JPWO2007119796A1

JPWO2007119796A1 - エフェクター機能を有するポリペプチド変異体

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Publication number: JPWO2007119796A1
Application number: JP2008510990A
Authority: JP
Inventors: 孝辻; 康宏梶原; 由利南部; 一博深江; 洋明朝井; 昭弘村上
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2006-04-14
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2009-08-27
Anticipated expiration: 2027-04-12
Also published as: JP5242382B2; US20100080794A1; EP2011870A1; WO2007119796A1; EP2011870A4; TW200808830A

Abstract

本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含んでいる。前記Ｆｃ領域は、好ましくはヒトＩｇＧのＦｃ領域である。本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域の糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有していてもよい。また、本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域以外のポリペプチド部位が、ヒト細胞表層存在分子を認識するポリペプチド分子であってもよい。

Description

本発明は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド変異体に関する。より詳細には、Ｆｃ領域にアミノ酸置換による改変が施されたエフェクター機能を有するＦｃ領域を含むポリペプチドに関する。

抗体は、抗原に対する認識能の特異性が高く、また抗原との相互作用も強いので医薬治療用途や診断薬用途、検査試薬等に広く利用されており、今後もその利用は拡大していくものと期待されている。

抗体の構造は、図１に示されるように、２つの重鎖と２つの軽鎖からなるポリペプチド四量体であって、重鎖と軽鎖とはジスルフィド結合により結合されている。抗体は、抗原結合部位に相当する可変部位と定常部位とを有しており、重鎖定常部位のＣ末端側はCH2及びCH3からなるＦｃ領域で構成されている。Ｆｃ領域は、抗原への結合に直接関わらないが、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）との結合を介して同分子を表面に有する細胞に種々のエフェクター機能を発現させることができる。具体的には、Ｆｃ領域上のＦｃレセプター結合部位が、エフェクター細胞表面に存在するＦｃＲに結合することにより、抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解［抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称される］、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等を含むいくつかの重要で多様な生物学的反応が引き起こされる。

ＩｇＧのＡＤＣＣ活性の発現には、Ｆｃ領域と、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃＲとの結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域及び定常部位の第２番目のドメイン（以下、CH2ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性が示唆されている［Eur.J.Immunol.,23,1098(1993)、Immunology,86,319(1995)、Chemical Immunology,65,88(1997)］。また、Ｆｃ領域とＦｃＲとの結合には、CH2ドメインに結合している糖鎖の重要性も示されており［Chemical Immunology,65,88(1997)、第３回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム講演抄録ｐ３０（２００５）］、糖鎖構造の最適化により高いエフェクター機能を有する抗体の作成も報告されている［特開２００５−２２４２４０号公報］。これらの報告は、ヒトＩｇＧのエフェクター機能に糖鎖を含むＦｃ領域のCH2ドメインが極めて重要で、その部分のアミノ酸あるいは糖鎖構造の最適化により高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。

これまでにＦｃのアミノ酸置換に関する研究が盛んに行われてきた。ＰｒｅｓｔａらはＦｃアミノ酸のアラニン置換を網羅的に行い、適当なアミノ酸置換（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）がＦｃγＲＩＩＩａに対する結合能を上昇させ、ＡＤＣＣ活性が上昇することを見いだした［国際公開第ＷＯ００／４２０７２号パンフレット］。さらにＬａｚａｒらによると、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅの同時置換により、異なる抗体のＡＤＣＣ活性が共に上昇するというデータが示されている［ＵＳ２００５／００５４８３２Ａ１］。

このような抗体を生産する際には、目的の抗原を認識する抗体を産生する細胞の作成に時間と労力を要し、しかも必要な抗体活性を確保する為に動物細胞を用いる産生方法を行う必要があるため、抗体産生のコストを押し上げ、今後の抗体医療の大きな問題ともなっている。抗体の効率的な展開の為には、コスト削減の為の安価な抗体製造方法や高活性な抗体の製造方法が求められている。

特開２００５−２２４２４０号公報国際公開第００／４２０７２号パンフレット米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号明細書Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１０９８（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５）ＣｈｅｍｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）第３回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム講演抄録ｐ30(2005)

本発明の目的は、エフェクター機能が増強されたポリペプチド変異体、該ポリペプチド変異体を簡易に製造する方法、及び該ポリペプチド変異体を含み、薬理活性が高く投与量を低減でき、しかも副作用が少なく、広範な用途に利用可能な治療用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意検討を行ったところ、Ｆｃ領域の特定部位を特定のアミノ酸残基に置換することにより、エフェクター機能を著しく向上しうること、上記変異を施したポリペプチドを抗体治療用組成物に用いることにより、少ない投与量で高い治療効果が得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むポリペプチド変異体を提供する。前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域であってもよい。本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域の糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有していてもよい。本発明のポリペプチド変異体は、置換前と比較して、エフェクター機能が向上したものである。本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域以外のポリペプチド部位が、ヒト細胞表層存在分子を認識するポリペプチド分子であってもよい。

本発明のポリペプチド変異体は抗体を構成してもよい。即ち本発明は、抗体の変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた変異体を提供する。前記ポリペプチド変異体が構成する抗体は、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する抗体であってもよい。前記ポリペプチド変異体が構成する抗体は、抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する抗体であってもよい。

本発明のポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域以外のポリペプチド部位が、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合する、抗体由来ではないポリペプチド分子であってもよい。前記Ｆｃ領域以外のポリペプチド部位は、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合するポリペプチド分子であってもよい。

また、本発明は、上記本発明のポリペプチド変異体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを有する宿主細胞又は宿主生物をそれぞれ提供する。

さらに、本発明は、上記本発明の宿主細胞又は宿主生物を、核酸がコードするポリペプチド変異体を発現するように培養することを特徴とするポリペプチド変異体の製造方法を提供する。

本発明は、また、上記本発明のポリペプチド変異体を含む治療用組成物を提供する。

本明細書中、「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、重鎖定常部位のＣ末端側に位置するＣＨ２及びＣＨ３から構成される。「Ｆｃ領域における糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸」とは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号［Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)］に基づくアミノ酸を意味しており、例えば、IgG1のＦｃ領域にある糖鎖修飾部位のアミノ酸はＫａｂａｔのＥＵインデックス番号でＮ２９７であり、該部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸はＱ２９５に相当する。すなわち、本発明のポリペプチド変異体が、ＩｇＧ１のＦｃ領域を含む場合には、アミノ酸残基Ｑ２９５がＣ２９５に置換された構成を有している。
また本発明において「ポリペプチド変異体」とは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含む変異体を意味する。
また本発明のポリペプチド変異体は、その一部に他のペプチド又はポリペプチドを有するものであっても良い。他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のポリペプチド変異体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。

本発明は、以下〔１〕から〔２３〕を提供するものである。
〔１〕ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むポリペプチド変異体。
〔２〕ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むポリペプチド変異体。
〔３〕置換前と比較してエフェクター機能が向上した、〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド変異体。
〔４〕Ｆｃ領域がヒトＩｇＧのＦｃ領域である〔１〕〜〔３〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
〔５〕Ｆｃ領域の糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有している〔１〕〜〔４〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
〔６〕ヒト細胞表層存在分子を認識する部位を有する、〔１〕〜〔５〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
〔７〕抗体の変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた変異体である〔１〕〜〔６〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
〔８〕サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、〔７〕記載のポリペプチド変異体。
〔９〕抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、〔８〕記載のポリペプチド変異体。
〔１０〕細胞表層存在分子を認識する部位、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体である、〔１〕〜〔６〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
〔１１〕サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合する、〔１０〕記載のポリペプチド変異体。
〔１２〕ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合する、〔１１〕記載のポリペプチド変異体。
〔１３〕〔１〕〜〔１２〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体をコードする単離された核酸。
〔１４〕〔１３〕に記載の核酸を含むベクター。
〔１５〕〔１４〕に記載のベクターを有する宿主細胞又は宿主生物。
〔１６〕〔１５〕に記載の宿主細胞又は宿主生物を、核酸がコードするポリペプチド変異体を発現するように培養することを特徴とするポリペプチド変異体の製造方法。
〔１７〕〔１〕〜〔１２〕の何れかの項に記載のポリペプチド変異体を含む治療用組成物。
〔１８〕以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
〔１９〕以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程、
（２）細胞表層存在分子を認識する部位及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
〔２０〕以下（１）から（５）の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程、
（４）細胞表層存在分子を認識する部位、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（５）発現産物を回収する工程。
〔２１〕エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法。
〔２２〕細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法。
〔２３〕以下（１）から（３）の工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、及び
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程。

抗体IgG1の模式図である。精製された野生型キメラ抗体及び295Cys型キメラ抗体の電気泳動結果を示す写真である。精製された野生型キメラ抗体及び295Cys型キメラ抗体のフローサイト分析結果を示す図である。精製された野生型キメラ抗体及び295Cys型キメラ抗体の電気泳動結果を示す写真である。 Anti-EGFRヒト抗体のフローサイト分析結果を示す図である。 AILIM-IgFc Cys変異体の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、AILIM/ICOSの細胞外領域の配列を波下線で示した。また、ヒンジ領域の配列を2重下線で、ヒトIgG Fc領域の配列を下線で示した。AILIM/ICOSの細胞外領域の配列及びヒンジ領域の配列の間に、リンカー配列が存在する。さらに、置換部位のシステイン、該システインをコードするコドンをboxで示した。なお、boxで示されたシステイン及びシステインをコードするTGCは、置換前は、それぞれ、グルタミン及びグルタミンをコードするCAGである。図６−１の続きを示す図面である。実施例１で得た抗CD20抗体及びそのCys295変異体のADCC活性を測定した評価結果を示すグラフである。実施例２で得た野生型及び295Cys型Anti-CD20ヒト抗体のADCC活性を測定した結果を示すグラフである。実施例３で得た野生型及び295Cys型Anti-EGFRヒト抗体のADCC活性を測定した結果を示すグラフである。実施例４で得たAILIM/ICOS-IｇFcキメラ分子及びそのCys295変異体のADCC活性を測定した評価結果を示すグラフである。抗CD20抗体Cys295変異体のCD16との反応性解析の結果を示すグラフである。 AILIM−IgFcキメラ分子Gln223CysのCD16結合反応性の解析の結果を示すグラフである。

本発明のポリペプチド変異体の特徴は、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられている点にある。本発明のポリペプチド変異体は、上記構成を有するため、エフェクター機能を著しく向上することができる。エフェクター機能には、例えば抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解［抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］、補体タンパク質による細胞膜破壊［補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）］、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等が含まれる。なかでも、本発明のポリペプチド変異体はＡＤＣＣ及びＣＤＣの向上に適しており、特にＡＤＣＣ活性の向上に好適である。

本発明のポリペプチド変異体は、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣをより効果的に媒介することができる。ＡＤＣＣは、細胞が媒介する反応を意味しており、エフェクター細胞が標的細胞を認識し、標的細胞の溶解を引き起こす反応である。前記エフェクター細胞には、例えばキラーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージなどが挙げられる。これらのエフェクター細胞は、通常、細胞表層にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現しており、Ｆｃ領域の構造に応じて、結合可能な種類のＦｃＲを発現する細胞が認識され、細胞障害活性を発現することができる。

ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域を介してエフェクター細胞を認識することにより、ＡＤＣＣを誘導、促進することができる。本発明においては、変異が導入されたＦｃ領域がエフェクター細胞の表層分子［ＦｃγＲ等］と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量のポリペプチド変異体で高いＡＤＣＣ活性を速やかに誘導することができる。

ＣＤＣは、補体タンパク質が媒介する反応を意味しており、補体タンパク質が標的細胞を認識し、標的細胞の細胞膜の破壊を引き起こす反応である。前記補体タンパク質は、ポリペプチド変異体のＦｃ領域に結合することにより活性化される。本発明においては、変異が導入されたＦｃ領域が補体タンパク質［Ｃ１ｑ等］と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量のポリペプチド変異体で高いＣＤＣ活性を速やかに誘導することができる。

本発明におけるＦｃ領域は、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を効果的に媒介できる構造であることが好ましい。このような観点から、システイン置換前のＦｃ領域（親Ｆｃ領域）としては、ＩｇＧのＦｃ領域を用いる場合が多い。なかでも、ヒトＩｇＧのＦｃ領域が好ましく、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の各Ｆｃ領域等が用いられる。本発明においては、元来ＡＤＣＣ活性を有しているヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域が好適に用いられる。また、ＣＤＣ活性はサブクラスに応じて殺効果が異なり、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４等のＦｃ領域を用いることができる。システイン置換前のヒトCγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4の塩基配列を、配列番号：１０３、１０５、１０７、１０９に示す。また、システイン置換前のヒトCγ1、ヒトCγ2、Cγ3、Cγ4のアミノ酸配列を、配列番号：１０４、１０６、１０８、１１０に示す。
なお、本明細書における定常領域の配列は全て、［Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)］を基に作成した。

