JPWO2008108325A1 - 新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子および酵素活性を向上させる方法 - Google Patents

新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子および酵素活性を向上させる方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、中性からアルカリ性側にその反応至適ｐＨを有する極めて有用な新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素および当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。本発明はさらに、当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を含むベクター、および当該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供すると共に、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。

Description

本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素をコードする遺伝子で形質転換した微生物を用いる当該酵素の製造方法に関する。
糖転移酵素は生体内において糖タンパク質や糖脂質等（以下、複合糖質）の糖鎖の生合成に関与する酵素である。その反応生成物である複合糖質の糖鎖は生体内において非常に重要な機能を有している。例えば、主に哺乳類細胞において、糖鎖は分化や発生における細胞間および細胞−細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることなどが明らかにされている。
これを応用した例として、血液中の赤血球を生産するホルモンであるエリスロポエチンが挙げられる。天然型のエリスロポエチンは効果の持続性が低い欠点があった。そこで、エリスロポエチンは元来糖タンパク質であるが、新たな糖鎖を付加することによって、生体内における寿命を向上させた組換えエリスロポエチンタンパク質が開発、製造され、市販された。今後もこのように糖鎖を付加あるいは改変した医薬品、機能性食品等の開発が増えていくと考えられている。したがって、任意に糖鎖を合成・生産する手段の開発が求められている。とりわけ、最も効率的な手段のひとつとして、糖転移酵素の開発の重要性は増してきている。
これまでに約１５０種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラットおよび酵母等の真核生物から単離されてきた。さらに、これらの遺伝子はＣＨＯ細胞や大腸菌等の宿主細胞で発現され、糖転移酵素活性を有するタンパク質が生産されてきた。一方、原核生物である細菌からも、２０〜３０種類程度の糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる組換え生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。
シアル酸は、糖鎖の非還元末端に存在することが多いため、糖鎖の機能発現において極めて重要な糖であると考えられている。そのため、糖転移酵素の中でもシアル酸転移酵素は最も需要の高い酵素の一つである。β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関して、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993); Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)）。しかし、これらの動物由来の酵素は精製が困難で大量に得られないため非常に高価であり、さらに酵素としての安定性が悪いという問題を有している。一方、細菌由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびその遺伝子としては、フォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）に属する微生物から分離されたものが報告されている（国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号；米国特許６２５５０９４号公報、Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)）。
これまでに知られている各種の哺乳動物、細菌由来のシアル酸転移酵素はいずれも反応至適ｐＨ範囲が５〜６のような酸性側であると報告されている(Paulson, J. C. et al., J. Biol. Chem., 252, 2363-2371 (1977)、Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996))。各種の糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質糖鎖や単純な糖鎖に結合しているシアル酸は、酸性条件下においては徐々に分解されることが広く知られている。更に、シアル酸転移酵素の糖供与体基質であり、その価格が極めて高価なＣＭＰ−シアル酸は、酸性条件下では速やかに分解するが、アルカリ性条件下においては極めて安定であることが知られている。従って、シアル酸転移酵素を用いて各種の複合糖質や糖鎖にシアル酸を転移させる場合、反応後のシアル酸を含む糖鎖の安定性・保存性の観点から、更にシアル酸転移反応に使用するＣＭＰ−シアル酸の効率的な利用の観点からも、反応至適ｐＨが中性からアルカリ性側にあるシアル酸転移酵素が求められている。
国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号パンフレット 米国特許６２５５０９４号公報 Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993) Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987) Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996) Paulson, J. C. et al., J. Biol. Chem., 252, 2363-2371 (1977)
本発明の課題は、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来する新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することである。更に具体的には、本発明は反応至適ｐＨが中性からアルカリ性側である、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
また、本発明の課題は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする遺伝子を利用して遺伝子組換え技術により本酵素を高生産する方法を提供することである。
本発明の課題はさらに、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素によるシアル酸転移反応の効率を高める方法を提供することを目的とする。
本発明者らは日本全国から４，０００菌株以上の微生物を分離し、その性質について鋭意研究に努めた結果、フォトバクテリウム（Photobacterium）属に属する微生物の菌株から、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を生産する菌株を見出した。次に公知の遺伝子であるフォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のＤＮＡをプローブに、当該菌株から新規なα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子をクローニングした。本新規遺伝子を大腸菌で発現させた結果、本遺伝子はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードし、その酵素タンパク質の反応至適ｐＨが７から９.５であることを見出した。さらに、この新規な組換え酵素を精製し詳細に解析した結果、本組換え酵素は、シアル酸を単糖や糖鎖中のガラクトース残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などにα２，６結合で効率よく転移させることも見出し、本発明を完成させた。本発明は反応至適ｐＨが中性からアルカリ性側である、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸、ならびに、当該シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を提供する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの６位、またはガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはマンノースなどの複合糖質を構成しうる単糖であって６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において、「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここでいうシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、N−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸（ジN−アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃα２，８（９）Ｎｅｕ５Ａｃ）などを示す。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、１−１５番目のアミノ酸を除去し、そのＮ末端にメチオニンを付加した配列である。後述の実施例２において示すように、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質も、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と同様のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を保持した。このことは、配列番号２のうち少なくともアミノ酸１６−４９７が存在すればβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を保持しうることを示すものである。よって、本発明の新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号２のアミノ酸１−４９７中のアミノ酸１−１５の全部又は一部を欠失しているアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、あるいは、配列番号２のアミノ酸１６−４９７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。
