JPWO2010050356A1 - 蛍光標識材料および蛍光標識剤 - Google Patents
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Abstract
外端にアミノ基が位置する有機化合物により酸化亜鉛ナノ粒子を表面修飾したことを特徴とする蛍光標識材料である。また、このアミノ基を利用して、EDC等を結合させ、これに、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な物質、例えば、抗体を連結させたことを特徴とするin vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤である。
Description
本発明は、蛍光標識材料および蛍光標識剤に関し、特に、生体にとって毒性のない材料を用いた蛍光標識材料およびこれを用いた蛍光標識剤に関する。
近年、生体細胞等を蛍光標識する技術が注目を浴びており、発光源としてＣｄＳｅ（セレン化カドミウム）やＺｎＯ（酸化亜鉛）のナノ粒子を用いたものが開発されつつある。ＣｄＳｅは量子ドットとして所望の発色が可能であり、スペクトルも鋭く、また、酸化亜鉛は、生体にとって毒性のない材料であるため、発光源としてこれらはともに好適である。
確かにＣｄＳｅは発光源としては優れるものの、生体にとっては毒性があるため、使用条件や標識対象が限定されるという問題点がある。
生体に標識をおこなう際には、標的に発光源を選択的に付着させる必要がある。このとき、抗体等を適当な結合剤を介して発光源であるナノ粒子に修飾する必要が生じる。
修飾材料としての結合剤は、標的の種類ひいては抗体等の種類が多様であるため、結合反応の観点から有機物であることが好ましい。一方で、酸化亜鉛を蛍光発光材料と考える場合には、結晶性がよいことが必要とされる。
しかしながら、酸化亜鉛に限らず、無機結晶に対しては、その結晶構造が規則正しいほど、表面に有機物を修飾ないし結合させることは困難であるという問題点がある。換言すれば、表面修飾された無機物は不安定であって、安定性と発光性を兼ね備えた蛍光標識剤の開発は困難であるという問題点があった。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、生体にとって毒性のない無機結晶を発光源としつつ、安定的に生体の蛍光標識を実現する蛍光標識材料および蛍光標識剤を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の蛍光標識材料は、外端にアミノ基が位置する有機化合物により酸化亜鉛ナノ粒子を表面修飾したことを特徴とする。
すなわち、請求項１に係る発明は、生体にとって毒性のない発光源を用いつつ、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な種々の物質、例えば、抗体等を、アミノ基を介して粒子側に容易に結合させることができる。これにより、蛍光標識対象を増やすことが可能となる。
なお、外端とは、粒子に結合する側とは反対側、すなわち粒子からみて外側という意味である。また、本願にいう酸化亜鉛ナノ粒子は、蛍光発光する程度の結晶性を有する必要があるため、この意味において酸化亜鉛のナノ結晶ということができる。また、有機化合物と酸化亜鉛ナノ粒子は１：１の割合で結合しているのではなく、有機化合物は酸化亜鉛ナノ粒子表面を覆う様に複数結合しているものとする。
また、請求項２に記載の蛍光標識材料は、請求項１に記載の蛍光標識材料において、有機化合物がアミド基とウレタン基とを有することを特徴とする。
すなわち、請求項２に係る発明は、それぞれ助色団であるアミド基とウレタン基とが存在するため発色効率ないし発光効率の上昇が期待できる。なお、バンドギャップの観点からは両者が近接して存在することが好ましい。
また、請求項３に記載の蛍光標識材料は、請求項１または２に記載の蛍光標識材料において、有機化合物と酸化亜鉛ナノ粒子がエステル結合していることを特徴とする。
すなわち、請求項３に係る発明は、例えば酢酸亜鉛を出発原料とした湿式法により、ナノ粒子形成と表面修飾とを同時におこなって、結合を強固とした安定的な発光源とすることができる。換言すれば、エステル結合により表面修飾された発光源を簡便に得ることができる。濃度、反応時間、反応温度などを制御することにより粒径の調製が可能である。また、湿式法を採用することにより、粒径のばらつきを抑え、粒度分布の狭い良好な単分散粒子を得ることも可能となる。
また、請求項４に記載の蛍光標識材料は、請求項１に記載の蛍光標識材料において、有機化合物が、次式で表される結合鎖であることを特徴とする。
すなわち、請求項４に係る発明は、生体にとって毒性のない蛍光標識材料を用いて、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な種々の物質、例えば抗体等を、アミノ基を介して粒子側に容易に結合させることができる。また、それぞれ助色団であるアミド基とウレタン基とが近接して存在するため発色効率ないし発光効率の上昇が期待できる。また、酢酸亜鉛を出発原料として、ナノ粒子形成と表面修飾とを同時におこなって、結合を強固とした安定的な発光源とすることができる。
ここで、ｎ＝１〜６としたのは、ｎの数が小さい場合には水への溶解性が良好であって生体標識に好適であるからであり、ｎが６を超えると取り扱い性が悪くなるからである。また、発光性の観点から電子の移動が５０ｎｍ程度までとしておくことが求められ、この点も考慮するとｎの上限は６となる。なお、ｎ＝１〜４がより好ましい。
また、請求項５に記載の蛍光標識材料は、請求項１〜４のいずれか一つに記載の蛍光標識材料において、粒径が１５ｎｍ以下であることを特徴とする。
すなわち、請求項５に係る発明は、毛細血管内の標的を含め、微小な生体組織ないし生体物質に対する蛍光標識も可能となる。なお、粒径がシングルナノメートルオーダーから十数ナノメートル程度までの酸化亜鉛結晶粒子は、ゾルゲル法などにより得ることができる。
また、請求項６に記載の蛍光標識材料は、請求項１〜５のいずれか一つに記載の蛍光標識材料において、酸化亜鉛ナノ粒子が、蛍光発光する結晶性を有することを特徴とする。