親Ｆｃ領域としては、天然に存在する抗体のＦｃ領域に限定されず、これらのＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列の一部に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよく、対応するアミノ酸配列からなる合成ポリペプチドであってもよい。親Ｆｃ領域におけるシステイン残基への置換は、遺伝子組換え技術を用いた公知の方法を用いて行うことができる。

本発明におけるＦｃ領域は糖鎖結合部位を含んでいる。前記糖鎖結合部位には、必ずしも糖鎖が結合している必要はないが、ＡＤＣＣ活性を促す点で少なくとも一つの糖鎖が結合していることが好ましい。前記糖鎖としては、一以上の単糖からなる糖鎖であれば特に限定されず、例えば抗体重鎖のＦｃ領域に結合している糖鎖やそのグライコフォーム、合成糖鎖のいずれであってもよい。例えば、下記式で表される糖鎖は、IgG1抗体重鎖のＦｃ領域における糖鎖結合部位に結合している糖鎖の例である。

一般に、Ｆｃ領域に結合する糖鎖の構造は、エフェクター機能に密接に関連することが知られており、同機能の向上を目的として、天然型糖鎖に適宜な修飾が施された糖鎖を用いることも好ましい。天然型糖鎖に修飾が施された糖鎖の例としては、例えば、上記式中、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合しているフコースに対し、付加、欠失、置換等の修飾を施した構造の糖鎖などが挙げられる。糖鎖修飾部位に結合する糖鎖は、Ｏ−結合型、Ｎ−結合型の何れであってもよいが、好ましくはＮ−結合型糖鎖からなる糖鎖が用いられる。

一般に、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域の糖鎖は、ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性にきわめて重要であり、糖鎖の存在そのものや、その糖鎖構造がＡＤＣＣ活性に密接に関与していることが知られている。また、糖鎖修飾部位への糖鎖の結合（特にＮ型糖鎖の発現）には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸残基）というアミノ酸配列が必要である。ここで、本発明のポリペプチド変異体は、「ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域」で構成されている。このため、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位を含むＣ末端側に存在するアミノ酸配列（例えば、２９７番〜２９９番のアミノ酸配列Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）が保存され、糖鎖結合部位においてＮ型糖鎖等の糖鎖の発現が損われることがなく、より優れたＡＤＣＣ活性の向上効果を得ることができる。例えば、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位を含むＣ末端側に存在するアミノ酸配列に変異を施した場合にはＡＤＣＣ活性の向上効果が低いか、活性が損なわれる場合がある。また、システイン残基の置換部位が、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって１番目のアミノ酸である場合にも、糖鎖修飾部位へ糖鎖が結合しにくいか、または結合しても糖鎖の立体構造が保持されないためか、ＡＤＣＣ活性の向上効果を十分に得ることができない。

本発明のポリペプチド変異体は、ＩｇＧにおけるＦｃ領域以外のポリペプチド部位として、細胞表層存在分子を認識する部位を有していることが好ましい。前記細胞表層存在分子は、ヒト細胞及び非ヒト細胞（マウス細胞等）のいずれの表層に存在する分子であってもよいが、ヒト細胞表層存在分子が好適である。

前記ヒト細胞表層存在分子には、例えばサイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、及びウィルス感染細胞表層分子等が含まれる。このようなヒト細胞表層存在分子の具体例としては、例えばＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、及びインテグリン分子等が挙げられる。

本発明のポリペプチド変異体は、例えばＩｇＧにおけるＦｃ領域を含むような抗体の変異体、若しくは細胞表層存在分子（特にヒト細胞表層存在分子）を認識するポリペプチド分子とＩｇＧにおけるＦｃ領域とのキメラ分子のようなポリペプチド（抗体様分子）の変異体で構成することができる。抗体及び抗体様分子の変異体は、単独で又はこれらを組み合わせて用いることができる。
より具体的には、本発明のポリペプチド変異体には、抗体の変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた変異体、並びに、細胞表層存在分子を認識する部位及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体が含まれる。本発明のポリペプチドの変異体は、置換前と比較して、エフェクター機能が向上している。本発明のポリペプチドの変異体においてＦｃ領域はヒトＩｇＧのＦｃ領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の各Ｆｃ領域等が挙げられる。本発明のＦｃ領域は、上述の通り、糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有していることが好ましい。

本発明における抗体とは、抗原結合部位を有し、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ）を誘導可能な分子であれば特に限定されず、例えばヒト抗体、マウス抗体等の非ヒト抗体などの天然型抗体及びこれらの誘導体；キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体等が含まれる。これらは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよく、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記天然型抗体の誘導体とは、天然型抗体のアミノ酸配列の一部に、欠失、付加、置換等の変異が導入された抗体を意味しており、これらの変異は自然に生じたものでもよく、人為的であってもよい。前記抗原結合部位には、天然型抗体のＦａｂ領域における可変部位ＶＨ及びＶＬ（特に超可変部位ＣＤＲ１〜３）及びこれらと相同な配列からなる領域等が含まれる。

なかでも、良好なＡＤＣＣ活性を発揮でき、抗体医薬に適用しやすい点で、組換え抗体、特にキメラ抗体、ヒト化抗体などが好ましく用いられる。前記キメラ抗体とは、２以上の異種又は同種の融合タンパクからなる抗体を意味しており、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域と非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）のＦａｂ領域とで構成される抗体等が挙げられる。前記ヒト化抗体としては、例えば非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）の超可変部領域を、ヒトＩｇＧ由来のＦｃ領域を含む残りの領域に融合させた抗体等が挙げられる。

抗体としては、種々の抗原に対する抗体を用いることができる。これらの抗体が認識する抗原には、膜貫通分子などのレセプター、成長因子などのリガンド等のポリペプチド；腫瘍関連糖脂質抗原などの米国特許第５０９１１７８号に記載の非ポリペプチド抗原等が含まれる。具体的な抗原としては、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びvon Willebrands因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ−β（ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、及びＴＧＦ-β５等）等のトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；ＩＬ-１からＩＬ-１０等のインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ等のインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等の腫瘍関連抗原；及びこれらのポリペプチドの断片等が含まれる。

抗体に対する好適な分子標的には、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４等のＣＤタンパク質；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のＥｒｂＢレセプターファミリー；ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそのα又はβサブユニットを何れか含むαｖ／β３インテグリン(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)等の細胞接着分子；ＶＥＧＦ等の成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等が含まれる。

上記に例示の抗原の中でも、可溶型抗原及びその断片は、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。例えばレセプターのような膜貫通分子に対しては、例えば、レセプターの細胞外ドメイン等の断片を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は、天然源（例えば、癌株化細胞）から取り出すことができ、又は組換えベクターを用いて膜貫通分子等の抗原認識領域を発現するように形質転換された細胞であってもよい。

これらの抗体は、抗原結合部位以外に、細胞表層存在分子を結合可能な部位を有していてもよい。このような構成を有する抗体によれば、標的細胞の認識効率を向上できるため、少量の抗体で高いエフェクター機能を発揮することが可能である。

本発明においては、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＣＤ２０抗体の変異体を提供する。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：５４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：５２に記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：５４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：７０に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：６２に記載のアミノ酸配列（Ｌ鎖全長のアミノ酸配列）を有するL鎖。
また本発明においては、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＥＧＦＲ抗体の変異体を提供する。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７７に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：８７に記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：７５に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：７７に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：７９に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：８１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：８３に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：８５に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：８９に記載のアミノ酸配列（Ｌ鎖全長のアミノ酸配列）を有するL鎖。

本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＣＤ２０抗体の変異体を提供する。
（１）配列番号：５３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：５９に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：５１に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）配列番号：５３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：５５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７１に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）配列番号：６３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：６５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：６７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：６９に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：６１に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
また本発明は、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ＥＧＦＲ抗体の変異体をコードするDNAを提供する。
（１）配列番号：７４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：５９に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（２）配列番号：８８に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体の変異体、
（３）配列番号：７４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：７６に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：７８に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：７１に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体の変異体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体の変異体、
（ｉ）配列番号：８０に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：８２に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：８４に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：８６に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：９０に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。

本発明における抗体様分子とは、抗原結合部位を有しない点で抗体とは異なるが、細胞表層存在分子を認識する部位を分子内に有し、当該部位における細胞表層分子との結合を介してエフェクター機能の発現に寄与することができる点で抗体類似の機能を有している。

本発明における抗体様分子としては、細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むキメラ分子等の組換え分子等が用いられる。即ち本発明は、細胞表層存在分子を認識する部位及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体を提供する。本発明のキメラ分子の変異体は、エフェクター機能を有する限り、細胞表層存在分子を認識する部位、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域の間に、ペプチド領域を含むことができる。ペプチド領域としては、次の（１）から（３）が例示できるが、これらに制限されるものではない。（１）リンカー、（２）抗体のヒンジ領域、並びに、（３）リンカー及び抗体のヒンジ領域。「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。
細胞表層存在分子は、上記に例示のものと同様である。即ち本発明は、サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合するキメラ分子の変異体を提供する。前記細胞表層存在分子を認識する部位は、例えば接着タンパク質の結合ドメインで構成することができる。また前記細胞表層存在分子を認識する部位は、例えば抗体Ｈ鎖及び/又はＬ鎖の可変領域で構成することが出来る。
本発明の技術は、抗体の抗原認識部位と同様に抗原に結合する機能を持った部位、及び、抗体のＦｃ領域を含む分子であって、エフェクター機能を有する分子で有る限り適用できる技術である。従って、本発明の技術の適用対象は、抗体分子に限られるものではない。本発明の技術は、細胞表層存在分子を認識する部位（例えば、接着タンパク質、接着分子、シグナル分子等の結合ドメイン）及び、抗体のＦｃ領域を含むキメラ分子全般に適用可能である。ここで言う接着タンパク質とは、例えば、細胞間相互作用を媒介する分子であって、細胞の認識部位として細胞外領域を構造内に有している。本発明における抗体様分子は、上記細胞外領域の構造を結合ドメインとして利用するため、本来この分子が結合する細胞表層存在分子を認識することが可能である。

前記接着タンパク質としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、チロシンキナーゼ活性を持つレセプター(レセプターチロシンキナーゼ)等のサイトカインに対するレセプター、造血素及び神経成長因子レセプタースーパーファミリー、インテグリン、カドヘリン、(Ｅ-、Ｌ-及びＰ-)セレクチン等の細胞表層存在分子の細胞外ドメイン及びこれと親和性を有する（結合可能な）ポリペプチド分子が挙げられる。前記IgSFには、NCAMやL1のように膜貫通型の細胞接着分子の他に、膜貫通部分を持たないGPI-アンカー型の細胞接着分子も含まれる。
より具体的には、本発明は、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合するキメラ分子の変異体を提供する。

本発明における抗体様分子及びその変異体は、結合ドメイン（本明細書においては、細胞表層存在分子を認識する部位と表現することもある）をＮ末端側、Ｆｃ領域をＣ末端側に有する構造が好ましいが、これに限定されず、Ｆｃ領域をＮ末端側、結合ドメインをＣ末端側に有する構造であってもよい。抗体様分子及びその変異体を構成するＦｃ領域は、CH2及びCH3ドメインを保持していることが好ましく、抗体様分子及びその変異体を構成する結合ドメインは、抗体重鎖のCH1及び／又は抗体軽鎖に対応する部位に配置されることが好ましい。

本発明においては、例えば以下（１）から（３）に記載のキメラ分子の変異体を提供する。
（１）細胞表層存在分子を認識する部位として配列番号：９６に記載のアミノ酸配列、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域として配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を含むキメラ分子の変異体、
（２）細胞表層存在分子を認識する部位として配列番号９６に記載のアミノ酸配列、抗体のヒンジ領域として配列番号：９８に記載のアミノ酸配列、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域として配列番号：９７に記載のアミノ酸配列を含むキメラ分子の変異体、
（３）配列番号：９９に記載のアミノ酸配列からなるキメラ分子の変異体。
また本発明は、例えば以下（１）から（３）に記載のキメラ分子の変異体を提供する。
（１）配列番号：９１に記載の塩基配列からコードされる細胞表層存在分子を認識する部位、及び配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体、
（２）配列番号：９１に記載の塩基配列からコードされる細胞表層存在分子を認識する部位、配列番号：９３に記載の塩基配列からコードされる抗体のヒンジ領域、及び配列番号：９２に記載の塩基配列からコードされるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体、
（３）配列番号：９４に記載の塩基配列からコードされるキメラ分子の変異体。
本発明のキメラ分子の変異体は、さらに細胞表層存在分子を認識する部位及び抗体のヒンジ領域の間にリンカー配列を有していてもよい。リンカー配列としては、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り特に制限はないが、例えば配列番号：１００に記載のアミノ酸配列からなるリンカー配列が挙げられる。配列番号：１００に記載のアミノ酸配列をコードするDNAとしては、例えば配列番号：９５に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられるが、これに限定されない。また本発明の「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。

