JPWO2008047880A1

JPWO2008047880A1 - 関節リウマチ治療薬

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Publication number: JPWO2008047880A1
Application number: JP2008539875A
Authority: JP
Inventors: 和雄遊道
Original assignee: St Marianna University School of Medicine
Current assignee: St Marianna University School of Medicine
Priority date: 2006-10-20
Filing date: 2007-10-18
Publication date: 2010-02-25
Also published as: US20100040599A1; WO2008047880A1; EP2087886A1; EP2087886B1; EP2087886A4; US8440893B2

Abstract

C60を滑膜線維芽細胞、浸潤リンパ球およびマクロファージに添加し、炎症性サイトカイン産生量を測定したところ、いずれの細胞においても炎症性サイトカイン産生量が有意に抑制された。また、破骨細胞分化誘導因子存在下の破骨前駆細胞にC60を添加して培養したところ、一定以上の濃度のC60によって、破骨細胞への分化が抑制された。骨吸収へのC60添加の影響を観察したところ、破骨細胞による骨吸収をC60が抑制することが確認された。さらに、関節炎モデル動物を用い、C60が破骨細胞による骨吸収および骨破壊並びに炎症症状を抑制することをin vivoで確認した。破骨細胞分化抑制作用、骨吸収抑制作用および炎症性サイトカイン抑制作用により、C60は関節リウマチ等の関節炎疾患治療に有効である。

Description

本発明はフラーレンの新規用途に関し、特に、フラーレンを有効成分として含有する、関節リウマチ新規治療薬に関する。

関節リウマチは、滑膜を炎症の主座とする慢性炎症性疾患である。炎症が進展すると骨破壊が起こり骨や軟骨に変形や損傷をきたすが、時に、滑膜や骨関節組織ばかりでなく全身性の炎症を伴う消耗性疾患として様々な臓器・組織に障害をもたらし、生命予後に関わる重篤な症状を呈することさえある。

関節リウマチは多くの要素が複雑に絡み合って発症すると考えられ、その発症メカニズムは十分に解明されてはいない。しかし臨床の所見として、滑膜が血管新生を伴い絨毛様に増生することや、滑膜組織内において、様々な炎症性サイトカンや増殖因子を産生する炎症細胞（リンパ球、マクロファージ）の浸潤が観察される。これらのことから、関節リウマチにおける様々な関節炎症状は、滑膜内の浸潤炎症細胞の活性化が密接に関与して惹起されると考えられている。また、関節リウマチ患者の骨関節組織においては、絨毛様に増殖した滑膜が、骨組織を中心に関節組織を侵食破壊する像が観察されることから、滑膜の絨毛様増殖は、炎症に伴う傍関節性骨粗鬆症や関節機能（支持性、可動性、無痛性）損傷の、直接的な原因と考えられている。

本邦において、関節炎、特に関節リウマチ患者は70万人強に上るといわれている。関節リウマチは30〜40歳代から発症し、中高年にかけて漸次進行増悪をみることから、日常生活への影響も大きい。このため、国内外において精力的な抗リウマチ薬の研究開発が行われてきた。近年は、炎症性サイトカインをターゲットとする抗サイトカイン療法が注目され、インフリキシマブ（Infliximab）、エタネルセプト（Etanercept）、アナキンラ（Anakinnra）、Atlizumabといった、有効な抗リウマチ作用を有する新しい生物製剤が開発されている。

しかし、優れた抗リウマチ薬といえども全ての患者に有効ではなく、各種の抗リウマチ薬には、必ず応答者（responder）と非応答者（non-responder）が存在する。また、応答者においても、薬剤の長期投与により薬効が減弱する耐性効果がみられ、薬剤増量や他の薬剤への変更を迫られることも多い。また、患者の合併症や既往症によっては、抗リウマチ薬の投与が制約される場合も少なくない。既存の抗リウマチ薬では応答しない患者や、合併症のため抗リウマチ薬を投与できない症例を救済するために、依然として、新規の抗リウマチ薬開発には高いニーズがある。

関節リウマチが進行するにしたがい、骨破壊が生じる。骨破壊は、破骨細胞によって行われる。破骨細胞は骨髄単球・マクロファージ系の前駆細胞から分化し、その分化誘導にはRANKL （receptor activator of NF-κB ligand）-RANKシグナルが深く関与することが知られている。RANKLは、当初は樹状細胞活性化因子として報告されたが、その後、破骨細胞形成指示細胞に発現する破骨細胞分化因子ODF (osteoclast differentiation factor)と同一であることが明らかになった。RANKLはTNFリガンドファミリーに属するII型膜貫通型タンパク質であるが、膜型がメタロプロテアーゼによって切断されることにより可溶型としても産生される。膜型RANKL、可溶型RANKLともにホモ三量体として存在し、RANK（receptor activator of NF-κB）に対しアゴニストとして作用する。RANKLは、IL-1、IL-6、TNF-α等によって誘導され、骨芽細胞、滑膜線維芽細胞、活性化T細胞、等に発現する。RANKLの受容体であるRANKは、樹上細胞、破骨前駆細胞等に発現するI型膜タンパク質であり、その細胞内領域にTraf1, 2, 3, 5,および6との結合部位を有する。RANKLが破骨前駆細胞上のRANKと結合すると、RANKL-RANKシグナルがその下流のTraf6、NF-κB、JNK、p38等へ伝達され、破骨細胞の分化が誘導される。最近になって、RANKLシグナルによる破骨細胞分化において、活性酸素種（reactive oxygen species、ROS）が重要な役割を果たすことが、相次いで報告された（非特許文献1-4）。

