JPWO2009020119A1 - ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α発現阻害物質含有医薬 - Google Patents

ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α発現阻害物質含有医薬 Download PDF

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Abstract

加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの血管新生を伴う網膜疾患の治療において、より治療効果の高い医薬品を提供する。ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質を含有する、網膜疾患の治療剤。本発明の治療剤中の有効成分である前記阻害物質は、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αに対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである。

Description

本発明は、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α発現阻害物質含有医薬に関する。詳しくは、ＲＮＡ干渉を誘導可能な核酸等を含有する網膜疾患の治療剤に関する。
低酸素誘導因子１および２（ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２）は、αおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体であり、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメインとＰＡＳドメインを共通に有する転写因子である。ＨＩＦの発現および転写活性は、細胞内酸素濃度が減少すると著しく増加する。ＨＩＦによりトランス活性化される標的遺伝子として、ＶＥＧＦ(血管内皮細胞増殖因子)、エリスロポイエチン、グルコース輸送体、および解糖酵素をコードする遺伝子などが同定されている（非特許文献１を参照。）。
糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性症は、後天的失明に至る原因疾患であり、両疾患で認められる新生血管を抑制するための薬剤の開発が現在求められている。特に眼内におけるＶＥＧＦの増加が、新生血管誘発の原因の一つであることが知られており、幾つかのＶＥＧＦ拮抗薬が開発中である。ＨＩＦはＶＥＧＦの発現を制御する転写因子であり、ＨＩＦ阻害剤も血管新生抑制剤として期待されている。
ＨＩＦ阻害剤として、ｓｉＲＮＡを使用した研究から、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、およびＫｅｌｌｙ細胞では、ＨＩＦ−１αのｓｉＲＮＡによってＶＥＧＦの発現が抑制されることが報告されている（非特許文献２を参照）。また、乳癌細胞（ＭＤＡ４６８）ではＨＩＦ−１αのｓｉＲＮＡのみが低酸素によるＶＥＧＦの発現誘導を抑制し、ＨＩＦ−２αのｓｉＲＮＡでは抑制しないことが報告されている（非特許文献３を参照）。この実験系において、ＨＩＦ−１αおよび２αの両アイソフォームのｓｉＲＮＡを用いても、ＨＩＦ−１αのｓｉＲＮＡのみを用いたときと比べて、同程度しかＶＥＧＦの発現誘導を抑制していない。これに対して、腎癌細胞（７８６−Ｏ）では、ＨＩＦ−２αのｓｉＲＮＡのみが低酸素によるＶＥＧＦの発現誘導を抑制すること、ならびに、癌抑制遺伝子ＶＨＬ（von Hippel-Lindau）をもつ腎癌細胞（Ｃａｋｉ−１）では、ＨＩＦ−１αと２αのそれぞれのｓｉＲＮＡがＶＥＧＦ発現を抑制することが報告されている（非特許文献４を参照）。このように、ＨＩＦのどのアイソフォームがＶＥＧＦ産生に強く関与しているかについては、細胞によって異なることが考えられる。
これまでに、加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症の治療薬として、ＨＩＦ−１αのｓｉＲＮＡやアンチセンスを使用することは報告されているが（特許文献１〜３を参照）、ＨＩＦ−２αのｓｉＲＮＡおよびアンチセンスの使用については、本発明者らの知る限り報告されていない。また、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの両方のアイソフォームを阻害すれば、片方のアイソフォームを阻害するより、ＶＥＧＦ産生抑制作用が著しく高くなること、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの両方のアイソフォームに対するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスを含有する組成物を網膜疾患に用いることは報告されていない。
国際公開第２００７／００２７１８号パンフレット 国際公開第２００４／０４２０２４号パンフレット 国際公開第２００６／０５０７３４号パンフレット Semenza GL (1999), Ann．Rev．Cell．Dev． Biol．15: 551-578 Christina W et al (2004) FASEB J 12: 1462-1464 Heidi MS et al (2004) Cancer Res 63: 6130-6134 Raju RR et al (2005) Molecular and Cellular Biology 25: 5675-5686
本発明の目的は、加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの血管新生を伴う網膜疾患の治療において、より治療効果の高い医薬品を提供することにある。
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡおよびＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡを網膜色素上皮細胞に作用させ、両アイソフォームの発現を阻害した場合、片方のアイソフォームのｓｉＲＮＡを作用させた場合より、著しくＶＥＧＦ産生を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質を含有する、網膜疾患の治療剤。
〔２〕 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、前記〔１〕に記載の網膜疾患の治療剤。
〔３〕 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、前記〔２〕に記載の網膜疾患の治療剤。
〔４〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、前記〔３〕に記載の網膜疾患の治療剤。
〔５〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である前記〔４〕に記載の網膜疾患の治療剤：
（ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
〔６〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである前記〔４〕または〔５〕に記載の網膜疾患の治療剤：
（1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
〔７〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である前記〔１〕〜〔６〕いずれかに記載の網膜疾患の治療剤。
〔８〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である前記〔７〕に記載の網膜疾患の治療剤。
〔９〕 網膜疾患の治療剤を製造するための、ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質の使用。
〔１０〕 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、前記〔９〕に記載の使用。
〔１１〕 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、前記〔１０〕に記載の使用。
