JPWO2008096745A1

JPWO2008096745A1 - 毛髪の形成方法及び生物材料

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Publication number: JPWO2008096745A1
Application number: JP2008557115A
Authority: JP
Inventors: 英浩小澤; 八巻　真理子; 真理子八巻; 浅島　誠; 誠浅島; 惠蝦名
Original assignee: Matsumoto Dental University
Current assignee: Matsumoto Dental University
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2028-02-05
Also published as: EP2119769A4; EP2119769B1; WO2008096745A1; US8158423B2; US20100304479A1; EP2119769A1; JP5249789B2

Abstract

哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップと、該胚様体をさらに培養するステップとを含む毛髪の形成方法であって、前記培養ステップは、前記胚様体を三次元マトリクスにて５乃至１２日間培養する、毛髪の形成方法が提供される。また、上記の毛髪の形成方法により得られる生物材料が提供される。さらに、上記の毛髪の形成方法を利用して得られる、医薬品等を評価するスクリーニング系の生物材料が提供される。

Description

本発明は、毛髪の形成方法及び生物材料に関する。

毛の再生、すなわち、育毛は、中高年層だけでなく、近頃では、若い層も大きな関心を寄せる問題であり、食事をはじめとする生活の欧米化が、若年層の毛髪喪失の理由として指摘されている。また、中高年層では社会の高齢化に伴い急速に関心が高まっている生活の質の向上（ＱＯＬ）の視点から、育毛が以前に増して大きな関心事となっている。日本における育毛剤の市場は、２００５年時点で３００億円だが、この市場規模は、今のところ入手可能な市販の育毛剤の効果が顕著でないために、潜在規模に比べて異常に小さくなっており、仮に、薬効が科学的に証明されるような確かな育毛剤が開発されれば、育毛剤の市場規模は２，０００億円に、世界では２兆円にも上ると見積もられている（器官再生研究と実現可能な医療的、経済的効果に関する調査（２００６年１０月）参照）。このように、確かな育毛剤の開発は、現在では、社会的要請ということができる。

現在市販されている育毛剤の効果が顕著でないという事実は、生きた動物を利用した評価方法しか存在せず、育毛効果を効率よく、かつ、網羅的に評価するための適切な評価系が存在しないという単純な理由によっている。すなわち、「試験管内で、育毛剤の効果を、網羅的かつ効率的に評価するスクリーニング系」が存在しないために、本来２，０００億円の国内市場が、３００億円市場に留まっている。一方、一般的な薬剤開発では、そのようなスクリーニング系を活用して、各製薬会社が、自社あるいは共同開発契約に準拠して、数万から数百万の薬物を高速度で評価するのが定法であり、その結果、効果と安全性に優れた薬剤が開発されている。ところが、育毛剤の開発は、そのような通常の薬剤開発の状態とまったくかけ離れている。今のところ、世界で最も信頼されているミノキシジル（和名リアップ）は、元来、循環器の治療薬として開発されたものだが、重篤な副作用のために、開発が中断された経緯を持つ。ところが、臨床治験の過程で、治験患者に有意に多毛現象が見つかり、元々の循環器治療薬でなく育毛剤として活用されたものである。ミノキシジルは偶然発見された育毛剤ながら、育毛効果が最も優れているが、それでもなお、ミノキシジルの育毛効果が必ずしも満足する水準にないことは、世の中の共通認識である。また、男性ホルモンの育毛阻害作用に着目して開発された育毛剤も市販されているが、その育毛効果は必ずしも高く評価されていない。これらの事実は、育毛剤の開発が非効率的になされていること、ならびに、通常の薬剤開発のような過程が可能となれば、より効果的で、かつ、安全性に優れた育毛剤が開発できることを意味している。

一方、白髪化は、黒色色素（メラノソーム）を産生するメラノサイトの老化によるメラノソームの産生機能が低下、あるいは、何らかの原因で、メラノサイトが産生した毛髪細胞にメラノソームを送り出す機能が低下、あるいは、毛髪細胞がメラノソ−ムを取得する機能が低下することが原因と考えられる。白髪化の原因が何であれ、現在のところ、白髪を元の色の毛髪に回復する方法は、世の中にまったく存在しない。育毛が、主として男性の重大な関心事であることと対照的に、白髪は、男性だけでなく、女性にとっても重大な関心事である。

また、毛髪育成の技術と関連して、防寒衣類の材料としての毛皮について言及する。古来、毛皮は、防寒衣類の材料として利用価値の高いものだが、最近の動物愛護の視点から、その利用に関して異議が唱えられてきている。そうは言いながらも、毛皮に代わる高機能の防寒衣類の材料は、現在まったく存在しない。そこで、動物を殺さずに、毛皮、つまり毛髪を産生する技術があれば、この問題を解決する糸口になる。
器官再生研究と実現可能な医療的、経済的効果に関する調査（２００６年１０月）