また、関節リウマチの病因にはマクロファージが主に産生する炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-１、IL-6等）が密接に関わるが、活性酸素種は、そのマクロファージ活性化を誘導する役割を担うリンパ球の活性化に関与する（非特許文献5）。さらに、TNF-α、IL-１、IL-6等の刺激に伴い、細胞内における活性酸素種の産生が増加し、かつ、細胞内シグナル伝達経路（NFkB, P38, PI-3kinase）のメッセンジャーとして活性酸素種が重要な役割を担うことが知られている（非特許文献6-7)。

ところが一方、過剰に産生される高濃度の活性酸素種は、細胞障害性や細胞死を誘導する。このことは、過剰な活性酸素種を消去することは、細胞活性低下の抑制、細胞老化および細胞死の抑制、ならびに細胞寿命の延長に繋がることを意味する。すなわち、活性酸素消去により炎症性サイトカイン産生細胞の細胞死や細胞活性低下が抑制された場合には、その結果として細胞活性（サイトカイン産生誘導、破骨細胞分化成熟）が上昇し、結果として、リウマチ性疾患の憎悪につながる可能性がある。実際、細胞内の活性酸素の上昇がp38 kinaseを介する細胞情報経路を介して造血幹細胞の細胞老化、細胞活性低下を引き起こすことが報告されている（非特許文献８）。この知見は、活性酸素種の消去が老化抑制および細胞活性化を導く可能性を示唆するものと考えられる。

このように、活性酸素は、細胞内情報伝達に深くかかわっており、細胞にとって正負両面の作用を持ちながら生命活動を制御しているものと考えられる。活性酸素の相反する作用のうち、どちらが優位となるかは、その作用を受ける細胞個々の特性や環境に左右されると考えられ、一概には考えられない。

ところで、フラーレンにはフリーラジカルの捕捉・消去能力があることが知られている（非特許文献9-10）。
Ha H. et al. Exp Cell Res. 2004 Dec 10; 301(2): 119-27 Lee JM et al. Blood. 2005 Aug 1;106(3):852-9 Lean JM et al. Endocrinology. 2005;146:728-35 Yip KH et al. J Bone Miner Res. 2005 20(8): 1462-71 Williams MS and Kwon J. Free Radical Biology & Medicine. 2004; 1144-1151. Bonizzi G et al. Mol. Cell. Biol. 1999 Mar; 19(3): 1950-60 Droge W. Physiol. Rev. 2002 Jan; 82(1): 47-95 Ito K et al. Nature medicine, 12(4), 446-451 Li C, et al., Org Biomol Chem. 2004 Dec 7;2(23):3464-9. Mirkov SM, et al., Nitric Oxide. 2004 Sep;11(2):201-7.

本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、関節リウマチ等の、関節炎を伴う疾患の治療および／または予防用の新規医薬品を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意努力した。本発明者はフラーレン類がフリーラジカルの捕捉・消去能力を持つ点に着目し、関節リウマチ等の治療薬として利用することを考えついた。上述のとおり、活性酸素種の生体への作用は非常に複雑であり、関節リウマチ等の関節炎を伴う疾患に対しては、活性酸素種は両刃の作用を有すると考えられる。また、フラーレンを関節炎等の治療に使用した報告はこれまで全くない。したがって、フラーレン投与が関節リウマチに有効か否かは全く予想がつかないのであるが、それにもかかわらず、本発明者はフラーレンによる関節リウマチ治療の可能性を検討した。まず、関節炎は関節内の滑膜を主座とする炎症性疾患であることから、滑膜線維芽細胞、浸潤リンパ球およびマクロファージに対するC60の直接作用を検討した。C60を滑膜線維芽細胞、浸潤リンパ球およびマクロファージに添加し、該細胞における炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-1β）の産生量を測定したところ、いずれの細胞においても炎症性サイトカイン産生量が有意に抑制され、C60による炎症性サイトカイン産生抑制効果が確認された。次に、関節リウマチの主症状の一つである骨破壊をC60で治療または予防する可能性を探るため、破骨細胞分化ならびに破骨細胞による骨吸収に対する、C60の影響を検討した。破骨細胞分化誘導因子存在下の破骨前駆細胞にC60を添加して培養したところ、一定以上の濃度のC60によって、破骨細胞への分化が抑制されることが確認された。さらに、骨吸収へのC60添加の影響を観察したところ、破骨細胞による骨吸収をC60が抑制することが確認された。これまでの知見からは、フラーレン類が骨破壊や炎症性サイトカイン産生に対し与える影響として、増悪と改善の両方が予想され、具体的にどちらの影響を与えるのかは全く予想がつかなかったのであるが、上記検討により、フラーレン類が破骨細胞分化抑制作用、骨吸収抑制作用を有し、骨破壊の予防および治療に有用であることが直接かつ具体的に証明された。さらに、C60の抗酸化作用、炎症性サイトカイン産生抑制能、破骨細胞分化抑制能を他の活性酸素消去剤と比較したところ、フラーレン類の抗酸化作用、炎症性サイトカイン産生抑制能、破骨細胞分化抑制能は、他の活性酸素消去剤と比較して極めて強いことが明らかになった。したがって、フラーレン類を関節に到達可能に投与すれば、滑膜組織（滑膜線維芽細胞、浸潤リンパ球）に炎症性サイトカイン抑制作用を及ぼすことにより、関節リウマチをはじめとする関節炎疾患治療に有効な結果が得られると考えられる。また、C60は破骨細胞分化抑制効果および骨吸収抑制効果を有することから、フラーレン類は、破骨細胞が関与する疾患である、骨粗鬆症に対しても有効であると考えられる。すなわち、本発明はフラーレンを利用した新規医薬品に関し、より具体的には下記の発明を提供するものである。
（１）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の治療および／または予防用医薬品、
（２）関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患が、骨破壊を伴う疾患である、上記（１）に記載の医薬品、
（３）活性酸素消去能を有する物質を含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症における骨破壊の治療および／または予防用医薬品、
（４）活性酸素消去能を有する物質を含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症における炎症の治療および／または予防用医薬品、
（５）活性酸素消去能を有する物質がフラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つである、上記（１）から（４）のいずれかに記載の医薬品、
（６）関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患が、悪性関節リウマチ、フェルティ症候群、カプラン症候群からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である、上記（１）から（５）のいずれかに記載の医薬品、
（７）関節炎を伴う自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、オーバーラップ症候群からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である、上記（１）から（６）のいずれかに記載の医薬品、
（８）フラーレンがC60である、上記（１）から（７）のいずれかに記載の医薬品、
（９）注射剤である、上記（１）から（８）のいずれかに記載の医薬品、
（１０）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、破骨細胞分化抑制剤、
（１１）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、骨吸収抑制剤、
（１２）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、炎症性サイトカイン産生抑制剤、
（１３）炎症性サイトカインが、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-17からなる群より選択される少なくとも一つを含む、上記（１２）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤、
（１４）上記（１０）に記載の破骨細胞分化抑制剤、上記（１１）に記載の骨吸収抑制剤、または上記（１２）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤のいずれかを含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の治療および／または予防用医薬品、
（１５）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、関節炎を呈する疾患の治療および／または予防方法、
（１６）関節炎を呈する疾患が、関節リウマチ、関節リウマチ類縁疾患、自己免疫疾患、骨粗鬆症のいずれかである、上記（１５）記載の方法、
（１７）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、破骨細胞分化を抑制する方法、
（１８）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、骨吸収を抑制する方法、
（１９）フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、炎症性サイトカイン産生を抑制する方法、
（２０）関節炎治療および／または予防用医薬品の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用、
（２１）破骨細胞分化抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用、
（２２）骨吸収抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用、
（２３）炎症性サイトカイン産生抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用。