〔１２〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、前記〔１１〕に記載の使用。
〔１３〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である前記〔１２〕に記載の使用：
（ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
〔１４〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである前記〔１２〕または〔１３〕に記載の使用：
（1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
〔１５〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である前記〔９〕〜〔１４〕いずれかに記載の使用。
〔１６〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である前記〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕 網膜疾患の治療を必要とする対象に、ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、網膜疾患の治療方法。
〔１８〕 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、前記〔１７〕に記載の治療方法。
〔１９〕 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、前記〔１８〕に記載の治療方法。
〔２０〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、前記〔１９〕に記載の治療方法。
〔２１〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である前記〔１９〕に記載の治療方法：
（ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
〔２２〕 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである前記〔１９〕に記載の治療方法：
（1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
〔２３〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である前記〔１７〕に記載の治療方法。
〔２４〕 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である前記〔２３〕に記載の治療方法。
本発明の網膜疾患の治療剤によれば、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの両方の発現を特異的に阻害することによって、いずれか一方の発現を阻害する場合に比べて、網膜細胞でのＶＥＧＦの産生を有効に抑制することができる。このＶＥＧＦ産生の抑制効果は、相乗的である。本発明の網膜疾患の治療剤は、通常の核酸医薬に比べて優れた効果を期待できる。
図１は、ＲＰＥ細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を示すグラフである。 図２は、ＲＰＥ細胞におけるＨＩＦ−２αの発現量を示すグラフである。 図３は、ＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦの発現量を示すグラフである。 図４は、ＲＰＥ細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を示すグラフである。 図５は、ＲＰＥ細胞におけるＨＩＦ−２αの発現量を示すグラフである。 図６は、ＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦの発現量を示すグラフである。 図７は、ＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦの発現量を示すグラフである。
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞表面に存在する受容体（Ｆｌｔ−１、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１等）に特異的に作用して、血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成による毛細血管ネットワークの構築を促進する因子であり、血管新生の発生において非常に重要な役割を担っている（Ferrara, N. et al. Kidney Int. 1999, 56, 794-814）。また、ＶＥＧＦは、眼組織における血管形成や血管透過性の重要な制御因子であり、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜疾患に関与していることが知られている（Shams, N. et al. Ophthalmol. Clin. North. Am. 2006, 19, 335-344）。本発明の治療剤は、網膜色素上皮細胞やミューラー細胞等の網膜由来の細胞において、ＶＥＧＦの発現を上流で制御するＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害することができる。本発明の治療剤は、ＶＥＧＦ産生を抑制し、血管新生の発生を制御することにより網膜疾患の治療剤、特に血管新生を伴う網膜疾患の治療剤として有用である。血管新生を伴う網膜疾患の具体的な疾患としては、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、緑内障（特に血管新生緑内障）等が挙げられる。網膜色素上皮細胞におけるＶＥＧＦの増加が、加齢性黄斑変性症で認められる血管形成の原因の一つであることが知られていることから（Katrina et al. Am. J. Pathol. 2000, 157, 135-144）、本発明の治療剤は、網膜色素上皮細胞において優れたＶＥＧＦ産生抑制作用を発揮することによって、特に加齢性黄斑変性の治療剤として有用である。
本発明において、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αは、任意の哺乳動物由来の転写因子である。哺乳動物としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。ヒトの疾患の治療のためには、ヒト由来のＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αが好ましい。ＨＩＦ−２αは、ＥＰＡＳ１またはＨＬＦとも称される。ヒトＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αの塩基配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＨＩＦ−１αの塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）（GenBank Accession No. NM_001530）、ならびにＨＩＦ−２αの塩基配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）（GenBank Accession No. NM_001430）などがＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。
本発明の治療剤は、ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質を含有することを特徴とする。
本発明の治療剤に有効成分として含まれるＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質は、ＨＩＦ−１αの転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。また、本発明の治療剤に有効成分として含まれるＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質は、ＨＩＦ−２αの転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。かかる阻害物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターが挙げられる。