また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質である。本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号３の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。配列番号３の塩基配列は、配列番号１の塩基４６−１４９４の塩基配列の５’末端に、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列に相当する。配列番号１および配列番号３の塩基配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列をコードする。また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号１の塩基４６−１４９４の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。
本発明はまた、上記の本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する変異タンパク質をも包含する。このような変異タンパク質もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素に含まれる。
本発明の変異体タンパク質は、配列番号２、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数の、あるいは１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は保存的置換であってもよく、これは特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
なお、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。
本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列において、１または複数の、あるいは１または数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加は、部位特異的変位誘発のほか上述した方法により行うことができる。
本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号２、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
または、本発明の変異体タンパク質は、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
本発明の変異タンパク質はまた、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark's solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラクトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシアリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を糖受容体基質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを糖供与体基質として用いて酵素反応を行い、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。
本発明の一態様において本発明の酵素は、フォトバクテリウム属に属する微生物由来である。本発明の酵素は、フォトバクテリウム属に属する微生物由来であれば特に限定されるものではなく、フォトバクテリウム属に属する新種の微生物由来の酵素であってもよい。好ましい態様において、本発明の酵素はフォトバクテリウム・レイオグナシー（Photobacterium leiognathi）に属する微生物由来である。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の酵素学的性質および理化学的性質は、上記に定義したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とするほか、限定するわけではないが、至適ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ９．５の範囲、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ９、ｐＨ８〜ｐＨ９の範囲、さらに好ましくはｐＨ８である。また、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、至適温度が２５〜３０℃であること、および／または分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で５０，０００±５，０００Ｄａ程度であることを特徴としてもよい。
また、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、リン酸バッファーを含む反応液中で使用すると、他のバッファー、例えば、酢酸バッファー、カコジル酸バッファー、ビス−トリスバッファー、トリス−塩酸バッファー、ＴＡＰＳバッファー、ＣＨＥＳバッファー、ＣＡＰＳバッファーなど、と比較して高い酵素活性を示す。よって本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の使用であって、リン酸バッファーを含む組成を有する反応液中で使用することを特徴とする、前記使用、をも提供する。本明細書において、リン酸バッファーとは、当業者が通常用いる意味として解される。好ましい態様において、リン酸バッファーとはリン酸イオン（ＰＯ4 3-）を緩衝剤の構成成分として含むバッファーを意味する。さらに好ましい態様において、リン酸バッファーは、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、および、それらの組合せ、からなる群より選択される緩衝剤を含むバッファーであってよい。また、本発明の酵素をリン酸バッファーを含む反応液中で使用する際は、至適ｐＨである、ｐＨ７〜ｐＨ９．５の範囲で使用することが好ましい。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。
本発明の核酸は、配列番号２、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸である。
本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。そのような核酸もまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸に含まれる。
そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数の、あるいは１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列において、１または複数の、あるいは１または数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸である。アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／付加は、上述した方法により導入することができる。
また、そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号３を付加した配列）からなる群より選択される塩基配列と、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、アミノ酸配列または塩基配列の同一性は、上記に示した方法で決定することができる。
そのような核酸の変異体はさらに、配列番号１、配列番号３からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸であって、該核酸はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、ストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件とは、上記で定義したとおりである。
また、本発明の核酸によりコードされるタンパク質は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することを特徴とするほか、限定されるわけではないが、その酵素活性の至適ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ９．５の範囲、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．５、ｐＨ７．５〜ｐＨ９、ｐＨ８〜ｐＨ９の範囲、さらに好ましくはｐＨ８である。また本発明の核酸によりコードされるタンパク質は、至適温度が２５〜３０℃であること、および／または、当該タンパク質の分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で５０，０００±５，０００Ｄａ程度であることを特徴としてもよい。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する微生物
本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物が新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現する単離された微生物を提供する。本発明の微生物は、フォトバクテリウム属に属し、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する単離された微生物である。好ましい態様において、本発明の微生物は、フォトバクテリウム・レイオグナシーに属し、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素生産能を有する単離された微生物である。なお、上記のフォトバクテリウム属の微生物は一般に海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類から分離される。
本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離することができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を接種源としたりする。これらをマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントアガー培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの平板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。
