JPWO2007029630A1 - 新規なセラミダーゼ及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
Microbial degradation of polyurethane, polyester polyurethanes and polyether polyurethanes. T. Nakajima-Kambe, Y. Shigeno-Akutsu, N. Nomura, F. Onuma, T. Nakahara. Appl. Microbiol. Biotechnol. , 51, 134-140 (1995) Biodegradation of polyurethane: a review, G. T. Howard. Int. Biodet. Biodeg., 49, 245-252 (2002)
[1] 以下の(a)または(b)の蛋白質であるセラミダーゼ:
(a) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質。
[2] 以下の(a)または(b)の蛋白質をコードするDNA:
(a) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質。
[3] 以下の(a)または(b)のDNA:
(a) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、
(b) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
[4] cDNAである態様2または3記載のDNA。
[5] 態様2〜4のいずれか一項に記載のDNAを含む組換え用DNA。
[6] 組換え用DNAがプラスミドベクターである、態様5記載の組換え用DNA。
[7] 態様5叉は6記載の組換え用DNAを有する形質転換体。
[8]形質転換体の宿主が原核微生物叉は真核微生物であることを特徴とする、態様7記載の形質転換体。
[9]原核微生物がエシェリシア属、バチルス属、叉はストレプトマイセス属であることを特徴とする、態様8記載の形質転換体。
「10」真核微生物が、酵母、叉は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、リズプス属、メタリチウム属、アクレモニウム属、及びムコール属からなる群から選択される真核糸状菌であることを特徴とする、態様8記載の形質転換体
[11] 宿主がアスペルギルス・オリゼ叉はアスペルギルス・ソーエであることを特徴とする、態様10記載の形質転換体。
[12] 更にエステラーゼをコードするDNAを含む組換え用DNAを有する、態様7〜11のいずれか一項に記載の形質転換体。
[13] エステラーゼがリパーゼまたはクチナーゼである、態様12記載の形質転換体。
[14] 態様7〜13のいずれか一項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からセラミダーゼを採取することを含む、セラミダーゼの製造法。
[15] 態様1記載のセラミダーゼを用いて高分子物質を分解する方法。
[16] 態様1記載のセラミダーゼを用いて高分子物質に含まれるウレタン結合及び/又はアミド結合を分解する方法。
[17] 態様1記載のセラミダーゼとエステラーゼとの組み合わせを用いて高分子物質を分解する方法。
[18] エステラーゼがリパーゼまたはクチナーゼである、態様16記載の方法。
[19] 態様7〜13のいずれか一項に記載の形質転換体を高分子物質に接触させることを含む、高分子物質を分解する方法。
[20] 高分子物質がポリウレタン、任意の割合でウレタン結合を含むポリエステル、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ナイロン、ポリスチレン、デンプン、及びそれらの混合物から成る群から選択されることを特徴と刷る、態様15〜19のいずれか一項に記載の方法。
[21] 高分子物質が生分解性プラスチックであることを特徴とする、態様15〜19のいずれか一項に記載の方法。
[22] 生分解性プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンコハク酸、ポリブチレンコハク酸・アジピン酸、脂肪族ポリエステル、ポリカプロラクトン、叉はポリハイドロキシ酪酸である態様21記載の方法。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987))に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
1 x 106 個胞子 / ml となるように麹菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)RIB40株の胞子懸濁液を 3 リットル 容坂口フラスコ内の1 (w/v %) PBSA 乳化液を唯一の炭素源とした Czapek-Dox 培地1リットルに接種した。30℃にて7日間振盪培養し、その培養液をMIRACROTH (CALBIOCHEM(商品登録))で濾過し菌体を除いた。その濾液を20 % の硫酸アンモニウムで飽和させ1時間氷冷し、10,000×g 、4℃にて30分間遠心分離による沈殿を除去した。その上清を10 mM Tris-HCl 緩衝液、 pH 8.0、 20 % 飽和硫酸アンモニウムで飽和させた Octyl-cellulofine type-S (生化学工業) に供した後、1リットルの精製水でカラムを洗浄した。洗浄後のカラムを0-70 % エタノールの直線勾配で溶出した。
クローニングされた目的遺伝子の周辺塩基配列を参考に一組のオリゴヌクレオチドを設計した(配列番号2:5‘-GTTGCGCACGtgTTCTAATGTCG-3’、 配列番号3:5‘-GCGATGTCTAgATCCCCGAGTCC-3’)。アスペルギルス・オリゼRIB40株のゲノムDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。増幅反応は、95℃、3 分間鋳型 DNA を変性し、95℃、1分間、55℃、1分間、72℃, 3分間保持するサイクルを30 サイクル行った後、72℃、5分間で完全伸長させ、4℃で保持した。そのPCRによる増幅断片をアガロース電気泳動にて確認を行ったところ約3,269塩基対の増幅が見られた。
