナライトとしてＦＧＦ２（０．１μＭ）とアプタマー（０．３μＭ）を混合して１５分保持したものを流した。もしアプタマーがＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合を阻害する場合はセンサーグラムのシグナルは上がらないが、もし阻害しない場合は三者複合体を形成しシグナルが上がることが予想される。阻害実験を開始する前にＦＧＦ２受容体にＦＧＦ２が結合することを確認した。またネガティブコントロールとして、ＦＧＦ２と４０Ｎを混ぜたものを用いた。４０Ｎは、４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、ＳＥＬＥＸの１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。実験の結果、配列番号１、６、７、９〜１１で表されるアプタマーの全てがＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合を阻害することがわかった。特に、配列番号９〜１１で表されるアプタマーの阻害効果が高かった。一方、４０Ｎは阻害活性を示さなかった。一例として配列番号９で表されるアプタマーがＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合を阻害していることを示すセンサーグラムを図６に示す。
以上より、配列番号１、６、７、９〜１１で表されるアプタマーはＦＧＦ２の阻害剤として使用できることが示された。
実施例３：アプタマーは培養細胞のＦＧＦ２シグナリングを阻害する
配列番号１、６、７、９〜１１で表されるアプタマーが、ＦＧＦ２による細胞刺激を阻害できるか、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を用いて確認した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＦＧＦ２による細胞刺激で、シグナル伝達系が活性化すると、ＦＲＳ２、Ｇｒｂ２、ＳＯＳを介してＭＡＰキナーゼ経路やＰＩＫ３／ＡＫＴ１経路などが活性化され、最終的にＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨＧＦ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ−αなどの各種サイトカインや受容体遺伝子が発現誘導される。その際、ＦＲＳ２やＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）等の因子がリン酸化されることが解っている。ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヒトＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激する際、培地中にアプタマーを加え、３０分後にウエスタンブロッティング法により測定した。抗体はリン酸化特異的抗体（Ｐ-ＦＲＳ２-ａｌｐｈａ Ｙ１９６，Ｐ-ＥＲＫ Ｔ２０２／Ｙ２０４；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。アプタマーによるＦＧＦ２シグナリングの阻害効果を図７に示す。配列番号７、９〜１１で表されるアプタマーはＦＲＳ２やＥＲＫのリン酸化を強く阻害した。配列番号９〜１１で表されるアプタマーによる強い阻害効果は、プラズモン共鳴法によるＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合阻害結果と一致した。以上のことから、本発明の、配列番号７、９〜１１で表されるアプタマーは、生存している細胞に対してもＦＧＦ２シグナリングの高い阻害活性を有していることが示された。
実施例４：配列番号７、９〜１１で表されるアプタマーの短小化
配列番号７、９〜１１で表されるアプタマーの短小化をおこない、これらの核酸がＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合阻害活性を有しているかどうか、実施例２と同様に表面プラズモン共鳴法により調べた。配列番号３５〜３８で表される核酸をＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて試験管内転写反応で得た。その結果、配列番号３６、３８で表されるアプタマーが、短小化後でも、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合阻害を有していた。配列番号３６と３８で表される短小化アプタマーのＭＦＯＬＤプログラムによる二次構造予測を図８に示す。
配列番号３５：配列番号７で表されるアプタマーの改変体で３８ヌクレオチドの長さのアプタマー
ｇｇｇａａｇｃ（Ｆ）ａｇｇａｇｇｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）
配列番号３６：配列番号９で表されるアプタマーの改変体で４１ヌクレオチドの長さのアプタマー
ｇｇｇｇｃ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）
配列番号３７：配列番号１０で表されるアプタマーの改変体で４７ヌクレオチドの長さのアプタマー
ｇｇｇａｕ（Ｆ）ｃｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｃｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）
配列番号３８：配列番号１１で表されるアプタマーの改変体で３５ヌクレオチドの長さのアプタマー
ｇｇｇｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）
実施例５：短小化アプタマーは培養細胞のＦＧＦ２シグナリングを阻害する
配列番号３６、３８で表されるアプタマーが、ＦＧＦ２による細胞刺激を阻害できるか、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を用いて実施例３と同様に確認した。その結果、配列番号３６、３８で表されるアプタマーはＦＲＳ２やＥＲＫのリン酸化を強く阻害した（図９）。これらの短小化アプタマーは生存している細胞に対して、配列番号９、１１で表されるアプタマー同様、ＦＧＦ２シグナリングの高い阻害活性を有していることが示された。
実施例６：配列番号３６で表されるアプタマーの変異体の作製
配列番号３６で表されるアプタマーの変異体をＳＥＬＥＸ法で作製した。ＳＥＬＥＸは配列番号３６で表されるアプタマー配列に人為的に変異をおこしたＤＮＡ鋳型を用い、実施例１と同様に行った。標的物質としてヒトＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた。
最初のラウンドで用いたＲＮＡは、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す両端にプライマー配列を持った長さ１００ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。以下に用いたＤＮＡ鋳型とプライマーを示す。下線部は３０％の割合で、それ以外の他の塩基に置換する様に合成した。
ＤＮＡ鋳型：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａｇａｇｇｔｃａｇａｔｇｇｇｇｃｇａｔｇｃａａｇｔｔａｃｃａｇｔｇｔａｇｃｔａｇｔｔａｃｔａｇｇｇｃｇｔｇｔｇｔｔｇｃｃｃｃｔａｔｇｃｇｔｇｃｔａｇａｇｔｇａ−３’（配列番号５８）
プライマーＦｗｄ：
５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａａｇａｇｇｔｃａｇａｔ−３’（配列番号５９）
プライマーＲｅｖ：
５’−ｔｃａｃｔｃｔａｇｃａｃｇｃａｔａ−３’（配列番号６０）
ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングし、大腸菌株ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサーで４１クローンの塩基配列を調べた。
ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後の配列に収束が見られた。一方、配列番号３６で表されるアプタマーと同一の配列は無かったが、全ての配列に共通する配列が存在した（配列番号４２；共通配列４）。配列番号４３で表される配列は２０配列存在した。配列番号４４で表される配列は５配列存在した。配列番号４５で表される配列は３配列存在した。配列番号４６で表される配列は２配列存在した。配列番号４７〜５７で表される配列は１配列であった。
配列番号４２で表される共通配列４を含む、配列番号４３〜４６で表される配列の二次構造について、ＭＦＯＬＤプログラムを用いて予測したところ、共通配列４の部分の形状に相似がみられた（図１０参照）。
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。なお、各ヌクレオチドにおける括弧は、リボースの２’位の修飾を示す。またＦはフッ素原子を示す。具体的には、ｃ（Ｆ）はリボースの２’位がフッ素原子で置換されたシチジンを示し、ｕ（Ｆ）はリボースの２’位がフッ素原子で置換されたウリジンを示す。
また各配列の先頭は５’末端であり、終端が３’末端である。
配列番号４２：
ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎａｇｇｇｃ（Ｆ）