本発明のポリペプチド変異体は、遺伝子組換え技術等を用いた公知の方法で製造することができる。本発明のポリペプチド変異体は、本発明のポリペプチド変異体をコードする単離された核酸を用い、該核酸を含むベクターを作成し、該ベクターを有する宿主細胞又は宿主生物を得、これらの宿主細胞又は宿主生物を核酸がコードするポリペプチドを発現するように培養する方法を用いて製造することができる。

ポリペプチド変異体が抗体で構成される場合には、一般的な抗体の製造方法を適用できる。抗体の変異体の製造方法は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988、Monoclonal Antibodies:principles and practice,Third Edition,Acad.Press,1993、Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,1996等に記載された方法を用いることができ、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。また、同様の方法は抗体様分子の製造に適用することもできる。

ポリペプチド変異体の製造は、例えば親Ｆｃ領域を含むポリペプチドをコードする核酸において、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸に代えてシステイン残基をコードするように置換された配列からなる核酸を単離する工程；ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸を、適当なプロモーターを含む発現ベクターに組み込んで複製可能な組換えベクターを生産する工程；得られた組換えベクターを用いて宿主細胞又は宿主生物を形質転換する工程；及び形質転換した宿主細胞又は宿主生物を培養しポリペプチド変異体を生産する工程を含んでいる。

親Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸以外のアミノ酸や、糖鎖修飾部位に結合した糖鎖等に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよい。

本発明のポリペプチド変異体をコードする核酸は、塩基配列に変異を導入する慣用の方法で得ることができ、例えば、親Ｆｃ領域における被置換アミノ酸残基をコードする核酸配列を「ＴＧＣ」又は「ＴＣＴ」に置き換えた核酸配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用い、親Ｆｃ領域を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより調製することができる。本発明のポリペプチド変異体は、エフェクター機能を阻害しない範囲で、システイン置換の変異を導入する工程中または導入後に、さらに他の修飾が施されてもよく、例えばアミノ酸配列や糖鎖結合部位に結合する糖鎖の一部に欠失、付加、置換等の修飾が施されてもよい。特に本発明においては、Ｆｃ領域の糖鎖結合部位に結合する糖鎖に公知の修飾を加えることにより、エフェクター機能の向上効果を得ることができ好ましい。

複製可能な組換えベクターは、本発明のポリペプチド変異体をコードする核酸（ＤＮＡ断片又は全長cDNA）を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製できる。発現ベクターとしては、導入する宿主細胞又は宿主生物の種類に応じて適宜選択することができ、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とするポリペプチド変異体をコードする核酸を転写可能なプロモーターを含有しているものが用いられる。これらの組換えベクターは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明においては、２以上の組換えベクターを併用してもよい。併用する組換えベクターとしては、例えば、相補的抗体軽鎖または重鎖、あるいは所望のレセプターやリガンドの結合ドメインをコードする核酸、所望の糖鎖修飾酵素をコードする核酸等を適当なプロモーターを含む発現ベクターを用いることができる。これらの組換えベクターを併用することにより、より高いエフェクター機能を発現可能なポリペプチド変異体を得ることができる。２以上の組換えベクターを用いる場合には、宿主細胞又は宿主生物は同一でも異なってもよい。

宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、本発明においては、宿主細胞として、エフェクター機能に影響を及ぼす糖鎖結合部位に結合する糖鎖に対する修飾酵素の活性が低下又は欠失した細胞を選択するか、人為的手法により同活性を低下又は欠失させた細胞を用いることができる。このような酵素には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素等が含まれ、具体的には細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素等が挙げられる。宿主生物としては、例えば動物個体、植物個体等が挙げられる。

酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等を利用できる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。

組換えベクターの酵母への導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。

動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐcDNAＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐcDNAＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。

組換えベクターの動物細胞への導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。

昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。

バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。

組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。

植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。

組換えベクターの植物細胞への導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。

このように１又は２以上の組換えベクターが導入された形質転換体は、宿主に応じた培地を用いて、公知の方法に従って培養することにより、培養物中に抗体の変異体及び抗体様分子の変異体（ポリペプチド変異体）を生成蓄積することができる。

大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。

大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

培養している形質転換体は、自然に又は誘導によりポリペプチド変異体を発現し、培養物中に生成蓄積することができる。ポリペプチド変異体の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。ポリペプチド変異体の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチド変異体の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。

ポリペプチド変異体が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチド変異体を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、ポリペプチド変異体をコードするＤＮＡ、およびポリペプチド変異体の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後にポリペプチド変異体を発現させることにより、目的とするポリペプチド変異体を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてポリペプチド変異体を製造することもできる。

形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、ポリペプチド変異体を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチド変異体を採取することにより、該ポリペプチド変異体を製造することができる。動物個体を用いてポリペプチド変異体を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするポリペプチド変異体を生産する方法があげられる。

動物個体の場合は、例えば、ポリペプチド変異体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、ポリペプチド変異体を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりポリペプチド変異体を採取することにより、ポリペプチド変異体を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。

植物個体を用いてポリペプチド変異体を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、ポリペプチド変異体を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチド変異体を採取することにより、ポリペプチド変異体を生産する方法があげられる。ポリペプチド変異体をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたポリペプチド変異体は、例えばポリペプチド変異体が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチド変異体の精製標品を得ることができる。

また、ポリペプチド変異体が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチド変異体の不溶体を回収する。回収したポリペプチド変異体の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ポリペプチド変異体を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチド変異体の精製標品を得ることができる。

ポリペプチド変異体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチド変異体あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、ポリペプチド変異体の精製標品を得ることができる。

このようにして取得されるポリペプチド変異体として、例えば、抗体の変異体、抗体の変異体の断片、抗体の変異体のＦｃ領域を有する融合タンパク質（キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体；キメラ分子等の抗体様分子）などを挙げることができる。
即ち発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法を提供する。
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程
（３）発現産物を回収する工程。

本発明の一つの態様としては、まず、当業者に公知のエフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。本発明の別の態様としては、まず、エフェクター機能を有する抗体を製造し、次いで、製造された抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。例えば、まず、後述の方法によって所望の抗原に結合する抗体を得て、次いで、得られた抗体がエフェクター機能を有するか否かを当業者に周知の方法によって判定することで、エフェクター機能を有する抗体を製造することができる。エフェクター機能の判定方法としては、例えば実施例に記載の方法が挙げられる。

本発明において、アミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、部位特異的変異誘発法（Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vector:an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA、Mark J. Zoller and Michael Smith、Nucleic Acids Research、Volume 10 Number 20, 6487-6500, 1982；Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis Asako Sawano and Atsushi Miyawaki、Nucleic Acids Research、Volume 28, Number 16, e78, 2000）によって行うことが出来る。

本発明においては、次いで、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、当業者に周知な方法によって宿主細胞又は宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。次いで、当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（抗体の変異体）を回収することが出来る。

ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとＦｃ領域をコードするDNAが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。L鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。

以下に所望の抗原に結合する抗体を得る方法に関して述べる。
抗体のH鎖又はL鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97、Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平20−504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法(WO95/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388を参考にすることができる。

ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。

より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、本発明のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法(例えば、WO98/46777など)などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。

抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56参照)。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878号公報参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735参照)。

動物の免疫化は、例えば、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。

ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。

続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ(例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。

構築された抗体遺伝子を公知の方法により発現させることで、抗体を取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現させる抗体遺伝子、及びその３’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサーが挙げられる。また、それ以外にも、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）などのウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター−1αなどの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いることができる。例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合には、Mullingらの方法 (Mulling RC et al., Nature (1979) 277: 108-14)に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。ヒトエロンゲーションファクター−1αを用いる場合には、Mizushimaの方法 (Mizushima, Nucleic Acids Res (1990) 18: 5322) に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させたDNAを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーターとしてLacZプロモーター、araBプロモーターが挙げられる。

ハイブリドーマ培養・増殖又は遺伝子組換えにより得られた抗体は、均一になるまで精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム等による塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラム、プロテインLカラム等が挙げられる。このようにして取得された抗体がエフェクター機能を有するか否かは、当業者に周知な方法によって判定可能であり、例えば実施例に記載の方法によって判定することができる。

以下に、本発明のポリペプチド変異体の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の製造方法について記すが、他のポリペプチド変異体を当該方法と同様にして取得することもできる。

（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステインに置換されたヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）C領域及びヒト抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステインに置換されたヒト抗体のＨ鎖C領域及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。

ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のIgG1サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。

動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。

ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］、ｐＥＥ１８［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１７，５５９（１９９８）］などがあげられる。

構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。

（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。

目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。

ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。

ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。 cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］、或いは市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒ cDNA ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）やＺＡＰ−cDNA ＳｙｎｔｂｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。

cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、ＬａｍｂｄａＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。

ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。

cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．ＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを調製することもできる。

上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該cDNAの塩基配列を決定することができる。

決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。

さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。

アミノ酸配列が公知である場合には、アミノ酸配列を、コドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。

（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。

（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。

（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするcDNAの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。

次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。

（７）ヒト化抗体の安定的生産
（４）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等があげられる。

ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。

ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。

以上、動物細胞を宿主としたポリペプチド変異体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法によりポリペプチド変異体を製造することができる。

すでに宿主細胞が、ポリペプチド変異体を発現する能力を有する場合には、公知の方法を用いて本発明における、ポリペプチド変異体を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とするポリペプチド変異体を精製することにより、本発明のポリペプチド変異体を製造することができる。

また本発明は、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、エフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法を提供する。より具体的には本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法を提供する。
（１）細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程
（２）細胞表層存在分子を認識する部位とＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程
（３）発現産物を回収する工程

本発明のキメラ分子の変異体の製造方法で使用するキメラ分子としては、エフェクター機能を有する限り、細胞表層存在分子を認識する部位、及びＦｃ領域の間に、ペプチド領域を含むことができる。ペプチド領域としては、次の（１）から（３）が例示できるが、これらに制限されるものではない。（１）リンカー、（２）抗体のヒンジ領域、並びに、（３）リンカー及び抗体のヒンジ領域。「抗体のヒンジ領域」には、抗体のヒンジ領域の全長だけでなく、エフェクター機能に寄与する（あるいはエフェクター機能を阻害しない）限り、抗体のヒンジ領域の一部も含まれる。
本発明のキメラ分子の変異体の製造方法においてはまず、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、上述の部位特異的変異誘発法によって行うことが出来る。
本発明のキメラ分子の変異体の製造方法においては、次に、細胞表層存在分子を認識する部位とＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該DNAを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子の変異体）を回収することが出来る。

また本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法を提供する。
（１）細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程
（４）細胞表層存在分子を認識する部位とＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程
（５）発現産物を回収する工程
本方法においてはまず、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する。製造されるキメラ分子は、少なくとも細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を有するものであり、例えば、細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域の間にペプチド領域を有するキメラ分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。キメラ分子の製造は、以下のようにして行うことが可能である。
まず細胞表層存在分子を認識する部位をコードするDNAとＦｃ領域をコードするDNAを当業者に周知な方法でクローニングする。また必要に応じて、これら以外のペプチドをコードするDNAをクローニングする。Ｆｃ領域の由来は特に限定されず、エフェクター機能を有する抗体に由来するものであってもよいし、エフェクター機能を有しない抗体に由来するものであってもよい。
次いで、細胞表層存在分子を認識する部位をコードするDNA、及びＦｃ領域をコードするDNAを当業者に周知な方法で結合させ（必要に応じて、細胞表層存在分子を認識する部位をコードするDNA、及びＦｃ領域をコードするDNA、これら以外のペプチドをコードするDNAを結合させ）、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むキメラ分子をコードするDNAを調製する。次いで、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むキメラ分子をコードするDNAを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該DNAを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子）を回収することが出来る。
本方法においては次に、上記にて製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する。キメラ分子がエフェクター機能を有するか否かの判定は、当業者に周知な方法によって行うことが可能であり、例えば実施例に記載の方法によって判定することができる。
本方法においては次に、エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する。ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、上述の部位特異的変異誘発法によって行うことが出来る。
本発明のキメラ分子の変異体の製造方法においては、次に、細胞表層存在分子を認識する部位とＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを、当業者に周知な方法を利用して宿主細胞や宿主生物に導入し、該DNAを発現させる。当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物（キメラ分子の変異体）を回収することが出来る。