アスペルギルス・オリゼの形質転換はプロトプラスト-PEG法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドDNAは上記で作製したpNEN-Cer及び pNEN142 を用いた。これらのプラスミドDNA10μgをBamHIで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後 10μlのTEに溶解し形質転換用DNA溶液とした。
形質転換されたセラミダーゼ高発現麹菌とセラミダーゼ遺伝子を挿入していない麹菌(pNEN142)を 3 ml のYPM 培地 ( 1 (w/v%) 酵母エキス , 2 (w/v%) ペプトン , 2 (w/v%) マルトース) に1 x 106 胞子/ml 濃度で植菌し、30℃ , 24 時間振盪培養した。培養後、ガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清 0.2 ml に対して 50 μlの 100 (w/v%) 冷トリクロロ酢酸を加え、よく混合した後、氷中に 20 分間放置した。サンプルを 15,000 x g , 4℃ , 20 分間遠心分離し上清を完全に除いた後、沈澱を 15μl のSDS化溶液に溶解させたあと、沸騰湯浴中に5分間放置し SDS化を行い SDS-PAGE に供した。その後、電気泳動したゲルをPVDF膜に転写し、PVDF膜上より 100 kDa の断片を切り抜き、そのままアミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった。セラミダーゼ高発現麹菌でのみ発現しているタンパク質のペプチド配列の解析の結果、アミノ末端領域のアミノ酸配列が「NTEFA 」であり、セラミダーゼの推定アミノ酸配列(配列番号1のアミノ酸配列における第46〜50番目のアミノ酸)と完全一致したためセラミダーゼの高発現が確認された(図3)。
セラミダーゼ高発現株の胞子を1×106 個胞子/ml になるように、 1リットルの YPM 培地を入れた3リットル容坂口フラスコに接種し 30℃で 24 時間培養した。培養液を MIRACLOTH (CALBIOCHEM) にて濾過し、培養上清を得た。培養上清に40% 飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた後、10,000 x g , 4℃, 40 分間遠心分離し、得られた上清画分を得た。上清画分を 10 mM トリス-塩酸緩衝液, pH 8.0、 40 % 飽和硫安にて平衡化したOctyl-cellulofine type-S(生化学工業)に供した後、1リットルの精製水でカラムを洗浄した。洗浄後のカラムを0-70 % エタノールの直線勾配で溶出した。溶出させた全画分を SDS-PAGEに供し、100 kDa のセラミダーゼが含まれた画分を回収した。回収した画分を 10 mM Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.0) で透析し、同緩衝液で平衡化した DEAE-cellulofine A-500 に供し、吸着画分を NaCl、 0-0.5M の直線勾配で溶出させた。回収した全画分を SDS-PAGE に供し、銀染色により 100 kDa であるセラミダーゼの単一バンドが確認されたため、これをセラミダーゼの精製標品とした。精製されたセラミダーゼをミリQ水に対して透析を行った後凍結乾燥を行い、セラミダーゼの乾燥粉末を得た。
セラミダーゼ精製標品の PBSA 分解について検討を行った。セラミダーゼの凍結乾燥粉末を 50 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)に溶解し、100 μg/ml となるように調整した。また、PBSA 分解酵素である麹菌由来のクチナーゼも 100 μg/ml となるように50 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)に溶解した。96穴マイクロタイタープレートのウェルに50 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)に懸濁してある0.15 (w/v) PBSA 乳化液 100μlを入れ、次の条件で各ウェルに酵素を添加した。
(条件2)10 μl の50 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)と 10 μl の100 μg/ml のセラミダーゼ溶液を混合して添加
(条件3)10 μl の50 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)と 10 μl の100 μg/ml のクチナーゼ溶液を混合して添加
(条件4)10 μl の100 μg/ml のクチナーゼ溶液と 10 μl の100 μg/ml のセラミダーゼ溶液を混合して添加
ポリブチレンスクシネート(PBS、分子量:6万)のペレット 4 mg を 2 ml の 50 mM Tris 塩酸緩衝液(pH 8.5)に懸濁した。この PBS を含む溶液を二つに分け、片方に 100 μl の セラミダーゼ溶液(100 mg/ml)を加え、もう片方にはコントロールとして 100 μl の 50 mM Tris 塩酸緩衝液(pH 8.5)を加えた。この溶液を 37℃ で 12 時間保温した。それぞれの溶液に 500 μl のクチナーゼ溶液(185 μg/ml)を加え 37 ℃ にて 12 時間保温し、PBS のペレットを完全に分解した。この PBS 分解物 400 μl を排除分子量 1 万のセントリカット超ミニ(クラボウ)に供し限外濾過を行った。この濾過物を逆相クロマトグラフィーに供し、PBS 分解物の変化を観察した。尚、逆相クロマトグラフィーの解析に用いた機種は L-4000 UV Detector(日立製作所)、L-6200 Intelligent Pump(日立製作所)、L-6000 Pump(日立製作所)であり、解析条件は以下の通りである。使用カラム:Shodex C18P-4E(昭和電工)、カラム温度:室温、流速:1.0 ml/min、溶離液A:水 / 酢酸 = 100 / 0.1(v/v)、溶離液 B: アセトニトリル / 酢酸 = 100 / 0.1(v/v)、溶出勾配条件(Gradient B [%])= 5(0 min) → 5(5 min) → 100 (50 min)→ 100(60 min)→ 5 (61 min)→ 5(75 min)。解析の結果、セラミダーゼの添加によって保持時間 22.7 分に出現するピークの減少が観察された(図5)。この 22.7 分に出現するピークは 2分子の1,4 ブタンジオールと1分子の1,6-ヘキサメチレンジイソシアネートからなるエステル化合物(以下、便宜上「 BHB」(図6)とする)であった。BHB はその分子内に二つのウレタン結合を含む。セラミダーゼはセラミド分子内のアミド結合を分解する作用があるため、構造的に類似している BHB のウレタン結合をセラミダーゼが分解している。