本発明の目的の一つは、新規な毛髪の形成方法を提供することである。

本発明の別の目的は、新規な生物材料を提供することである。

本発明の第一の態様は、哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップと、該胚様体をさらに培養するステップとを含む毛髪の形成方法であって、前記培養ステップは、前記胚様体を三次元マトリクスにて５乃至１２日間培養する、毛髪の形成方法である。

本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様である毛髪の形成方法により得られる生物材料である。

本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様である毛髪の形成方法を利用して得られる、医薬品等を評価するスクリーニング系の生物材料である。

本発明の第一の態様によれば、新規な毛髪の形成方法を提供することができる。

本発明の第二の又は第三の態様によれば、新規な生物材料を提供することができる。

マウス胎仔の下顎臼歯の歯胚を示す図である。マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞の特性評価を示す図であり、間葉系細胞の培養を示すものである。マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞の特性評価を示す図であり、培養の成長速度を示すものである。マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞の特性評価を示す図であり、マーカー蛋白質の発現を示すものである。本発明の実施形態の毛髪の形成法を説明する概略図である。試験管内で成長した黒色毛を示す図である。ＥＳ細胞を利用し、試験管内で黒色毛の形成を示す図である。ネズミ生体内での黒い毛髪の育成と毛包を示す顕微鏡像である。

本発明の実施形態は、毛髪の形成方法に関し、より詳細には、哺乳類の未分化細胞を培養して得た胚様体を、さらに担体を用いて培養することによる毛髪の形成法に関し、さらに、当該方法を利用する毛皮の産生及び育毛剤などの医薬品開発に関する。

したがって、本発明の実施形態は、哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製し、さらに、作製された胚様体を三次元培養することによって、新規な毛髪の形成方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明の実施形態は、当該方法を利用した毛皮の産生、医薬品等を評価するスクリーニング系生物材料の提供を目的とする。

本発明の実施形態に係る毛髪の形成方法は、哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップと、該胚様体をさらに培養するステップとよりなる毛髪の形成方法であって、前記培養ステップは、前記胚様体を三次元マトリクスにて５乃至１２日間培養することを特徴とする。

また、本発明の実施形態に係る毛髪の形成方法において、前記胚様体を培養する三次元マトリクスは、培養又は移植用の担体であり、特に、担体は、タイプＩコラーゲンスキャフォルドであることが好ましい。

また、前記未分化細胞はさらに、誘導因子を含む培養液で培養することが好ましく、特に、誘導因子は、インスリン成長因子１、繊維芽細胞成長因子２及びトランスフォーミング増殖因子β１のすべてを含むことが好ましい。

前記未分化細胞はさらに、ＥＳ細胞と混合して共に培養することが好ましい。

また哺乳類は、すべての哺乳類から選ばれる一種である。

また、本発明の実施形態は、上記に記載の毛髪の形成方法により得られる生物材料を提供し、特に、生物材料は動物の毛皮であることを特徴とする。

さらにまた、本発明の実施形態は、上記に記載の毛髪の形成方法により得られる生物材料により、育毛剤等の医薬品の評価に関するスクリーニング系生物材料として利用することを特徴とする。

本発明の実施形態によれば、哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製し、さらに、作製された胚様体を三次元培養することによって、新規な毛髪の形成方法を提供することができる。

また、本発明の実施形態は、本発明の実施形態の毛髪の形成方法によって産生した毛皮を提供できる。

また、本発明の実施形態の毛髪の形成方法を利用することによって得られる生物材料により、育毛剤等の評価に関するスクリーニング系生物材料を提供することができる。

さらには、本発明の実施形態の毛髪の形成方法によって作製した生物材料を頭皮に埋め込み、縫合して完全な毛髪の再生を行なうなど、生体の再生機能を活用する再生医療の手法が提供できる可能性がある。

次に、本発明の一つの好ましい実施形態について詳述して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明の一つの実施形態は、哺乳類において、多種多様な細胞や、組織に分化することができる、未分化細胞を用いて胚様体を作製し、さらに、作製された胚様体を三次元培養することによって、新規な毛髪の形成方法を導くことを特徴とする。

したがって、本発明の実施形態の毛髪の形成方法は、哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップ」と、さらに、「作製された胚様体を三次元マトリクスで培養するステップ」との組み合わせからなることを特徴とする。