精製したポリペプチド変異体の蛋白量、抗原との結合活性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、Monoclonal Antibodies:principles and practice,Third Edition,Acad.Press,1993、あるいはAntibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988等に記載の公知の方法を用いることができる。具体的な例としては、ポリペプチド変異体がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。また、ポリペプチド変異体のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。

本発明のポリペプチド変異体は、上記方法により測定されるＡＤＣＣ活性について、システイン置換する前のポリペプチドと比べて向上している。このため、抗体療法に用いる場合には薬剤の使用量を低くすることができるため、経済的であり、副作用を少なくすることができる。

本発明のポリペプチド変異体は、上記のようにエフェクター機能が極めて向上されるため、治療、診断、評価等の広範な用途に利用可能である。

本発明の治療用組成物は、上記本発明のポリペプチド変異体を含んでいる。このため、ＡＤＣＣ活性が改善されており、少量の投与量で十分な薬理効果を得ることができ、優れた抗体治療用途に極めて有利である。治療用組成物には、上記ポリペプチド変異体以外に、例えば核酸類、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、その他の有機化合物、無機化合物、賦形剤などの製剤用添加物及びこれらの組み合わせなどが添加されていてもよい。本発明の治療用組成物は、必要に応じて成形手段を用いて製剤化し、経口又は非経口に投与することができる。本発明の治療用組成物は、特に注射剤、点滴剤、経皮吸収剤による非経口投与等の方法で好適に利用できる。

より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチド変異体および医薬的に許容し得る担体を含む、治療用組成物を提供する。また本発明は、本発明のポリペプチド変異体を投与することを含む、哺乳動物の治療方法を提供する。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、サルなど）が挙げられる。

本発明の治療用組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。

また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明のポリペプチド変異体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり、約1μgから100mg（例えば約1μgから15mg、約10μgから20mg、約0.1mgから20mg）の範囲で選ぶことが可能である。本発明の医薬組成物は、1箇所への投与又は複数の別々の部位への投与が可能である。また本発明の医薬組成物は連続投与をすることも可能である。数日間以上に渡る繰り返し投与については、状態応じて、望まれる疾患状態の抑制が起こるまで続ける。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

本発明の治療用組成物は、抗体療法を適用可能な広範な疾病の治療に用いることができる。抗体療法が適用される疾病・症状としては、例えば転移性乳ガン（抗ＨＥＲ２抗体）、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキン性リンパ腫（抗ＣＤ２０抗体）、関節リウマチやクローン病（抗ＴＮＦα抗体）、腎臓移植後の急性拒絶正反応（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体）等が挙げられる。括弧内は治療に用いる抗体を示している。これらの疾病等に対し、従来の抗体に代えて本発明の治療用組成物を利用することにより、治療効果を著しく向上でき、患者の経済的、身体的負担を軽減することができる。さらに、抗体療法に今後適用されうる抗体医薬としても好適に利用できる。

また本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
さらに本発明は、細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
上記方法において、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基の置換は、上述の方法によって行うことが出来る。

また本発明は、以下の工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
（１）細胞表層存在分子を認識する部位とＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程
上記方法において、キメラ分子の製造、製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かの判定、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基の置換は、上述の方法によって行うことが出来る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されない。

調製例１ヒト末梢血単核球の分離精製
ヒト血液を抗凝固剤添加採血バック（テルモ社製）に採取した。この血液を、５０ｍｌの遠心チューブ（Falcon社製）に１５ｍｌずつ分注したLymphoprep（AXIS-SHIELD社製）に重層し、取り扱い説明書に従って、一般的に用いるスイング型細胞分離用遠心機にて、室温で１，６００回転、３０分の遠心を行なった。遠心後、取り扱い説明書に従って、単核球層を回収し、牛血清アルブミン（BSA：シグマ社製）を最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）で添加したカルシウム、マグネシウム不含phosphate-buffered saline (BSA-PBS：シグマ社製)にて3回洗浄後、牛血清（FCS）を最終濃度１０％で含有するRPMI-1640培地（１０％FCS-RPMI-1640）に分散して、ヒト末梢血由来単核球の細胞懸濁液とした。

実施例１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体及び抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体Cys変異体
１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの作製
１−１．抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAの構築
国際公開ＷＯ９４／１１０２６号パンフレットに記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体、２Ｂ８の軽鎖の可変領域（以下ＶＬと表記する）のアミノ酸配列をコードするcDNAを、ＰＣＲ法を用いて以下の様に構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬのcDNA配列の５’末端と３’末端に、発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列、５’末端制限酵素SacI、並びに３’末端制限酵素HindIII配列を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、６本のオリゴヌクレオチドDNAを合成した。

それぞれの合成オリゴヌクレオチドを、最終濃度が０．１μMになるように、PCR反応液に添加し、最終容量50μlの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社製）を0.25μl加え、ExTaq polymerase付属のBufferを5μl添加して、３０サイクル、PCR反応を行った。PCR反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、PCRで増幅されたcDNA断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社製）を用いて、取扱説明書に従い精製した。cDNA濃度を260nmの吸光度（1O.D.260=50μg/ml）から算出した。この断片、1μgをそれぞれ10単位の制限酵素SacIと制限酵素HindIIIで、取り扱い説明書に従って37℃で3時間切断した後、上記と同様の方法で、制限酵素SacIと制限酵素HindIIIで切断された末端を有する、VL領域のcDNA断片を得た。

１−２．抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするcDNAの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体、２Ｂ８の重鎖の可変領域（以下ＶＨと表記する）のアミノ酸配列をコードするcDNAを、ＰＣＲ法を用いて以下の様に構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨのcDNA配列の５’末端と３’末端に、発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列、５’末端制限酵素XhoI、並びに３’末端制限酵素NheI配列を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、６本のオリゴヌクレオチドDNAを合成した。

それぞれの合成オリゴヌクレオチドを、最終濃度が０．１μMになるように、PCR反応液に添加し、最終容量50μlの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社製）を0.25μl加え、ExTaq polymerase付属のBufferを5μl添加して、３０サイクル、PCR反応を行った。PCR反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、PCRで増幅されたcDNA断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社製）を用いて、取扱説明書に従い精製した。cDNA濃度を260nmの吸光度（1O.D.260=50μg/ml）から算出した。この断片、1μgをそれぞれ10単位の制限酵素XhoIと制限酵素NheIで、取り扱い説明書に従って37℃で3時間切断した後、上記と同様の方法で、制限酵素XhoIと制限酵素NheIで切断された末端を有する、VH領域のcDNA断片を得た。

１−３．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターは、Baculovirus Expression Vector pAc-k-CH3 (PROGEN Biotechnik GmbH社製)から、可変領域を除くヒト抗体をコードするcDNAを分離して、作製した。まずはじめに、pAc-k-CH3ベクターから制限酵素を用いて、可変領域を除いたIgG軽鎖（CH1）をコードするcDNAと、可変領域を除いたIgG重鎖（CH1,CH2,CH3）をコードするcDNAをそれぞれ分離した。これをそれぞれ、pIRES puro2ベクター、並びにpIRES hyg2ベクターへ常法により組み込み、ヒトIgG軽鎖発現ベクター、並びにヒトIgG重鎖発現ベクターを構築した。ヒトIgG軽鎖発現ベクターは制限酵素SacIと制限酵素HindIIIで、ヒトIgG重鎖発現ベクターは制限酵素Xho Iと制限酵素NheIで常法により切断し、アガロースゲルを用いて常法によりそれぞれの発現ベクターを調製した。それぞれのベクターに、１−１項で得たVL cDNAを制限酵素SacIと制限酵素HindIIIで、１−２項で得たVH cDNAを制限酵素Xho Iと制限酵素NheIで常法により切断し、アガロースゲルで分離した目的のcDNAを、Ligation High（東洋紡社製）を用い、取り扱い説明書に従って連結した。その後、形質転換用の大腸菌、DH5α（東洋紡社製）を形質転換し、得られたコロニーをNZY brothにて16時間、液体培養を行った。形質転換した大腸菌からWizard plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega社製）によりPlasmidを精製した。その後、ABI 3100-Avant(Applied Biosystems)を用いて、取り扱い説明書に従って反応を行ってDNA配列を確認し、抗CD20ヒト型キメラ抗体軽鎖、並びに重鎖を発現するベクター、pIRESpuro2-IgG-L、並びにpIRESpuro2-IgG-Hを得た。

２． CHO細胞を用いた抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
１−３項で得た抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体軽鎖、並びに重鎖発現ベクター、それぞれpIRESpuro2-IgG-L、並びにpIRESpuro2-IgG-Hを用いて抗ＣＤ２０キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様に実施した。
CHO-K1細胞、1x10⁶ 個に対して、FuGENE 36μlと、pIRESpuro2-IgG-Lベクター 12μgを用いて、取り扱い説明書に従って遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後2日目にPuromycinを、10% 牛胎児血清（ＦＣＳ）添加RPMI-1640培地に終濃度0.5-5μg /mlになるように添加し、その後、9日間培養を行なった。puromycinにより薬剤耐性CHO-K1細胞の選択を行なった後、限界希釈法により細胞のクローン化を行ない、抗ＣＤ２０キメラ抗体軽鎖を高発現している細胞をELISAによりスクリーニングして選択した。
引き続いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体軽鎖を高発現しているCHO-K1細胞、1x10⁶ 個に対して、FuGENE 36μlと、pIRESpuro2-IgG-Hベクター 12μgを用いて、取り扱い説明書に従って遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後2日目にhygromycinを、10% 牛胎児血清（ＦＣＳ）添加RPMI-1640培地に種々の濃度になるように添加し、その後、9日間培養を行なった。hygromycinにより薬剤耐性CHO-K1細胞の選択を行なった後、限界希釈法により細胞のクローン化を行ない、ELISAにより抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高発現している、クローンantiCD20 mAb-CHO細胞を取得した。

３．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の培養上清からの精製
２項で得られた抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を発現するantiCD20 mAb-CHO細胞を10% FCS添加RPMI-1640培地で培養し、培養シャーレの最大細胞密度の60%まで増加させた。Ca²⁺, Mg²⁺不含Phosphate-buffered saline (PBS(-))で２回洗浄して増殖培地を除去し、0.1%BSA添加RPMI-1640に置換して3日間培養し、上清を回収した。その上清を0.2μmのフィルターでろ過した後、常法によりProtein Gカラム（Amersham Bioscience社製）に吸着させ、0.1M Glycin Buffer (pH 2.8)で溶出を行ない、0.75M Tris-HCl (pH 9.0)を用いてpHを中和した。その後、常法によりPBS(-)で透析を行なった。この試料中の抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を、抗ヒトIgG抗体を用いたELISA法により濃度測定を行い、実験に使用した。

実施例２．Anti-CD20キメラ抗体の作製
1）Anti-CD20キメラ抗体の作製
キメラ抗体は、以下のA)〜F)の工程を経て、精製キメラ抗体として取得した。
A)キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング、
B)クローニングされた遺伝子の変異導入、
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築、
D)キメラ抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入、
E)キメラ抗体発現CHO細胞の培養、
F)キメラ抗体発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜F)の工程を順に記載する。

A) キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング
1種のAnti-CD20キメラ抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子、Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子、Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子である。この遺伝子のクローニング実施例について、以下に記述する。

（Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子）
本出願人が保有するAnti-CD20マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてmRNAを得た。そのmRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このcDNAを鋳型としてPCR法で遺伝子を増幅させるのであるが、以下に示す11パターンのPrimerの組み合わせによりPCR反応を行った。
PCR反応条件は、
マウスハイブリドーマからのcDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
MKV1〜MKV11 primer(20μM)の11種類中の1つ 2.5 μL
MKC primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
MKV1 primer：ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG（配列番号：１）
MKV2 primer：ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG（配列番号：２）
MKV3 primer：ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG（配列番号：３）
MKV4 primer：ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG（配列番号：４）
MKV5 primer：ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC（配列番号：５）
MKV6 primer：ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG（配列番号：６）
MKV7 primer：ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG（配列番号：７）
MKV8 primer：ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG（配列番号：８）
MKV9 primer：ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG（配列番号：９）
MKV10 primer：ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT（配列番号：１０）
MKV11 primer：ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC（配列番号：１１）
MKC primer：ACTGGATGGTGGGAAGATGG（配列番号：１２）
（M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT）

PCR反応では、MKV5とMKC primerの組み合わせにより、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子は挿入されたベクターをpCR2.1-MLVと名前を付けた。

（Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子）
Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子のクローニングと同様に、Anti-CD20マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から調整されたcDNAを鋳型として、以下に示す12パターンのPCR増幅を行った。
マウスハイブリドーマからのcDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
MHV1〜MHV12 primer(20μM)の12種類中の1つ 2.5 μL
MHCG2b primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
MHV1 primer：ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC（配列番号：１３）
MHV2 primer：ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT（配列番号：１４）
MHV3 primer：ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT（配列番号：１５）
MHV4 primer：ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT（配列番号：１６）
MHV5 primer：ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT（配列番号：１７）
MHV6 primer：ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC（配列番号：１８）
MHV7 primer：ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT（配列番号：１９）
MHV8 primer：ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG（配列番号：２０）
MHV9 primer：ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG（配列番号：２１）
MHV10 primer：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG（配列番号：２２）
MHV11 primer：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG（配列番号：２３）
MHV12 primer：ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG（配列番号：２４）
MHCG2b primer：CAGTGGATAGACTGATGGGGG（配列番号：２５）
（M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT）

PCR反応では、MHV7とMHCG2b primerの組み合わせにより、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをpCR2.1-MHVと名前を付けた。

（Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子）
ヒトの血液からLymphoprep(Axis Shield)を用いてリンパ球を取り出した。このリンパ球からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてmRNAを得た。そのmRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このヒトリンパ球からのcDNAを鋳型にして、以下のPCR反応を行いHuman IgG1 L鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをpCR2.1-LCと名前を付けた。
PCRの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球cDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
hIgG1 LCF primer(20μM) 2.5 μL
hIgG1 LCR primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
hIgG1 LCF primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC（配列番号：２６）
hIgG1 LCR primer：TTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT（配列番号：２７）

（Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子）
Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子のクローニングと同様にして、ヒトリンパ球からのcDNAを鋳型にして、以下のPCR反応を行いHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もpCR2.1ベクター（Invitrogen）に一時的に挿入され保管された。このベクターは、pCR2.1- HC (野生型)と名前を付けた。
PCRの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球cDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
hIgG1 HCF primer(20μM) 2.5 μL
hIgG1 HCR primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
hIgG1 HCF primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC（配列番号：２８）
hIgG1 HCR primer：TTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT（配列番号：２９）

B)クローニングされた遺伝子の変異導入
295Cysキメラ抗体を得るためには、クローニングされたHuman IgG1 H鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。本明細書においては、特に断りのない限り、Elvin A. KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域のEuindexの番号に従ってアミノ酸に番号を付している。295番のGlnをCysに変更するために、クローニングされたHunan IgG1 H鎖定常領域が挿入されたpCR2.1ベクター：pCR2.1-HC（野生型）を鋳型として、PCR法により変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。

295（Gln→Cys）への変異導入
pCR2.1-HC (野生型) (25 ng/μL) 2 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
295Cys1 primer(20μM) 1.25 μL
295Cys2 primer(20μM) 1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 35.5μL
Total 50μL
95℃ 30 sec
95℃ 30 sec 55℃ 1min 68℃ 13min (12サイクル)
68℃ 4min
4℃ 無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
295Cys1 primer：ACAAAGCCGCGTGAGGAGTGCTACAACAGCACGTACCGT（配列番号：３０）
295Cys2 primer：ACGGTACGTGCTGTTGTAGCACTCCTCACGCGGCTTTGT（配列番号：３１）

上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーションが終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異295（Gln→Cys）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したpCR2.1ベクターを得た。この変異導入されたベクターをpCR2.1-HC(295Cys)と名前を付けた。

C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築
1種類のAnti-CD20キメラ抗体を発現させるために、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型及び295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体を作製するにあたり、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターは、どちらのキメラ抗体を発現させるためにも共通に使用するものであるが、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型及び295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各キメラ抗体の発現に共通に使用できるAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に野生型及び295Cys型キメラ抗体の発現に必要な専用のAnti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。

Anti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMGneoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MLVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。また、Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-LCを鋳型として以下のPCR反応により断片を得た。

（Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MLV (20 ng/μL) 2μL
2.5 mM dNTPs 4μL
L1 primer(20μM) 2.5μL
L2 primer(20μM 2.5μL
DMSO 2.5μL
×10 pfu polymerase Buffer 5μL
pfu polymerase 1μL
滅菌水 30.5μL
total 50μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (20サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
L1 primer：ACCGCTCGAGATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGC（配列番号：３２）
L2 primer：TTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACC (5’-リン酸化されている)（配列番号：３３）

（Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-LC (20 ng/μL) 2μL
2.5 mM dNTPs 4μL
L3 primer(20μM) 2.5μL
L4 primer(20μM) 2.5μL
DMSO 2.5μL
×10 pfu polymerase Buffer 5μL
pfu polymerase 1μL
滅菌水 30.5μL
Total 50μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (20サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
L3 primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC(5’-リン酸化されている)（配列番号：３４）
L4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGT（配列番号：３５）

上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、PCR反応で得られたHuman IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMGneoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターは、pキメラLCと名前が付けられた。

Anti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMGneoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MHVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。野生型及び295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種Human IgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。

（Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MHV (20 ng/μL) 2μL
2.5 mM dNTPs 4μL
H1 primer(20μM) 2.5μL
H2 primer(20μM) 2.5μL
DMSO 2.5μL
×10 pfu polymerase Buffer 5μL
pfu polymerase 1μL
滅菌水 30.5μL
total 50μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (20サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
H1 primer：ACCGCTCGAGATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTC（配列番号：３６）
H2 primer：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC (5’-リン酸化されている)（配列番号：３７）

（Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL) 2μL
2.5 mM dNTPs 4μL
H3 primer(20μM) 2.5μL
H4 primer(20μM) 2.5μL
DMSO 2.5μL
×10 pfu polymerase Buffer 5μL
pfu polymerase 1μL
滅菌水 30.5μL
total 50μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (20サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：３８）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：３９）

#：野生型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295Cys)を鋳型として用いた。

上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMGneoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体H鎖の発現ベクターは、pキメラHC(野生型)、pキメラHC(295Cys)とそれぞれ名前が付けられた。

D)キメラ抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入
構築された各種発現ベクターは、以下の組み合わせでTransIT-CHO Transfection kit（Mirus, MIR2170）を使用してCHO細胞へ遺伝子導入された。
野生型キメラ抗体：pキメラLC+ pキメラHC（野生型）
295Cysキメラ抗体：pキメラLC+ pキメラHC (295Cys)

（ELISA測定）
その後、抗ＣＤ２０キメラ抗体を高発現している細胞をELISAによりスクリーニングして選択した。

E)キメラ抗体発現CHO細胞の培養
ELISA測定により選択されたキメラ抗体発現CHO細胞は、10％Fetal Bovine Serumと0.1 mg/mLのGeneticinを補足したDulbecco’s Modified Eagle’s Mediumで37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖させた。十分に増殖したキメラ抗体の発現CHO細胞は、0.1 mg/mLのGeneticinを補足した無血清培地であるCHO-S-SFMII（GIBCO, 12052-098）での培養に置き換えられ、継続して1000mL程度培養された。

F)キメラ抗体発現細胞の培養上清からのカラム精製
無血清培地であるCHO-S-SFMIIで培養されたキメラ抗体発現CHO細胞の培養上清は、回収された。野生型キメラ抗体の精製は、そのFc領域構造に変化を加えていないため、抗体精製に通常用いられるProtein Aカラム精製により実施された。しかしながら、295Cys型キメラ抗体はそのFc領域構造に変異を加えているために、Fc領域の構造変化を伴い、通常のProtein Aカラムへは、ほとんど吸着されない。この理由から、Cys型キメラ抗体では、Protein Lカラムを使用して精製を実施した。今回作製されたAnti-CD20キメラ抗体は、その可変領域がκ鎖である。このProtein Lは、この可変領域κ鎖を認識して結合できるタンパク質である。以下に、野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製とCys型キメラ抗体のProtein Lカラム精製の詳細を記述する。
野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製
1)1000 mL のCHO-S-SFMII培地で野生型キメラ抗体発現CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000 mLから100 mLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液に、Protein A-SepharoseであるrProtein A Sepharose Fast Flow (Amersham Bioscience, 17-1279-03) 8mLを添加し、2日間4℃で攪拌させてProtein Aに野生型キメラ抗体を吸着させた。
3)野生型キメラ抗体を吸着したProtein A-Sepharoseは、直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムに充填させた。
4)Protein A-Sepharoseが充填されたカラムは、PBS 100 mLで洗浄された後、Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムから野生型キメラ抗体を溶出した。溶出された野生型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてpHを中性にした。
5)野生型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収した野生型キメラ抗体を、精製品とした。
Cys型キメラ抗体のProtein Lカラム精製
1)1000 mL のCHO-S-SFMII培地でCys型キメラ抗体発現CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000mLから100mLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液100 mLは、ProteinL Binding Buffer (0.1M Phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.2) 100 mLを加えて混合された。
3)直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムにProtein L-SepharoseであるImmunoPure Immobilized Protein L Plus (PIERCE, 20250) 2 mLを充填させた。
4) 2）で調整した液をカラム上端から加えて、カラム下端からゆっくり流し出した。この操作でProtein L-SepharoseへCys型キメラ抗体を吸着させた。その後、Protein L Binding Buffer 50 mLでカラムを洗浄し、カラムに吸着した余分な蛋白を除去した。
5)Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムからCys型キメラ抗体を溶出した。溶出されたCys型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてpHを中性にした。
6)Cys型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収したCys型キメラ抗体を、精製品とした。
以上のように、精製された野生型キメラ抗体あるいはCys型キメラ抗体は、12.5％SDS-PAGEで電気泳動されたのち、銀染色された。この電気泳動像を図２に示す。

精製された各種キメラ抗体のフローサイト分析
カラム精製により得られた各種Anti-CD20キメラ抗体のCD20分子への反応性が同一であることを確かめるために、フローサイト分析が行われた。Bリンパ球が癌化したRaji細胞は、その細胞膜表面に多数のCD20分子を持つことが知られている。このフローサイト分析は、Raji細胞上のCD20分子を各種Anti-CD20キメラ抗体が認識できるかどうかについて検証された。以下に、測定方法を詳細に記述する。
１）10％のFetal Bovine Serum補足したRPMI-1640 (Sigma, R8758)培地で培養したRaji細胞10mL(細胞数：2×10⁷個)を遠心分離（1200 rpm, 5 min）して、その上清を除去して、Raji細胞ペレットを取り出した。
２）Raji細胞ペレットにWash Buffer (PBS+10％FCS) 10 mLを加えて懸濁し、再び遠心分離（1200 rpm, 5 min）してから、上清を除去した。
３）Raji細胞ペレットを2mLのWash Bufferで懸濁してから、各チューブへ0.3mLずつ細胞懸濁液を入れ、各チューブにさらに0.5 mLのWash Bufferを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
４）Raji細胞ペレットに、各種精製Anti-CD20キメラ抗体を5μLを加えて、30分間室温で反応させた。
（i）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
（ii）Raji細胞に、Wash Bufferで50倍希釈したAnti-Human IgG(γ-chain) FITC conjugated (MBL, code 214)を30μL加えて、15分間室温で反応させた。
（iii）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
（iv）Raji細胞ペレットにWash Buffer 0.5 mLを加えて懸濁し、フローサイト分析をFACSCalibur (Becton Dickinson)で行った。
以上のフローサイト分析結果を図３に示す。この結果より、野生型キメラ抗体及び295Cys型キメラ抗体のCD20への反応性は同じであることがわかる。

実施例３．Anti-EGFR抗体の作製
295Cys型Anti-CD20キメラ抗体は、野生型Anti-CD20キメラ抗体に比べて非常にADCC活性が高いものであったので、新たに野生型と295Cys型のAnti-EGFR抗体を作製して、Anti-CD20キメラ抗体の場合と同様の傾向があるかどうかを探索した。