すなわち、請求項６に係る発明は、いわゆる結晶性に由来する発光特性を利用して標識が可能となる。励起光は、生体標識に特に影響を及ぼさない領域であればどの波長の光を用いてもよい。励起は紫外光によってもよく、また、場合によっては可視光でもよい。光源の例としては、連続発振するヘリウムカドミウムレーザ（３２５ｎｍ）や窒素レーザ（波長３３７ｎｍ）等のパルスレーザ、水銀ランプ等の紫外線ランプを挙げることができる。なお、観測に際しては適宜フィルタを介して所定の色、例えば、青、緑、橙、赤などの発光として観測することができる。
また、請求項７に記載の蛍光標識剤は、請求項１〜６のいずれか一つに記載の蛍光標識材料に、前記アミノ基を介して、AEDP (3-[(2-Aminoethyl)Dithio]Propionic Acid)、ASBA (4-(p-Azidosalicylamido)
Butylamine)、 EDC (1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride)、または、 Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)を加えたEDC、を結合させ、これに、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な物質を連結させたことを特徴とするin vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤である。
Butylamine)、 EDC (1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride)、または、 Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)を加えたEDC、を結合させ、これに、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な物質を連結させたことを特徴とするin vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤である。
すなわち、請求項７に係る発明は、粒子側とも容易に結合可能であって、かつ、標的に対して選択的に結合可能な物質にも、また例えば、マクロファージなどが貪食可能な物質にも、好適に結合し、容易な標識を実現する蛍光標識剤を提供することができる。Sulfo-NHSは安定剤として加えるものである。なお、結合の手順は特に限定されない。すなわち、蛍光標識材料とＥＤＣ等とをまず結合させ、次いで、標的に対して選択的に結合可能な物質を連結させてもよいし、ＥＤＣ等と標的に対して選択的に結合可能な物質とをまず連結させ、次いで、蛍光標識材料を結合させてもよい。
また、請求項８に記載の蛍光標識剤は、請求項７に記載の蛍光標識剤において、標的に対して選択的に結合可能な物質が、抗体、酵素、レクチン、または、核酸であることを特徴とする。
すなわち、請求項８に係る発明は、生体検査等において、目的の疾病等を容易に認識可能にする。核酸は、DNAやRNAを当然に含む。標的に対して選択的に結合可能な物質としては、この他、生理活性物質（ホルモン、サイトカイン、成長因子など）、受容体、糖質（炭水化物）、脂質等を挙げることができる。
また、請求項９に記載の発明は、請求項７まはた８に記載の蛍光標識剤の使用であって、標的が、腫瘍細胞、白血病細胞、ウイルス感染細胞、若しくは、正常細胞、タンパク質、酵素、または、核酸であることを特徴とする。
すなわち、請求項９に係る発明は、腫瘍等を簡便に認識可能となる。腫瘍細胞は良性と悪性とのいずれをも含むものとする。また、請求項９に係る発明は、細胞表面のみならず、細胞質内の種々の生体物質も簡便に認識可能となる。
本発明によれば、生体にとって毒性のない酸化亜鉛を用いつつ、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な種々の物質、例えば抗体等を、アミノ基を介して粒子側に容易に結合させることができる蛍光標識材料を提供可能とし、これに基づいた安定な蛍光標識剤を調製することができる。
特に、本発明は、市販の試薬を用いて調製でき、工業的量産性にも優れる（安価に製造できる）という利点も有する。
特に、本発明は、市販の試薬を用いて調製でき、工業的量産性にも優れる（安価に製造できる）という利点も有する。
〔実施の形態１〕
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。実施の形態１では、化学式（１）においてｎ＝２の場合について説明する。具体的には、本願発明者らがＺＨＩＥと命名した蛍光標識材料を市販の試薬を用いて安価かつ簡便に調製した例を説明し、次に、これを用いて蛍光標識剤を調製し、実際にマウス
マクロファージによるザイモサンの貪食作用等を観測する例について説明する。最後に、ＺＨＩＥに毒性がないことを示し、極めて汎用性の高い蛍光標識材料であることを説明する。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。実施の形態１では、化学式（１）においてｎ＝２の場合について説明する。具体的には、本願発明者らがＺＨＩＥと命名した蛍光標識材料を市販の試薬を用いて安価かつ簡便に調製した例を説明し、次に、これを用いて蛍光標識剤を調製し、実際にマウス
マクロファージによるザイモサンの貪食作用等を観測する例について説明する。最後に、ＺＨＩＥに毒性がないことを示し、極めて汎用性の高い蛍光標識材料であることを説明する。
実施の形態１の蛍光標識材料は、以下の方法により製造できる。
１）溶解度の高い亜鉛化合物を出発原料として、数ナノメートルの酸化亜鉛結晶の表面に末端がＯＨ基である有機物を導入する（図１）。このとき、湿式法により結晶粒子形成と表面修飾とを同時におこなって強固な結合をもつ複合材を調製する。換言すると、酸化亜鉛ナノ結晶に後から有機物を付加的に修飾するのではなく、官能基をはじめから有する新規な酸化亜鉛ナノ結晶を合成する。
２）次に、イソシアナート基とエステル基をもった有機物を用いて、末端のＯＨ基とイソシアナート基を反応させる（図２）。これにより、一つ目の助色団であるウレタン基が導入される。
３）次に、両末端にアミノ基をもつ炭化水素化合物を用いて、アミド化反応により二つ目の助色団であるアミド基を導入し、外端にアミノ基をもった酸化亜鉛ナノ粒子を調製する（図３）。