破骨細胞と破骨細胞成熟に関与する因子の関係を示した図である。滑膜線維芽細胞（n=6）、リンパ球（n=4）、マクロファージ（n=4）にC60を0.1, 1.0, 10.0 μMで添加したときの、各細胞によるTNF-α産生濃度を示すグラフである。滑膜線維芽細胞（n=6）、リンパ球（n=4）、マクロファージ（n=4）にC60を0.1, 1.0, 10.0 μMで添加したときの、各細胞によるIL-1β産生濃度を示すグラフである。 A:破骨細胞分化に対するC60の影響を評価した図である。 B:C60による骨吸収抑制効果を評価したグラフである。 TRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色し、C60無添加での破骨細胞分化を観察した写真である。 TRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色し、C60濃度：0.1μMでの破骨細胞分化を観察した写真である。 TRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色し、C60濃度：1.0μMでの破骨細胞分化を観察した写真である。 TRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色し、C60濃度：10μMでの破骨細胞分化を観察した写真である。破骨細胞による骨吸収像をヘマトキシリン染色によって観察した写真である。各種活性酸素消去剤の抗酸化能を比較したグラフである。関節炎モデルにC60またはコントロールを投与した時の、関節炎スコアの経時的推移を示すグラフである。◆はコントロール投与群、■はC60投与群のスコアを示す。関節炎モデルにC60またはコントロールを投与した時の、病理組織スコアの経時的推移を示すグラフである。◆はコントロール投与群、■はC60投与群のスコアを示す。アジュバント関節炎モデルの関節組織標本の写真である。左写真は関節炎誘導前（免疫前）、右写真は免疫後４週目。関節炎誘導前の関節では、関節軟骨は正常であり、滑膜増殖および炎症細胞浸潤は認められない。免疫後４週目では、関節軟骨面不整が認められる。滑膜は増殖し、骨への侵食（破骨細胞活性化）が始まっている。炎症細胞の浸潤も認められる。アジュバント関節炎モデルの関節組織標本の写真である（関節炎誘導前、免疫後４週目）。関節炎誘導前では（３個体）、いずれにおいても関節軟骨は正常、滑膜増殖および炎症細胞浸潤は認められない。免疫後４週目では、コントロール群（溶媒投与群）ではいずれの個体においても炎症細胞浸潤が認められる。一方、C60投与群では、炎症細胞浸潤は殆ど認められないか、あるいはコントロール群に比べ軽度である。アジュバント関節炎モデルの関節組織標本の写真である（免疫後６週目）。コントロール群３個体（左列）は、いずれも炎症細胞の浸潤が認められる。また２個体において、破骨細胞による骨吸収が認められる（左列、中および下段）。C60投与群３個体（右列）でも、炎症細胞の浸潤が認められるものの、コントロール投与群に比べ軽度である。アジュバント関節炎モデルの関節組織標本の写真である（免疫後８週目）。コントロール群２個体では、炎症細胞浸潤、著しい関節破壊、軟骨面消失が認められる（左列、上および中段）。また１個体は、著しい関節破壊、軟骨面消失のほか、骨性強直が認められ、リウマチ関節破壊の最終形態を示している（左列、下段）。一方、C60投与群では、１個体において著しい関節破壊が観察されるものの、軟骨は一部が残存している（右列、下段）

本発明は、第一の態様として、フラーレン、包接化フラーレン、フラーレン誘導体およびその塩（以下、本明細書において「フラーレン類」とも称す。）を利用した関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の治療および／または予防用医薬品を提供する。本発明者らは、関節炎に関連する細胞における炎症性サイトカイン産生が、フラーレン投与によって抑制されることを確認した。また本発明者等は、フラーレンが前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制し、破骨細胞による骨吸収も抑制することを確認した。さらに本発明者等は、関節炎モデル動物を用い、関節炎における炎症および骨吸収・骨破壊をフラーレンが実際に抑制することを、in vivoで確認した。したがってフラーレン類は、炎症および骨破壊を伴う疾患の治療および予防薬として利用できる。