（Anti-EGFRヒト抗体の発現ベクターの構築）
野生型と295Cys型のAnti-EGFRヒト抗体をCHO細胞で発現させるために、発現ベクターとして3種類の発現ベクター（Anti-EGFRヒト抗体L鎖発現ベクター、野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクター、295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクター）を構築した。各発現ベクターの構築の詳細を以下に記述する。
1）Anti-EGFRヒト抗体L鎖発現ベクターの構築
Anti-EGFRヒト抗体L鎖の可変領域と定常領域を含む遺伝子（DNA配列を配列番号：９０に示す）を鋳型として、以下に示すprimerを用いてPCR反応によりDNA断片を得た。
EGFR-L1 primer：ACCGCTCGAGATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC（配列番号：４０）
EGFR-L2 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTACGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT（配列番号：４１）
PCR反応で得られたDNA断片は、エタノール沈殿をして精製した後に、制限酵素Xho I(タカラバイオ、1094A)とNot I(タカラバイオ、Code 1166A)により処理された。BCMG-neoベクターも同様に制限酵素XhoIとNotIで処理された。次に、制限酵素処理されたPCR増幅DNA断片とBCMG-neoベクターをエチジウムブロミドを含む1％アガロースゲルで電気泳動された。電気泳動後、UV照射することで可視化されたDNA断片の中から目的サイズのDNA断片をゲルから切り出し、SUPREC-01(タカラバイオ、code 9040)を用いてゲルからDNA断片を抽出して精製された。ゲルからの切り出し精製されたPCR増幅断片とBCMG-neoベクターは、DNA Ligation kit Ver.2.1（タカラバイオ、code 6022）を用いてLigation反応させた。Ligation反応終了後のDNA溶液は、大腸菌JM109へTransformationするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドDNAをアルカリSDS法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Anti-EGFRヒト抗体のL鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これをAnti-EGFRヒト抗体L鎖発現ベクターとした。

2）野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクターと295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクターの構築
Anti-EGFRヒト抗体H鎖の可変領域を含む遺伝子（DNA配列を配列番号：４２に示す）を鋳型として、以下に示すprimerを用いてPCR反応によりDNA断片を得た。
EGFR-H1 primer：ACCGCTCGAGATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC（配列番号：４３）
EGFR-H2 primer：CGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG（5’-リン酸化されている）（配列番号：４４）
PCR反応で得られたDNA断片は、エタノール沈殿をして精製した後に、制限酵素Xho I(タカラバイオ、1094A)により処理された。次に、制限酵素処理されたPCR増幅DNA断片は、エチジウムブロミドを含む1％アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後、UV照射することで可視化されたDNA断片の中から目的サイズのDNA断片をゲルから切り出し、SUPREC-01(タカラバイオ、code 9040)を用いてゲルからDNA断片を抽出して精製された。この精製DNA断片が、Anti-EGFRヒト抗体H鎖可変領域遺伝子である。
Anti-EGFRヒト抗体の作製に必要なHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子は、Anti-CD20キメラ抗体を作製する際に使用したDNA断片と同様のものを使用した。プラスミドpCR2.1-HC (野生型)を鋳型として、H3 primerとH4 primerを用いてPCR増幅させてDNA断片を得た。そのDNA断片は、制限酵素Not Iで処理してから精製された。このDNA断片が、野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖定常領域遺伝子である。プラスミドpCR2.1-HC (295Cys)を鋳型にして、野生型と同様にH3 primerとH4 primerを用いてPCR増幅させて得られたDNA断片を制限酵素Not Iで処理してから精製したものが、295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖定常領域遺伝子である。
上記のように調整されたAnti-EGFRヒト抗体H鎖可変領域遺伝子断片と野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖定常領域遺伝子断片とBCMG-neoベクターをXho IとNot Iで切断して精製したDNA断片を混合して、DNA Ligation kit Ver.2.1（タカラバイオ、code 6022）を用いてLigation反応させた。Ligation反応終了後のDNA溶液は、大腸菌JM109へTransformationするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドDNAをアルカリSDS法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Anti-EGFRヒト抗体の野生型H鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクターとした。同様に、Anti-EGFRヒト抗体H鎖可変領域遺伝子断片と295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖定常領域遺伝子断片とBCMG-neoベクターをXho IとNot Iで切断して精製したDNA断片を混合して、DNA Ligation kit Ver.2.1（タカラバイオ、code 6022）を用いてLigation反応させた。Ligation反応終了後のDNA溶液は、大腸菌JM109へTransformationするのに使用され、得られた形質転換体からプラスミドDNAをアルカリSDS法にて精製した。精製されたプラスミドは、シークエンス解析が行われ、Anti-EGFRヒト抗体の295Cys型H鎖（可変領域と定常領域）遺伝子を含んでいることを確認し、これを295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクターとした。

（Anti-EGFRヒト抗体発現ベクターのCHO細胞への導入）
構築された発現ベクターは、以下の組み合わせでTransIT-CHO Transfection kit (Mirus, MIR2170)を使用してCHO細胞へ遺伝子導入された。
野生型Anti-EGFRヒト抗体をCHO細胞に産生させる場合：
Anti-EGFRヒト抗体L鎖発現ベクター＋野生型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクター
295Cys型Anti-EGFRヒト抗体をCHO細胞に産生させる場合：
Anti-EGFRヒト抗体L鎖発現ベクター＋295Cys型Anti-EGFRヒト抗体H鎖発現ベクター

（Anti-EGFRヒト抗体高発現CHO細胞の培養）
先に示したAnti-CD20キメラ抗体の作製時と全く同様にしてヒト抗体を高発現するクローンを選択し、選択されたヒト抗体高発現CHO細胞は培養された。

（Anti-EGFRヒト抗体発現CHO細胞の培養上清からのカラム精製）
野生型と295Cys型のAnti-EGFRヒト抗体は、野生型Anti-CD20キメラ抗体の精製同様に、Protein Aカラム精製することで高純度に得られた。得られたAnti-EGFRヒト抗体（野生型、295Cys型）は、15％SDS-PAGEで電気泳動された後、銀染色された。この電気泳動像を図４に示す。

（精製Anti-EGFR抗体のフローサイト分析）
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)は、別名HER-1と呼ばれ、170ｋDaの上皮組織で発現している膜蛋白である。このEGFRは、扁平上皮癌（肺癌）において高発現していることが知られているので、Anti-EGFRヒト抗体は、肺癌の治療薬候補として期待されている。これらの背景を踏まえて、肺癌由来の扁平上皮癌細胞であるNCI-H226が、今回作製されたAnti-EGFRヒト抗体に染色されるかどうかをフローサイト分析することで検証した。実験手順の詳細を以下に示す。
1）75 cm² Dishを培養容器として、10％のFetal Bovine Serum補足したRPMI-1640 (Sigma, R8758)培地でNCI-H226細胞を37℃のCO_２インキュベーターで培養した。
2）培養されたNCI-H226癌細胞は、接着性の細胞であるため、Dishから細胞を剥がす必要があるので、培地を除去した後、Cell Dissociation Buffer Enzyme-Free PBS-based (GIBCO, 13151-014)を5 mL加えて5分間37℃のCO_２インキュベーターに入れることで細胞を剥がした。
3）Dishから剥がしたNCI-H226細胞溶液は、遠心分離（1200 rpm, 5 min）して、その上清を除去して、NCI-H226細胞ペレットを取り出した。
4）NCI-H226細胞ペレットにWash Buffer (PBS+2％FCS) 10 mLを加えて懸濁し、再び遠心分離（1200 rpm, 5 min）してから、上清を除去した。
5）NCI-H226細胞ペレットを2mLのWash Bufferで懸濁してから、各チューブへ0.3mLずつ細胞懸濁液を入れ、各チューブにさらに0.5 mLのWash Bufferを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
6）NCI-H226細胞ペレットに、野生型あるいは295Cys型の精製Anti-EGFRヒト抗体を5μLを加えて、30分間室温で反応させた。
7）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。
8）NCI-H226細胞に、Wash Bufferで50倍希釈したAnti-Human IgG(γ-chain) FITC conjugated (MBL, code 214)を30μL加えて、15分間室温で反応させた。
9）Wash Buffer 1 mLを加えて懸濁した後、遠心分離（2000 rpm, 5 min）して上清を捨てた。最後に、NCI-H226細胞ペレットにWash Buffer 0.5 mLを加えて懸濁し、フローサイト分析をFACSCalibur (Becton Dickinson)で行った。
以上のフローサイト分析結果を図５に示す。この結果より、肺癌由来の扁平上皮癌細胞NCI-H226は、野生型あるいは295Cys型Anti-EGFRヒト抗体に強く染色されることから、細胞表面にEGFRが高発現していると言える。また、野生型と295Cys型のAnti-EGFRヒト抗体の染色程度が同一であることから、野生型と295Cys型の間で、細胞表面のEGFRを認識する能力は同一と見なされた。

実施例４．AILIM/ICOS-IgFc及びAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体
１．AILIM/ICOS-IｇFcキメラ分子発現ベクターの作製
１−１．AILIM/ICOSの細胞外ドメイン領域をコードするcDNAの構築
AILIM/ICOSの細胞外ドメイン領域をコードするcDNAは、活性化T細胞のmRNAから、AILIM/ICOSの既知配列情報を元に設計したPrimerを用いて、常法に従ってPCR法により単離した。以下に具体例を記載した。

調製例１で得たヒト末梢血単核球から、T細胞をPanT-Isolation Kit（Myltenyi社製）を用いて取扱説明書に従って精製した。精製T細胞を、抗CD3抗体（クローンOKT3、Ortho Biotech社製）を最終濃度1μg/mlと抗CD28抗体（クローン２８．２、BD社製）を最終濃度5μg/mlとなるようCa²⁺, Mg²⁺不含Phosphate-buffered saline (PBS(-))で希釈した溶液で、37℃、1時間、コートしたELISAプレートに、10⁵ cells/ウェルになるよう播きこみ、37℃で24時間、5％CO₂を含むCO₂インキュベータにて培養して活性化T細胞とした。活性化T細胞からRNAをTRIzol Reagent（Invitrogen社製）にて抽出し、このRNAの１μｇを鋳型としてcDNAを ReverTra Ace-a（東洋紡社製）を用いて、取り扱い説明書にしたがって合成した。この合成したcDNA溶液の0.2μlと、合成オリゴヌクレオチドとして下記のセンスプライマー（配列番号：４５）及びアンチセンスプライマー（配列番号：４６）をそれぞれ50 pmole用いて、最終容量50μlの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社製）を0.25μl加え、ExTaq polymerase付属のBufferを5μl添加して、３５サイクル、PCR反応を行った。
配列番号：４５：5’-tgttgctagcaaacatgaagtcaggcctc-3’ （AILIM/ICOSの配列に、NheIの配列を付加した）
配列番号：４６：5’- aacggatccttcagctggcaacaaag -3’（AILIM/ICOSの配列に、BamHIの配列を付加した）

PCR反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４５ｋｂｐのcDNA断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社製）を用いて、取扱説明書に従い精製した。cDNA濃度を260nmの吸光度（1O.D.260=50μg/ml）から算出した。この断片、1μgをそれぞれ10単位の制限酵素NheIと制限酵素BamHIで、取り扱い説明書に従って37℃で3時間切断したのち、上記と同様の方法で、制限酵素NheIとBamHIで切断された末端を有する、約０．４５ｋｂｐのAILIM/ICOS細胞外領域のcDNA断片を得た。

１−２．ヒトIgFcをコードするcDNAの構築
一方、ヒトイムノグロブリン１のFc領域（IgFc）をコードするcDNAは、GenBank Accession no. J00228に記載されているIgFcのアミノ酸配列をコードするcDNAを、ＰＣＲ法を用いて以下の手順で構築した。まず、GenBank Accession no. J00228のIgFcのアミノ酸配列をコードするcDNAの５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（IgFc cDNAの５’末端側の制限酵素BamHI配列、３’末端側の制限酵素NotI配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計８本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、下記のセンスプライマー（配列番号：４７）及びアンチセンスプライマー（配列番号：４８）からなるオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれの合成オリゴヌクレオチドを、最終濃度が０．１μMになるように、PCR反応液に添加し、最終容量50μlの反応系でExTaq polymerase（TaKaRa社製）を0.25μl加え、ExTaq polymerase付属のBufferを5μl添加して、３０サイクル、PCR反応を行った。
配列番号：４７：5’-tgaaggatcccgaggagcccaaatcttgtgacaa-3’ （IgFcの配列に、BamHIの配列を付加した）
配列番号：４８：5’- gaagcggccgctcatttacccggagacagggagaggctc -3’ （IgFcの配列に、NotIの配列を付加した）

PCR反応後、常法に従って１％アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４５ｋｂｐのcDNA断片を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega社製）を用いて、取扱説明書に従い精製した。cDNA濃度を260nmの吸光度（1O.D.260=50μg/ml）から算出した。この断片、1μgをそれぞれ10単位の制限酵素BamHIと制限酵素NotIで、取り扱い説明書に従って37℃で3時間切断した後、上記と同様の方法で、制限酵素BamHIとNotIで切断された末端を有する、約０．７６ｋｂｐのIgFc領域のcDNA断片を得た。