セラミダーゼの活性はジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第275巻、第3462-3468頁(2000)に記載されている方法を一部改変して行った。すなわち20 μlの25 mM トリス塩酸緩衝液(pH 7.5)中に 550 pmol の、C12-NBD-セラミド(Avanti Polar Lipids, Inc.)、及び適当量のセラミダーゼを溶解した反応混合液を37℃で30分間インキュベートした。この反応液を沸騰水浴で 5 分間インキュベートすることで反応を停止した。得られた反応液を凍結乾燥し、水分を完全に除いた後、乾固物をクロロホルム/メタノール=2/1(V/V)に溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/28%アンモニア水=90/20/0.5(V/V/V))で展開した。その後、Fla-2000(フジフィルム)を用い、励起波長 473 nm、蛍光波長 520 で上記の反応によって生成した C12-NBD-脂肪酸の定量を行った。反応系にセラミダーゼを加えなかった場合はC12-NBD-セラミドのスポットのみが検出されたが、反応系にセラミダーゼを加えた場合において C12-NBD-セラミドの分解物である C12-NBD-脂肪酸のスポットが検出された(図7)。このことより本麹菌セラミダーゼはセラミド分解活性を有することが証明された。
Claims (22)
- 以下の(a)または(b)の蛋白質であるセラミダーゼ:
(a) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)または(b)の蛋白質をコードするDNA:
(a) 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)または(b)のDNA:
(a) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、
(b) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつセラミダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。 - cDNAである請求項2または3記載のDNA。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載のDNAを含む組換え用DNA。
- 組換え用DNAがプラスミドベクターである、請求項5記載の組換え用DNA。
- 請求項5叉は6記載の組換え用DNAを有する形質転換体。
- 形質転換体の宿主が原核微生物叉は真核微生物であることを特徴とする、請求項7記載の形質転換体。
- 原核微生物がエシェリシア属、バチルス属、叉はストレプトマイセス属であることを特徴とする、請求項8記載の形質転換体。
- 真核微生物が、酵母、叉は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、リズプス属、メタリチウム属、アクレモニウム属、及びムコール属からなる群から選択される真核糸状菌であることを特徴とする、請求項8記載の形質転換体
- 宿主がアスペルギルス・オリゼ叉はアスペルギルス・ソーエであることを特徴とする、請求項10記載の形質転換体。
- 更にエステラーゼをコードするDNAを含む組換え用DNAを有する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の形質転換体。
- エステラーゼがリパーゼまたはクチナーゼである、請求項12記載の形質転換体。
- 請求項7〜13のいずれか一項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からセラミダーゼを採取することを含む、セラミダーゼの製造法。
- 請求項1記載のセラミダーゼを用いて高分子物質を分解する方法。
- 請求項1記載のセラミダーゼを用いて高分子物質に含まれるウレタン結合及び/又はアミド結合を分解する方法。
- 請求項1記載のセラミダーゼとエステラーゼとの組み合わせを用いて高分子物質を分解する方法。
- エステラーゼがリパーゼまたはクチナーゼである、請求項16記載の方法。
- 請求項7〜13のいずれか一項に記載の形質転換体を高分子物質に接触させることを含む、高分子物質を分解する方法。
- 高分子物質がポリウレタン、任意の割合でウレタン結合を含むポリエステル、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ナイロン、ポリスチレン、デンプン、及びそれらの混合物から成る群から選択されることを特徴とする、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 高分子物質が生分解性プラスチックであることを特徴とする、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 生分解性プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンコハク酸、ポリブチレンコハク酸・アジピン酸、脂肪族ポリエステル、ポリカプロラクトン、叉はポリハイドロキシ酪酸である請求項21記載の方法。
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