JPWO2006121178A1 - 変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子を用いた形質転換方法 - Google Patents
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Abstract
Description
大腸菌及びネズミチフス菌には、ALSのイソ酵素が3種存在していることが知られている。これら各々のイソ酵素は、酵素の触媒活性を司る分子量の大きい触媒サブユニットと分岐鎖アミノ酸が結合することによりフィードバック阻害剤として機能する分子量の小さい制御サブユニットとからなるヘテロオリゴマーである(Chipman et al.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401−419,1998〔非特許文献1〕)。触媒サブユニットは、それぞれI1v IH、I1v GM、I1v BNオペロンに位置している。一方、酵母菌の場合、ALSは、単一な酵素であるが、細菌と同様に触媒サブユニットと制御サブユニットとからなり(Panget al.,Biochemistry,38,5222−5231,1999〔非特許文献2〕)、触媒蛋白質サブユニットはILV2座位に位置している。
植物におけるALSの場合も、上述した微生物と同じように触媒サブユニットと制御サブユニットとからなることが知られている(Hershey et al.,Plant Molecular Biology.40,795−806,1999〔非特許文献3〕)。例えば、双子葉植物のタバコの場合、ALSの触媒サブユニットは、SuRA及びSuRBの2つの遺伝子座位によってコードされ(Lee et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988〔非特許文献4〕)、トウモロコシの場合、ALSの触媒サブユニットは、als1及びals2の2つの遺伝子座位にコードされている(Burr et al.,Trendsin Genetics 7,55−61,1991〔非特許文献5〕;Lawrence et al.,Plant Mol.Biol.18,1185−1187,1992〔非特許文献6〕)。触媒サブユニットをコードする遺伝子に関しては、双子葉植物の場合、タバコだけでなくアラビドプシス(Arabidopsis)、ナタネ、ワタ、オナモミ(Xanthium)、アマランサス(Amaranthus)及びホウキギ(kochia)等について完全に塩基配列が決定されている(Chipman et al.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401−419,1998〔非特許文献1〕及び国際公開公報W097/08327参照〔特許文献1〕)。単子葉植物でもトウモロコシやイネにおいて塩基配列が完全に決定されている。
スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤並びにピリミジニルカルボキシ系除草剤(以下、「PC系除草剤」という。)等の除草剤は、このALSを阻害することによって植物の成長を抑制することが知られている(Ray,Plant Physiol.75,827−831,1984〔非特許文献7〕;Shaner et al.,Plant Physiol.76,545−546,1984〔非特許文献8〕;Subramanian et al.,Plant Physiol.96,310−313,1991〔非特許文献9〕;Shimizu et al.,J.Pestic.Sci.19,59−67,1994〔非特許文献10〕)。
これら除草剤に対して抵抗性を有する植物としては、ALSをコードする遺伝子において、種を越えて保存されている保存領域中の1個又は2個のアミノ酸置換を引き起こす1個又は2個の塩基置換を有しているものが知られている。例えば、スルホニルウレア系除草剤に対して強い抵抗性を有するALSをコードするもの(Kathleen et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988〔非特許文献11〕;Mourad et al.,Planta,188,491−497,1992〔非特許文献12〕;Guttieri et al.,Weed Sci.43,175−178,1995〔非特許文献13〕;Bernasconi et al.,J.Biol.Chem.270,17381−17385,1995〔非特許文献14〕及び特開昭63−71184号公報参照〔特許文献2〕)、イミダゾリノン系除草剤に対して強い抵抗性を有するALSをコードするもの(Mourad et al.,Planta,188,491−497,1992〔非特許文献12〕;Lee et al.,FEBS Lett.452,341−345,1999〔非特許文献15〕及び特開平5−227964号公報参照〔特許文献3〕)、PC除草剤に対して強い抵抗性を有するALSをコードするもの(WO02/44385A1〔特許文献4〕及びWO03/083118A1〔特許文献5〕参照)、或いはスルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、PC除草剤に対して抵抗性を有するALSをコードするもの(Kathleen et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988〔非特許文献11〕;Bernasconi et al.,J.Biol.Chem.270,17381−17385,1995〔非特許文献14〕;Hattori et al.,Mol.Gen.Genet.246,419−425,1995〔非特許文献16〕;Alison et al.,Plant Physiol.111,1353,1996〔非特許文献17〕;Rajasekarauet al.,Plant Sci.119,115−124,1996〔非特許文献18〕、特開昭63−71184号公報〔特許文献2〕、特開平4−311392号公報〔特許文献6〕、Bernasconi et al.,US Patent 5633437,1997〔特許文献7〕、WO02/44385A1〔特許文献4〕及びWO03/083118A1〔特許文献5〕参照)が挙げられる。