１−３．AILIM/ICOS-IｇFcキメラ分子発現ベクターの構築
これらのcDNA断片を組み込んだ発現ベクターを構築するため、発現ベクター、pIRES-puro2（Clontech社製）、1μgを、それぞれ10単位の制限酵素NheIと制限酵素NotIで、取り扱い説明書に従って37℃で3時間切断したのち、上記と同様の方法で、制限酵素NheIとNotIで切断された末端を有する、pIRES-puro2 cDNA断片を得た。この断片と、制限酵素NheIとBamHIで切断された末端を有する、約０．４５ｋｂｐのAILIM/ICOS細胞外領域のcDNA断片、並びに制限酵素BamHIとNotIで切断された末端を有する、約０．７６ｋｂｐのIgFc領域のcDNA断片をLigation High（東洋紡社製）を用いて取り扱い説明書に従って連結した後、形質転換用の大腸菌、DH5α（東洋紡社製）を形質転換した。得られたコロニーをNZY brothにて16時間、液体培養を行った。形質転換した大腸菌からWizard plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega社製）によりPlasmidを精製した。その後、ABI 3100-Avant(Applied Biosystems)を用いて、取り扱い説明書に従って反応を行ってDNA配列を確認し、AILIM/ICOSの細胞外領域とIｇFcを連結したキメラ分子のcDNAを発現するベクター、pIRESpuro2-AILIM/ICOS-IgFcを得た。

２．AILIM/ICOS-IgFc Cys変異体発現ベクターの作製
pIRESpuro2-AILIM/ICOS-IgFcを鋳型として、Quick Change Site-Directed AILIM/ICOS-IgFc分子の223番目（kabat のEU indexで、295番目を指す）のグルタミン残基（DNA配列のコドン、ＣＡＧ）をシステイン残基（DNA配列のコドン、ＴＧＣ）に変異を導入するため、下記のセンスプライマー（配列番号：４９）とアンチセンスプライマー（配列番号：５０）を合成し、Mutagenesis Kit (STRATAGENE)を用いて取扱説明書に従って反応した。
配列番号：４９：5’-caaagccgcgggaggagtgctacaacagcacgtaccgg-3’
配列番号：５０：5’-ccggtacgtgctgttgtagcactcctcccgcggctttg-3’

変異導入後、コンピテント大腸菌を形質転換して得られたコロニーをNZY brothにて16時間、液体培養を行った。形質転換した大腸菌からWizard plus SV Minipreps DNA Purification Kit（Promega社製）によりPlasmidを精製した。その後、ABI 3100-Avant(Applied Biosystems)を用いて、取り扱い説明書に従って反応を行ってDNA配列の確認を行い、当該部位のみの変異を有する発現ベクター、pIRES-puro2 AILIM-IgFc Cys変異体を得た。AILIM-IgFc Cysをコードする塩基配列を配列番号：９４に、該塩基配列から生成されるアミノ酸配列を配列番号：９９に示す（図６−１及び６−２参照）。配列番号：９９に記載のアミノ酸配列における１４４番目から３７５番目のアミノ酸は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２１６番目から４４７番目のアミノ酸に相当する。図６−１及び６−２中、AILIM/ICOSの細胞外領域の配列を波下線で示し、ヒトIgG1Fc領域の配列を下線で示し、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５（配列番号：９９に記載のアミノ酸配列では２２３番目）のグルタミンをシステインに置換した部位を枠内に示した。なお、キメラ分子の変異体において、変異が導入される前のアミノ酸配列を配列番号：１０２に、それをコードする塩基配列を配列番号：１０１に示す。

３．AILIM/ICOS-IgFc、並びにAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体を発現するCHO-K1細胞の作製
CHO-K1細胞、1x10⁶個に対して、FuGENE 36μlと、pIREpuro2-AILIM/ICOS-IgFc、またはpIRESpuro2-AILIM/ICOS-IgFc Cys変異体 12μgを用いて、取り扱い説明書に従って遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後2日目にPuromycinを、10% 牛胎児血清（ＦＣＳ）添加RPMI-1640培地に終濃度0.5-5μg/mlになるように添加し、その後、9日間培養を行なった。puromycinにより薬剤耐性CHO-K1細胞の選択を行なった後、限界希釈法により細胞のクローン化を行ない、AILIM/ICOS-IgFc、またはAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体を高発現している細胞を、抗AILIM/ICOS抗体を用いたELISAによりスクリーニングして選択した。

４．AILIM/ICOS-IgFc、並びにAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体の生産と精製
AILIM/ICOS-IgFc、並びにAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体高発現細胞を、10% FCS添加RPMI-1640培地で培養し、培養シャーレの最大細胞密度の60%まで増加させた。Ca²⁺, Mg²⁺不含Phosphate-buffered saline (PBS(-))で２回洗浄して増殖培地を除去し、0.1%BSA添加RPMI-1640に置換して3日間培養し、上清を回収した。その上清を0.2μmのフィルターでろ過した後、常法によりProtein Gカラム（Amersham Bioscience社製）に吸着させ、0.1M Glycin Buffer (pH 2.8)で溶出を行ない、0.75M Tris-HCl (pH 9.0)を用いてpHを中和した。その後、常法によりPBS(-)で透析を行なった。この試料中のAILIM/ICOS-IgFc、またはAILIM/ICOS-IｇFc Cys変異体の濃度を、抗AILIM/ICOS抗体を用いたELISA法により測定した。

（評価方法）
抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性の測定
（１）実施例１で得た抗CD20抗体及びそのCys変異体のADCC活性の測定
抗CD20抗体によるADCC活性測定には、ターゲット細胞としてDaudi細胞とエフェクター細胞としてヒト末梢血単核球を用いた。常法によりDaudi細胞を10％ FCS RPMI1640培地に2x10⁵cells/mlの濃度になるよう懸濁し、２５μlずつU底の96ウェルプレート（Falcon社製）に播いた。抗CD20キメラ抗体を各種濃度になるよう10％ FCS RPMI1640培地で希釈し、２５μlずつU底96ウェルプレート（Falcon社製）にさらに添加し、37℃にて１時間、反応させた。その後、末梢血単核球を2.5x10⁵cells/ウェルとなるように添加し、37度にて１６時間、培養した。培養後、培養プレートを遠心して、上清を５０μlずつウェルごとに回収し、新しい平底の96ウェルプレートに移した。各ウェルにAssay Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay、Promega社製)を50μl加え、室温で30分、遮光下で反応させ、その後、50μlのStop Buffer(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を加え、それぞれのOD値を490nmで測定した。

細胞傷害率を算定するための基準として、Daudi細胞を含むウェル、ヒト末梢血単核球を含むウェルを最終溶液量100μlで用意しておき、Daudi細胞を含むウェルの半数に10μlのLysis Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を添加し、４５分間、反応して、細胞を溶解した。その後、実験条件群と同様に、上清50μlを新しい平底96ウェルプレートに移し、Assay Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を50μl加え、室温で30分、遮光下で反応させ、その後、50μlのStop Buffer(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を加え、それぞれのOD値を490nmで測定した。このとき、Daudi細胞、及びヒト末梢血単核球細胞を含むウェルでのOD値の合計を細胞傷害率、０％とし、Lysis Bufferを添加したDaudi細胞を含むウェルのOD値からLysis Bufferを添加していないDaudi細胞を含むウェルのOD値を差し引いた値を１００％として、細胞傷害算出のための標準線を求めた。各種条件下における細胞傷害活性はこの標準線から算出した。実験データは、それぞれの実験条件において３ウェル以上の数で実験を行い、その平均値と標準誤差を算出した。これらの結果を図７に示す。図７に示されるように、抗CD20抗体のCys変異体は、抗CD20抗体と比較して低い抗体濃度でのＡＤＣＣ活性が高く、加えて０．０１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度における最大ＡＤＣＣ活性の向上効果は顕著であった。

（２）実施例２で得た抗CD20抗体及びそのCys変異体のADCC活性の測定
キメラ抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価は、lactate dehydrogenase release assayにより行った。このAssayでは、Target細胞としてCD20分子を細胞膜表面に持つHuman Bリンパ球細胞であるRaji細胞を用い、Effector細胞として、Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)を用いた。このHuman PBMCは、Lymphoprep (Axis Shield)を使って、ヒトの血液から調整された。
Raji細胞（1×10⁴個/50μL）は、96-well U-bottomedプレートの各wellに入れ、Effector細胞であるHuman PBMCが、E/T ratioが20/1となるように2×10⁵個加えられた。この細胞液にさらに、Anti-CD20キメラ抗体を連続的な希釈系列となるように添加して、37℃で4〜6時間保温された。保温後に、96-well U-bottomedプレートは、遠心分離され、その上清中のlactate dehydrogenase activityをCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, G1780)を用いて測定された。抗体依存的かつ特異的な細胞障害(Cytotoxicity)％は、以下の式と用いて算出された。
% Cytotoxicity = 100×（E−S_E−S_T）/(M−S_T)

ここで、EとはExperimental releaseを表し、抗体とEffctor細胞が、Target細胞と共に保温された時のTarget細胞からrelaeseされたlactate dehydrogenase活性である。S_Eとは、Effector細胞からの自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。S_Tとは、Target細胞からも自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。Mとは、Target細胞の最大に放出されるlactate dehydrogenase活性を表し、これはLysis Solution (9％ Triton X-100)の添加により、Target細胞から放出されたlactate dehydrogenase活性である。
以上のような評価方法により、野生型及び295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性結果を図８に示す。この図８から、野生型キメラ抗体のADCC活性と比較して、295Cys型キメラ抗体は非常に高いADCC活性を示すことがわかる。
また295Cys型キメラ抗体は、通常の濃度よりも低い濃度（0.001μg/mL以上の濃度）においてもADCC活性を発揮することが確認された（図８）。

さらに、抗CD20野生型抗体と295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。その結果、添加した抗体の濃度が0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型抗体の場合はそれぞれ0.31％、1.25％、3.52％、10.93％、16.63％、20.52％、295Cys型キメラ抗体の場合はそれぞれ6.38％、11.52％、19.66％、30.25％、35.69％、38.24％であった。よって、ADCC活性の比（野生型抗体と変異型抗体が同一濃度である2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、20.6倍、9.2倍、5.6倍、2.8倍、2.1倍、1.9倍となることがわかった（表８）。

また表８より、野生型抗体と295Cys型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、295Cys型キメラ抗体は0.01μg/mLで約20％、野生型抗体は1μg/mLで約20％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が1000分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約1000倍上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が1000倍になった）と判断することが出来る。
このようなADCC活性の上昇（約100-1000倍程度）は、他の濃度域でも確認された。当業者であれば、上記の方法に倣い、図８および表８よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。

（３）実施例３で得た抗EGFR抗体及びそのCys変異体のADCC活性の測定
Anti-EGFRヒト抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価は、lactate dehydrogenase release assayにより行った。このAssayでは、Target細胞としてEGFR分子を細胞膜表面に持つNCI-H226細胞を用い、Effector細胞として、Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)を用いた。このHuman PBMCは、Lymphoprep (Axis Shield)を使って、ヒトの血液から調整された。
NCI-H226細胞（1×10⁴個/50μL）は、96-well U-bottomedプレートの各wellに入れ、Effector細胞であるHuman PBMCが、E/T ratioが20/1となるように2×10⁵個加えられた。この細胞液にさらに、野生型あるいは295Cys型のAnti-EGFRヒト抗体を連続的な希釈系列となるように添加して、37℃で16時間保温された。保温後に、96-well U-bottomedプレートは、遠心分離され、その上清中のlactate dehydrogenase activityをCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, G1780)を用いて測定された。抗体依存的かつ特異的な細胞障害(Cytotoxicity)％は、以下の式と用いて算出された。
% Cytotoxicity = 100×（E−S_E−S_T>）/(M−S_T)
ここで、EとはExperimental releaseを表し、抗体とEffctor細胞が、Target細胞と共に保温された時のTarget細胞からrelaeseされたlactate dehydrogenase活性である。S_Eとは、Effector細胞からの自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。S_Tとは、Target細胞からも自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。Mとは、Target細胞の最大に放出されるlactate dehydrogenase活性を表し、これはLysis Solution (9％ Triton X-100)の添加により、Target細胞から放出されたlactate dehydrogenase活性である。
以上のような評価方法により、野生型と295Cys型Anti-EGFRヒト抗体のADCC活性結果を図９に示す。この図９の結果より、Anti-EGFRヒト抗体は、Anti-CD20キメラ抗体の場合と同様に、295Cys型は、野生型に比べて1000倍以上の高いADCC活性を示した。
また295Cys型Anti-EGFRヒト抗体は、通常の濃度よりも低い濃度（0.00001-0.0001μg/mL以上の濃度）においてもADCC活性を発揮することが確認された（図９）。