フラーレンは、一般的に、20個以上の炭素原子がそれぞれ隣接する三原子と結合している閉じた擬球構造を持つ分子であり、炭素原子数として、60, 70, 76, 78などが知られている。本発明では活性酸素を除去し得る活性を有する限り、これらC60、C70などのフラーレンのいずれでも好適に使用できる。また、ヘテロフラーレン、ノルフラーレン、ホモフラーレン、セコフラーレン、化学修飾フラーレン、フラーレンポリマー等のフラーレン誘導体や、これらの塩も、上記活性または作用を有する限り、好適に使用できる。化学的な修飾としては、水素化、フラーレンへの置換基の付加が挙げられる。フラーレンに付加し得る置換基としては、例えば、水酸基などを挙げることができるが、フラーレンの活性酸素除去能を保持し、細胞毒性が低く維持し得るものであれば特に限定はない。また付加する置換基の炭素に対する割合は、活性酸素の除去能、細胞毒性への影響を考慮して適宜調整することができる。置換基による修飾の他にも、フラーレンの細胞や組織への適合性を向上させるため親水性高分子などにより修飾してもよい。このような親水性高分子としてはポリエチレングリコール、ヒアルロン酸などを挙げることができる。

フラーレンは通常、疎水性であり、水に難溶である。そこで本発明の薬剤にフラーレンを用いる際は、製剤化の便宜などの目的で、フラーレンを親水性にして（水溶化）使用しても良い。フラーレンを水溶化する手段としては、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基といった、親水性置換基付加を挙げることができる。好適に用いることができる親水性フラーレンの例として、水酸化フラーレンを挙げることができ、市販されている水酸化フラーレンの具体例として、フロンティアカーボン(株)社製「ナノムスペクトラ」を挙げることができる。

また、フラーレンを水溶化する別の手段として、水溶性高分子（例えば、ポリビニルピロリドン（PVP))で包接する方法や、水溶性の大環状化合物（例えば、シクロデキストリン）で包接する方法を挙げることができる。このような包接化されたフラーレン（包接化フラーレン）は、本発明の薬剤に好適に用いられる「フラーレン類」の一つである。

なお、フラーレン類の細胞毒性は、例えば、水溶性テトラゾリウム塩を用いたＸＴＴ法などによって評価することができる。また、修飾等を施したフラーレン類の活性酸素除去能の測定は、フラーレン類の抗酸化能を測定する際の方法、一例をあげれば銅イオンの還元力を指標とした方法（Schitt AA., Pergamon Press, London, Newwork、Paris, 1966、Yamashita N et al., Alpha-tocopherol induces oxidative damage to DNA in the presence of copper (II) ions. Chemical Res. Toxicl. 11: 855-862, 1998）などを利用することができる。具体的には、Cu²⁺イオンとフラーレン類と接触させ、Cu²⁺からCu⁺への還元反応を阻害できるか（銅イオン還元力）を指標として評価することができる。その他にも、活性酸素（過酸化水素）が抗酸化物質（Ｙ）と反応するときに発生する微弱発光を利用した抗酸化能評価法（活性酸素消去微弱発光分析）や、スーパーオキサイド消去活性（SOD 様活性）分析法、などによりフラーレン類の活性酸素除去能を測定してもよい。

本発明のフラーレン類は、関節炎や骨破壊を呈する疾患に有効である。このような関節炎や骨破壊を呈する疾患の代表例として、「関節リウマチ」を挙げることができる。慢性関節リウマチという疾患名は、日本リウマチ学会において「関節リウマチ」に表記が統一されている。したがって、慢性関節リウマチは、本発明における「関節リウマチ」に含まれる。また関節リウマチには、幾つかの類縁する疾患が知られており、例えば、悪性関節リウマチは、関節炎のほか、血管炎や重篤な多臓器症状を呈する疾患である。フェルティ症候群は、関節炎以外に、脾臓腫大や白血球減少症を呈する疾患である。カプラン症候群は、関節炎のほかに塵肺症を伴う疾患である。上述のとおり、本発明のフラーレン類は関節炎に関連する細胞からの炎症性サイトカイン発生を抑制することが確認されており、これらの「関節リウマチ類縁疾患」も、関節炎を伴う点で、本発明のフラーレン類によって有効に治療または予防することができる。また、自己免疫疾患の中には関節炎を伴うものが知られており、このような関節炎を伴う自己免疫疾患に対しても本発明のフラーレン類による治療または予防が期待できる。本発明のフラーレン類によって治療または予防が期待できる「関節炎を伴う自己免疫疾患」の具体例として、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、オーバーラップ症候群を挙げることができるが、本発明のフラーレン類を適応可能な自己免疫疾患はこれらに限定されることはなく、関節炎を伴う限り、本発明のフラーレン類によって治療可能な自己免疫疾患である。

また本発明のフラーレン類は、破骨細胞の分化および破骨細胞による骨吸収を抑制することがin vitroおよびin vivoの両方で確認されており、骨破壊を伴う疾患であれば、いずれの疾患であっても有効に治療または予防できると考えられる。骨破壊を伴う疾患としては、関節リウマチのほか、骨破壊を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症を挙げることができる。悪性関節リウマチ、フェルティ症候群、カプラン症候群は、骨破壊を伴う関節リウマチ類縁疾患の例である。また、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、オーバーラップ症候群は、骨破壊を伴うことが知られている疾患である。骨粗鬆症は、閉経や加齢による一次性骨粗鬆症と、副甲状腺機能亢進症，腎疾患，肝疾患，消化器疾患，糖尿病，卵巣摘出による人工閉経，ステロイド長期大量投与，関節リウマチ等の慢性炎症性疾患，骨軟化症，骨形成不全症などの原疾患に続発しておこる二次性骨粗鬆症とに大きく分けられるが、いずれの場合においても、破骨細胞による骨吸収が骨産生よりも優位となることによって骨量が減少する。本発明のフラーレン類は破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有するため、一次性または二次性を問わず、また二次性骨粗鬆症の場合はその原疾患を問わず、いずれの骨粗鬆症に対しても有効であると考えられる。