また、スルホニルウレア系除草剤に特異的に抵抗性を示すALSを有する個体とイミダゾリノン系除草剤に特異的に抵抗性を示すALSを有する個体とを掛け合わせて、両方に抵抗性を示す植物体を作る試みもなされている(Mourad et al.,Mol.Gen.Genet,243,178−184,1994〔非特許文献19〕)。さらに、ALSをコードする遺伝子を人為的に除草剤抵抗性遺伝子へ変えることも行われており(Ott et al.,J.Mol.Biol.263,359−368,1996〔非特許文献20〕、特開昭63−71184号公報〔特許文献2〕、特開平5−227964号公報〔特許文献3〕、特表平11−504213号公報〔特許文献8〕参照)、1個のアミノ酸の欠失がスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に抵抗性を示すことが明かにされている(特開平5−227964号公報〔特許文献3〕参照)。
上述のように除草剤に対する抵抗性を有するALS及びALSをコードする遺伝子について精力的に研究されてきた経緯があるが、PC系除草剤抵抗性を指標とし、PC系除草剤に対してのみ特異的な抵抗性を有する変異ALS遺伝子については現在までに報告が無かった。特定の除草剤に対して特異的な抵抗性を有する変異ALS遺伝子が得られれば、当該変異ALS遺伝子を様々な用途に使用できると考えられるが、PC系除草剤に対する特異性の点で有用な変異ALS遺伝子については現在までに報告されていない。
Chipman et al.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401−419,1998 Panget al.,Biochemistry,38,5222−5231,1999 Hershey et al.,Plant Molecular Biology.40,795−806,1999 Lee et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988 Burr et al.,Trendsin Genetics 7,55−61,1991 Lawrence et al.,Plant Mol.Biol.18,1185−1187,1992 Ray,Plant Physiol.75,827−831,1984 Shaner et al.,Plant Physiol.76,545−546,1984 Subramanian et al.,Plant Physiol.96,310−313,1991 Shimizu et al.,J.Pestic.Sci.19,59−67,1994 Kathleen et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988 Mourad et al.,Planta,188,491−497,1992 Guttieri et al.,Weed Sci.43,175−178,1995 Bernasconi et al.,J.Biol.Chem.270,17381−17385,1995 Lee et al.,FEBS Lett.452,341−345,1999 Hattori et al.,Mol.Gen.Genet.246,419−425,1995 Alison et al.,Plant Physiol.111,1353,1996 Rajasekarauet al.,Plant Sci.119,115−124,1996 Mourad et al.,Mol.Gen.Genet,243,178−184,1994 Ott et al.,J.Mol.Biol.263,359−368,1996
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、特定の変異を有するALSがPC系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すことを明らかにし、当該変異を有するALSをコードする遺伝子を選抜マーカーとして使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1) 目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換細胞をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で培養する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする形質転換方法。
(2) 上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする(1)記載の形質転換方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列における95番目のアラニンを除く、少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
(3) 上記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする(1)記載の形質転換方法。
(4) 目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換植物をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で育成する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする植物育成方法。