配列番号４３：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇａａａａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４４：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４５：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４６：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｇｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｇｃｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｇａａａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４７：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇａａａａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４８：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇａａｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４９：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５０：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５１：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５２：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５３：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５４：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５５：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇａｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５６：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ａａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号５７：
ｇｇｇａａｇａｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇａｕ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ａｇｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｇｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ｇｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇａｇｕ（Ｆ）ｇａ
配列番号４３〜５７で表されるアプタマーがＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合阻害活性を有しているかどうか、実施例２と同様の表面プラズモン共鳴法により調べた。配列番号４３〜５７で表される核酸をＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて試験管内転写反応で得た。その結果、配列番号４３〜５７で表されるアプタマーが、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体の結合阻害活性を有していることが分かった。
本発明のアプタマーまたは複合体は、炎症性疾患や癌、アレルギー、感染症などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマーまたは複合体はまた、ＦＧＦ２の精製及び濃縮、ＦＧＦ２の標識、並びにＦＧＦ２の検出及び定量に有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願２０１０-０２９３７７を基礎としており、それらの内容は本明細書にすべて包含される。

Claims (21)

  1. ＦＧＦ２に結合するアプタマー。
  2. ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項１記載のアプタマー。
  3. ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合は阻害するが、ＦＧＦ１と受容体との結合は阻害しない、請求項２記載のアプタマー。
  4. 下記式：
    ＡＧＵＡＣＵＡＣＵＮＧＵＵＡＣＣ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される６または７個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
  5. ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項４記載のアプタマー。
  6. 下記式：
    ＧＡＧＧＧＵＧＡＣＧＧＵＮ’ＧＣＵＧＵＵＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される７または１０個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
  7. ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項６記載のアプタマー。
  8. 下記式：
    ＵＡＧＧＧＣＮ’’ＣＡＧＵ（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｕはウラシルをそれぞれ示し、Ｎ’’は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからそれぞれ選択される１０〜１８個の連続したヌクレオチドからなる配列を示す）で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
  9. ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項８記載のアプタマー。
  10. 配列番号４２で表される配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
  11. ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項１０記載のアプタマー。
  12. 配列番号３６または３８の配列を含んでいる、ＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害するアプタマー。
  13. ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつＦＧＦ２とＦＧＦ２受容体との結合を阻害する、請求項１２記載のアプタマー。
  14. 以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、請求項１に記載のアプタマー：
    （ａ）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
    （ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
    （ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー；
    （ｂ）配列番号１〜３８および４２〜５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマーであって、該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
    （ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
    （ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
  15. ヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアプタマー。
  16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
  17. 機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項１６に記載の複合体。
  18. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１６又は１７に記載の複合体を含む、医薬。
  19. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１６又は１７に記載の複合体を含む、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、あるいは心臓の形成異常、血管の形成異常または骨格の形成異常の治療用または予防用医薬。
  20. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１６又は１７に記載の複合体を含む、診断薬。
  21. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１６又は１７に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＦＧＦ２の検出方法。
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