以下、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照しながら、より詳細に説明する。

まず、本発明の実施形態で使用する未分化細胞について説明する。本発明の実施形態に係る未分化細胞は、ある細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に変身、すなわち分化する能力を有する細胞であり、また、変化を遂げる前の未分化の状態で長期間にわたって自らを複製、再生する能力も備えている細胞である。未分化細胞には階層性があり、より未分化な幹細胞は自己複製能力が高く、非常に広範な細胞系列に分化できるが、幹細胞も下位になるに従い自己複製能力は失われ、分化できる細胞系列が限定されてくる。ＥＳ細胞は受精卵に次いで上位に位置する未分化細胞である。哺乳類の臓器には、組織特異的な未分化細胞（すなわち、体性幹細胞、別名組織幹細胞）が存在する。体性幹細胞は固有の系列への分化能力を有するとともに、分裂した際自己と同じ能力を持った細胞を再生（自己複製）することにより、それぞれの組織を維持していると考えられている。つまり、胚からは胚性幹細胞、すなわちＥＳ細胞、成人からは体性幹細胞、胎仔からは胚生殖細胞を取り出すことができる。

特に、ＥＳ細胞は、ある一定の培養条件下で未分化な状態を保持しながら半永久的に自己複製し、生殖細胞系列を含むあらゆる種類の細胞に分化できる全能性、多分化能を有する細胞として知られている。

ＥＳ細胞は、受精した胚、つまり、受精卵が分化して胎仔に発展するまでの状態である胚の初期段階から採り出されるもので、身体のどのような細胞にも成長できる性質を有するため多能性幹細胞とも呼ばれている。ＥＳ細胞は、受精後５、６日目の胚盤胞の内層細胞（内部塊細胞）から採り出して培養され、人体から採り出される体性幹細胞と違って、培養によって実験室において無限に増殖させることができ、かつ、どのような細胞にも変化できる万能性を有することから、事故や病気によって機能を損なわれた細胞や組織、臓器などの取って代わるための各種細胞を作り出すことのできる“素材”として研究されている。理論上、ＥＳ細胞から分化させた細胞に遺伝子治療の技術を用いて免疫関係の遺伝子を入れ替えたり、患者の遺伝情報を持つ胚を作り、そこからＥＳ細胞を取り出して目的の細胞に誘導したりすることによって、拒絶反応を起こさずに臓器を移植する方法も考えられる。

一方、体性幹細胞とは、体の中にすでにかたちづくられた組織の中から採り出される分化する前の状態の細胞をいう。組織内には、その組織における特定の働きを担う、すでに分化を終えた細胞が多数存在しているが、中にはそうした特定の働きを持つ細胞へと分化する前の未分化細胞、すなわち幹細胞が混じって存在している。体性幹細胞は、自らと同じ細胞を複製し、製造する能力を持つとともに、分化によって、それが存在していた組織内のあらゆる個別細胞を作り出すことができる。

特定の組織に分化することがわかっているためにすでに多くの治療に活かされ、白血病などの治療に必要な骨髄移植に用いられる骨髄幹細胞などが代表的な例である。

したがって、上述したような機能を有する未分化細胞を用いることによって、本発明の実施形態を達成することが可能である。

本発明の好ましい実施態様では、上皮系細胞への分化制御機能を有するようになる１４日齢（ＥＤ１４）のマウス胎仔の歯胚間葉系細胞を用いた。しかし、使用する未分化細胞は歯胚間葉系細胞に限定されず、体性幹細胞、骨髄幹細胞などの多分化能を有する、すべての未分化細胞のいずれか一種を使用してよい。

本発明の好ましい実施態様では、１４日齢（ＥＤ１４）の白いマウス（ｄｄｙ）の胎仔１２匹分の下顎臼歯の歯胚を取り出し、Ｈａｎｋｓ液中で組織を十分に洗い、氷上で５時間ディスパーゼ酵素処理をした後、顕微鏡下で間葉系組織を分離した（図１において、実線の円で示す部分が歯胚全体を、点線の円で示す部分が間葉系細胞を、また、実線の楕円で示す部分が上皮系細胞を示す）。

１２，０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄した後、沈さを１０ｃｍφのプラスティックディッシュに移し１０％ＦＢＳ加α−ＭＥＭ培地（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ培地）で３７℃，５％ＣＯ_２下で１日間培養した。翌日、培地をＭＳＣＧＭ培地（Ｃｈａｍｂｒｅｘ社）に置換して、同様に３７℃，５％ＣＯ_２下で培養を行った（図２Ａ）。以後、コンフルエントグロース（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｇｒｏｗｔｈ）になる前に継代培養して安定化した間葉系細胞系列を作った。以下、この細胞系列をＭＤＵ１と呼ぶ。