１）溶解度の高い亜鉛化合物を出発原料として、数ナノメートルの酸化亜鉛結晶の表面に末端がＯＨ基である有機物を導入する（図１）。このとき、湿式法により結晶粒子形成と表面修飾とを同時におこなって強固な結合をもつ複合材を調製する。換言すると、酸化亜鉛ナノ結晶に後から有機物を付加的に修飾するのではなく、官能基をはじめから有する新規な酸化亜鉛ナノ結晶を合成する。
２）次に、イソシアナート基とエステル基をもった有機物を用いて、末端のＯＨ基とイソシアナート基を反応させる（図２）。これにより、一つ目の助色団であるウレタン基が導入される。
３）次に、両末端にアミノ基をもつ炭化水素化合物を用いて、アミド化反応により二つ目の助色団であるアミド基を導入し、外端にアミノ基をもった酸化亜鉛ナノ粒子を調製する（図３）。
＜蛍光標識材料ＺＨＩＥの調製：ＺＨＰの調製＞
まず、無水エタノール（和光純薬工業社製）２５０ｍｌに、酢酸亜鉛二水物（和光純薬工業社製）５．４８８ｇ（０．０２５ｍｏｌ）を加えて溶解し、８０℃で３時間かけて蒸留し、フラスコ内の残留液が１００ｍｌ（蒸留液が１５０ｍｌ）となったところで、操作を終了した。
まず、無水エタノール（和光純薬工業社製）２５０ｍｌに、酢酸亜鉛二水物（和光純薬工業社製）５．４８８ｇ（０．０２５ｍｏｌ）を加えて溶解し、８０℃で３時間かけて蒸留し、フラスコ内の残留液が１００ｍｌ（蒸留液が１５０ｍｌ）となったところで、操作を終了した。
３−ヒドロキシプロピオン酸（ＨＰＡ：Hydroxypropionic Acid）（東京化成工業株式会社製）０．１１２６ｇ（０．００１２５ｍｏｌ）をエバポレータを用いて水分除去し、これを上記の残留液（濃縮液）に加え、８０℃で１時間還流した。これを溶液１とする。
次いで、予め無水エタノール１５０ｍｌに水酸化リチウム一水和物（和光純薬工業株式会社製）１．４８６ｇ（０．０３５ｍｏｌ）を加えて４時間〜５時間攪拌し０℃まで冷却したものを、溶液１に加え、１５分間超音波処理をした。
処理液にアセトンを加えて沈殿を生成させ、遠心分離をおこなった後、４０℃で減圧乾燥して白色粉末を得た。粉末は、図１右側に示した、３−ヒドロキシプロピオン酸で修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルであると考えられた。ＦＴ−ＩＲスペクトル（図４）、ＸＲＤパターン（図５）を測定したところ、確かに３−ヒドロキシプロピオン酸で修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されていることを確認した。
なお、図１では、酸化亜鉛ナノクリスタル表面に３−ヒドロキシプロピオン酸が一つ修飾されている様に表記しているが、実際は被膜を形成する様に多数結合している。以降においては、適宜この物質を、ＺＨＰと表記することとする。なお、以上は、モル比でＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１となる量で調製した結果であるが、２０：１，３０：１，５０：１，６０：１としたものでも同様に調製できることを確認した。
次に、ＺＨＰのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した。図６に示した様に、緑色の発光を示すことを確認した。これにより、ＺＨＰ中の酸化亜鉛ナノ粒子は、蛍光発光する結晶性であることが確認できた。なお、モル比を異ならせて調製したＺＨＰを用いた蛍光スペクトルのピーク波長を図７に示した。なお図には極大吸収波長も同時に示した。
＜蛍光標識材料ＺＨＩＥの調製：ＺＨＩの調製＞
ＺＨＰは、外端にＯＨ基をもつ。次に、これを利用してＺＨＰからＺＨＩを調製する（図２）。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（和光純薬工業社製）５ｍｌにＺＨＰ（ＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１で調製したもの）を０．５ｇ加え、超音波処理してよく分散させた。その後、攪拌しながらＨＰＡに対して１０倍ｍｏｌ量のイソシアナート酢酸エチルエステル（東京科学工業社製）を滴下しながら加えた。触媒としてトリエチルアミン（和光純薬工業社製）を５滴加え、常温で２時間攪拌し、その後１００℃で２０時間還流した。この分散溶液中の粒子をメタノールにより２回攪拌洗浄し、遠心分離により白色粉末を得た。
ＺＨＰは、外端にＯＨ基をもつ。次に、これを利用してＺＨＰからＺＨＩを調製する（図２）。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（和光純薬工業社製）５ｍｌにＺＨＰ（ＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１で調製したもの）を０．５ｇ加え、超音波処理してよく分散させた。その後、攪拌しながらＨＰＡに対して１０倍ｍｏｌ量のイソシアナート酢酸エチルエステル（東京科学工業社製）を滴下しながら加えた。触媒としてトリエチルアミン（和光純薬工業社製）を５滴加え、常温で２時間攪拌し、その後１００℃で２０時間還流した。この分散溶液中の粒子をメタノールにより２回攪拌洗浄し、遠心分離により白色粉末を得た。
粉末は、次式で表される結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルであると考えられた（図２参照）。
ＦＴ−ＩＲスペクトル（図８）、ＸＲＤパターン（図９）を測定したところ、確かに上記結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されたことを確認した。
ＦＴ−ＩＲスペクトル（図８）、ＸＲＤパターン（図９）を測定したところ、確かに上記結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されたことを確認した。
なお、図２では、修飾の数が一つである様に表記しているが、実際は被膜を形成する様に上記有機物が酸化亜鉛ナノクリスタル表面に多数結合している。以降においては、適宜この物質を、ＺＨＩと表記することとする。なお、以上は、ＨＰＡ換算でＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１となる量で調製した結果であるが、２０：１，３０：１，５０：１，６０：１としたものでも同様にＺＨＩが調製できることを確認した。
