JPWO2006101266A1 - 光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、シアノ置換ベンジリデンヒダントイン（１）を還元して、アミノメチル置換ベンジルヒダントイン（２）又はその塩を得、次いで該アミノメチル置換ベンジルヒダントイン（２）又はその塩のアミノ基を水酸基に変換して、ヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン（３）を得、そして該ヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン（３）を酵素で処理して、Ｄ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン（４ａ）又はその塩、或いはＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン（４ｂ）又はその塩を得る、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法である。本発明によれば、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的規模で簡便に得ることができる製造方法を提供することができる。
Description
本発明は、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法に関する。
光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニン誘導体は、医薬又はその原料として有用な化合物である。例えば、４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンのＬ体は抗高血圧薬として用いられており（国際公開第９２／１４７０６号パンフレット）、またそのＤ体はブラジキニンＢ１レセプターアンタゴニスト等の中間体として用いられている（特開２００４−５２５９３６号公報）。
従来の４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンの製造方法としては、例えば、４−ブロモメチル安息香酸エチルを出発原料として、下記反応スキームに示すように還元、アセチル化、アセトアミドマロン酸ジエチルとの縮合、並びに加水分解及び脱炭酸を行うことにより、Ｎ−アセチル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンを得、そしてＮ−アセチル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンをアシラーゼで加水分解することによりＬ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンを得る方法が知られている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，（１９６７），１４８（２），４１４−４２２）。しかし、出発原料が高価で大量に入手し難く、また中間体の４−ヒドロキシメチルベンジルブロマイドが不安定であるため、大量生産が困難である。また、アシラーゼで加水分解すると不要なアセチル体（Ｄ体）が副生するため、収率は最大５０％に過ぎない。
また、光学活性な相間移動触媒を用いたジフェニルメチレングリシンエステルのアルキル化により４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンを得る製造方法では、Ｌ体とＤ体との比率（Ｌ／Ｄ）が４／１と立体選択性が悪く、更なる精製が必要となる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，（１９９４），４４，４５７−４６５）。さらに、光学活性なフェニルアラニンから誘導した光学活性な４−ヨードフェニルアラニンや、光学活性なチロシンから誘導した光学活性なチロシントリフルオレート誘導体の４位をアルデヒドに変換し、次いで還元して光学活性な４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンを得る製造方法では、高価なトリオクチルシラン、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパンを使用することから大量合成には不向きである（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（１９９８），２８（２），４２７９−４２８５）。
このように従来の光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法においては、高価な試薬が不可欠であること、得られる中間体が不安定であること、収率が悪いこと、純度が低く精製が必要になること等の問題点があることから、工業的規模での生産に適さないのが実情である。したがって、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的規模で簡便に得ることができる製造方法の創製が望まれている。
そこで、本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的規模で簡便に得ることができる製造方法、並びに当該製造方法に有用な化合物及びその製造方法を提供することにある。
従来の４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンの製造方法としては、例えば、４−ブロモメチル安息香酸エチルを出発原料として、下記反応スキームに示すように還元、アセチル化、アセトアミドマロン酸ジエチルとの縮合、並びに加水分解及び脱炭酸を行うことにより、Ｎ−アセチル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンを得、そしてＮ−アセチル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンをアシラーゼで加水分解することによりＬ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンを得る方法が知られている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，（１９６７），１４８（２），４１４−４２２）。しかし、出発原料が高価で大量に入手し難く、また中間体の４−ヒドロキシメチルベンジルブロマイドが不安定であるため、大量生産が困難である。また、アシラーゼで加水分解すると不要なアセチル体（Ｄ体）が副生するため、収率は最大５０％に過ぎない。