この細胞系列は、２０日間の培養を過ぎた時点で一時的に分裂能力の低下が見られたが、３０日を越えた時点から再び活発に分裂を行なうようになり、以後、安定して継代培養できる細胞系列が得られた。培養細胞の成長速度は、１２０日程度を過ぎると安定し、その細胞は、およそ５０時間で１回分裂するようになる（図２Ｂ）。図２Ｃに示したように、ＭＤＵ１細胞株は、未分化マーカーのネスチンやＯｃｔ３／４を発現しているので、高度に未分化な性質を持っている。また、ビメンチン陽性で、且つ、ケラチン陰性であることから、上皮細胞を殆ど含まない間葉系細胞である。（注：図２Ｃは、ネスチン及びビメンチンは、細胞質に発現し、Ｏｃｔ３／４は、細胞核に発現しており、この細胞株は、未分化マーカーであるネスチン及びＯｃｔ３／４陽性であり、間葉系マーカーであるビメンチン陽性であることを示す。また、この細胞株は、上皮系マーカーであるケラチンが、細胞質に発現しておらず、陰性であることを示す。）
次いで、ＭＤＵ１細胞株を、プラスティックディッシュから、トリプシン−ＥＤＴＡ処理（ＧＩＢＣＯ）により剥がして回収して、プラスチックフィルターを通してバラバラにし、次いで、低接着性の９６ウェルのプラスティックプレート（Ｎｕｎｃ社）に播種して胚様体様構造（ｅｍｂｒｙｏｉｄｂｏｄｙ−ｌｉｋｅｓｐｈｅｒｅ）を作製した。作製した胚様体様構造をおよそ１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍに細断したコラーゲン担体（ＣｏｌｌａｇｅｎＳｐｏｎｇｅＨｏｎｅｙｃｏｍｂ^ＴＭ、株式会社高研：コラーゲンスキャフォルド（ｃｏｌｌａｇｅｎｓｃａｆｆｏｌｄ）、（ＣＳ））とともに５−１２日間培養した。細胞をすべてＣＳに接着するのに５日間かかり、１２日までに毛髪が産生しない場合は、３週間以上培養しても毛髪が産生しなかった。この結果、本発明の実施形態では、５−１２日間の培養が好適であることが認識できる。胚様体様構造を接着したＣＳの一部を、そのまま固定して、パラフィン包埋試料として観察した。残りの試料は、６週齢の成体マウス（ｄｄｙ）の頭蓋上皮下および背筋筋膜下に常套手段で移植して１５日後に取り出し光学顕微鏡で観察した。図３に以上に述べた本発明の実施形態のプロトコルを示す。

［毛髪形成の検証］
［試験管内での検証］
はじめに、試験管内で毛髪の形成状況を検証した（図４）。胚様体様構造を接着したＣＳ上に黒色毛が成長していた（典型的な例を矢印で示した）。すなわち、この培養系で、毛髪が形成できるだけでなく、メラノサイトも形成でき、さらに、メラノサイトが産生したメラノソームを含む毛髪が形成できることが確認された。ＭＤＵ１細胞株は、白ネズミ由来なので、この系でメラノサイトが新たに形成されたことが検証された。成長因子を含む培養液を使い、同様にしてＭＤＵ１細胞株を培養したところ、インスリン成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−１，ＩＧＦ−１；ＴＯＹＯＢＯ）、繊維芽細胞成長因子２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−２，ＦＧＦ−２；ＴＯＹＯＢＯ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−β１，ＴＧＦ−β１；ＴＯＹＯＢＯ）が有意に毛髪の成長を促進した。また、ＭＤＵ１細胞株を、単独でなく、マウス由来の胚性肝細胞（ＥＳ細胞）と混合して、同様に培養する（ここで、ＭＤＵ１とＥＳ細胞を混合した培養体をキメラ胚様体と呼ぶ）と、これも有意に毛髪の成長を促進した。さらに、ＭＤＵ１細胞株及び上記キメラ胚様体ではなく、胚性肝細胞（ＥＳ細胞）単体で、上述した実施例と同様に培養あるいは、誘導因子を含めずに同様に培養しても毛髪を形成したことが確認された（図５）。

また、胚性肝細胞（ＥＳ細胞）単体で、全過程を、１０％血清（ＦＣＳ）を加えた培地で培養（ただし、誘導因子は含めない）すると、毛髪の誘導効率が約１０％から約１５％に上昇することが確認された。