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９塩基の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αの発現阻害作用を有していれば数塩基置換されているものであってもよく、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。２本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡは、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αのｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１７〜２５塩基長、好ましくは１７〜２３塩基長、さらに好ましくは１７〜２１塩基長である。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖である。具体的には、ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡは、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個（好ましくは１７〜２３個、さらに好ましくは１７〜２１個）の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。好ましくは、配列番号１の９０６番目から１４７８番目を標的とする１７〜２５個（好ましくは１７〜２３個、さらに好ましくは１７〜２１個）の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡは、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個（好ましくは１７〜２３個、さらに好ましくは１７〜２１個）の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。好ましくは、配列番号３の５８０番目から４２４２番目を標的とする１７〜２５個（好ましくは１７〜２３個、さらに好ましくは１７〜２１個）の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方または双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（overhang）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例、１、２または３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２αのｍＲＮＡは、相同性が高いことから、双方のｍＲＮＡを同時にノックダウン可能なｓｉＲＮＡを選択することも可能である。この場合、本発明の治療剤中に含まれる核酸は、１種のみでありうる。
（１）ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡ
ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡの具体的な配列は、下記配列番号１７〜２０または３１の塩基配列を基準として、下記（ａ）または（ｂ）で定義される二重鎖ＲＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。ここで、配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個（例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）の塩基の付加および／または欠失は、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性の保持という観点から、ＨＩＦ−１α遺伝子をコードするセンス鎖およびそのアンチセンス鎖の部分塩基配列との同一性を確保するように達成され得る。
Figure 2009020119
ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡの内、オーバーハングを有しているｓｉＲＮＡは、下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであることが好ましい（下線はオーバーハングを示す。）
（1-1）配列番号５(5’-ggaac cugau gcuuu aacutt-3’)で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１１(5’-aguua aagca ucagg uucctt-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-2）配列番号６(5’-gggua aagaa caaaa cacatt-3’)で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１２(5’-ugugu uuugu ucuuu accctt-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-3）配列番号７（5’-ggcagcagaaaccuacugctt-3’）で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１３(5’-gcaguagguuucugcugcctt-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-4）配列番号８（5’-gcacgacuugauuuucucctt-3’）で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号１４(5’-ggagaaaaucaagucgugctg-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（1-5）配列番号２９（5’-ccucaguguggguauaagatt-3’）で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
配列番号３０(5’-ucuuauacccacacugaggtt-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
（２）ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡ
ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡの具体的な配列は、下記配列番号２１、２２または３５のいずれかを基準として、下記（ｃ）または（ｄ）で定義される二重鎖ＲＮＡであることが好ましい。
（ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
（ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。ここで、配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個（例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１または２個）の塩基の付加および／または欠失は、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性の保持という観点から、ＨＩＦ−２α遺伝子をコードするセンス鎖およびそのアンチセンス鎖の部分塩基配列との同一性を確保するように達成され得る。
Figure 2009020119
ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡの内、オーバーハングを有しているｓｉＲＮＡは、下記（2-1）〜（2-3）のいずれかであることが好ましい（下線はオーバーハングを示す。）：