関節リウマチ患者では、全身性のステロイド性骨粗鬆症、疼痛による廃用性骨粗鬆症、局所性の傍関節性骨粗鬆症が多く観察される。傍関節性骨粗鬆症は、リウマチ罹患関節周囲に発症する骨粗鬆症である。傍関節性骨粗鬆症の成因は、関節から近傍における破骨細胞の活性化亢進と考えられ、関節炎に関連する炎症性サイトカインと、該炎症性サイトカインにより活性化亢進される破骨細胞分化とが、関節周囲の骨粗鬆症の誘因と考えられる。本発明のフラーレン類は、傍関節性骨粗鬆症に対し、直接的な破骨細胞分化抑制効果（RANK-RANKLシグナルメッセンジャーであるROSを除去することにより、RANK-RANKLシグナルを阻害し、破骨細胞分化を抑制する効果）と、炎症抑制効果による二次的な破骨細胞分化抑制効果（炎症性サイトカイン産生を抑制することにより、炎症性サイトカインによるRANK-RANKLシグナル増強を抑え、破骨細胞分化を二次的に抑える効果）との二重の効果を期待できる。したがって本発明のフラーレン類は、関節リウマチに続発する傍関節性骨粗鬆症に対し、特に有効であると考えられる。

また本発明は、第二の態様として、活性酸素消去能を有する物質を含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症における骨破壊の治療および／または予防用医薬品を提供する。本発明者等は、破骨細胞分化をフラーレンが有意に抑制することを確認したが、このフラーレンの破骨細胞分化抑制効果は、破骨前駆細胞が破骨細胞に分化する際に、RANKL-RANKシグナルのメディエーターであるROSをフラーレンが捕捉することによりRANKL-RANKシグナルを下方制御し、その結果として破骨細胞の分化を抑制するものと考えられる。したがって、フラーレンと同様に、活性酸素消去能を有する物質は、RANKL-RANKシグナルが関与する骨破壊を有効に抑制するものと考えられる。本発明のフラーレンによって治療または予防可能な骨破壊は、RANKL-RANKシグナルが関与する骨破壊である限り、特に制限はないが、例えば、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症おける骨破壊を挙げることができる。

本発明の活性酸素消去能を有する物質としては、活性酸素消去能を有する限り、特に種類は問わない。一般的に、活性酸素消去能を有する物質の例として、フラーレン類、ビタミンE、ビタミンA、カロチン、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、カタラーゼ、ポリフェノール類、グルタチオンペルオキシダーゼ等を挙げることができる。物質の活性酸素消去能は、上述した銅イオンの還元力を指標とした方法などによって知ることができる。本発明の活性酸素消去能を有する物質として、好ましくは、フラーレン類である。

フラーレンがTNF-αおよびIL-1βの産生量を抑制することが本発明者によって確認されたことから、本発明のフラーレン類は、炎症性サイトカイン産生抑制剤として利用できる。炎症性サイトカインとは、一般的に、生体内の炎症反応惹起に関与するサイトカインの総称であり、代表的な炎症性サイトカインとして、TNF-α、IL-1、IL-6などを挙げることができる。フラーレン類の炎症性サイトカイン産生抑制能の有無は、フラーレン類存在下で細胞を培養し、炎症性サイトカイン産生量をELISA法等の公知方法で測定することにより知ることができる。実施例で示したように、関節炎に関連する細胞の炎症性サイトカイン産生を抑制するフラーレン類は、炎症性サイトカインの産生量抑制を通じて、リウマチを始めとする各種関節炎の治療および予防に有効である。またTNF-α、IL-1、IL-6は骨吸収サイトカインとも呼ばれ、骨吸収を促進することが知られている。したがって、これら骨吸収サイトカインの産生を抑制するフラーレン類は、骨破壊の治療および予防に有効である。

上記のとおり、フラーレン類は、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の医薬品を製造するために使用することができる。上記医薬品を製造する場合、フラーレン類を適宜、適当な添加剤と混合し、各種工程を経て製剤化することができる。製剤化する際に使用する添加剤は、薬理学的に許容され得るものの中から目的に応じて選択することができる。「薬学的に許容され得る添加剤」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。フラーレン類を直接、または適当な溶媒に溶解した後、各種添加剤と混合し、造粒工程、分級工程、練合工程、成形工程、乾燥工程、打錠工程、充填工程、滅菌工程、無菌ろ過工程、等の、所望の剤形に応じた各種工程を経て、運動器疾患治療用医薬組成物とすることができる。本発明による医薬組成物の製剤形態は、患部に到達させ得る形態であれば経口薬剤（錠剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤など）、注射剤、貼布剤、リニメント剤、懸濁剤、乳剤あるいは軟膏等でもよいが、患部へ確実に到達させる手法として、患部へ直接注入する注射剤等とすることが好ましい。注射剤の場合には、例えば薬学的に許容され得る担体中にフラーレンを下記投与量となるように溶解、懸濁または乳濁させることにより製造することができる。注射剤に使用する担体としては、生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水の他、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）を使用することができる。注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって調製した無菌のフラーレン類を、使用前に無菌の担体に溶解して使用することができる。