(5) 上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする(4)記載の植物育成方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列における95番目のアラニンを除く、少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005−136186号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図2−1は、イネ由来の変異型ALS遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図2−2は、イネ由来の変異型ALS遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図2−3は、イネ由来の変異型ALS遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。
図3は、bispyribac−sodiumを含む発根培地におけるG95A−1系統及びG95A−2系統由来のクローン個体における発根を観察した結果を示す写真である。
図4は、G95A変異型ALS発現ベクターの作製方法を説明する模式図である。
図5は、野生型ALSに対する阻害50%濃度を基準としたG95A変異型ALSの薬剤抵抗性比(RS比)を示す特性図である。
本発明のアセト乳酸シンターゼタンパク質(以下、「変異型ALSタンパク質」という。)は、野生型ALSタンパク質における所定の部位を変異させることによって得ることができる。イネ由来の野生型ALSタンパク質においては、N末端のメチオニンから数えて95番のアミノ酸がグリシンである。本発明の変異型ALSタンパク質では、この95番目のグリシンがアラニンに置換されている。すなわち、イネ由来の本発明に係る変異型ALSタンパク質は、95番目のグリシンがアラニンに置換された(G95Aと表記する)アミノ酸配列を有している。イネ由来の変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子(以下、「変異型ALS遺伝子」という。)の塩基配列及び変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1及び2に示す。
図1に、イネ由来の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列とイネ由来の野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。なお、図1において、一列目のアミノ酸配列は変異型ALSタンパク質を示し、二列目のアミノ酸配列は野生型ALSタンパク質を示している。
イネ由来の変異型ALS遺伝子(配列番号1)は、イネ由来の野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子と比較して、野生型ALSタンパク質における95番目のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドンに置換されたものである。図2−1〜図2−3に、イネ由来の変異型ALS遺伝子の塩基配列とイネ由来の野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列とを比較した結果を示す。なお、図2−1〜図2−3において、一列目の塩基配列は変異型ALS遺伝子を示し、二列目の塩基配列は野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子を示している。
この変異型ALS遺伝子は、日本型イネ品種である台中65号のゲノムDNAに存在する野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子に対して、上述したような変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する手法としては、従来より公知の手法を使用することができ、例えば、部位特異的変異導入法を用いることができる。部位特異的変異導入法は、市販のキット、例えばMutan−K(宝酒造株式会社製)、GeneEditor(プロメガ社製)、ExSite(ストラタジーン社製)等を使用して行うことができる。なお、変異ALSタンパク質をコードする遺伝子は、PC系除草剤感受性の野生株培養細胞をPC系除草剤の存在下で培養し、その後、出現したPC系除草剤に対する抵抗性を示す変異株培養細胞から得ることができる。
本発明に係る変異型ALS遺伝子は、配列番号1に示したイネ由来の遺伝子に限定されず、広く植物由来のALS遺伝子から取得することができる。例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン、イタリアングラス、タバコ及びシロイヌナズナ等に由来するALS遺伝子に、同様の変異を導入することによって本発明に係る変異型ALS遺伝子を取得することができる。ここで、同様の変異とは、イネ由来の野生型ALSタンパク質における95番目のグリシンに相当するグリシン(植物によっては95番目ではない場合がある)をアラニンに置換する変異を意味する。
トウモロコシ由来の2種類の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3及び4に示す。コムギ由来の2種類の変異型ALSタンパク質の部分アミノ酸配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。ワタ由来の2種類の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7及び8に示す。ナタネ由来の2種類の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。タバコ由来の2種類の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号11及び12に示す。イタリアングラス由来の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列を配列番号13に示す。シロイヌナズナ由来の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示す。