このように従来の光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法においては、高価な試薬が不可欠であること、得られる中間体が不安定であること、収率が悪いこと、純度が低く精製が必要になること等の問題点があることから、工業的規模での生産に適さないのが実情である。したがって、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的規模で簡便に得ることができる製造方法の創製が望まれている。
そこで、本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的規模で簡便に得ることができる製造方法、並びに当該製造方法に有用な化合物及びその製造方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シアノ置換ベンジリデンヒダントインを出発物質とし、還元、水酸基化で得たヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを酵素で処理することにより光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンが収率よく簡便に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］下記式（１）
で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントインを還元して、下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩を得、次いで該アミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩のアミノ基を水酸基に変換して、下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを得、そして該ヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを酵素で処理して、下記式（４ａ）
で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩、或いは下記式（４ｂ）
で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩を得ることを特徴とする、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法。
［２］還元が還元触媒下における水素添加により行われる、［１］記載の製造方法。
［３］還元触媒が遷移金属触媒である、［２］記載の製造方法。
［４］還元触媒がパラジウム触媒である、［２］記載の製造方法。
［５］アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、［１］〜［４］のいずれか一に記載の製造方法。
［６］酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［７］酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［８］酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［９］下記式（１）
で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントインを還元することを特徴とする、下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩の製造方法。
［１０］還元が還元触媒下における水素添加により行われる、［９］記載の製造方法。
［１１］還元触媒が遷移金属触媒である、［１０］記載の製造方法。
［１２］還元触媒がパラジウム触媒である、［１０］記載の製造方法。
［１３］下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩のアミノ基を水酸基に変換することを特徴とする、下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインの製造方法。
［１４］アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、［１３］記載の製造方法。
［１５］下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを酵素で処理して、下記式（４ａ）
で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩、或いは下記式（４ｂ）
で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩を得ることを特徴とする、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法。
［１６］酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１５］記載の製造方法。
［１７］酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１５］記載の製造方法。
［１８］酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、［１５］記載の製造方法。
［１９］下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩。
［２０］下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］下記式（１）
［２］還元が還元触媒下における水素添加により行われる、［１］記載の製造方法。
［３］還元触媒が遷移金属触媒である、［２］記載の製造方法。
［４］還元触媒がパラジウム触媒である、［２］記載の製造方法。
［５］アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、［１］〜［４］のいずれか一に記載の製造方法。
［６］酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［７］酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［８］酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、［１］〜［５］のいずれか一に記載の製造方法。