次に、ＺＨＩのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した。図１０に示した様に、概ね緑色の発光を示すことが確認できた。これにより、ＺＨＩ中の酸化亜鉛ナノ粒子は、依然として蛍光発光する結晶性であることが確認できた。なお、モル比を異ならせて調製したＺＨＩの蛍光スペクトルのピーク波長を図１１に示した。なお極大吸収波長も同時に示した。
なお、異なるモル比から調製したＺＨＩのＴＤ／ＤＴＡ測定における最小減少率を測定した結果を図１２に示す。図から明らかな様に、６０：１から４０：１へと有機物の量が増えるにつれ最終減少率が小さくなっているが、４０：１から２０：１にかけて最終減少率がほとんど変化していない。このことから、ＺｎＯの表面に結合することのできる有機物の量の限界がおおよそＺｎＯのモル比の１／４０〜１／５０の範囲内にあることが確認できた。
＜蛍光標識材料ＺＨＩＥの調製：ＺＨＩＥの調製＞
ＺＨＩは、外側近くにエステル基をもつので、これをアミド化反応させ、アミド基を導入し、かつ、外端に抗体等との結合性を高めるべくアミノ基を導入することとした。すなわち、ＺＨＩからＺＨＩＥを調製することとした（図３）。
ＺＨＩは、外側近くにエステル基をもつので、これをアミド化反応させ、アミド基を導入し、かつ、外端に抗体等との結合性を高めるべくアミノ基を導入することとした。すなわち、ＺＨＩからＺＨＩＥを調製することとした（図３）。
ジメチルスルホキシド（東京化成工業社製）５ｍｌに、ＺＨＩ（ＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１で調製したもの）０．２ｇを加え、超音波処理してよく分散させた。その後、攪拌しながらＨＰＡに対して１０倍ｍｏｌ量のエチレンジアミン（関東化学社製）を滴下しながら加えた。これを１００℃で２時間還流し、その後０℃まで冷却して１０分間減圧することにより副生成物であるエタノールを除去した。１時間ごとに計６回この処理を繰り返した。この分散溶液中の粒子をアセトンで２回攪拌洗浄し、遠心分離により白色粉末を得た。
粉末は、次式で表される結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルであると考えられた（図３参照）。
ＦＴ−ＩＲスペクトル（図１３）、ＸＲＤパターン（図１４）を測定したところ、確かに上記結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されたことを確認した。これは、化学式（１）においてｎ＝２の場合の結合鎖である。
ＦＴ−ＩＲスペクトル（図１３）、ＸＲＤパターン（図１４）を測定したところ、確かに上記結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されたことを確認した。これは、化学式（１）においてｎ＝２の場合の結合鎖である。
なお、図３では、修飾の数が一つである様に表記しているが、実際は被膜を形成する様に末端にアミノ基を有する上記有機物が酸化亜鉛ナノクリスタル表面に多数結合している。以降においては、適宜この物質を、ＺＨＩＥと表記することとする。なお、以上は、ＨＰＡ換算でＺｎＯ：ＨＰＡ＝４０：１となる量で調製されたＺＨＩから調製したものであるが、２０：１，３０：１，５０：１，６０：１として調製されたＺＨＩからも同様にＺＨＩＥが調製できることを確認した。
次に、ＺＨＩＥのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した。図１５に示した様に、概ね緑色の発光を示すことが確認できた。これにより、ＺＨＩＥ中の酸化亜鉛ナノ粒子は、依然として蛍光発光する結晶性であることが確認できた。ピークは４１２ｎｍと５３２ｎｍにあり、それぞれ、励起子に基づく発光、結晶欠陥に基づく発光と考えられる。吸収スペクトルを測定した結果を図１６に示す。３４８ｎｍにピークがみられ、これは、励起子吸収に基づくものと考えられる。
なお、モル比を異ならせて調製したＺＨＩＥの蛍光スペクトルのピーク波長を図１７に示した。なお極大吸収波長も同時に示した。
また、ＺＨＩＥのＴＥＭ写真を図１８に示す。図１８−１は塊部分を撮影した写真である。図１８−３は、分散した小塊を撮影した写真である（一部凝集している）。が、概ねＺＨＩＥの小塊は５ｎｍ〜６ｎｍのシングルナノオーダーであることが分かる。なお、メタノールに分散させて粒径を測定したところ、大きさは数ｎｍ〜１５ｎｍ程度であり、平均粒径は１１．７ｎｍであった。よって、液中ではナノ粒子が単独でもしくは数個凝集した状態で分散していることが確認できた。
また、ＺＨＩＥ５ｍｇを量り取り、２０ｍｌの純水に入れ、５分間の超音波処理により分散させたものに下からＵＶライトを当てた際の発光の様子を図１９に示した。
以上の調製手法により、可視光域の蛍光発光をし、外端にアミノ基が位置する有機化合物により表面修飾された、十数ナノメートル程度以下の蛍光標識材料を得ることができた。特に、市販の原料を用いて調整できるので量産性に優れる。なお、酸化亜鉛ナノ粒子にシランカプリング剤を用いて別途有機物を修飾させる調製手法も考えられるが、本手法により得られるＺＨＩＥの方が有機物と酸化亜鉛ナノ粒子との結合力が大きく、安定している。また、このＺＨＩＥは、それぞれ助色団であるアミド基とウレタン基が存在しかつ近接しているため、発光効率も高いと考えられる。
＜ＺＨＩＥを用いた蛍光標識剤の調製例１＞
次に、ＺＨＩＥを用いて、in vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤を調製した。ここでは、標的に対して選択的に結合可能な物質をザイモサンとして、これをＥＤＣを介してＺＨＩＥに結合させた蛍光標識剤を調製する方法を説明する。
次に、ＺＨＩＥを用いて、in vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤を調製した。ここでは、標的に対して選択的に結合可能な物質をザイモサンとして、これをＥＤＣを介してＺＨＩＥに結合させた蛍光標識剤を調製する方法を説明する。