変異型ALSタンパク質は、由来に依存せず、イネ由来の野生型ALSタンパク質における95番目のグリシンに相当するグリシンがアラニンに置換されている限り、PC系除草剤に対して特異的に抵抗性を示すものとなる。
変異型ALSタンパク質は、野生型ALSタンパク質と比較して、PC系除草剤に対する優れた抵抗性を有する。このことは、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌等の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで形質転換された大腸菌から得られる変異型ALSの除草剤感受性を調べることにより判断することができる。
ここで、PC系除草剤としては、化1に示すように、bispyribac−Sodium,pyrithiobac−sodium,pyriminobacを例示することができる。
植物を形質転換する手法としては、従来より公知の手法を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)を用いて外来遺伝子を標的植物細胞に導入する手法を例示することができる。
具体的には、アグロバクテリウムのTiプラスミドのT−DNA配列を含んでいるバイナリーベクターに変異型ALS遺伝子及び目的遺伝子を挿入する。このTiプラスミドを大腸菌等に形質転換する。次に、大腸菌等で増殖させた変異型ALS遺伝子及び目的遺伝子を保持するバイナリーベクターを、ヘルパープラスミドを含んでいるアグロバクテリウム菌に形質転換する。そして、このアグロバクテリウム菌を、標的とする植物に感染させた後、形質転換植物を同定する。同定された形質転換植物が培養細胞の場合には、従来より公知の手法により、その植物細胞を完全な植物に再生させることができる。
また、変異型ALS遺伝子及び目的遺伝子を有する組換えベクターを、標的とする植物に形質転換する場合、従来より公知の手法を用いて直接的に植物体に導入してもよい。さらに、変異型ALS遺伝子及び目的遺伝子を有する組換えベクターを形質転換する方法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
一方、変異型ALS遺伝子及び目的遺伝子は、単子葉植物及び双子葉植物等のいかなる種類の植物に形質転換してもよい。変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する対象の作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコ等を挙げることができる。さらに、変異型遺伝子及び目的遺伝子を導入することによって、芝草や樹木等を形質転換してもよい。
いずれの場合であっても、変異型ALS遺伝子を植物に形質転換することによって、当該植物に対して、PC系除草剤に対して特異的な抵抗性を付与することができる。特に、PC系除草剤は、スルホニルウレア系除草剤やイミダゾリノン系除草剤と異なり水溶性であるため、取扱いが容易であり有機溶媒による宿主細胞への影響を排除できるため、形質転換における薬剤として使用することが好ましい。また、PC系除草剤は、イミダゾリノン系除草剤よりも約100倍強いALS阻害活性を示すので、微量のPC除草剤で形質転換体を選抜できる。
以下、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
イネ品種「台中65号」の穂ばらみ期において一核期の葯が最も多く得られる、葉耳間長6〜8cmの幼穂を採取した。その際、茎は止葉前葉の節の下で水切りし、幼穂を直接包んでいる止葉と止葉前葉の2枚以外の葉を除去した。
茎の基部を水を含ませたペーパータオルで包み、ビニール袋で覆い暗黒下・10℃で5〜10日間の低温処理を行った。その後、クリーンベンチ内で幼穂を取り出し、70%エタノールで10分滅菌し、滅菌したキムタオル(クレシア、東京)上で乾かした。一核期の葯が含まれる半透明の穎花を滅菌したピンセットで開き、葯のみを取り出し、カルス誘導培地(N6CI培地、表1)に置床した。これを連続明期・30℃で培養し、3週間毎に新しい培地に継代した。
カルス誘導後5週間目の葯培養由来カルスを0.25μMのbispyribac−Sodiumを含むカルス誘導培地で4週間培養した。次に、増殖したカルスを0.5μMのbispyribac−sodiumを含む再分化培地(表2)で4週間培養し、アルビノの再分化植物を得た。継代は全て2週間毎に行った。
上述の方法で選抜された個体の2系統をG95A−1系統及びG95A−2系統とし、アルビノ個体であったため、MS培地で培養し株分けして増殖した。
Bispyribac−sodium抵抗性の程度を検定するため、0、1、5、10、20μMのbispyribac−sodiumを含む発根培地(表3)へG95A−1系統から株分けしたクローン個体を移植した(図3A:シャーレ左側、アルビノのため白色)。クローン個体の少ないG95A−2系統は5μMのみで検定を行った。対照区としては播種後2週間目の野生型台中65号を用い(図3各シャーレ右側)、移植後1週間目(図3B)、2週間目(図3C)の植物体を観察した。その結果、G95A−1及びG95A−2の両系統とも、全ての濃度のbispyribac−sodium含有培地で新たな発根が見られ抵抗性を示したが、対照区の野生型はbispyribac−Sodium含有培地で全て枯死した。
上記の2系統の葉(約0.5×1cm)を1.5mlチューブに入れ、50℃で2時間以上乾燥させた。チューブ内に直径3mmのガラスビーズBZ−3(井内盛栄堂)を4粒入れ、ミキサーミルMM300(Retsch)で葉を粉砕した後、300μlの抽出バッファー(200mM Tris−HCl(pH.7.5)、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5% SDS)を加えて懸濁した。この懸濁液を14,000rpmで5分間遠心分離し、その上清200μlを新しいチューブに移し、200μlイソプロパノールを加えた。これを14,000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、得られた沈澱を3分間真空乾燥した。この沈澱に50μlの1/5×TEを加えた後14,000rpmで1分間遠心分離し、これをゲノムDNA溶液とした。