［９］下記式（１）
［１０］還元が還元触媒下における水素添加により行われる、［９］記載の製造方法。
［１１］還元触媒が遷移金属触媒である、［１０］記載の製造方法。
［１２］還元触媒がパラジウム触媒である、［１０］記載の製造方法。
［１３］下記式（２）
［１４］アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、［１３］記載の製造方法。
［１５］下記式（３）
［１６］酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１５］記載の製造方法。
［１７］酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１５］記載の製造方法。
［１８］酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、［１５］記載の製造方法。
［１９］下記式（２）
［２０］下記式（３）
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
本発明の製造方法は、下記反応スキームに表される。
（ｓｔｅｐ １）
ｓｔｅｐ １は、上記式（１）で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントイン（以下、「ベンジリデンヒダントイン（１）」という。）を還元して、上記式（２）で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩（以下、「ベンジルヒダントイン（２）」という。）を得る工程である。ここで還元反応としては、ベンジリデンヒダントイン（１）に還元触媒及び酸を加え、溶媒中で水素ガスと反応させることが好ましい。なお、ベンジルヒダントイン（２）の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の酸付加塩が挙げられる。また、ベンジリデンヒダントイン（１）のシアノ基の置換位置は２位、３位又は４位のいずれであってもよいが、４位が好ましい。
還元触媒としては水素添加に使用できるものであれば特に限定されないが、遷移金属触媒が好ましく用いられる。遷移金属触媒としては、パラジウム、パラジウム炭素、パラジウム黒、塩化パラジウム等のパラジウム触媒や、その他、酸化白金、白金黒、ラネーニッケル、ラネーコバルトが例示され、中でもパラジウム、パラジウム炭素、パラジウム黒、塩化パラジウム等のパラジウム触媒が特に好ましい。遷移金属触媒の使用量は、ベンジリデンヒダントイン（１）に対して通常０．１〜５ｍｏｌ％、好ましくは０．５〜２ｍｏｌ％である。また、酸としては、塩酸や硫酸等の無機酸が好適に使用される。酸の使用量は、ベンジリデンヒダントイン（１）に対して通常１．０〜１．５当量、好ましくは１．０〜１．２当量である。さらに、溶媒としては、水、又はメタノールやエタノール等の水溶性溶媒と水との混合溶媒を使用することができる。反応時間は、通常１〜１２時間、好ましくは２〜９時間である。反応終了後、遷移金属触媒をろ過により除去し、反応溶媒を濃縮乾固してベンジルヒダントイン（２）を得ることができる。得られたベンジルヒダントイン（２）はクロマトグラフィー等の常法により単離・精製することもできるが、単離・精製することなく、上記式（３）で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン（以下、「ベンジルヒダントイン（３）」という。）の製造に用いることができる。
（ｓｔｅｐ ２）
ｓｔｅｐ ２は、ベンジルヒダントイン（２）のアミノ基を水酸基に変換することにより、ベンジルヒダントイン（３）を得る工程である。ベンジルヒダントイン（２）のアミノメチル基の置換位置は２位、３位又は４位のいずれであってもよいが、４位が好ましい。
上記変換としては、アミノ基を水酸基に変換できる方法であれば特に限定されないが、亜硝酸塩との反応により行うことが好ましい。亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の亜硝酸アルカリ金属塩が用いられるが、好ましくは亜硝酸ナトリウムである。亜硝酸塩の使用量は、ベンジルヒダントイン（２）に対して通常１．０〜１．５当量、好ましくは１．２〜１．３当量である。反応温度は、通常９５〜１００℃、好ましくは９８〜１００℃である。反応時間は、通常１５〜２４時間、好ましくは１８〜２２時間である。上記反応は、溶媒中で行ってもよく、溶媒としては、水、エタノール／ジメチルホルムアミド、水／ジメチルホルムアミドが挙げられるが、水が好ましい。反応終了後、反応液を濃縮乾固してベンジルヒダントイン（３）を得ることができる。
（ｓｔｅｐ ３）
ｓｔｅｐ ３は、ベンジルヒダントイン（３）を酵素で処理して、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「フェニルアラニン（４）」という。）を得る工程である。これにより、ベンジルヒダントイン（３）から光学選択的に収率よく簡便に、下記式（４ａ）で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「Ｄ−フェニルアラニン（４ａ）」という。）又は下記式（４ｂ）で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「Ｌ−フェニルアラニン（４ｂ）」という。）を得ることができる。なお、フェニルアラニン（４）、Ｄ−フェニルアラニン（４ａ）およびＬ−フェニルアラニン（４ｂ）の塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩または燐酸塩などの酸付加塩、あるいはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが例示され、特に塩酸塩、ナトリウム塩が挙げられる。
酵素としては、ベンジルヒダントイン（３）を光学選択的に加水分解して光学活性なフェニルアラニン（４）を生成し得る酵素であれば特に限定されることなく、細菌類、放線菌類、菌類等の微生物又は動植物に由来する従来公知の酵素を使用することができる。このような酵素としては、例えば、ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼが挙げられ、これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。２種以上組み合わせて使用する場合の好適な酵素の組み合わせは、以下のとおりである。
（ｉ）ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼ
（ｉｉ）ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼ
酵素を２種以上組み合わせて使用する場合には、例えば、ベンジルヒダントイン（３）に、光学選択性を有するヒダントイナーゼを作用させてＬ−（Ｎ−カルバモイル）アミノ酸又はＤ−（Ｎ−カルバモイル）アミノ酸のいずれかを生成させ、更にカルバモイルアミノ酸にカルバモイラーゼを作用させることにより光学活性なフェニルアラニンを得ることができる。
また、用いるヒダントイナーゼが光学選択性を有しない場合でも、光学選択性を有するカルバモイラーゼを用いることにより、光学活性なアミノ酸を得ることができる。すなわち、ヒダントイナーゼは加水分解反応のみならず、脱水縮合反応も触媒するため、ヒダントインラセマーゼ及び光学選択性を有するカルバモイラーゼを併用することにより、所望の立体配置を有するアミノ酸を得ることができる。
Ｄ−フェニルアラニンを製造する場合には、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＤ−ヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＤ−カルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが望ましい。
他方、Ｌ−フェニルアラニンを製造する場合には、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＬ−ヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＬ−カルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが望ましい。
なお、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株は、当初フラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類されることが判明した。さらに現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
また、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株は、当初アルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類されることが判明した。現在では、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
酵素反応は、基質となるベンジルヒダントイン（３）のエナンチオマー混合物（例えば、ラセミ体）を、酵素の活性を考慮して以下の条件で処理することが望ましい。反応溶媒としては、通常水（例えば、イオン交換水）、緩衝液等の水性媒体を使用できるが、酵素反応を阻害しない限りアルコール等の有機溶媒を含んでいてもよい。反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。反応ｐＨは使用する酵素の至適ｐＨに依存するが、中性条件が望ましく、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、より好ましくは６．０〜８．０である。反応時間は、通常１５〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間である。また、酵素の使用量は特に限定されるものではなく、当業者であれば、各反応条件において予備的な実験を行うことで、適宜容易に設定することができる。酵素反応後、反応液を酸性（例えば、ｐＨ２）に調整して酵素を失活させ、活性炭等で処理してろ過することにより酵素を除去することができる。
また、前述した酵素は、ヒダントイナーゼ等の酵素遺伝子が組み込まれた組換えＤＮＡによって形質転換された菌体（以下、「形質変換体」という。）の培養物から得たものを用いてもよい。
組換えＤＮＡは、例えば、プロモーター、ヒダントイナーゼ等の酵素をコードするＤＮＡ、ターミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結することで得ることができる。
プロモーターとしては、目的の酵素遺伝子の転写を促すことができるプロモーターである限りにおいて特に制限はなく、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができるが、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等が挙げられる。
酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡから単離されたものや、マイクロバクテリウムリクエファシエンスＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものを用いることができる。ＤＮＡの菌体からの単離は、例えば超音波破砕、エタノール沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの常法により行うことができる。かかるＤＮＡとしては、２種以上のＤＮＡを用いてもよい。例えば、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼの３つの遺伝子を有する組換えＤＮＡを用いる。これにより１つの形質転換体を用いて３つの酵素を同時に発現させることでフェニルアラニン（４）を製造できるため、複数の形質転換体を個々に扱う場合に比べて効率的である。
また、生産量を増大させるために、酵素遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。かかるターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。中でも、ｒｒｎＢターミネーター等が、プラスミドの安定性をよくする点で好ましい。
宿主細胞に導入するための組換えＤＮＡを調製するための、これらのヒダントイナーゼ等の酵素をコードするＤＮＡが連結したＤＮＡ断片と連結するベクターＤＮＡとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位等によってプラスミドに改変したものをいう。なお、改変には、前記した塩基の置換等の他に、変異剤やＵＶ照射等による変異処理又は自然処理等による改変が含まれる。なお、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。遺伝子の連結は、例えばＰＣＲなどで増幅した目的遺伝子とベクターＤＮＡのマルチクローニングサイトを同じ制限酵素で切断した後、それらの遺伝子を例えばライゲーションキットなどを用いて行うことができる。