また、本発明の医薬組成物の投与量は、患部の状態、サイズなどによって適宜決定することができるが、一患部あたり0.1μM〜1000μM、好ましくは、10μM〜200μM、さらに好ましくは10μM〜100μMとすることができる。投与量は、種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。

本発明の医薬品を投与する際は、他の医薬品と併用して投与してもよい。例えば、本発明の医薬品を用いて関節リウマチおよびその類縁疾患を治療する際に、疾患修飾性抗リウマチ薬（Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug, DMARD）と併用することができる。疾患修飾性抗リウマチ薬の例として、免疫調節薬（金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ペニシラミン、サラゾスルファピリジン、ブシラミン、ロべンザリット、アクタリット、等）、免疫抑制薬（メトトレキサート、レフルノミド、ミゾリビン、アザチオプリン、シクロフォスファミド、シクロスポリン、タクロリムス、等）、キメラ型TNFαモノクローナル抗体（インフリキシマブ）、可溶性TNFレセプター融合蛋白（エタネルセプト）、ヒト抗TNFαモノクローナル抗体（アダリムマブ）、IL-1レセプター拮抗薬、ヒト化抗IL-6レセプター抗体（MRA）を挙げることができるが、本発明の医薬品と併用することのできる医薬品はこれらにかぎられない。また、上記併用に加え、非ステロイド抗炎症剤（NSAID）などの、リウマチ疾患に適用される医薬品をさらに組み合わせて投与してもよい。本発明の医薬品を他の医薬品と併用する場合、それぞれ別の製剤としてもよいが、本発明のフラーレン類と他の医薬品とを一つの配合剤として製剤化してもよい。例えば、本発明のフラーレン類とDMARDを含んでなる、配合剤としてもよい。または、本発明のフラーレン類とDMARDとを含む、一つのキットとすることもできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

［実施例１］炎症細胞（滑膜線維芽細胞、浸潤リンパ球）活性化に対するC60の効果
関節炎は関節内の滑膜を主座とする炎症性疾患であることから、滑膜線維芽細胞および浸潤リンパ球に対するC60の直接作用を検討した。特に、C60の添加による、上記細胞からの炎症性サイトカイン産生への影響を検討した。

［実施例１−１］細胞の培養
培養細胞はヒト関節滑膜組織から分離した滑膜線維芽細胞と、健常者の血液から分離したリンパ球とマクロファージを用いた。

i) 滑膜線維芽細胞の調製
インフォームド-コンセントを得た後、関節リウマチ患者の手術組織から滑膜組織を採取した。該組織を細切したのち1.0 mg/ml collagenaseを含有する液体低グルコースDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco社製)培地内(37 ℃)で一晩処理し、培養滑膜線維芽細胞を分離した。通常、細胞は培養フラスコ（培養面積25 cm²）で培養し、実験に使用する際にはポリスチレン性培養皿（直径6 cm）で培養した。細胞培養はDMEM培地に非働化ウシ胎児血清(FBS、TRACE社製)を培地容量の10 %添加し、さらに2 mM L-グルタミン, 25 mM HEPES, 100 units/mlのペニシリンとストレプトマイシンを添加したものを使用し、37 ℃、飽湿下、5 % CO₂＋95% airに設定したCO₂インキュベーター（正常酸素濃度環境）で行った。細胞の継代はリン酸緩衝液(PBS、ニッスイ社製)液で洗浄後、0.25 %トリプシン-PBS液(Gibco社製)を用いて細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を分散させた後、培地で適当な濃度に希釈した。

ii) リンパ球、マクロファージの調製
インフォームド-コンセントを得た後、健常者から50 mlの採血を行い、1 ％ヘパリン加血を得た。この血液をリンパ球分離液に重層した遠心管を1500回転/分で30分間遠心し、リンパ球とマクロファージをそれぞれ分離した。細胞培養はRMPI培地に非働化ウシ胎児血清(FBS、TRACE社製)を培地容量の10 %添加し、さらに2 mM L-グルタミン, 25 mM HEPES, 100 units/mlのペニシリンとストレプトマイシンを添加したものを使用し、37 ℃、飽湿下、5 % CO₂＋95 % airに設定したCO₂インキュベーター（正常酸素濃度環境）で行った。

［実施例１−２］細胞増殖能
C60による滑膜線維芽細胞、リンパ球、マクロファージに対する生存率への影響を、XTT法により評価した。
C60 (クラウンフラーレン：フロンティアカーボン(株)社製)はPBSに溶解し、40 μMストックを調製し、暗所に-20℃で保管した。
C60の処理濃度は0.1 μM, 1.0 μM, 10.0 μMとし、薬物処理濃度は48時間および96時間とした。対数増殖期にある軟骨細胞を5.0 x 10⁵ 個/mlの濃度で50 μlずつ96穴マイクロプレートに添加し、CO₂インキュベーター（正常酸素濃度環境）で24時間培養した。C60を各目的濃度(最終容量100 μl)となるように96穴マイクロプレートに加えて、48時間または96時間培養後、培地交換を行い、さらに12時間培養した。XTT試薬を50 μlずつ加え、4時間培養後、直ちにプレートリーダーにて450 nMの吸光度を測定、細胞生存率を解析した。
上記検討の結果、滑膜線維芽細胞、リンパ球、マクロファージの細胞のいずれにおいても、0.1, 1.0, 10.0 μMのC60添加による細胞生存率への影響は観察されなかった（各種細胞ともにn= 5）。

［実施例１−３］ C60の炎症性サイトカイン産生能への影響
C60による各種細胞からの炎症性サイトカイン産生に対する影響を、酵素結合イムノアッセイ法(ELISA)を用いて解析した。

