JPWO2010084613A1 - 細胞培養足場の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、効率よく培養を行うためには、細胞足場材の表面の微細凹部の密度(空孔率)、孔径、孔径分布等を培養する細胞の種類等に応じ適切は範囲に設定することが望まれるが、特許文献1に開示されている方法や、アルミナ陽極酸化膜を利用する方法においては、凹部の密度や孔径、孔径分布の制御が難しい。
そのため、簡易で、凹部の密度や孔径、孔径分布を所望の範囲に制御することができるナノポーラス表面を有する細胞培養足場材の製造方法が求められている。
本実施態様においては、基材上に母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を形成し、これからナノ粒子を選択的に除去することにより、その表面をナノポーラス表面とする。ナノ粒子を選択的に除去する方法に限定はなく、例えば、母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液に浸漬し、ナノ粒子のみを選択的に溶出させることによりナノ粒子を選択的に除去することができる。また、ナノ粒子は燃焼するが母材は燃焼しない温度で焼成することによりナノ粒子を選択的に除去してもよい。
熱可塑性樹脂の具体例としては、ポリエステル;ポリオレフィン;ポリアミド;ポリカーボネート;ポリイミド;ポリスチレン又はスチレン系共重合体;ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルコキシエチレン共重合体(PFA)、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(FEP)、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体(ETFE)、ポリクロロトリフルオロエチレン(PCTEF)、クロロトリフルオロエチレン・エチレン共重合体(ECTEF)、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化ビニル等のフッ素樹脂(分子内にフッ素を含む単量体を重合させることにより得られた重合体)等が挙げられる。硬化化性樹脂の具体例としては、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、アクリル樹脂、ウレタン樹脂等が挙げられる。エラストマーの具体例としては、天然ゴム、スチレン−ブタジエン共重合体及びその水添物等が挙げられる。
また、細胞培養足場材が生体内に埋め込んで使用される場合、母材を構成する材料として、生体分解性材料、すなわち、生体内に吸収可能な材料又は生体内で分解可能な材料、を用いることができる。生分解性材料の具体例としては、上記と一部重複するが、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリブチレンカーボネート、ゼラチン、キチン、コラーゲン、キトサン、ケラチン、アパタイト、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、多糖類等が挙げられる。
さらに、石英、酸化アルミニウム等の酸化物;窒化物;ガラス;その他各種セラミックス;Au、Pt、Si等の金属を用いることもできる。
例えば、ナノ粒子の選択的除去を、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液に浸漬することにより行う場合、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液を入手することができる限り、いかなる材料も採用することができる。
例えば、母材として熱可塑性樹脂、硬化性樹脂、エラストマー、セラミックス、Au、Pt等の金属等を用いる場合には、ナノ粒子としてAg、Cu、Fe、Ni、Cr、Zn粒子等の金属粒子を用いることができる。また、母材としてセラミックス、金属等を用いる場合には、ナノ粒子として、有機溶剤に溶解する高分子材料からなる粒子を用いることができる。
なお、本明細書において、粒径とは、粒子を透過電子顕微鏡(TEM)等で二次元観察したときの二軸平均径、すなわち、短径と長径の平均値をいう。ここで、短径、長径とは、それぞれ、粒子に外接する面積が最小となる外接長方形の短辺、長辺である。そして、平均粒径とは、粒子を二次元観察した際に同一視野内にあるランダムに選択した100個の粒子の粒径の平均をいう。また、本明細書において、孔径とは、JIS R1655に準じて水銀圧入法によって測定した気孔径をいう。
例えば、基材の形状については、平面状であってもよいし、立体形状であってもよい。具体的には、臓器や血管などの生体の器官や組織等を模倣した複雑な立体的な形状を有する基材を用いることもできる。また、シャーレやマルチウェルプレート等の細胞培養容器の形状をした基材を用いることもできる。
また、基材の材質については、剛性を有するものだけでなく、布、不織紙等の柔軟性を有するものを用いることができる。具体的には、母材の材料として挙げたものを使用できる。特に、細胞培養足場材が生体内に埋め込んで使用される場合、生体分解性材料を用いることもできる。
母材を構成する材料を含むナノ粒子分散液において、母材を構成する材料は、ナノ粒子分散液に溶解していても分散していてよい。母材を構成する材料を含むナノ粒子分散液の具体例としては、母材を構成する材料を溶解させた溶液にナノ粒子を分散させた液や、母材を構成する材料からなる粒子とナノ粒子の両方を分散媒に分散させた液等が挙げられる。例えば、水や、アルコール類、ケトン系溶剤、エステル系溶剤、炭化水素系溶剤、ハロゲン系炭化水素系溶剤等の有機溶剤に母材を構成する材料を溶解させ、この溶液にナノ粒子を分散させてナノ粒子分散液を調製してもよいし、或いは、母材を構成する材料からなる粒子を水等の分散媒に分散させ、この分散液にナノ粒子を分散させる又はその逆の順序で分散液を調製してもよい。