（2-1）配列番号９(5’-cggag guguu cuaug agcutt-3’)で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１５(5’-agcuc auaga acacc uccgtc-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-2）配列番号１０(5’-gguuu uguug cuagc ccuutt-3’)で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６(5’-aaggg cuagc aacaa aacctt-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
（2-3）配列番号３３(5’-ggaca uagua ucuuu gacutt-3’)で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４(5’-aguca aagau acuau gucctg-3’)で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
ＨＩＦ−１αに対するアンチセンス核酸またはＨＩＦ−２αに対するアンチセンス核酸は、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αの転写産物（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αの転写産物（例、配列番号１または配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αの転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。ＨＩＦ−１αに対するアンチセンス核酸は、好ましくは、配列番号１７〜２０、２３〜２６、３１、３２のいずれかで表される塩基配列（アンチセンス核酸がＤＮＡの場合、ＵはＴである）を含むものである。ＨＩＦ−２αに対するアンチセンス核酸は、好ましくは、配列番号２１、２２、２７、２８、３５、３６のいずれかで表される塩基配列（アンチセンス核酸がＤＮＡの場合、ＵはＴである）を含むものである。
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２αをコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)）。
ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α特異的阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α特異的阻害物質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。
本発明の発現ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。
本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、ヒト等の哺乳動物細胞中でＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α特異的阻害物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス由来のウイルスベクターが好ましい。
本発明の治療剤の投与量は、有効成分の種類もしくは活性、投与対象となる動物種、投与対象の病気の重篤度、薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇが例示される。
本発明の治療剤の投与対象としては、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。
本発明の治療剤は、患者に対して経口的または非経口的に投与することができ、投与形態としては、経口投与、眼局所投与（点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、静脈内投与、経皮投与などが挙げられ、必要に応じて、製薬学的に許容され得る添加剤と共に、投与に適した剤型に製剤化される。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、非経口投与に適した剤型としては、例えば、点眼剤、眼軟膏、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などが挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。本発明の治療剤は、上述の治療効果を奏する限りその投与経路および剤形は特に限定されないが、好ましい投与経路は眼局所投与であり、その剤形は注射剤または点眼剤である。
また、本発明の治療剤は、これらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアー等のＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。
例えば、本発明の治療剤を注射剤または点眼剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
本発明の治療剤は、ｓｉＲＮＡ等の核酸をリポフェクション法を用いて製剤化することもできる。リポフェクション法には、通常ホスファチジルセリンからなるリポソームが用いられる。ホスファチジルセリンは陰電荷を有するため、ホスファチジルセリンの代用として、より安定したリポソームを作りやすいＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）という陽イオン性脂質（商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることが好ましい。これらの陽イオン性脂質と陰電荷を持つｓｉＲＮＡ等の核酸との複合体を形成させると、全体として正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合できることで核酸を細胞内に導入することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。
製剤例１：硝子体内投与用注射剤
常法により下に示す硝子体内投与用注射剤を調製する。
HIF-1αsiRNA: sense-GGA ACC UGA UGC UUU AAC UTT（配列番号５） １ｍｇ
antisense-AGU UAA AGC AUC AGG UUC CTT（配列番号１１） １ｍｇ
HIF-2αsiRNA: sense-CGG AGG UGU UCU AUG AGC UTT（配列番号９） １ｍｇ
antisense-AGC UCA UAG AAC ACC UCC GTC（配列番号１５） １ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ｇ
塩化ナトリウム ０．９ｇ
水酸化ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
全量 １００ｍＬ
（ｐＨ７）
製剤例２：硝子体内投与用注射剤
常法により下に示す硝子体内投与用注射剤を調製する。
HIF-1αsiRNA: sense-GGG UAA AGA ACA AAA CAC ATT（配列番号６） 0.1ｍｇ
antisense-UGU GUU UUG UUC UUU ACC CTT（配列番号１２） 0.1ｍｇ
HIF-2αsiRNA: sense-GGU UUU GUU GCU AGC CCU UTT（配列番号１０）0.1ｍｇ
antisense-AAG GGC UAG CAA CAA AAC CTT（配列番号１６） 0.1ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
全量 １００ｍＬ
（ｐＨ７）
製剤例３：テノン嚢下投与用注射剤
常法により下に示すテノン嚢下投与用注射剤を調製する。
HIF-1αsiRNA: sense-GGC AGC AGA AAC CUA CUG CTT（配列番号７） ５ｍｇ
antisense-GCA GUA GGU UUC UGC UGC CTT（配列番号１３） ５ｍｇ
HIF-2αsiRNA: sense-GGA CAU AGU AUC UUU GAC UTT（配列番号３３） ５ｍｇ
antisense-AGU CAA AGA UAC UAU GUC CTG（配列番号３４） ５ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ｇ
塩化ナトリウム ０．９ｇ