まず、ＺＨＩＥ１ｍｇを、１ｍｌメタノール中でジルコニア粒子（粒径０．８−２ｍｍ，０．５ｍｇ）存在下で１５分間から３０分間高速振とうさせた。ジルコニア粒子を除去後、２０００ｒｐｍで５分間遠心処理して沈殿を除去し、次いで超音波処理した。処理条件は、発振周波数２８ｋＨｚ、出力２０Ｗ、１０−３０ｓｅｃＯＮ／１０−３０ｓｅｃＯＦＦ、２０ｃｙｃｌｅ以上とし温度は４℃〜２５℃とした。その後、溶媒を吸引アスピレータにより蒸発させた。完全に乾固しない程度で蒸発処理を終了した。次に、緩衝液としてＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid：和光純薬社製）を加えて良く分散させた。
一方、１ｍｇザイモサン（パン酵母由来βグルカン：シグマ社製）をＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid）緩衝液[0.1M MES,0.5M
NaCl,pH6.0]１ｍｌに分散させてから、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride：Ｐｉｅｒｃｅ社製）０．４ｍｇとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（N-Hydroxysulfosuccinimide：Ｐｉｅｒｃｅ社製）１．２ｍｇとを加え、１５分間室温で反応させた。２−ＭＥ（2-mercaptoethanol：和光純薬社製）を最終濃度が２０ｍＭとなる様に加えて反応を止め、５０００ｒｐｍで３分間遠心分離しザイモサンを沈殿させて上清を除きＨＥＰＥＳ緩衝液を１ｍｌ加えた。この遠心分離操作を２回繰り返し、２−ＭＥおよび未反応のＥＤＣとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを除去するとともに緩衝液をＨＥＰＥＳに置換した。なお、ザイモサンに結合したＥＤＣは不安定なので、これらの操作は速やかにおこなった。
NaCl,pH6.0]１ｍｌに分散させてから、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride：Ｐｉｅｒｃｅ社製）０．４ｍｇとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（N-Hydroxysulfosuccinimide：Ｐｉｅｒｃｅ社製）１．２ｍｇとを加え、１５分間室温で反応させた。２−ＭＥ（2-mercaptoethanol：和光純薬社製）を最終濃度が２０ｍＭとなる様に加えて反応を止め、５０００ｒｐｍで３分間遠心分離しザイモサンを沈殿させて上清を除きＨＥＰＥＳ緩衝液を１ｍｌ加えた。この遠心分離操作を２回繰り返し、２−ＭＥおよび未反応のＥＤＣとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを除去するとともに緩衝液をＨＥＰＥＳに置換した。なお、ザイモサンに結合したＥＤＣは不安定なので、これらの操作は速やかにおこなった。
次に、ＨＥＰＥＳ緩衝液に分散させたＺＨＩＥを、上記のＥＤＣ処理したザイモサンに
加え、これを室温で反応チューブ内で穏やかに回転させながら少なくとも２時間反応させ、その後ヒドロキシアミン１０ｍＭを加えて反応を止めた。上述したのと同様な遠心処理をおこない、ＺＨＩＥが結合したザイモサンを沈殿させた。未結合のＺＨＩＥを除去し、洗浄工程において溶媒をＰＢＳ（生理食塩水）に置換し、目的の蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサン）を得た。この蛍光標識剤に、励起光を紫外光から可視光まで変化させて照射し、フィルタを介して青色発光、緑色発光、赤色発光として蛍光観測した様子を図２０に示した。図から明らかな様に、蛍光標識剤は種々の発光色として蛍光観察が可能であることがわかる。また、この蛍光標識剤は、ＰＢＳ中で、４℃で１週間保存しても安定であることを確認した。
加え、これを室温で反応チューブ内で穏やかに回転させながら少なくとも２時間反応させ、その後ヒドロキシアミン１０ｍＭを加えて反応を止めた。上述したのと同様な遠心処理をおこない、ＺＨＩＥが結合したザイモサンを沈殿させた。未結合のＺＨＩＥを除去し、洗浄工程において溶媒をＰＢＳ（生理食塩水）に置換し、目的の蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサン）を得た。この蛍光標識剤に、励起光を紫外光から可視光まで変化させて照射し、フィルタを介して青色発光、緑色発光、赤色発光として蛍光観測した様子を図２０に示した。図から明らかな様に、蛍光標識剤は種々の発光色として蛍光観察が可能であることがわかる。また、この蛍光標識剤は、ＰＢＳ中で、４℃で１週間保存しても安定であることを確認した。
＜蛍光標識の例：貪食作用の観察＞
次に、生理食塩水に分散させた上記の蛍光標識剤を用いて、マウス
マクロファージの貪食作用を観測する実験をおこなった。
マウス マクロファージ系細胞Ｒａｗ２６４．７（２０，０００細胞／ｍｌ）を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）で培養し、上記の酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサンをこれに添加した。添加量は細胞１個あたりザイモサン１０個となる量とした。３０分〜１時間後に培養液をＰＢＳに置換した。３分後に再度新しいＰＢＳに交換して、さらに３分後にこれを除去して４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、１５分間細胞を固定した。パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを除去し、５０％グリセロール／ＰＢＳを添加し、蛍光の様子を観察した。
次に、生理食塩水に分散させた上記の蛍光標識剤を用いて、マウス
マクロファージの貪食作用を観測する実験をおこなった。