さらに、抗EGFR野生型抗体と295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。その結果、添加した抗体の濃度が0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、野生型抗体の場合それぞれ0.5％、1.1％、0.8％、2.4％、6.7％、8.7％、8.9％、295Cys型キメラ抗体の場合はそれぞれ1.0％、2.2％、2.4％、10.1％、16.8％、20.6％、18.6％であった。よって、ADCC活性の比（野生型抗体と変異型抗体が同一濃度である2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、1.9倍、2.0倍、2.9倍、4.3倍、2.5倍、2.4倍、2.1倍となることがわかった（表９）。

また表９より、野生型抗体と295Cys型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、295Cys型キメラ抗体は0.01μg/mLで約10％、野生型抗体は10μg/mLで約９％の細胞障害を示している。
この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が1000分の1以下に減少した。このことから、ADCC活性が1000倍以上上昇した（野生型抗体と変異型抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が1000倍以上となった）と判断することが出来る。
このようなADCC活性の上昇（約10-100倍程度）は、他の濃度域でも確認された。当業者であれば、上記の方法に倣い、図９および表９よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。

（４）実施例４で得たAILIM/ICOS-IgFcキメラ分子及びそのCys変異体のADCC活性の測定
AILIM/ICOS-IgFcキメラ分子によるADCC活性測定には、ターゲット細胞としてB7h発現Ba/F3細胞とエフェクター細胞としてヒト末梢血単核球を用いた。常法によりB7h発現Ba/F3細胞を10％ FCS RPMI1640培地（10% WEHI-3培養上清（IL-3））に4x10⁵cells/mlの濃度になるよう懸濁し、２５μlずつU底の96ウェルプレート（Falcon社製）に播いた。AILIM/ICOS-IgFcキメラ抗体を各種濃度になるよう10％ FCS RPMI1640培地（10% WEHI-3培養上清添加（IL-3））で希釈し、２５μlずつU底96ウェルプレート（Falcon社製）にさらに添加し、37℃にて１時間、反応させた。その後、末梢血単核球を5x10⁵cells/ウェルとなるように添加し、37度にて１６時間、培養した。培養後、培養プレートを遠心して、上清を５０μlずつウェルごとに回収し、新しい平底の96ウェルプレートに移した。各ウェルにAssay Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay、Promega社製)を50μl加え、室温で30分、遮光下で反応させ、その後、50μlのStop Buffer(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を加え、それぞれのOD値を490nmで測定した。

細胞傷害率を算定するための基準として、B7h発現Ba/F3細胞を含むウェル、ヒト末梢血単核球を含むウェルを最終溶液量100μlで用意しておき、B7h発現Ba/F3細胞を含むウェルの半数に10μlのLysis Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を添加し、４５分間、反応して、細胞を溶解した。その後、実験条件群と同様に、上清50μlを新しい平底96ウェルプレートに移し、Assay Buffer (CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を50μl加え、室温で30分、遮光下で反応させ、その後、50μlのStop Buffer(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)を加え、それぞれのOD値を490nmで測定した。このとき、B7h発現Ba/F3細胞、及びヒト末梢血単核球細胞を含むウェルでのOD値の合計を細胞傷害率、０％とし、Lysis Bufferを添加したB7h発現Ba/F3細胞を含むウェルのOD値からLysis Bufferを添加していないB7h発現Ba/F3細胞を含むウェルのOD値を差し引いた値を１００％として、細胞傷害算出のための標準線を求めた。各種条件下における細胞傷害活性はこの標準線から算出した。実験データは、それぞれの実験条件において３ウェル以上の数で実験を行い、その平均値と標準誤差を算出した。これらの結果を図１０に示す。図１０に示されるように、AILIM/ICOS-IgFcキメラ分子のCys変異体は、野生型AILIM/ICOS-IgFcキメラ分子と比較して低い抗体濃度でのＡＤＣＣ活性が高く、加えて１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度における最大ＡＤＣＣ活性の向上効果は顕著であった。

実施例５．抗ＣＤ２０抗体Ｃｙｓ２９５変異体を用いたＣＤ１６との反応性解析
ＣＤ１６高発現CHO-K1を１ｘ１０^５cells/mlで懸濁し（細胞懸濁液:３mM EDTA・０．５％ＢＳＡ・ＰＢＳ（―））５０μｌ（５００００cells分）ポリスチレンラウンドチューブに分取した。抗ＣＤ２０抗体のＷｉｌｄ−ｔｙｐｅ及びＣｙｓ２９５変異体を、２０μｇ／ｍｌから２倍希釈で８段階希釈し（抗体希釈溶液：３ｍＭＥＤＴＡ・０．５％ＢＳＡ・ＰＢＳ（−））、５０μｌ／tube加え、３７℃、１ｈｒ反応させた。
３ｍＭＥＤＴＡ・０．５％ＢＳＡ・ＰＢＳ（−）で洗浄した後、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗Ｉｇκchain（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．＃３４１７２Ｄ）を５００倍希釈し１００μｌ／tube加え３７℃、１．５ｈｒｓ反応させた。３ｍＭＥＤＴＡ・０．５％ＢＳＡ・ＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ・ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．＃５５４０６１（Ｗａｓ：１３０２５Ｄ））を４００倍希釈し１００μｌ／tube加え、３７℃、３０分反応させた。反応後３ｍＭＥＤＴＡ・０．５％ＢＳＡ・ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＬiburによって細胞を取り込み、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ＢＤ）を用いて解析した。

結果
抗ＣＤ２０抗体Ｃｙｓ２９５変異体のＣＤ１６との反応性解析の結果を図１１に示す。抗ＣＤ２０抗体Ｃｙｓ２９５変異体は抗ＣＤ２０抗体Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅと比較して約８倍ＣＤ１６との親和性が高いことが明らかとなった。さらに抗ＣＤ２０抗体Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅでは最大約８０％の結合を有していたのに対し、抗ＣＤ２０抗体Ｃｙｓ２９５変異体では約９５％の結合が検出された。そのため抗ＣＤ２０抗体Ｃｙｓ２９５変異体ではＡＤＣＣにおける抗体機能が上昇している可能性が示唆される。
なおBiaCore測定結果によると、レセプターとキメラ抗体の結合強度は、レセプターと野生型抗体の結合強度と比較して十倍程度増強した。

実施例６．AILIM−IgFcキメラ分子Gln223CysにおけるCD16結合反応性の解析
１．目的
AILIM−IgFcキメラ分子のIgFcドメインにはアミノ酸225番目にＮ-結合型糖鎖が付加することが知られている。その近傍である223番目（kabat のEU indexで、295番目を指す）のグルタミン（Gln，Q）をシステイン（Cys，C）に置換した場合（AILIM−IgFc Gln223Cys）のADCC活性について解析を行なった。

２．材料
1) 抗体
AlLIM-IgFc Wt 1.42 mg/m1
AlLIM-IgFc Cys223 1.11 mg/ml
HRP 標識Mouse 抗 Human IgG 抗体：ZYMED, Lot#; 40789491
2) 細胞
CD16a 発現 CHO-K1
3) その他の試薬
Phosphate Buffered Saline (PBS(-))
Bovine Serum Albumin (BSA) : Thermo, Cat#; 303050-500GM, Lot.#; 513
2NA(EDTA・2Na) : DOJINDO, Cat.#; 345-01865
4) 器具、機器
FACSculiber (Becton Dickinson)
FACSチューブ (FALCON. Cat#;352008)
低速遠心機(HITACHI)

３．方法
1．1次抗体反応
CD16a発現CHO−K1細胞を3mM EDTA-BSA-PBS(-)(EBP)を用いて細胞をはがし、Cell
countを行なった。今回の細胞濃度は7.2x10⁵cells/mlであり、必要量の細胞懸濁液を15mlチューブに分取し、1800r.p.m、3minで遠心後、EBPに置き換えた後、5x10⁴ cells/25
μl／チューブで分注した。AILIM−IgFc Wild TypeとCys223を20μl/mlに調整し、2倍希釈で全8段階作製し、それぞれをチューブに注ぎ4℃で1hr反応させた。
2. 2次抗体反応
1時間後、EBPを4ml/チューブで分注し、1800r.p.m、3minで遠心し、上清を除去した（wash）。上清除去後、液の残量が約60μlであることを確認し、EBPで500倍希釈したBiotin標識抗AILIM抗体を1μl/チューブで添加して、4℃で1hr反応させた。
3．3次抗体反応
反応終了後、EBPを4ml/チューブで分注し、1800r.p.m、3minで遠心し、上清を除去した（wash）。上清除去後、液の残量が約60μlであることを確認し、EBPで400倍希釈したPE標識Streptavidinを100μl/チューブで添加して、4℃で30min反応させた。
4．FACSによる解析
反応終了後、EBPを4ml/チューブで分注し、1800r.p.m、3minで遠心し、上清を除去した（wash）。そして、FACSculiberにより解析を行なった。
４．結果
AILIM−IgFcキメラ分子Gln223CysのCD16結合反応性の解析の結果を図１２に示す。AILIM-IgFc WtとCys223の、PE標識抗体の結合された細胞の割合を比較した結果、Wtは1.25μg/mlの濃度から上がりだしているのに対して、Cys223では0．625μg/mlから上がっていた。グラフから、CD16aに対する反応性はWtに比べてCys223の方が約2倍上昇していることが明らかになった。
なおBiaCore測定結果によると、レセプターとキメラ分子の結合強度は、レセプターと野生型キメラ分子の結合強度と比較して十倍程度増強した。
５．考察
今回の結果から、AILIM-IgFcの223番目のGlnをCysに置換することで、CD16aとの結合性が上昇することが示唆された。このことは、実施例４に記載のAILIM-IgFc Gln223CysによるADCC活性上昇の一因になると考えられる。

本発明のポリペプチド変異体によれば、抗体のＦｃ領域における特定のアミノ酸残基に変異を加えることにより、エフェクター機能を著しく向上することができる。このようなポリペプチド変異体からなる治療用組成物は、少量で優れた薬理効果を得ることができるため、抗体医薬として極めて有用である。また、使用量の低減によりコストを抑えることができ、しかも特異性が高く副作用が少ないため、患者の経済的、身体的負担を極めて軽減することができる。また、抗体を用いた治療と併用されてきた化学療法や放射性同位元素標識抗体などの他の治療方法を控えることができ、これらの治療方法による副作用を回避することも可能である。

Claims

ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位よりＮ末端側に向かって２番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むポリペプチド変異体。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むポリペプチド変異体。
置換前と比較してエフェクター機能が向上した、請求項１又は２記載のポリペプチド変異体。
Ｆｃ領域がヒトＩｇＧのＦｃ領域である請求項１〜３の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
Ｆｃ領域の糖鎖修飾部位にＮ−結合型糖鎖を有している請求項１〜４の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
ヒト細胞表層存在分子を認識する部位を有する、請求項１〜５の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
抗体の変異体であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた変異体である請求項１〜６の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、請求項７記載のポリペプチド変異体。
抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、請求項８記載のポリペプチド変異体。
細胞表層存在分子を認識する部位、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体である、請求項１〜６の何れかの項に記載のポリペプチド変異体。
サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合する、請求項１０記載のポリペプチド変異体。
ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７ｈ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つのヒト細胞表層存在分子に結合する、請求項１１記載のポリペプチド変異体。
請求項１〜１２の何れかの項に記載のポリペプチド変異体をコードする単離された核酸。
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
請求項１４に記載のベクターを有する宿主細胞又は宿主生物。
請求項１５に記載の宿主細胞又は宿主生物を、核酸がコードするポリペプチド変異体を発現するように培養することを特徴とするポリペプチド変異体の製造方法。
請求項１〜１２の何れかの項に記載のポリペプチド変異体を含む治療用組成物。
以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の変異体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程、
（２）細胞表層存在分子を認識する部位及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置換されたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
以下（１）から（５）の工程を含むエフェクター機能が向上したキメラ分子の変異体の製造方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程、
（４）細胞表層存在分子を認識する部位、及びＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられたＦｃ領域を含むキメラ分子の変異体をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（５）発現産物を回収する工程。
エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法。
細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むエフェクター機能を有するキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法。
以下（１）から（３）の工程を含む、キメラ分子のエフェクター機能を向上させる方法；
（１）細胞表層存在分子を認識する部位及びＦｃ領域を含むキメラ分子を製造する工程、
（２）製造されたキメラ分子がエフェクター機能を有するか否かを判定する工程、及び
（３）エフェクター機能を有すると判定されたキメラ分子におけるＦｃ領域中のアミノ酸残基であって、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で２９５番目のアミノ酸をシステイン残基に置換する工程。