水酸化ナトリウム 適量
滅菌精製水 適量
全量 １００ｍＬ
（ｐＨ７）
試験例１：網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞でのＶＥＧＦ発現誘導に対するＨＩＦ ｓｉＲＮＡの効果
１．方法
１）ＲＰＥ細胞へのＨＩＦ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
６穴プレートにＲＰＥ細胞（ATCC、細胞名：ARPE-19、カタログ番号：CRL-2302）を播種し、３０-５０％の細胞密度になるまで培養後、低血清培地（0.1% FBSを含むDMEM/F12培地、Invitrogen社）に交換した。下記の各ＨＩＦ ｓｉＲＮＡは、Ambion社の製品を使用した（下線はデオキシ体からなるオーバーハングを示す。）。
HIF-1αsiRNA: sense-GGA ACC UGA UGC UUU AAC UTT（配列番号５）、
antisense-AGU UAA AGC AUC AGG UUC CTT（配列番号１１）、
HIF-2αsiRNA: sense-CGG AGG UGU UCU AUG AGC UTT（配列番号９）、および
antisense-AGC UCA UAG AAC ACC UCC GTC（配列番号１５）
トランスフェクション試薬（RNAi MAX, Invitrogen社）の複合体の形成は、各種siRNAとトランスフェクション試薬をOpti-MEM（Invitrogen社）中で攪拌後、２５分間インキュベーションすることにより作製した。その後、各ｓｉＲＮＡの最終濃度が５ｎＭになるように調整した培地でＲＰＥ細胞を２４時間培養することにより、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。群分けは下記とおりである。
（ａ）正常群
（ｂ）低酸素群
（ｃ）低酸素+薬物群（HIF-1α siRNA 5nM）
（ｄ）低酸素+薬物群（HIF-2α siRNA 5nM）
（ｅ）低酸素+薬物群（HIF-1α siRNA 5nM + HIF-2α siRNA 5nM）
２）低酸素系でのＲＰＥ細胞の培養
ＲＰＥ細胞に、ＨＩＦ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、AnaeroPack for Cell（三菱ガス株式会社）を使用し、１日間の低酸素培養を行なった。また、通常酸素濃度下で培養したものを正常群とした。
３）ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
６穴プレートに播種したＲＰＥ細胞から、１ｍＬのTRIzol溶液（Invitrogen社、カタログ番号：15596-026）を用いてtotal ＲＮＡを抽出した。抽出方法はTRIzol溶液に付属されている説明書のプロトコールに従った。次にＤＮＡ-ｆｒｅｅ（Ambion社）を用いて抽出後のtotal ＲＮＡに混在しているゲノムＤＮＡを除去した後、SuperScript II（Invitrogen社）とRandom primer（Ambion社）を用いて逆転写反応を行った。その後、得られたｃＤＮＡ溶液を、TaqMan Universal PCR master mix（Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。プライマーはApplied Biosystems社のTaqManリアルタイムＰＣＲプライマー（HIF-1α: Hs00153153_m1, HIF-2α: Hs01026142_m1, VEGF: Hs00173626_m1）を使用した。
２．結果および考察
ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ、ＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡおよび両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡのそれぞれの添加により、低酸素処理によるＶＥＧＦの発現亢進が抑制されるかどうかについてＲＰＥ細胞を用いて検討した。
図１はＨＩＦ−１αの発現量を示す。ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ単独、または両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加することによって、ＨＩＦ−１αの発現阻害が観察された。一方、図２はＨＩＦ−２αの発現量を示し、ＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡ単独、または両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加することによって、ＨＩＦ−２αの発現阻害が認められた。同条件下にて、ＶＥＧＦの発現抑制を確認したものが図３である。ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ単独の添加により、ＶＥＧＦの発現抑制効果が認められたが、その抑制効果は不十分であり、３５％の抑制率であった。一方、ＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡ単独では、全く抑制効果が認められなかった。ところが、ＨＩＦ−１αと２αの両方のアイソフォームを添加した群では、単独の添加では予想もしなかったＶＥＧＦの著しい発現抑制効果が認められ、その抑制率は８９％を示した。以上の結果から、ＨＩＦを阻害することによって網膜における血管新生を抑制する場合、他の細胞とは異なり、両アイソフォームを阻害することが望まれる。
試験例２：網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞でのＶＥＧＦ発現誘導に対するＨＩＦ ｓｉＲＮＡの効果
１．方法
１）ＲＰＥ細胞へのＨＩＦ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
96穴プレートにＲＰＥ細胞（ATCC社、細胞名：ARPE-19、カタログ番号：CRL-2302）を播種し、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションのため、細胞を３０-５０％の細胞密度になるまで培養した。次に、ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬（RNAi MAX, Invitrogen社）をOpti-MEM（Invitrogen社）中で攪拌し、その後２０分間インキュベーションすることにより、siRNA-RNAi Max複合体を作製した。
ＨＩＦ ｓｉＲＮＡは、下記のAmbion社の製品を使用した（下線はデオキシ体からなるオーバーハングを示す。）。
HIF-1αsiRNA: sense-CCU CAG UGU GGG UAU AAG ATT（配列番号２９）、
antisense-UCU UAU ACC CAC ACU GAG GTT（配列番号３０）、
HIF-2αsiRNA: sense-GGA CAU AGU AUC UUU GAC UTT（配列番号３３）、および
antisense-AGU CAA AGA UAC UAU GUC CTG（配列番号３４）
培地を無血清培地（DMEM培地またはDMEM/F12培地、Invitrogen社）に交換後、ＲＰＥ細胞に最終濃度が１０ｎＭになるように各ｓｉＲＮＡを加え、トランスフェクションを行った。群分けは下記のとおりである。
（ａ）正常群
（ｂ）低酸素群
（ｃ）低酸素＋薬物群（HIF-1α siRNA 5nM）
（ｄ）低酸素＋薬物群（HIF-2α siRNA 5nM）
（ｅ）低酸素＋薬物群（HIF-1α siRNA 5nM + HIF-2αsiRNA 5nM）
２）低酸素系でのＲＰＥ細胞の培養
ＲＰＥ細胞にＨＩＦ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、AnaeroPack for Cell（三菱ガス株式会社）を使用し、ＶＥＧＦの発現誘導のため１日間の低酸素培養を行なった。また、通常酸素濃度下で培養したものを正常群とした。
３）ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ
低酸素培養終了後、５０μＬのLysis溶液（TaqMan Gene Expression Cell-to-CT kit、Applied Biosystems社、カタログ番号：AM1728）を用いて、ＲＰＥ細胞からtotal ＲＮＡを抽出した。抽出方法はTRIzol溶液に付属されている説明書のプロトコールに従った。次に、1xRT bufferと１xRT Enzyme Mix（前述キットに同封）を用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡ溶液は、TaqMan Gene Expression Master Mix（前述キット同封）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。プライマーはApplied Biosystems社のTaqManリアルタイムＰＣＲプライマー（HIF-1α: Hs00153153_m1, HIF-2α: Hs01026142_m1, VEGF: Hs00173626_m1）を使用した。
２．結果および考察：
ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ、ＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡおよび両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡのそれぞれの添加により、低酸素処理によるＶＥＧＦの発現亢進が抑制されるかどうかについてＲＰＥ細胞を用いて検討した。図４はＨＩＦ−１αの発現量を示す。ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡ単独、または両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加することによって、ＨＩＦ−１αの顕著な発現阻害が観察された。一方、図５はＨＩＦ−２αの発現量を示し、ＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡ単独、または両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加することによって、ＨＩＦ−２αの発現阻害が認められた。同条件下にて、ＶＥＧＦの発現抑制を確認したものが図６である。ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡあるいはＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡ単独を添加した群ではＶＥＧＦ発現抑制効果が認められなかった。これに対して、両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加した群では顕著なＶＥＧＦ発現抑制効果が認められた。
試験例３：網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞でのＶＥＧＦ発現誘導に対するＨＩＦ ｓｉＲＮＡの効果
１．方法
１）ＲＰＥ細胞へのＨＩＦ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
実験方法は、試験例２に準拠し、下記のAmibon社のｓｉＲＮＡを使用し、試験を実施した（下線はデオキシ体からなるオーバーハングを示す。）。
HIF-1αsiRNA: sense-gca cga cuu gau uuu cuc cTT（配列番号8）、
antisense-gga gaa aau caa guc gug cTT（配列番号14）、
HIF-2αsiRNA: sense-ggu uuu guu g cu agc ccu uTT（配列番号10）、および
antisense-aag ggc uag caa caa aac cTC（配列番号16）
２．結果および考察：
図７に示すように、ＨＩＦ−１α ｓｉＲＮＡあるいはＨＩＦ−２α ｓｉＲＮＡ単独を添加した群ではＶＥＧＦ発現抑制効果が認められなかった。これに対して、両方のアイソフォームからなる混合ｓｉＲＮＡを添加した群では顕著なＶＥＧＦの抑制効果が著しく認められた。
本発明の網膜疾患の治療剤によれば、網膜細胞でのＶＥＧＦの産生を有効に抑制することができ、加齢性黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの血管新生を伴う網膜疾患の治療において、通常の核酸医薬に比べて優れた投与量対効果を期待できる。
本出願は、日本で出願された特願２００７−２０４５８５（出願日：２００７年８月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
配列表フリーテキスト
配列番号５：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号６：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号７：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号８：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号９：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号１０：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号１１：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１２：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１３：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１４：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１５：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１６：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号１７：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号１８：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号１９：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号２０：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号２１：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号２２：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号２３：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２４：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２５：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２６：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２７：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２８：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号２９：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号３０：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号３１：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号３２：ヒトＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号３３：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号３４：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