［生体内での検証］
次に、培養したキメラ胚様体を吸着したコラーゲン担体をマウスの頭蓋上皮下及び背筋筋膜下に常套手段で移植して１５日後に取り出し光学顕微鏡で観察した。この結果、マウスの生体内で毛髪が形成されることを検証した（図６）。ここで形成された毛髪は、試験管内で形成された毛髪と同じく黒い毛髪だった。また、毛髪を産生する器官である毛包もまた、頻繁に見出され、確かに、この方法で、毛髪が新しく形成されたことが検証された。

なお、本実施例では、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞から胚様体を作製し、さらに三次元培養することで、毛髪を形成することができたが、本発明の実施形態はマウスに限定したものではなく、哺乳類一般に対して実施可能であり、ヒトを含めた哺乳類の毛髪の再生に適用可能である。また、本発明の実施形態で使用する未分化細胞は、間葉系細胞に限ったものでなく、すべての未分化細胞が本発明の実施形態に対して適用可能である。さらにまた、本発明の実施形態の毛髪の形成方法を利用して得られる生物材料により、育毛剤等の医薬品の評価に関するスクリーニング系生物材料の提供をすることもできる。

以上本発明の好ましい実施形態及び実施例について詳述したが、本発明の実施形態はかかる特定の実施形態又は実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。

［付記］
付記（１）：哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップと、該胚様体をさらに培養するステップとよりなる毛髪の形成方法であって、前記培養ステップは、前記胚様体を三次元マトリクスにて５乃至１２日間培養することを特徴とする毛髪の形成方法。

付記（２）：前記胚様体を培養する三次元マトリクスは、培養又は移植用の担体であることを特徴とする付記（１）に記載の毛髪の形成方法。

付記（３）：前記担体は、タイプＩコラーゲンスキャフォルドであることを特徴とする付記（２）に記載の毛髪の形成方法。

付記（４）：前記未分化細胞はさらに、誘導因子を含む培養液で培養することを特徴とする付記（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の毛髪の形成方法。

付記（５）：前記誘導因子は、インスリン成長因子１、繊維芽細胞成長因子２及びトランスフォーミング増殖因子β１のすべてを含むことを特徴とする付記（４）に記載の毛髪の形成方法。

付記（６）：前記未分化細胞はさらに、ＥＳ細胞と混合して共に培養することを特徴とする付記（１）乃至（５）のいずれか一つに記載の毛髪の形成方法。

付記（７）：前記哺乳類は、すべての哺乳類から選ばれる一種であることを特徴とする付記（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の毛髪の形成方法。

付記（８）：付記（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の毛髪の形成方法により得られる生物材料。

付記（９）：前記生物材料は動物の毛皮であることを特徴とする付記（８）に記載の生物材料。

付記（１０）：付記（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の毛髪の形成方法を利用して得られる医薬品等を評価するスクリーニング系生物材料。

本願は、２００７年２月６日に出願された特願２００７−０２７３９０に基づく優先権の利益を主張するものであり、その内容の全体は、これにより参照によって組み込まれる。

本発明の実施形態により、これまでにない有効な育毛剤を開発することが可能となり、さらにまた、白髪を元の色素を持つ毛髪に回復できるような薬剤の開発が可能となる。加えて、本発明の実施形態により、動物を殺さずに毛皮を産生する技術の開発が可能となる。さらには、本発明の実施形態により作製された生物材料を頭皮に埋め込み完全な毛髪の再生を行なえる可能性を有する。このように、本発明の実施形態は、その市場規模と社会的関心の高さからみて、産業的利用価値が非常に高い。

Claims

哺乳類の未分化細胞を培養して胚様体を作製するステップと、該胚様体をさらに培養するステップとを含む毛髪の形成方法であって、
前記培養ステップは、前記胚様体を三次元マトリクスにて５乃至１２日間培養する、毛髪の形成方法。
前記胚様体を培養する三次元マトリクスは、培養又は移植用の担体である、請求項１に記載の毛髪の形成方法。
前記担体は、タイプＩコラーゲンスキャフォルドである、請求項２に記載の毛髪の形成方法。
前記未分化細胞は、さらに、誘導因子を含む培養液で培養する、請求項１に記載の毛髪の形成方法。
前記誘導因子は、インスリン成長因子１、繊維芽細胞成長因子２及びトランスフォーミング増殖因子β１のすべてを含む、請求項４に記載の毛髪の形成方法。
前記未分化細胞は、さらに、ＥＳ細胞と混合して共に培養する、請求項１に記載の毛髪の形成方法。
請求項１に記載の毛髪の形成方法により得られる生物材料。
前記生物材料は、動物の毛皮である、請求項７に記載の生物材料。
請求項１に記載の毛髪の形成方法を利用して得られる、医薬品等を評価するスクリーニング系の生物材料。