本発明の酵素として記載される、反応至適ｐＨが７．０から９．５という特徴を有するβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産するフォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株は上記のスクリーニング法を用いることで得られた。
組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法にも関する。好ましい態様において本発明の方法は、本発明の酵素を生産する。
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。
本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子等から誘導された適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結したβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに、転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。
本発明のベクターに挿入されるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸配列は、上述した本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸の塩基配列である。この配列は、リーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。リーダー配列を含む場合、配列番号１のヌクレオチド１−４５に相当するリーダー配列であってもよく、また他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。
また、本発明の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質は、当該酵素をコードする核酸に続いて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧTMタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすることができる。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えα２，６−シアル酸転移酵素タンパク質から切り離すこともできる。
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１または２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびにβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸のＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotech.、米国、ウイスコンシン州、マディソン）などが含まれる。
原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター（Changら、Nature 275:615, 1978;およびGoeddelら、Nature 281:544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。
また、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、S. cerevisiae ）を用いるが、ピキア属（Pichia）またはクルイベロミセス属（Kluyveromyces）のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、例えば、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス２などから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する。）の方法で構築することができる。
本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を産生する１つの方法は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じてβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。
組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要因に従って適宜選択される。例えば、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等、またはそれらの組み合わせが含まれる。また、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、アフィニティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧTMタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを融合させた場合には、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム、抗ＦＬＡＧ抗体を連結したカラム、またはグルタチオンを連結したカラム、などを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−２，６−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。
抗体
本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどに免疫して作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。
本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質を、ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどのアッセイにおいて検出するのに用いることもできる。
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を向上させる方法
本発明はまた、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応の効率を高める方法に関する。
本発明者らは、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、その反応液中に一価金属イオンを添加すると、当該反応の効率が高められることを見いだした。
従って、一態様において本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を一価金属イオンの存在下で行うことにより、当該一価金属イオンの非存在下と比較して、当該反応の効率を高める方法、に関する。好ましくは、一価金属イオンはナトリウムイオン、カリウムイオンまたはリチウムイオン、さらに好ましくは、ナトリウムイオンまたはカリウムイオンである。
本発明の方法において、一価金属イオンの量は、反応系の総量を基準として、０．０５Ｍ〜２．０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜１．５Ｍ、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、０．０５Ｍ〜１．０Ｍ、０．１Ｍ〜１．０Ｍである。
本発明者らは、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、その反応液中にカルシウムイオンを添加すると、当該反応の効率が高められることを見いだした。
従って、一態様において本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応をカルシウムイオンの存在下で行うことにより、カルシウムイオンの非存在下と比較して、当該反応の効率を高める方法、に関する。
本発明の方法において、カルシウムイオンの量は、反応系の総量を基準として、１．０ｍＭ〜２．０Ｍ、好ましくは１．０ｍＭ〜１．０Ｍ、１．０ｍＭ〜５００ｍＭ、１．０ｍＭ〜１００ｍＭ、５．０ｍＭ〜２．０Ｍ、５．０ｍＭ〜１．０Ｍ、５．０ｍＭ〜５００ｍＭ、５．０ｍＭ〜１００ｍＭ、５．０ｍＭ〜５０ｍＭ、５．０ｍＭ〜２５ｍＭ、５．０ｍＭ〜２０ｍＭ、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜２５ｍＭ、１０ｍＭ〜２０ｍＭである。
また、本発明者らは、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、その反応液中に、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ホウ酸イオン、塩化物イオン、およびフッ化物イオンからなる群より選択される陰イオンを添加すると、当該反応の効率が高められることを見いだした。
従って、一態様において本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応をリン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、およびホウ酸イオンからなる群より選択される錯イオン、塩化物イオン、フッ化物イオンならびにそれらいずれかの組合せ、からなる群より選択される陰イオンの存在下で行うことにより、当該陰イオンの非存在下と比較して、当該反応の効率を高める方法、に関する。好ましい態様において陰イオンは、リン酸イオン、硫酸イオン、および硝酸イオンからなる群より選択される錯イオン、塩化物イオン、ならびにそれらいずれかの組合せ、からなる群より選択される陰イオンである。
本発明の方法において、陰イオンの量は、反応系の総量を基準として、０．０５Ｍ〜２．０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜１．５Ｍ、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、０．０５Ｍ〜１．０Ｍ、０．１Ｍ〜１．０Ｍである。
また、別の態様において本発明は、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を、一価金属イオンまたはカルシウムイオンと、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオンからなる群より選択される錯イオン、および塩化物イオンからなる群より選択される陰イオンとの塩の存在下で行うことにより、当該塩の非存在下と比較して、当該反応の効率を高める方法、に関する。