配列番号３５：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号３６：ヒトＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖

Claims (24)

  1. ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質を含有する、網膜疾患の治療剤。
  2. 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、請求項１に記載の網膜疾患の治療剤。
  3. 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の網膜疾患の治療剤。
  4. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、請求項３に記載の網膜疾患の治療剤。
  5. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である請求項４に記載の網膜疾患の治療剤：
    （ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
  6. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである請求項４または５に記載の網膜疾患の治療剤：
    （1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
  7. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である請求項１〜６いずれかに記載の網膜疾患の治療剤。
  8. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である請求項７に記載の網膜疾患の治療剤。
  9. 網膜疾患の治療剤を製造するための、ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質の使用。
  10. 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、請求項９に記載の使用。
  11. 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載の使用。
  12. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、請求項１１に記載の使用。
  13. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である請求項１２に記載の使用：
    （ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
  14. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである請求項１２または１３に記載の使用：
    （1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
  15. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である請求項９〜１４いずれかに記載の使用。
  16. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である請求項１５に記載の使用。
  17. 網膜疾患の治療を必要とする対象に、ＨＩＦ−１αの発現を特異的に阻害する物質およびＨＩＦ−２αの発現を特異的に阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、網膜疾患の治療方法。
  18. 前記阻害物質が、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターである、請求項１７に記載の治療方法。
  19. 前記ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１８に記載の治療方法。
  20. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号１の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなり、前記ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１７〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである、請求項１９に記載の治療方法。
  21. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（ａ）または（ｂ）であり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（ｃ）または（ｄ）である請求項１９に記載の治療方法：
    （ａ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｂ）配列番号１７〜２０または３１のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−１αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｃ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつ、ＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ；
    （ｄ）配列番号２１、２２または３５のいずれかで表される塩基配列の５’末端および／または３’末端において、１〜数個の塩基が付加および／または欠失された塩基配列を含むセンス鎖、およびその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端にオーバーハングを有していてもよく、かつＨＩＦ−２αの発現阻害活性を有する二重鎖ＲＮＡ。
  22. 前記ＨＩＦ−１αに対するｓｉＲＮＡが下記（1-1）〜（1-5）のいずれかであり、ＨＩＦ−２αに対するｓｉＲＮＡが下記（2-1）〜（2-3）のいずれかである請求項１３に記載の網膜疾患の治療剤：
    （1-1）配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-2）配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-3）配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１３で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-4）配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （1-5）配列番号２９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号３０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-1）配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖、および
    配列番号１５で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-2）配列番号１０で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号１６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ；
    （2-3）配列番号３３で表される塩基配列からなるセンス鎖、および配列番号３４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ＲＮＡ。
  23. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、または緑内障である請求項１７に記載の治療方法。
  24. 網膜疾患が、加齢性黄斑変性症または糖尿病性網膜症である請求項２３に記載の治療方法。
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