次いで、得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体を得る。宿主細胞としては、細菌細胞、放射菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、タンパク質の大量生産に関する知見が数多くあることから、大腸菌（腸内細菌）が好ましく、より好ましくはエシャリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。特に、エシャリヒア・コリＪＭ１０９株（より好ましくは、ＤＥ３）が好適である。
次いで、得られた形質転換体を培地中で培養する。宿主細胞を大腸菌とする場合、培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地等の、大腸菌を培養するために通常用いられる培地が挙げられる。なお、培養条件及び生産誘導条件は、用いるベクターのマーカー、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
遠心分離して菌体を回収した後、該菌体を破砕又は溶菌させ、生成した酵素を回収する。回収された酵素は、粗酵素液として使用することができる。破砕方法としては、例えば超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等を利用することができる。溶菌方法としては、例えば卵白リゾチーム、ペプチターゼ処理又はこれらを組み合わせた方法を用いることができる。さらに、必要に応じて、通常の沈殿、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、これらの酵素を精製して用いることができる。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
なお、プラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選択等を扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９，ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢ ＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＥＳＳ等に記載されている方法を適用することができる。
従って、例えばＤ−フェニルアラニン（４ａ）を製造する場合、Ｄ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ及びＤ−カルバモイラーゼをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞にヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡを導入させることで形質転換体を作製し、これを培養することで得られた酵素を用いることができる。他方、Ｌ−フェニルアラニン（４ｂ）を製造する場合には、Ｌ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−カルバモイラーゼをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞にヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡを導入させることで形質転換体を作製し、これを培養することで得られた酵素を用いることができる。また、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８６，１９−３０，２００１に記載されるようなアースロバクター・アウレセンスの酵素遺伝子を用いることができる。さらに、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，３１７−３２０，２０００に記載されるようなアースロバクター・スピーシーズの変異型ヒダントイナーゼを組み合わせてもよい。
そして、ベンジルヒダントイン（３）を培養物から得られた酵素で処理することにより、光学活性なフェニルアラニン（４）を製造することができる。酵素処理としては、前述した形質変換体を含む培地にベンジルヒダントイン（３）を直接添加して光学活性なフェニルアラニン（４）を製造してもよいし、上記形質変換体を、ベンジルヒダントイン（３）を含む反応液に直接添加してもよい。反応液の組成などは、ベンジルヒダントイン（３）の酵素反応が進行する限り特に限定されない。
形質変換体は、例えば、国際公開０３／０８５１０８号パンフレットの実施例８に記載の方法と同様の方法により調製することができる。この場合、前述の温度及びｐＨで、８時間〜６日静置すればよい。培養液又は反応液中に蓄積された光学活性なフェニルアラニン（４）は、定法により培養液又は反応液中より採取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることができる。
また、培養液又は反応液中の光学活性なフェニルアラニン（４）の定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができる。例えば、薄層クロマトグラフィーや、光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
なお、ベンジリデンヒダントイン（１）は、例えば、米国特許（ＵＳ２８６１０７９）に記載の方法と同様の方法により製造することができる。具体的には、下記反応スキームに示すように、シアノ置換ベンズアルデヒド及びヒダントインに、水中でエタノールアミンを加えて加熱する。次いで、析出した結晶を分離することによりベンジリデンヒダントイン（１）を得ることができる。