本発明の方法において、酵素反応を行う条件は、本発明のシアル酸転移酵素が反応する条件であれば、特に制限はない。酵素反応溶液には、限定するわけではないが、カコジレートバッファー、リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、ビストリスバッファー、ＴＡＰＳバッファー、ＣＨＥＳバッファー、ＣＡＰＳバッファーなどの緩衝液を用いてもよい。反応溶液のｐＨは、本発明のシアル酸転移酵素が反応する条件であればいずれでもよく、より好ましくはｐＨ７〜９．５であり、さらに好ましくは本発明のシアル酸転移酵素の至適ｐＨである。また、反応溶液の反応温度は、本発明のシアル酸転移酵素が反応する条件であればいずれでもよく、好ましくは本発明のシアル酸転移酵素の至適温度である。糖供与体および糖受容体濃度の条件は、糖転移酵素が反応する条件であれば特に制限はなく、当業者であれば、これらの濃度を適宜設定することができる。
本発明の方法において、糖転移酵素の反応系に一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩を添加する時期に特に制限はないが、例えば、酵素反応前に、酵素反応用緩衝液に、酵素溶液に、糖受容体基質溶液に、または糖供与体溶液に溶解させておいてもよく、あるいはこれらと独立に適当濃度の一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩溶液を調整し、これを反応系に添加してもよい。一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩溶液を酵素反応成分と独立に調整する態様では、反応の直前または反応の途中で一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩を反応系に添加することも可能である。
本明細書において、一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩の存在下とは、反応溶液の緩衝剤とは別に、一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩を反応液中に添加した状態を意味する。
本発明の方法において、酵素活性が向上する、または反応効率が高まるとは、当該反応を一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩の存在下で行うことにより、その非存在下に比べて当該反応の効率が高まることをいう。好ましい態様において、酵素活性が向上する、または反応効率が高まるとは、当該反応を一価金属イオン、カルシウムイオン、陰イオン、および／または塩の存在下で行うことにより、その非存在下に比べて、酵素の相対活性が１倍より大きい、より好ましくは１．１倍より大きい、さらに好ましくは１．２倍より大きいことをいう。増加した酵素活性の上限は特に定めなくてもよく、好ましくは１０倍以下、５倍以下、３倍以下、２倍以下であってもよい。
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされている糖鎖の合成・生産手段を提供するという観点において貢献する。特に、本発明のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素は、既存のものと比較して、反応至適ｐＨが中性からアルカリ性側にあるという特徴を有し、さらに受容体基質特異性が広範囲である。シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。
図１−１は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、ピリジルアミノ化ラクトース（ＰＡ−ラクトース）およびＣＭＰ−シアル酸に反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が３．９６７分のピークはＰＡ−ラクトース、４．４５２分のピークはＰＡ−６’−シアリルラクトースである。 図１−２は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、ピリジルアミノ化（ＰＡ）ラクトースと混合させた場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。図１−１の実験に対してシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸を反応液に混合していない対照実験の結果である。保持時間が３．９６２分のピークはＰＡ−ラクトースである。 図１−３は、ＰＡ−ラクトースの標品のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。ＰＡ−ラクトースは、保持時間３．９７３分のピークとして現れる。 図１−４は、公知の酵素であるフォトバクテリウム・ダムセラ ＪＴ０１６０株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をＰＡ−ラクトースおよびＣＭＰ−シアル酸に反応させた反応溶液（ピリジルアミノ化α２，６−シアリルラクトースが生成されている）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が３．９８１分のピークはＰＡ−ラクトース、４．４７０分のピークはＰＡ−６’−シアリルラクトースである。 図１−５は、公知の酵素であるフォトバクテリウム・ダムセラ ＪＴ０１６０株由来のα２，６−シアル酸転移酵素をＰＡ−ラクトースに反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。図１−４の実験に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応液に混合していない対照実験である。保持時間が３．９７６分のピークはＰＡ−ラクトースである。 図２−１は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性における反応ｐＨの影響を示すグラフである。用いた緩衝液の種類、ｐＨ範囲は以下の通りである：酢酸バッファー（ｐＨ４−５）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５−６）、ビスートリスバッファー（ｐＨ６−７）、リン酸バッファー（ｐＨ６−９．５）、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７−９）ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８−９）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９−１０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０−１１）。 図２−２は、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。 図３は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性に及ぼす、各種の塩の添加の効果を示すグラフである。 図４は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性に及ぼす、各種１価金属イオンの添加の影響を示すグラフである。 図５は、フォトバクテリウム・レイオグナシー ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性に及ぼす、カルシウムイオンの添加の影響を示すグラフである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１： β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産する微生物のスクリーニングと菌株の同定
（１）スクリーニング
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を粗酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株を得た。
シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、14ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ 約２０，０００ｃｐｍを含む。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクト−ス（１．２５μｍｏｌ）、ＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように添加し、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は２５℃で１０分間から１８０分間程度行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ4 3‐ フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクト−スに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
次に、シアル酸の結合様式を明らかにするために、ＰＡ−ラクトースを基質とする反応を行った。得られた粗酵素液を用い、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を用い分析した。５μｌの粗酵素液に１．５μｌの５ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよび１．５μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ糖受容体基質を加え、２５℃下で１８時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。ＨＰＬＣシステムとしてＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ１０Ａ（島津製作所製）を用い、分析カラムにはＴａｋａｒａ ＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｒ（タカラバイオ製）を用いた。０．１５％ Ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．０）で平衡化したカラムに７２μｌの溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を加えた反応液を注入した。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、３０〜５０％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜２０分）および１００％溶出液Ｂ（２１〜３５分）により、順次ピリジルアミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：蛍光（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４００ｎｍ））。その結果、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなった（図１−１ないし図１−５）。
（２）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析によるＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株の細菌学的同定