上記の方法で分離培養した各種細胞でサブコンフレントになったものを24 ウェル培養プレートにそれぞれ1 × 10^５細胞／ウェルで播種した。12時間培養後、PBSで洗浄して新鮮な10 ％FBS含有DMEMに置換し、腫瘍壊死因子TNF-αを添加した。C60の処理濃度は0.1, 1.0, 10.0 μMとし、TNF-αの処理濃度はそれぞれ10.0 ng/mlとした。培養軟骨細胞はTNF-αの存在下、非存在下にC60を添加して24時間培養した後、培養液を回収した。

培養上清中の炎症性サイトカインTNF-αとインターロイキン(IL)-1β濃度は、当技術分野で現在既知の標準的な技術であるELISAキットを用いて決定した。このELISAは以下の標準的方法によって行った。希釈した培養上清サンプルを感作プレート1ウェルあたり100μl添加し、室温に1時間静置した（一次反応）。一次反応後、洗浄瓶を用いて、各ウェルをPBSで4回以上、十分に洗浄した。0.1 % Tween 20-PBSで3000倍希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase：HRP）標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体を各ウェルに100μlずつ分注し、室温に1時間静置した（二次反応）。二次反応後、同様に、PBSで洗浄した後、0.8 mM TMB（テトラメチルベンジジン：Tetramethylbenzidine）溶液を1ウェルあたり100μl添加し、30 ℃で5〜20分間発色させた（発色反応）。1.5 N H₃PO₄を１ウェルあたり100μlずつ加えて発色反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。製造元によって提供された説明書に従ってコントロール凍結乾燥試薬を用いて測定濃度を較正した。

結果を図2および3に示す。滑膜線維芽細胞（n= 6）においては10.0 μMのC60添加によって、また、リンパ球（n= 4）とマクロファージ（n= 4）においては1.0 μMと10.0 μMのC60添加によって、対照群に比べてTNF-αとIL-1β濃度が有意に抑制された。

［実施例２］関節炎における骨破壊・吸収に対するC60の効果
関節炎、特に関節リウマチでは、炎症とともに骨破壊が進行する。関節炎において最も日常生活上の障害度が高いのが滑膜炎に伴う骨破壊である。骨破壊を担う破骨細胞は炎症因子により分化が誘導され、活性酸素がそれを仲介するmediatorであることが知られている。そこで、関節炎における破骨細胞分化ならびに骨吸収を抑制する効果をC60が有するか否かを検証した。

［実施例２−１］細胞の培養
破骨前駆細胞培養キット（セルガレージ社）を用いて、破骨前駆細胞から成熟破骨細胞への分化におけるC60の影響を観察した。

［実施例２−２］ C60の破骨細胞分化への影響
上記の破骨前駆細胞培養キットを用いて、破骨細胞分化誘導因子存在下に破骨前駆細胞をチャンバースライドの上で培養した。培地に最終濃度が0.1, 1.0, 10.0 μMになるようにC60を加えて7日間培養した。培地は各種添加因子を含めて3日毎に新しいものに交換した。7日目に、破骨細胞の分化の指標であるTRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色（セルガレージAK04 Lot:FEM）によって観察した。

TRAP染色法は、次のようにおこなった。まず、破骨細胞が形成されているのを確認した後、培養液を除去し、PBS 100μl/ウェルで洗浄した。次に、固定液（キット）を50μl/ウェル添加し、RT 5min行ったのち、固定液を除去し、DDW 250μl/ウェルで3回洗浄した。発色基質１本に緩衝液5mlを加えて溶解し、発色液を調製した。上記発色液を50μl/ウェル添加し、37℃ 20min インキュベートした。発色の具合を確認した後、発色液を除去し、DDW 250μl/ウェルで反応を停止した。DDWで全3回洗浄した後、ウェルをはずし、水溶性封入剤で封入した（NUNK 178599 16ウェルのチャンバースライド使用）。
結果を図4Aおよび図5〜図8に示す。破骨前駆細胞からTRAP陽性多核巨細胞となる成熟破骨細胞への分化は、10.0 μM濃度のC60存在下において有意に抑制された。

［実施例２−３］ C60の破骨細胞による骨吸収への影響
上記の破骨前駆培養キットを用いて、破骨細胞分化誘導因子存在下に破骨前駆細胞を象牙スライス片の上で培養した。培地に最終濃度が0.1, 1.0, 10.0 μMになるようにC60を加えて14日間培養した。培地は各種添加因子を含めて3日毎に新しいものに交換した。14日目に、破骨細胞の分化の指標であるTRAP陽性多核巨細胞をTRAP染色によって観察した。

破骨細胞による骨吸収像は、象牙の上に播種した破骨細胞を除去し、ヘマトキシリン染色を行って観察した。具体的には、象牙スライス片１枚を1 Mアンモニア水に入れて超音波処理を行って破骨細胞を除去した後、マイヤーのヘマトキシリン液で１分染色した。象牙スライスを水洗・乾燥した後、位相差顕微鏡で象牙スライス表面の吸収窩を観察し、画像解析装置で面積を比較した。
結果を図4Bおよび図9 に示す。1.0 μM, 10.0 μMの濃度でC60は破骨細胞による骨吸収を抑制した。

［実施例３］C60と他の活性酸素消去剤との比較
［実施例３−１］ C60と他の活性酸素消去剤の抗酸化能比較
各種濃度のC60、SOD、ビタミンC溶液を調製し（溶媒：DEME培地、SOD（10, 100μM）、C60（1, 10, 100μM）、ビタミンC（100μM））、それぞれの抗酸化能を、銅の酸化還元反応を応用した抗酸化能測定キット（OXIS Health Product社、OR、USA）を用いて測定した。
それぞれの抗酸化能について、ビタミンC（100μM）の抗酸化能に対する比として比較した（図10）。ビタミンC（100μM）の抗酸化能に対し、SOD（10μM）は約2倍、SOD（100μM）は約8倍、C60（1μM）が20倍、C60（10μM）が68倍、C60（10μM）が270倍であった。同じ濃度100μMで比較すると、SODはビタミンCの約8倍の抗酸化能を示したのに対し、C60の抗酸化能は約270倍であった。