マウス マクロファージ系細胞Ｒａｗ２６４．７（２０，０００細胞／ｍｌ）を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）で培養し、上記の酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサンをこれに添加した。添加量は細胞１個あたりザイモサン１０個となる量とした。３０分〜１時間後に培養液をＰＢＳに置換した。３分後に再度新しいＰＢＳに交換して、さらに３分後にこれを除去して４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、１５分間細胞を固定した。パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを除去し、５０％グリセロール／ＰＢＳを添加し、蛍光の様子を観察した。
蛍光は、高圧水銀ランプを励起光に用いて蛍光顕微鏡により観察した。励起波長（λＥＸ）は３６０−３７０ｎｍ、ダイクロイックミラーで分離する波長（λＤＩＣ）は４００ｎｍ、蛍光波長（λＥＭ）は４００ｎｍ以上を観察した。図２１は、観測結果を示した写真である。Ｒａｗ２６４．７細胞の貪食作用により取り込まれたザイモサン部分が明瞭に標識されていることが確認できた。
また、肺胞マクロファージの貪食作用も観測した。具体的には、生きたBalb/c マウスの尾に蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサン）を静脈注射し、投与３０分後に肺臓を取り出し、これをスライスしてスライドグラス上でそのまま蛍光の様子を観察した。
蛍光は、高圧水銀ランプを励起光に用いて蛍光顕微鏡により観察した。励起波長（λＥＸ）は３６０−３７０ｎｍ、ダイクロイックミラーで分離する波長（λＤＩＣ）は４００ｎｍ、蛍光波長（λＥＭ）は４００ｎｍ以上を観察した。図２２は、観測結果を示した写真である。肺胞マクロファージの貪食作用により取り込まれたザイモサン部分が明瞭に標識されていることが確認できた。これは、生体内で蛍光標識剤が安定に血中を流れ、蛍光特性を失わないこと実証した結果といえる。
上記の製法により得られた蛍光標識剤を構成する酸化亜鉛ナノ粒子は、毒性のない材料であり、退色はほとんどなく、図２０、図２１および図２２に示した様に、標的細胞の貪食作用を動的にも観測することが可能である。また、この蛍光標識剤はザイモサン以外の、例えば大腸菌由来の細胞膜成分も同様に標識でき、食作用およびエンドサイトーシスの研究にも活用できる。
＜ＺＨＩＥを用いた蛍光標識剤の調製例２＞
ＺＨＩＥ１ｍｇを上記と同様の方法によりメタノール中で超音波処理して分散させ、溶媒を吸引アスピレータにより蒸発させた（ただし、完全に乾固しない程度で蒸発処理を終了した）。
ＺＨＩＥ１ｍｇを上記と同様の方法によりメタノール中で超音波処理して分散させ、溶媒を吸引アスピレータにより蒸発させた（ただし、完全に乾固しない程度で蒸発処理を終了した）。
一方、Ｒａｗ２６４．７細胞の膜抗原Ｍａｃ−１に特異的な抗体２００mｇをＨＥＰＥＳ（４０mｌ）に溶解し、ＥＤＣ０．０４ｍｇとＮＨＳ０．１２ｍｇを加えて１５分間室温で反応させた。直ちに１ｍｌのＨＥＰＥＳを加えて反応液を十分に希釈し、これを、前記処理されたＺＨＩＥ入りの反応チューブに注入した。反応チューブ内で穏やかに回転させながら少なくとも２時間室温で反応させた。次に、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（分画分子量：３０００ＭＷ、ミリポア社製）を用いた限外濾過を徹底的に施してＨＥＰＥＳをＰＢＳに置換した。以上の処理により、目的の蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させた抗Ｍａｃ−１抗体）が得られた。
＜蛍光標識の例：抗体標識＞
次にこの蛍光標識剤を用いて抗体標識実験をおこなった。まず、酸化亜鉛ナノ粒子を結合させた抗Ｍａｃ−１抗体を培養液に添加してＲａｗ２６４．７細胞と３７℃、２時間反応させた。新しいＰＢＳに換え、５分間経ってから、これを除去して４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、１５分間細胞を固定した。パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを除去し、５０％グリセロール／ＰＢＳで封入して蛍光の様子を観察した。観測条件は貪食作用の場合と同様とした。結果を図２３に示した。図から明らかな様に、Ｒａｗ２６４．７細胞を認識する特異抗体（Ｍａｃ−１）のみを発光させることができた。
次にこの蛍光標識剤を用いて抗体標識実験をおこなった。まず、酸化亜鉛ナノ粒子を結合させた抗Ｍａｃ−１抗体を培養液に添加してＲａｗ２６４．７細胞と３７℃、２時間反応させた。新しいＰＢＳに換え、５分間経ってから、これを除去して４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、１５分間細胞を固定した。パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを除去し、５０％グリセロール／ＰＢＳで封入して蛍光の様子を観察した。観測条件は貪食作用の場合と同様とした。結果を図２３に示した。図から明らかな様に、Ｒａｗ２６４．７細胞を認識する特異抗体（Ｍａｃ−１）のみを発光させることができた。
＜ＺＨＩＥの細胞毒性試験＞
次に、本発明の蛍光標識剤を構成する蛍光標識材料ＺＨＩＥの細胞毒性試験を実施した。Ｒａｗ２６４．７細胞数５万個／ｗｅｌｌの条件において、ＺＨＩＥを種々の濃度（０−１００mＭ）で加え、２４時間後に細胞の生死をトリパンブルー法により測定した。測定の結果を図２４に示す。最高濃度１００mＭにおいても細胞が死滅しないことを確認した。これは、近年研究されている蛍光標識材料の有力候補であるセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）が１０ｎＭで細胞毒性を示す文献が存在することを勘案すれば、ＺＨＩＥはあったとしてもその細胞毒性はＣｄＳｅに比して１／１０，０００以下と極めて低いことを示しており、実用上毒性がないといえるレベルである。また、ＺＨＩＥは種々の抗体等に結合できるので、in vitroのみならずin vivoにおける様々な蛍光標識を実現可能にするといえる。