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はフォトバクテリウム・レイオグナシー（Photobacterium leiognathi）基準株ＡＴＣＣ２５５２１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．８％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株はビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物で、フォトバクテリウム・レイオグナシーに属すると同定した。
実施例２：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列決定、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログの存在の確認
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなったＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株において、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（Yamamoto et al. (1996) J Biochem 120: 104-110）、またはＪＴ−ＩＳＨ−２２４株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７）由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０４９９３）のホモログが存在するかどうかを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株の菌体ペレット約０．７５ｇから、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ５００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。次に、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株のゲノムＤＮＡ数μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨ I、Ｘｈｏ Iでそれぞれ消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分画した。泳動後、ゲルを０．４Ｍ ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングに供試し、ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）に転写した。このフィルターに関して、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｅ１７０２８）の部分断片（ＡＴＧからＨｉｎｄＩＩＩまでの約１．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片）、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（Ｎ１Ｃ０クローン、ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０４９９３）をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験はECL direct labeling & detection system（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブをラベリングした。ハイブリダイゼーションは、キット中のハイブリダイゼーション バッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃（通常４２℃）で４時間行った。洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５０℃（通常５５℃）で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を１回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。その結果、ＪＴ０１６０株由来のプローブを用いた場合、ＥｃｏＲＩ消化で約５．５ｋｂのバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で約４．８ｋｂのバンドが、そしてＢａｍＨ I消化で４．８ｋｂのバンドが検出された。また、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来のプローブを用いた場合は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化とＢａｍＨ I消化で約４．８ｋｂのバンドが検出された。さらに、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩでそれぞれで消化し、同様にハイブリダイゼーションを行った。その結果、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子の両プローブにおいて、ＰｓｔＩ消化で約１．６ｋｂのバンドが、ＨｉｎｃＩＩ消化で約１．３ｋｂのバンドが検出された。これらより、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株には、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモログが存在することが明らかとなった。
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログを含むゲノム断片のサブクローニング
上記より、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモローグの全長を含み、かつプラスミドベクターへの導入が容易であると考えられた１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８へ挿入し、コロニーハイグリダイゼーションによりスクリーニングを行った。
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株のゲノムＤＮＡを再度ＰｓｔＩで消化し、ＴＡＥ緩衝液中で低融点アガロース（SeaPlaqueGTG）を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。次に１．６ｋｂ付近のＤＮＡ断片を含む部分のゲルを切り出し、このゲルと等量（ｖ／ｗ）の２００ｍＭ ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、さらにエタノール沈殿によって１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。この断片をライゲーションキット（Takara社製）を用いて、あらかじめ脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部位にライゲーションした。ライゲーション反応後、ＤＮＡをエレクトロポレーションによって大腸菌ＴＢ１に形質転換し、１００(ｇ／ｍＬ アンピシリン、およびＸ−ｇａｌ (５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＡ寒天培地で培養した。DNA断片が挿入されたと考えられた白色コロニー４００個を上記抗生物質入りの別のＬＡ寒天培地に接種した。コロニーが形成されたプレートの表面にＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）を接触させ、コロニーをメンブレンに転写した。その後、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理によってＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。このメンブレンに対し、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、４つのコロニーにシグナルが検出された。なお、プローブのラベリング、ハイブリダイゼーション条件は、ECL systemによる上記と同様の方法で行った。
これらのコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドを抽出し、制限酵素分析により、１．６ｋｂ断片の挿入を確認した。
（３）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログの全塩基配列の決定
上記でインサートＤＮＡが確認されたプラスミドの一つに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片の両端の塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ配列を、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、アミノ酸配列に翻訳し、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索を行った。その結果、片方のＤＮＡ配列から翻訳されたアミノ酸配列が、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列と有意な相同性を示した。相同性を示した領域の方向性から、１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片の中には完全なＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログが含まれることが示唆された。
次に、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来同酵素遺伝子ホモログのＤＮＡ配列を完全に決定するため、１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、２種のプライマー：
ＳＨＩＺ１４５ ２６ Ｎ１ (５’−ＧＣＣＡＴＣＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＡＡＴＧ−３’（２２ｍｅｒ）：配列番号５)
ＳＨＩＺ１４５ ２６ Ｎ２（５’−ＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＣＧＣ−３’（２２ｍｅｒ）：配列番号６)
を合成し、塩基配列決定に用いた。