［実施例３−２］C60と他の活性酸素消去剤のサイトカイン産生抑制効果および破骨細胞分化抑制効果の比較
DMEM培地にSOD（最終濃度：10, 100μM）、ビタミンC（最終濃度：10, 100μM）を添加し、上記実施例1-3記載の方法によりマクロファージの炎症性サイトカイン産生量を、また上記実施例2-2記載の方法により骨細胞分化能を測定し、C60（10μM）の結果と比較した（表１）。
マクロファージからのサイトカイン（TNF-α, IL-1β)産生および破骨細胞分化に対する抗酸化剤の抑制効果について、コントロール（培地のみ）と比べて有意な抑制効果が見られたのは、C60のみであった。

［実施例４］関節炎モデルに対するC60の効果
培養細胞を用いた実施例１および２の結果から、C60が炎症ならびに骨吸収・破壊を抑制するポテンシャルを有することが示唆された。そこで、関節炎疾患動物モデルを用いてC60の関節炎（炎症、骨関節破壊）の抑制効果を検討した。
［４−１］方法
既報（Yamamoto A. et al., Arthritis & Rheumatism, 48: 2682-2692, 2003）に則って、アジュバント関節炎ラットを作製した。関節炎誘導のための１回免疫後にラットを２群に分け、コントロール群の左膝関節にはリン酸緩衝液(PBS) 20.0 μlを、C60投与群の左膝関節にはC60 (10.0 μM) 20.0 μlを、micro-needle注射シリンジを用いて週１回注入し、経時的に関節炎の病勢を観察して関節炎スコア（Woods JM. Et al., J Immunology, 166: 1214-1222, 2001.）および病理組織スコア（Takayanagi H. et al., J Clinical Investigation, 104: 137-146, 1990.）を求め、２群間の差をStudent’s T法で統計学的に比較した。両群とも右膝関節は無処置として、関節炎の発症と進行の程度を比較観察した。

［４-２］関節炎スコア
コントロール群のラット膝関節の腫脹と発赤（関節スコア）は、経時的な増強が観察され、関節炎の誘導と増悪がみられた。これに対してC60投与群の関節スコアは、投与開始後４週目からコントロール群の平均スコアに比べて低値を示すようになり、８週目では統計学的有意差がみられた。６週目のスコアについては、平均値はC60投与群のほうがコントロール群よりも低値であったが、ばらつきが大きく有意差はなかった（図１１）。

［４-３］病理組織スコア
病理組織学的変化についても、関節の腫脹と発赤（関節スコア）と同様の傾向が認められた。すなわち、両群とも経時的に関節炎・骨軟骨破壊は進行したが、C60投与群の病理組織スコアは、投与開始後４週目からコントロール群のスコアに比べて統計学的有意に低かった（図１２）。病理組織標本の写真を図１３〜１６に示す。

本発明によって、関節リウマチを始めとする関節炎を伴う疾患に対し、効果的な新規医薬品が提供された。本医薬品によって、従来の抗リウマチ薬が有効でない患者や合併症等の理由で利用できる医薬品に制限がある患者に対し、治療薬の新たな選択肢を提供することが可能となる。

Claims

フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の治療および／または予防用医薬品。
関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患が、骨破壊を伴う疾患である、請求項１に記載の医薬品。
活性酸素消去能を有する物質を含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症における骨破壊の治療および／または予防用医薬品。
活性酸素消去能を有する物質を含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症における炎症の治療および／または予防用医薬品。
活性酸素消去能を有する物質がフラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１から４のいずれかに記載の医薬品。
関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患が、悪性関節リウマチ、フェルティ症候群、カプラン症候群からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である、請求項１から５のいずれかに記載の医薬品。
関節炎を伴う自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ベーチェット病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、オーバーラップ症候群からなる群より選択される少なくとも一つの疾患である、請求項１から６のいずれかに記載の医薬品。
フラーレンがC60である、請求項１から７のいずれかに記載の医薬品。
注射剤である、請求項１から８のいずれかに記載の医薬品。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、破骨細胞分化抑制剤。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、骨吸収抑制剤。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを含む、炎症性サイトカイン産生抑制剤。
炎症性サイトカインが、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-17からなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項１２に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
請求項１０に記載の破骨細胞分化抑制剤、請求項１１に記載の骨吸収抑制剤、または請求項１２に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤のいずれかを含む、関節リウマチ、関節炎を伴う関節リウマチ類縁疾患および自己免疫疾患、並びに骨粗鬆症の治療および／または予防用医薬品。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、関節炎を呈する疾患の治療および／または予防方法。
関節炎を呈する疾患が、関節リウマチ、関節リウマチ類縁疾患、自己免疫疾患、骨粗鬆症のいずれかである、請求項１５記載の方法。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、破骨細胞分化を抑制する方法。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、骨吸収を抑制する方法。
フラーレン、包接化フラーレン、およびフラーレン誘導体からなる群より選択される少なくとも一つを投与する工程を含む、炎症性サイトカイン産生を抑制する方法。
関節炎治療および／または予防用医薬品の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用。
破骨細胞分化抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用。
骨吸収抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用。
炎症性サイトカイン産生抑制剤の製造のための、フラーレン、包接化フラーレン、および／またはフラーレン誘導体の使用。