また、前述した製造方法により得られた、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンは、クロマトグラフィー等の常法により単離・精製することができるが、単離・精製することなく次の反応に用いることもできる。例えばその保護体である、光学活性なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンメチルエステルを製造することができる。光学活性なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンメチルエステルは、文献（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００），８（７），１６７７−１６９６）記載の方法により得ることができる。具体的には、下記反応スキームに示すように、メタノールと塩化チオニルとを混合し、該混合物に光学活性な４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンを加えてエステル化した後、炭酸水素ナトリウム及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートと反応させて、光学活性なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンメチルエステルを得ることができる。なお、式中、記号＊は不斉炭素を意味する。
さらに、上記製造方法により得られた光学活性なＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニンメチルエステルは、前記特開２００４−５２５９３６号公報記載の方法に基づいて、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等の溶媒中、トリエチルアミン等の塩基存在下に、その水酸基をメタンスルホニルクロライドと反応させた後、アミン化合物（例えば、２，６−ジメチルピペリジン）と反応させることにより、ブラジキニンＢ１レセプターアンタゴニストとして重要な中間体を得ることができる。
本発明の製造方法は、下記反応スキームに表される。
ｓｔｅｐ １は、上記式（１）で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントイン（以下、「ベンジリデンヒダントイン（１）」という。）を還元して、上記式（２）で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩（以下、「ベンジルヒダントイン（２）」という。）を得る工程である。ここで還元反応としては、ベンジリデンヒダントイン（１）に還元触媒及び酸を加え、溶媒中で水素ガスと反応させることが好ましい。なお、ベンジルヒダントイン（２）の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の酸付加塩が挙げられる。また、ベンジリデンヒダントイン（１）のシアノ基の置換位置は２位、３位又は４位のいずれであってもよいが、４位が好ましい。
還元触媒としては水素添加に使用できるものであれば特に限定されないが、遷移金属触媒が好ましく用いられる。遷移金属触媒としては、パラジウム、パラジウム炭素、パラジウム黒、塩化パラジウム等のパラジウム触媒や、その他、酸化白金、白金黒、ラネーニッケル、ラネーコバルトが例示され、中でもパラジウム、パラジウム炭素、パラジウム黒、塩化パラジウム等のパラジウム触媒が特に好ましい。遷移金属触媒の使用量は、ベンジリデンヒダントイン（１）に対して通常０．１〜５ｍｏｌ％、好ましくは０．５〜２ｍｏｌ％である。また、酸としては、塩酸や硫酸等の無機酸が好適に使用される。酸の使用量は、ベンジリデンヒダントイン（１）に対して通常１．０〜１．５当量、好ましくは１．０〜１．２当量である。さらに、溶媒としては、水、又はメタノールやエタノール等の水溶性溶媒と水との混合溶媒を使用することができる。反応時間は、通常１〜１２時間、好ましくは２〜９時間である。反応終了後、遷移金属触媒をろ過により除去し、反応溶媒を濃縮乾固してベンジルヒダントイン（２）を得ることができる。得られたベンジルヒダントイン（２）はクロマトグラフィー等の常法により単離・精製することもできるが、単離・精製することなく、上記式（３）で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン（以下、「ベンジルヒダントイン（３）」という。）の製造に用いることができる。
（ｓｔｅｐ ２）
ｓｔｅｐ ２は、ベンジルヒダントイン（２）のアミノ基を水酸基に変換することにより、ベンジルヒダントイン（３）を得る工程である。ベンジルヒダントイン（２）のアミノメチル基の置換位置は２位、３位又は４位のいずれであってもよいが、４位が好ましい。
上記変換としては、アミノ基を水酸基に変換できる方法であれば特に限定されないが、亜硝酸塩との反応により行うことが好ましい。亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の亜硝酸アルカリ金属塩が用いられるが、好ましくは亜硝酸ナトリウムである。亜硝酸塩の使用量は、ベンジルヒダントイン（２）に対して通常１．０〜１．５当量、好ましくは１．２〜１．３当量である。反応温度は、通常９５〜１００℃、好ましくは９８〜１００℃である。反応時間は、通常１５〜２４時間、好ましくは１８〜２２時間である。上記反応は、溶媒中で行ってもよく、溶媒としては、水、エタノール／ジメチルホルムアミド、水／ジメチルホルムアミドが挙げられるが、水が好ましい。反応終了後、反応液を濃縮乾固してベンジルヒダントイン（３）を得ることができる。
（ｓｔｅｐ ３）
ｓｔｅｐ ３は、ベンジルヒダントイン（３）を酵素で処理して、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「フェニルアラニン（４）」という。）を得る工程である。これにより、ベンジルヒダントイン（３）から光学選択的に収率よく簡便に、下記式（４ａ）で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「Ｄ−フェニルアラニン（４ａ）」という。）又は下記式（４ｂ）で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩（以下、「Ｌ−フェニルアラニン（４ｂ）」という。）を得ることができる。なお、フェニルアラニン（４）、Ｄ−フェニルアラニン（４ａ）およびＬ−フェニルアラニン（４ｂ）の塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩または燐酸塩などの酸付加塩、あるいはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが例示され、特に塩酸塩、ナトリウム塩が挙げられる。
酵素としては、ベンジルヒダントイン（３）を光学選択的に加水分解して光学活性なフェニルアラニン（４）を生成し得る酵素であれば特に限定されることなく、細菌類、放線菌類、菌類等の微生物又は動植物に由来する従来公知の酵素を使用することができる。このような酵素としては、例えば、ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼが挙げられ、これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。２種以上組み合わせて使用する場合の好適な酵素の組み合わせは、以下のとおりである。