これらのプライマーを用いて、塩基配列を決定した結果、配列表の配列番号１の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのＯＲＦは、１４９４塩基対からなり、４９７個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７を用いてＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのＤＮＡ配列は、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と６８.２％の相同性を有していた。またアミノ酸配列でも、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素（ＪＣ５８９８）と６６.３％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子に対して、塩基配列では６３．７％、そしてアミノ酸配列では５５．１％の相同性を示した。
（４）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログ発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするか否かを調べるため、同遺伝子ホモログの全長、およびＮ末端側のシグナルペプチドをコードする部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのコードするアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の１５アミノ酸がシグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例においてＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー対：
ＳＨＩＺ１４５ Ｎ０ ＢｓｐＨＩ（５’−ＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡ−３’（２９ｍｅｒ）：配列番号７）；および
ＳＨＩＺ１４５ Ｃ０ Ｈｉｎｄ（５’−ＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＴＣ−３’（３３ｍｅｒ）：配列番号８）；
さらに、シグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例においてＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー対：
ＳＨＩＺ１４５ Ｎ１ Ｐｃｉ（５’−ＴＡＴＡＣＡＴＧＴＧＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴＡＣＡＧ−３’（３０ ｍｅｒ）：配列番号９）；および
ＳＨＩＺ１４５ Ｃ０ Ｈｉｎｄ（５’−ＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＴＣ−３’（３３ｍｅｒ）：配列番号８）；
を設計、合成した。
１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片を含むプラスミドを鋳型に、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログを増幅した。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ ５００ｎｇ、１０× ＰｙｒｏＢｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ II ５μｌ、２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰ ４μｌ、プライマー 各５０ｐｍｏｌｅｓ、ＰｙｒｏＢｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Takara社製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００(ASTEK製)を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ２分を５回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．５ｋｂ、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．４５ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、ベクターｐＣＲ４ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition）に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。その結果、変異のないＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０（配列番号１）、およびＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０（配列番号３）がクローニングされたことを確認した。
塩基配列が確認されたＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０、ならびにＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０のクローンについて、制限酵素ＢｓｐＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０の場合）、または制限酵素ＰｃｉＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０の場合）で二重消化した後、上述と同様にＤＮＡ断片をゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化しゲル精製したものを、上記のように調製したＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０ならびにＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０のＤＮＡ断片とライゲーションキット（Takara社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に形質転換した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析を行い、ＤＮＡ断片の発現ベクターへの組み込みを確認し、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａ、ならびにＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａを完成した。
（５）発現誘導と活性測定
上記で得られた２種類の発現ベクターの内、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａを用いて、タンパク質発現誘導実験を行った。ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０クローン（配列番号３）が組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、Ａ600＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え発現誘導を開始し、３０℃でさらに一晩振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、４００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ ビストリス緩衝液（ｐＨ６.０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液としシアル酸転移活性の測定に供試した。方法は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）の記載に従った。具体的には、糖供与体基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、14ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ 約２０，０００ｃｐｍを含む。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、糖受容体基質である１２０ｍＭ ラクト−ス、さらに上記に記した方法で調製した粗酵素液５μｌを混和し、３０℃で３０分間反応させた。その後、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．９７ｍｌで反応を停止させ、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ4 3‐ フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。カラムの溶出液に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクト−スに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。２反復で測定を行ったところ、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０を含む大腸菌の粗酵素液中には、糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の14ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクト−スに転移する活性、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。具体的には、インサートが挿入されていないｐＴｒｃ９９Ａベクターを組み込んだ大腸菌から調製した破砕液を用いた場合（ネガティブコントロール）の放射活性が１５６ｃｐｍであったのに対し、ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを組み込んだ大腸菌から調製した破砕液を用いた場合の放射活性は、８３２６ｃｐｍであった。
以上のことから、クローン化したホモログは、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素（配列番号４）をコードする遺伝子（配列番号３）であることが明らかとなった。
Figure 2008108325
（６）β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性の確認
上記（５）のＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０２６）を用い、酵素反応を行った。その結果、実施例１と同様に、ＰＡ−６’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）が検出された。これらの結果から、フォトバクテリウム属 ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子がクローニングされ、かつ、大腸菌内で発現されたことが証明された。