調製したゲノムDNAを鋳型とし、下記に示すプライマーを用いてPCR−ダイレクトシークエンシングによりALS遺伝子の全領域の配列を解析した。PCRにはExTaq(タカラバイオ株式会社)を用いた。反応は、94℃1分で初期変性後、94℃30秒、58℃30秒、72℃40秒のサイクルを40回行った。ALSF2とALS2Rのプライマーの組み合わせの場合はPCRxエンハンサー(インビトロジェン社)を加え、94℃1分で初期変性後、94℃1分、50℃1分、72℃1分のサイクルを40回行った。それぞれのPCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、Mini Elute Gel Extraction kit(QIAGEN社)を用いて精製した。
このPCR産物を鋳型として、ABI Sequencing kitを用いて下記のプライマーによりシークエンス反応を行った。ALSF2、ALS2Rのプライマーを用いる場合はシークエンスRxエンハンサー溶液A(インビトロジェン社)を加えた。シークエンス反応条件は96℃10秒、50℃5秒、60℃4分を35サイクルで行った。シークエンス反応後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,U.S.A.)により塩基配列を決定した。
ALSF2(5’−CCACCACCCACCATGGCTACG−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の−12−9番目に対応;配列番号15)
ALS2R(5’−GAAGAGGTGGTTGGTGATGA−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の326−345番目に対応;配列番号16)
ALS12(5’−GCAACCAACCTCGTGTCCGC−3,センスプライマー,ALS遺伝子の436−455番目に対応;配列番号17)
ALS22(5’−GAAGGCTTCCTGTATGACGC−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の620−639番目に対応;配列番号18)
ALS13(5’−GAATTGCGCTGGTTTGTTGA−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の868−887番目に対応;配列番号19)
ALS23(5’−CTCAATTTTCCCTGTCACACG−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1051−1071番目に対応;配列番号20)
ALS24F(5’−GGTAGCTTCCTCATGAACAT−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の1537−1556番目に対応;配列番号21)
ALS24R(5’−AATGTTCATGAGGAAGCTAC−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1538−1557番目に対応;配列番号22)
ALS25(5’−CATTCAGGTCAAACATAGGCC−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1919−1989番目に対応;配列番号23)
こうして上記2系統のALS遺伝子配列を調べたところ、両者ともにALSの95番目のアミノ酸が1塩基置換によりグリシン(GGC)からアラニン(GCC)へ置換していた。
pUC18ベクターに組み込んだイネ由来W548L/S627I 2点変異型ALS(WO02/44385A1参照)を鋳型として、95番目のグリシン部分のコドンを縮重したセンスプライマーALS−M5(5’−TACCCGGGCNNNGCGTCCATGGAGATCCA−3’:アミノ酸配列で92−101番目に対応;配列番号24)と191−196番目のアミノ酸配列に対応するアンチセンスプライマーALS−RspA(5’−TGTGCTTGGTGATGGA−3’;配列番号25)で増幅したPCR生成物をpT7Blue−Tベクターにクローニングし、このベクターで常法により大腸菌(HB−101株)を形質転換した。
同プライマーセットによりコロニーPCRを行いシークエンス解析し、95番目のグリシン(GGC)部分がセリン(AGC)、システイン(TGC)、チロシン(TAT)、アラニン(GCA)、バリン(GTG)、ロイシン(CTG)、イソロイシン(ATA)、メチオニン(ATG)、トリプトファン(TGG)、フェニルアラニン(TTT)、アスパラギン酸(GAT)、グルタミン酸(GAG)、アルギニン(CGG)に変異したコロニーを得た。アラニン変異体については、大腸菌を液体培養後、プラスミドを抽出し、SmaIで切断した。電気泳動後アガロースゲルから変異型ALS遺伝子断片を精製し、SmaIで消化後にBAP処理して精製したイネ由来W548L/S627I 2点変異型ALS遺伝子を組み込んだpUC18ベクターにライゲートした。出来上がったG95A/W548L/S627I 3点変異型ALS遺伝子を持つpUC18ベクターからG95A部分を含むNcoI断片を切り出し、NcoI処理後にBAP処理した野生型ALS遺伝子が組込んだ大腸菌タンパク発現ベクター(pGEX−2T)とライゲートし、G95A 1点変異型ALS遺伝子を持つpGEX−2T発現ベクターを得た(図4)。