次に、本発明の蛍光標識剤を構成する蛍光標識材料ＺＨＩＥの細胞毒性試験を実施した。Ｒａｗ２６４．７細胞数５万個／ｗｅｌｌの条件において、ＺＨＩＥを種々の濃度（０−１００mＭ）で加え、２４時間後に細胞の生死をトリパンブルー法により測定した。測定の結果を図２４に示す。最高濃度１００mＭにおいても細胞が死滅しないことを確認した。これは、近年研究されている蛍光標識材料の有力候補であるセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）が１０ｎＭで細胞毒性を示す文献が存在することを勘案すれば、ＺＨＩＥはあったとしてもその細胞毒性はＣｄＳｅに比して１／１０，０００以下と極めて低いことを示しており、実用上毒性がないといえるレベルである。また、ＺＨＩＥは種々の抗体等に結合できるので、in vitroのみならずin vivoにおける様々な蛍光標識を実現可能にするといえる。
〔実施の形態２〕
実施の形態２では、化学式（１）においてｎ＝１の場合について説明する。これは、原料をＨＰＡに替えて、グリコール酸を用いたものである。グリコール酸は固体結晶であるのでＨＰＡに比して取り扱いやすく、エバポレータによる水分除去等の操作が不要となる。具体的には、本願発明者らがＺＧＡＩと命名した蛍光標識材料の調整例を説明する。
実施の形態２では、化学式（１）においてｎ＝１の場合について説明する。これは、原料をＨＰＡに替えて、グリコール酸を用いたものである。グリコール酸は固体結晶であるのでＨＰＡに比して取り扱いやすく、エバポレータによる水分除去等の操作が不要となる。具体的には、本願発明者らがＺＧＡＩと命名した蛍光標識材料の調整例を説明する。
実施の形態２の蛍光標識材料の調整は、実施の形態１と同様であるため、反応スキームのみを示す。
１）酢酸亜鉛一水和物を出発原料として、数ナノメートルの酸化亜鉛結晶の表面に末端がＯＨ基である有機物を導入する（図２５：ＺＧＡの調整）。
２）次に、イソシアナート基とエステル基をもった有機物を用いて、末端のＯＨ基とイソシアナート基を反応させる（図２６：ＺＧＡＩの調整）。これにより、一つ目の助色団であるウレタン基が導入される。
３）次に、両末端にアミノ基をもつ炭化水素化合物を用いて、アミド化反応により二つ目の助色団であるアミド基を導入し、外端にアミノ基をもった酸化亜鉛ナノ粒子を調製する（図２７：ＺＧＡＩＥの調整）。
なお、図２５、図２６，図２７では、修飾の数が一つである様に表記しているが、実際は被膜を形成する様に末端にアミノ基を有する上記有機物が酸化亜鉛ナノ粒子表面に多数結合している。
１）酢酸亜鉛一水和物を出発原料として、数ナノメートルの酸化亜鉛結晶の表面に末端がＯＨ基である有機物を導入する（図２５：ＺＧＡの調整）。
２）次に、イソシアナート基とエステル基をもった有機物を用いて、末端のＯＨ基とイソシアナート基を反応させる（図２６：ＺＧＡＩの調整）。これにより、一つ目の助色団であるウレタン基が導入される。
３）次に、両末端にアミノ基をもつ炭化水素化合物を用いて、アミド化反応により二つ目の助色団であるアミド基を導入し、外端にアミノ基をもった酸化亜鉛ナノ粒子を調製する（図２７：ＺＧＡＩＥの調整）。
なお、図２５、図２６，図２７では、修飾の数が一つである様に表記しているが、実際は被膜を形成する様に末端にアミノ基を有する上記有機物が酸化亜鉛ナノ粒子表面に多数結合している。
なお、実際にモル比でＺｎＯ：グリコール酸＝４０：１、８０：１として上記スキームに従ってＺＧＡＩＥを調整可能であることを確認した。以降では、４０：１で調整したＺＧＡＩＥを用いた例を示す。
次に、得られたＺＧＡＩＥのＵＶスペクトル、ＰＬスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル、ＸＲＤパターンを測定した。測定結果をそれぞれ、図２８，図２９，図３０，図３１に示した。これらの結果から、確かに化学式（１）においてｎ＝１とした結合鎖により表面修飾された酸化亜鉛ナノクリスタルが調製されたことを確認した。
以上は、化学式（１）においてｎ＝１の場合であるが、同様に出発原料を4−ヒドロキシ酪酸、5−ヒドロキシ吉草酸、6−ヒドロキシへキサン酸、７−ヒドロキシヘプタン酸とすれば、それぞれｎ＝３，４，５，６の蛍光標識材料を得ることが出来る。これらの蛍光標識材料を用いることにより、その末端のアミノ基を介して、ＥＤＣ等を結合させ、さらに、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な物質を連結させることにより、所望の蛍光標識剤を設計することが可能となる。
以上のように、本発明の蛍光標識剤を構成する酸化亜鉛ナノ粒子は、毒性のない材料であり、退色はほとんどなく、標的細胞を容易に蛍光標識できるという特徴を有するため様々な用途に利用することができる。
上述した例の他には、例えば、がん細胞を認識するためにビオチン標識がん特異抗体とストレプトアビジンとを含む蛍光標識剤が考えられる。ストレプトアビジンにはビオチンを効率的に捕捉する性質があり、蛍光の増強効果が望める。
この他、二次抗体にＺＨＩＥを結合させて蛍光標識剤を調製し、これを間接蛍光抗体として使用することもできる。即ち、一次抗体としてマウスの抗体を使用する場合、二次抗体として蛍光発光する抗マウス抗体であるところの蛍光標識剤を用いることができる。生命科学研究において二次抗体には汎用性があり、抗体種を選ばないので、その産業上の利用価値は計り知れない。
また、本発明の活用例として、本発明を、手術中のがん部位特定のための診断に用いることもできる。例えば、膀胱がん摘出手術において、酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたがん抗原に特異的な抗体を利用して、患部にレーザーをあてることで蛍光標識し、陽性か陰性かを即座に判別する術中診断も可能となる。また、皮膚がんの診断など、その無毒性から幅広い臨床検査に応用が可能である。
図１８−１，図１８−３，図１９−１，図２０−１，図２１−１，図２２−１，図２３−１は写真をグレースケースで表示しており、図１８−２，図１８−４，図１９−２，図２０−２，図２１−２，図２２−２，図２３−２は、上記各図に基づいて描画した図面である。なお、グレースケールで表した図に関しては、表示を明瞭とするため適宜コントラストと明るさを調節している。指定国においては必要に応じてグレースケールで表した図または写真を提出する。