実施例３：ＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１からのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の抽出、精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０クローン（配列番号３）が組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。
本培養は、以下の手順で実施した。１．５ｍｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）＋３００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧ（１．１９２ｇ／５ｍｌ）を添加した３００ｍｌ−ＬＢ培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、これを９本（合計２．７Ｌ）用意した。各々のフラスコに前培養液１２ｍｌを接種し、３０℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。
この菌体を、９９０ｍｌの０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１．６ｇ／２６ｍｌとし、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。
この粗酵素液を、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose HP（Amersham社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ７．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、予め０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）から０．３３６％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。
次に、この酵素活性を示す画分を、予め０．２Ｍの塩化ナトリウム及び０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲルろ過カラムSuperdex（Amersham社製）に供して、ゲルろ過を行い、シアル酸転移活性を示すタンパク質画分を回収した。
その後に、再度この酵素活性を示す画分を、ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ（Amersham社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ Bis-Tris緩衝液（ｐＨ７．０）から１Ｍ 塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させ酵素活性を有する画分を回収した。
酵素活性を示す画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約５０，０００の分子量を示した。
粗酵素液からのＳＨＩＺ１４５−Ｎ１Ｃ０クローンのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表２に示す。酵素活性は、実施例１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, 104-110(1996)に記載されている方法に準じて、測定した。また、タンパク質の定量はCoomassie Protein Assay Reagent（PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。
Figure 2008108325
実施例４：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性の至適ｐＨ、至適温度
実施例３で調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の至適ｐＨ、至適温度を調べた。
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４−５）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５−６）、ビス−トリスバッファー（ｐＨ６−７）、リン酸バッファー（ｐＨ６−９．５）、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７−９．５）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８−９）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９−１０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０−１１）をそれぞれ調製し、これらを用いて、３０℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。
その結果、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）は、図２−１に示すように、ｐＨ７．０〜９．５の範囲の至適ｐＨを有することが明らかとなった。また、リン酸バッファー中では特に高い活性を示し、ｐＨ８．０において、酵素活性が最大であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性はリン酸バッファーを用いた場合のｐＨ８．０における酵素活性を１とする相対活性で評価した。
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適温度
リン酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いて、１０℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。
その結果、図２−２に示すように、３０℃において、酵素活性が最大であった。なお、各温度における酵素活性は３０℃における酵素活性を１００とする相対活性で評価した。
実施例５：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の糖受容体基質特異性
実施例３で調製したＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の精製酵素を用いて、各種の単糖／二糖類を糖受容体基質として、シアル酸転移反応を行った。反応は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)に記載されている方法に従って行った。
糖受容体基質として用いた単糖は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Man−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の８種類を用いた。二糖類として、ラクト−ス（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）及びGal−β1,3−GalNAcの３種類を用いた。
その結果、今回糖受容体基質として用いた１１種類の単糖及び二糖の中では、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクト−ス、Ｎ−アセチルラクトサミン及びGal−β1,3−GalNAcにシアル酸が効率よく転移していることが明らかとなった（表３）。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラクトースに対するシアル酸転移活性を１００とした場合を示す。
Figure 2008108325
実施例６：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の糖タンパク質に対する受容体基質特異性の比較
糖受容体基質として、アシアロフェツイン、アシアロムチンを用いた。２ｍｇのアシアロフェツインまたはアシアロムチンを１ｍｌの２０ｍＭ Bis-tris緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させて、糖受容体基質溶液とした。糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを用いた。糖受容体基質溶液４０μｌ、糖供与体基質５μｌ、酵素溶液５μｌを混合して、３０℃、０．５時間インキュベートしてシアル酸転移反応を行った。反応終了後、反応溶液を０．１ Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−５０スーパーファイン（０．８ｘ１８．０ｃｍ）に供して、ゲルろ過を行った。糖タンパク質が含まれるゲルろ過の溶出液画分（２〜４ｍｌの画分）を集め、この画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定することで、糖受容体基質に転移したシアル酸の定量を行った。
その結果、いずれの糖受容体基質にもシアル酸が転移することが明らかとなった。
Figure 2008108325
実施例７：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性に対する各種イオンの影響
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性に対する錯イオンの効果
硝酸カリウム（ＫＮＯ3）水溶液、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3）水溶液、硫酸カリウム（Ｋ2ＳＯ4）水溶液、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）水溶液、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）水溶液、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）水溶液、および、リン酸カリウム（ＫＨ2ＰＯ4＋Ｋ2ＨＰＯ4（ＫＰＢと略す））水溶液を調整し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて、３０℃で、反応液中の陰イオン濃度をそれぞれ０．１Ｍに調整し、酵素活性を測定した。
その結果、図３に示すように、リン酸カリウム（ＫＰＢ）またはリン酸水素二ナトリウムを添加した場合に酵素活性は最大となった。また、リン酸イオンのみならず、硫酸イオン、硝酸イオンといった錯イオンを含む塩を添加した場合においても、無添加条件と比較して酵素活性が有意に高くなった。なお、各種溶液を添加した反応液における酵素活性は、無添加条件（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのみ）における酵素活性を１とする相対活性で評価した。
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性に対するＮａ + およびＫ + イオンの効果