本ベクターで形質転換された大腸菌(JM109株)を2ml*10本37℃で12時間培養し、プラスミド抽出装置(TOMY DP−480)によりプラスミドを抽出(500μl)後、遠心濃縮により200μl程度まで濃縮した。GFX PCR and Gel Purification Kit(Amersham Bioscience)で脱塩し最終的には200μlの滅菌水で溶出した。このプラスミドをBigDye Terminator ver.1.1 cycle sequencing kit(Applied Biosystems)を用いてシークエンス反応を行った。[総容量20μl(鋳型DNA13μl、プライマー(3.2pmol/μl)1μl、pre−mix4μl、dilution buffer2μl)、反応条件:初期denaturing 96℃(5min)、denaturing 96℃(5sec)−annealing50℃(5sec)−elongation60℃(4min)のサイクルで40回、最終サイクルのelongationは60℃(9min)]シークエンス反応後、AutoSeq G−50 column(Amersham Bioscience)を用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去した。反応サンプルをABI PRIZM 310 genetic analyserで測定し、シークエンスを確認した。シークエンス用のプライマーとしては以下の配列のプライマーを用いた。
PGEX−5(5’−GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の上流側;配列番号26)
ALS−RspC(5’−CAGCGACGTGTTCGCCTA−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の258−275番目に対応;配列番号27)
ALS−M1(5’−CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の510−539番目に対応;配列番号28)
ALS−Rsp3(5’−CTGGGACACCTCGATGAAT−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の720−738番目に対応;配列番号29)
ALS−Rsp7(5’−AACTGGGATACCAGTCAGCTC−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の886−906番目に対応;配列番号30)
ALS−Rsp1(5’−GCTCTGCTACAACAGAGCACA−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の1192−1212番目に対応;配列番号31)
3−1−3(5’−GATTGCCTCACCTTTCG−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1346−1362番目に対応;配列番号32)
4−83−10(5’−CAGCCCAAATCCCATTG−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1457−1473番目に対応;配列番号33)
3−1−4(5’−AGGTGTCACAGTTGTTG−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の1506−1522番目に対応;配列番号34)
ALS−RspB(5’−TCAAGGACATGATCCTGGATGG−3’,センスプライマー,ALS遺伝子の1892−1913番目に対応;配列番号35)
ALS−Rsp2(5’−AGTCCTGCCATCACCATCCAG−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の1906−1926番目に対応;配列番号36)
PGEX−3(5’−CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG−3’,アンチセンスプライマー,ALS遺伝子の下流側;配列番号37)
実施例6で作製したG95A変異型ALS遺伝子を持つpGEX−2T及び野生型ALS遺伝子を持つpGEX−2T(WO02/44385A1参照)で形質転換した大腸菌を、2mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて27℃でそれぞれ振とう培養(前培養)した。この前培養液1mlを用いて250mlのアンピシリンを含むLB液体培地で、それぞれ本培養を行った。一晩培養後、1mM IPTGを加えてさらに3時間〜4時間培養することによって、GST融合タンパク質の発現誘導を行った。なお、菌体はALS抽出緩衝液(30%グリセロールと0.5mM MgCl2を含んだリン酸カリウム緩衝液pH7.5)で洗浄後−80℃で保存した。
大腸菌からのALSの調製と精製は次の方法で行った。先ず、−80℃に保存しておいた大腸菌のペレットを、ALS抽出緩衝液に懸濁した(培養液50mlから得られたペレットに対して2.5mlのALS抽出緩衝液を添加)。この懸濁液を超音波処理(Heat Systems−Ultrasonics社製、Sonicator W−225R、マイクロチップ、アウトプットコントロール8、約1秒インターバル、40秒2回)した後、4℃、15000×gで20分間遠心し、その上澄を粗酵索溶液とした。これにより、GST融合G95A変異型ALSタンパク質及びGST融合野生型ALSタンパク質の粗酵素溶液を調製した。
活性測定反応に使用する反応溶液は、20mMのピルビン酸ナトリウム、0.5mMのチアミンピロリン酸、0.5mMのMgCl2、10μMのフラビンアデニンジヌクレオチド、10mMのバリン(大腸菌由来のALS活性を阻害するために添加)並びに20mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)からなる溶液に、活性測定対象のGST融合ALSを混合したものである。この反応溶液を0.5ml使用した。測定反応は、測定対象のGST融合ALSを添加した後、37℃で30分行った。また、測定反応は、0.05mlの6N硫酸を添加することにより停止させた。次に、反応が終了した反応溶液を37℃で60分間インキュベートした。これにより、反応溶液中に含まれるアセト乳酸をアセトインに変化させた。次に、反応溶液中に含まれるアセトインを定量するため、0.5%(w/v)のクレアチン0.05mlと2.5Nの水酸化ナトリウムに溶かした5%(w/v)のα−ナフトール0.05mlとを添加し、37℃で10分間インキュベートした。その後、反応溶液における吸光度525nmを比色することでアセトインを定量し、ALS活性を評価した。なお、反応0時間を対照区とした。薬剤の阻害活性を調べる場合には、bispyribac−sodiumとpyrithiobac−sosiumは100倍濃度の水溶液を作製して反応液中へ添加した。水溶性の低いpyriminobac、chlorsulfuron、bensulfuron−methyl、imazaquin並びにimazapyrは100倍濃度のアセトン溶液を作製して反応液中へ添加した。