酢酸亜鉛とヒドロキシプロピオン酸とを用いてＺＨＰを調製するスキームを示した図である。
ＺＨＰからＺＨＩを調製するスキームを示した図である。
ＺＨＩからＺＨＩＥを調製するスキームを示した図である。
ＺＨＰのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＨＰのＸＲＤパターンを示した図である。
ＺＨＰのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。
合成比の違いによるＺＨＰの蛍光スペクトルのピーク波長および吸収波長を示した図表である。
ＺＨＩのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＨＩのＸＲＤパターンを示した図である。
ＺＨＩのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。
合成比の違いによるＺＨＩの蛍光スペクトルのピーク波長および吸収波長を示した図表である。
合成比の違いによるＺＨＩのＴＤ／ＤＴＡ測定における最小減少率を測定した結果を示した図表である。
ＺＨＩＥのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＨＩＥのＸＲＤパターンを示した図である。
ＺＨＩのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＨＩＥの吸光スペクトルを測定した結果を示した図である。
合成比の違いによるＺＨＩＥの蛍光スペクトルのピーク波長および吸収波長を示した図表である。
ＺＨＩＥのＴＥＭ写真である。
図１８−１の見え方を表した図である。
ＺＨＩＥのＴＥＭ写真である。
図１８−３の見え方を表した図である。
ＺＨＩＥを水に溶解したものの紫外線照射による発光の様子を示した写真である。
図１９−１の見え方を表した図である。
蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させたザイモサン）に、励起光を紫外光から可視光まで変化させて照射し、フィルタを介して青色発光、緑色発光、赤色発光として蛍光観察した写真である。
図２０−１の見え方を表した図である。
細胞の貪食作用を蛍光標識により観察した写真である。左の写真は、共焦点レーザ走査型顕微鏡による蛍光観察結果である。右の写真は、明視野による光学観察と蛍光観察の結果を重ねたものである。
図２１−１の見え方を表した図である。
生体内で蛍光標識剤が血中を流れても蛍光特性を失わないことを貪食作用で確認した写真である。
図２２−１の見え方を表した図である。
Raw２６４．７細胞膜抗原を蛍光標識により観察した写真である。左の写真は、明視野による光学観察結果である。中央の写真は、非標識抗Ｍａｃ−１抗体による対照実験結果である。右の写真は、本発明の蛍光標識剤（酸化亜鉛ナノ粒子を結合させた抗Ｍａｃ−１抗体）による蛍光観察結果である。
図２３−１の見え方を表した図である。
ＺＨＩＥの細胞毒性試験の結果を示した図である。
酢酸亜鉛とグリコール酸とを用いてＺＧＡを調製するスキームを示した図である。
ＺＧＡからＺＧＡＩを調製するスキームを示した図である。
ＺＧＡＩからＺＧＡＩＥを調製するスキームを示した図である。
ＺＧＡＩＥの吸光スペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＧＡＩＥのメタノール中における蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＧＡＩＥのＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した結果を示した図である。
ＺＧＡＩＥのＸＲＤパターンを示した図である。
Claims (9)
- 外端にアミノ基が位置する有機化合物により酸化亜鉛ナノ粒子を表面修飾したことを特徴とする蛍光標識材料。
- 有機化合物がアミド基とウレタン基とを有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識材料。
- 有機化合物と酸化亜鉛ナノ粒子がエステル結合していることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光標識材料。
- 有機化合物が、次式で表される結合鎖であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識材料。
- 粒径が１５ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の蛍光標識材料。
- 酸化亜鉛ナノ粒子が、蛍光発光する結晶性を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の蛍光標識材料。
- 請求項１〜６のいずれか一つに記載の蛍光標識材料に、前記アミノ基を介して、
AEDP (3-[(2-Aminoethyl)Dithio]Propionic Acid)、
ASBA (4-(p-Azidosalicylamido) Butylamine)、
EDC (1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride)、または、
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)を加えたEDC、
を結合させ、
これに、蛍光標識をおこなう標的に対して選択的に結合可能な物質を連結させたことを特徴とするin vivoまたはin vitroにおいて使用する蛍光標識剤。 - 標的に対して選択的に結合可能な物質が、抗体、酵素、レクチン、または、核酸であることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識剤。
- 標的が、
腫瘍細胞、白血病細胞、ウイルス感染細胞、若しくは、正常細胞、
タンパク質、
酵素、または、
核酸であることを特徴とする請求項７または８に記載の蛍光標識剤の使用。
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