硝酸カリウム（ＫＮＯ3）水溶液、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3）水溶液、硫酸カリウム（Ｋ2ＳＯ4）水溶液、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）水溶液、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）水溶液、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）水溶液、および、リン酸カリウム（ＫＨ2ＰＯ4＋Ｋ2ＨＰＯ4（ＫＰＢと略す））水溶液を調整し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて、３０℃で、反応液中の陰イオン濃度をそれぞれ０．１Ｍに調整し、酵素活性を測定した。
その結果、図３に示すように、リン酸カリウム（ＫＰＢ）またはリン酸水素二ナトリウムを添加した場合に酵素活性は最大となった。また、他のカリウム／ナトリウム水溶液を添加した場合においても、無添加条件と比較して酵素活性が有意に高くなった。なお、各種溶液を添加した反応液における酵素活性は、無添加条件（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのみ）における酵素活性を１とする相対活性で評価した。
（３）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性に対するＮａ + 、Ｋ + およびＬｉ + イオンの効果
塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）水溶液を調製し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて、３０℃で、反応液中の陽イオン濃度をそれぞれ０．１Ｍ、０．２Ｍまたは０．５Ｍに調整し、酵素活性を測定した。
その結果、図４に示すように、無添加条件と比較して酵素活性が有意に高くなった。なお、各種溶液を添加した反応液における酵素活性は、無添加条件（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのみ）における酵素活性を１とする相対活性で評価した。
（４）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性に及ぼすカルシウムイオンの影響
粗酵素液を用いて反応液中に塩化カルシウムおよび／またはＥＤＴＡを添加し、カルシウムイオンについては終濃度１０ｍＭ、ＥＤＴＡについては終濃度５０ｍＭとなるよう調整し、酵素活性を測定した。
その結果、図５に示すように、カルシウムイオン存在下での酵素活性は無添加条件と比較して著しく増加した。なお、反応系にカルシウムイオンと共にキレート剤であるＥＤＴＡを添加すると酵素活性はカルシウムイオン無添加条件とほぼ同じ程度を示した。
実施例８：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株以外のフォトバクテリウム・レイオグナシー菌株におけるシアル酸転移酵素活性の確認
フォトバクテリウム・レイオグナシー（Photobacterium leiognathi）基準株であるＮＣＩＭＢ２１９３（ＡＴＣＣ２５５２１）株、ならびに、フォトバクテリウム・レイオグナシー株ＮＣＩＭＢ１５１１（ＡＴＣＣ２５５８７）株およびＮＣＩＭＢ２１３４（ＡＴＣＣ３３４６９）株を、それぞれシー・ウォーター・イースト・ペプトン培地（イースト・エクストラクト３．０ｇ／ｌおよびペプトン５．０ｇ／ｌ）６ｍｌを用いて培養し、前述の実施例２−（５）の方法に従って粗酵素液を調製し、シアル酸転移酵素活性の測定に供試した。その結果、表５に示すように粗酵素液を含まないバッファーのみを含む場合（ネガティブコントロール）および粗酵素液を含む場合の放射活性はいずれも５００〜６００ｃｐｍであった。この結果は、当該技術分野において入手可能な複数のフォトバクテリウム・レイオグナシー株が、シアル酸転移酵素を持たない、または検出限界以下の極めて弱い酵素活性しか持たないことを示すものである。一方、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株は、フォトバクテリウム・レイオグナシー株でありながら高いシアル酸転移酵素活性を有する。
Figure 2008108325
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされている糖鎖の合成・生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発に利用することが可能である。

Claims (16)

  1. β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
    （ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
    （ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
    を含んでなる、前記単離されたタンパク質。
  2. β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
    （ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列；
    （ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列において、１またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
    （ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列；または、
    （ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
    を含んでなる核酸によってコードされる、前記単離されたタンパク質。
  3. フォトバクテリウム属に属する微生物由来である、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質。
  4. 反応至適ｐＨが、ｐＨ７〜ｐＨ９．５の範囲である、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質。
  5. β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
    （ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
    （ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−４９７、からなる群より選択されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
    を含んでなるタンパク質をコードする、前記単離された核酸。
  6. β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
    （ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列；
    （ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列において、１またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
    （ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列；または
    （ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１４９４、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
    を含んでなる、前記単離された核酸。
  7. 請求項５または６に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
  9. β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
    １）請求項５または６に記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
    ２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
    ３）培養した形質転換細胞またはその培養上清から、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
    ことを含んでなる、前記製造方法。
  10. シアル酸転移反応における、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の使用であって、リン酸バッファーを含む組成を有する反応液中で使用することを特徴とする、前記使用。
  11. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を一価金属イオンの存在下で行うことにより、当該一価金属イオンの非存在下と比較して当該反応の効率を高める方法。
  12. 一価金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオンまたはリチウムイオンである、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ホウ酸イオン、塩化物イオン、フッ化物イオンおよびそれらいずれかの組合せ、
    からなる群より選択される陰イオンの存在下で行うことにより、当該陰イオンの非存在下と比較して当該反応の効率を高める方法。
  14. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を、一価の金属イオンと、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ホウ酸イオン、塩化物イオン、およびフッ化物イオンからなる群より選択される陰イオンとの塩の存在下で行うことにより、当該塩の非存在下と比較して当該反応の効率を高める方法。
  15. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応をカルシウムイオンの存在下で行うことにより、カルシウムイオンの非存在下と比較して当該反応の効率を高める方法。
  16. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて糖転移反応を行うに際し、当該反応を、カルシウムイオンと、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ホウ酸イオン、塩化物イオン、およびフッ化物イオンからなる群より選択される陰イオンとの塩の存在下で行うことにより、当該塩の非存在下と比較して当該反応の効率を高める方法。
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