発現させたG95A変異型ALSに対する各種ALS阻害剤の阻害活性を調べた結果、bispyribac−sodium、pyrithiobac−sosium並びにpyriminobacの阻害活性は極めて弱かったが(100μMで50%以下の阻害活性)、chlorsulfuronの阻害活性は強く、また、bensulfuron−methyl、imazaquin並びにimazapyrも阻害活性を示すことがわかった(表4)。
そこで、G95A変異型ALSに対する各薬剤の阻害50%濃度と野生型ALS(GST融合野生型ALS)に対する阻害50%濃度を比較して、野生型ALSに対する阻害50%濃度を基準としたG95A変異型ALSの薬剤抵抗性比(RS比)を算出したところ、bispyribac−sodium、pyrithiobac−sosium並びにpyriminobacのRS比はそれぞれ16,000倍以上、9,100倍以上、13,000倍以上であったが、chlorsulfuron、bensulfuron−methyl、imazaquin並びにimazapyrのRS比は0.19、40、0.82、4.9であり、G95A変異型ALSはPC除草剤に対して特異的に強い抵抗性を示すことが判明した(表5及び図5)。なお、図5においてBSはbispyribac−sodiumであり、PSはpyrithiobac−sosiumであり、PMはpyriminobacであり、CSはchlorsulfuronであり、BMはbensulfuron−methylであり、IQはimazaquinであり、IPはimazapyrである。
以上の実施例より、イネ由来の野生型ALSタンパク質に対してG95A変異が導入された変異型ALSタンパク質は、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対して特異的に抵抗性を示すことが明らかとなった。このように優れた特異性を示す変異型ALSタンパク質の特性を利用することによって、変異型ALSタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞とをPC系除草剤の存在下で確実に効率よく選抜できることが判明した。
なお、上述した実施例ではイネ由来のALS遺伝子を使用しているが、本発明の技術的範囲はイネ由来の変異型ALS遺伝子を用いた形質転換方法に限定されるものではない。一般に、ALS遺伝子は、異なる植物間で高い相同性を有することが知られている。また、ALS遺伝子における特定の変異が、複数種の植物において同様の影響を与えることも知られている。よって、本実施例により、例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコに由来する、G95A変異と同じ変異を有する変異型ALSタンパク質も同様にピリミジニルカルボキシ除草剤に対して特異的に抵抗性を示すことが明らかになった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (5)
- 目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換細胞をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で培養する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする形質転換方法。 - 上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の形質転換方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列における95番目のアラニンを除く、少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。 - 上記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項1記載の形質転換方法。
- 目的遺伝子と、イネ由来の野生型アセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列における95番目に相当するグリシンがアラニンに変異した変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子とを含む組換えベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程と、
上記工程で得られた形質転換植物をピリミジニルカルボキシ除草剤の存在下で育成する工程とを含み、上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を選択マーカーとして使用することを特徴とする植物育成方法。 - 上記変異型アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項4記載の植物育成方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列における95番目のアラニンを除く、少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
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