ナノ粒子の表面にタンパク質又はペプチドを固定する表面修飾は、特開2007−217331号公報に開示された方法に準じて行うことができる。具体的には、ナノ粒子を界面活性剤を用いて水に分散させ、この分散液にタンパク質又はペプチドを添加してpH5.0以上で超音波を照射することにより、ナノ粒子の表面の界面活性剤がタンパク質又はペプチドに置換し、その結果、表面にタンパク質又はペプチドを固定したナノ粒子の水分散液が得られる。例えば、このようにして得られたナノ粒子水分散液に、さらに、母材を構成する材料からなる粒子を分散させて、母材を構成する材料を含むナノ粒子分散液とすることができる。
また、ナノ粒子を低分子量ビニルプロリドンで被覆する表面修飾は、特開2008−121043号開示された方法に準じて行うことができる。具体的には、ナノ金属粒子を低分子量ビニルプロリドンの存在下で調製することにより、低分子ビニルピロリドンで被覆されたナノ金属粒子を得る。このようにして得た低分子ビニルピロリドンで被覆されたナノ金属粒子を、例えば1,2エタンジオール等の有機溶媒に分散させる。このようにして得られたナノ粒子分散液に、さらに、母材を構成する材料を溶解するか、母材を構成する材料からなる粒子を分散させて、母材を構成する材料を含むナノ粒子分散液とすることができる。
塗布後、乾燥等により塗布層から分散媒溶媒を除去して、母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層が形成される。必要に応じて、塗布層を加熱し、母材を構成する材料を焼結或いは溶融させて強固な連続相に変化させてもよい。母材を構成する材料が高分子材料である場合には、そのガラス転移温度以上の温度で加熱することができる。
メカニカルアロイングは、一般に、金属どうしの混合の際に用いられる方法であるが、折りたたみと圧延を行うことが可能な材料どうしであれば、例えば、高分子材料同士や高分子材料と金属等の混合に対しても応用することができることを本発明者は見出した。
そして、メカニカルアロイングにより得られた固体混合物をそのまま基材上に溶融塗布したり、固体混合物を適当な溶媒に分散させ、その分散液を基材上に塗布することにより、母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を基材上に形成する。分散液の塗布方法としては前述の方法を採用することができる。また、塗布後、必要に応じて、塗布層を加熱し、母材を構成する材料を焼結或いは溶融させて強固な連続相に変化させてもよい。
ナノ粒子を選択的に除去する方法として、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液に浸漬しナノ粒子を液中に溶出させる方法を採用する場合、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液に限定はなく、ナノ粒子と母材を構成する材料との組合せに応じ、適切なものを選択することができる。例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の酸溶液;水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液;有機溶剤等を用いることができる
浸漬時間に限定はなく、ナノ粒子が溶出するのに十分な時間浸漬すればよい。浸漬中に、試料に超音波を照射する等の溶出を促進させるための補助処理を行うこともできる。
溶出後、必要により水洗などをした後、乾燥させることにより、ナノポーラス表面を有する細胞培養足場材が得られる。
Claims (11)
- 基材を用意し、
該基材上に、母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を形成し、
該層からナノ粒子を選択的に除去する、
ことを含む、細胞培養足場材の製造方法。 - 前記ナノ粒子を選択的に除去することが、前記母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を、ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液に浸漬することによって行われる、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記ナノ粒子を溶解するが母材を溶解しない液が、アルカリ溶液又は酸溶液である、請求の範囲第2項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記ナノ粒子が、金属粒子である、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記ナノ粒子が、Ag粒子である、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記母材が、生体分解性材料を含む、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を形成することが、
母材を構成する材料を含む、ナノ粒子分散液を用意することと、
該ナノ粒子分散液を前記基材上に塗布することと、
を含む、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。 - 前記母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を形成することが、
母材を構成する材料からなる粒子とナノ粒子を構成する材料からなる粒子を混合して、固体混合物を得ることと、
該固体混合物を前記基材上に塗布することと、
を含む、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。 - 前記混合が、ボールミルを用いて行われる、請求の範囲第8項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 前記基材が立体形状をしている、請求の範囲第1項に記載の細胞培養足場材の製造方法。
- 基材を用意し、
該基材上に、母材中に複数のナノ粒子が分散した材料からなる層を形成し、
該層からナノ粒子を選択的に除去する、
ことにより製造される、細胞培養足場材。
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