（ｉ）ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼ
（ｉｉ）ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼ
酵素を２種以上組み合わせて使用する場合には、例えば、ベンジルヒダントイン（３）に、光学選択性を有するヒダントイナーゼを作用させてＬ−（Ｎ−カルバモイル）アミノ酸又はＤ−（Ｎ−カルバモイル）アミノ酸のいずれかを生成させ、更にカルバモイルアミノ酸にカルバモイラーゼを作用させることにより光学活性なフェニルアラニンを得ることができる。
また、用いるヒダントイナーゼが光学選択性を有しない場合でも、光学選択性を有するカルバモイラーゼを用いることにより、光学活性なアミノ酸を得ることができる。すなわち、ヒダントイナーゼは加水分解反応のみならず、脱水縮合反応も触媒するため、ヒダントインラセマーゼ及び光学選択性を有するカルバモイラーゼを併用することにより、所望の立体配置を有するアミノ酸を得ることができる。
Ｄ−フェニルアラニンを製造する場合には、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＤ−ヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＤ−カルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが望ましい。
他方、Ｌ−フェニルアラニンを製造する場合には、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＬ−ヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＡＪ１１１９９株由来のＬ−カルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが望ましい。
なお、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株は、当初フラボバクテリウム エスピー．（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類されることが判明した。さらに現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
また、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株は、当初アルカリゲネス アクアマリヌス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ）として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類されることが判明した。現在では、フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
酵素反応は、基質となるベンジルヒダントイン（３）のエナンチオマー混合物（例えば、ラセミ体）を、酵素の活性を考慮して以下の条件で処理することが望ましい。反応溶媒としては、通常水（例えば、イオン交換水）、緩衝液等の水性媒体を使用できるが、酵素反応を阻害しない限りアルコール等の有機溶媒を含んでいてもよい。反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。反応ｐＨは使用する酵素の至適ｐＨに依存するが、中性条件が望ましく、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、より好ましくは６．０〜８．０である。反応時間は、通常１５〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間である。また、酵素の使用量は特に限定されるものではなく、当業者であれば、各反応条件において予備的な実験を行うことで、適宜容易に設定することができる。酵素反応後、反応液を酸性（例えば、ｐＨ２）に調整して酵素を失活させ、活性炭等で処理してろ過することにより酵素を除去することができる。
また、前述した酵素は、ヒダントイナーゼ等の酵素遺伝子が組み込まれた組換えＤＮＡによって形質転換された菌体（以下、「形質変換体」という。）の培養物から得たものを用いてもよい。
組換えＤＮＡは、例えば、プロモーター、ヒダントイナーゼ等の酵素をコードするＤＮＡ、ターミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結することで得ることができる。
プロモーターとしては、目的の酵素遺伝子の転写を促すことができるプロモーターである限りにおいて特に制限はなく、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができるが、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等が挙げられる。
酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡから単離されたものや、マイクロバクテリウムリクエファシエンスＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものを用いることができる。ＤＮＡの菌体からの単離は、例えば超音波破砕、エタノール沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの常法により行うことができる。かかるＤＮＡとしては、２種以上のＤＮＡを用いてもよい。例えば、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及びヒダントインラセマーゼの３つの遺伝子を有する組換えＤＮＡを用いる。これにより１つの形質転換体を用いて３つの酵素を同時に発現させることでフェニルアラニン（４）を製造できるため、複数の形質転換体を個々に扱う場合に比べて効率的である。
また、生産量を増大させるために、酵素遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。かかるターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。中でも、ｒｒｎＢターミネーター等が、プラスミドの安定性をよくする点で好ましい。
宿主細胞に導入するための組換えＤＮＡを調製するための、これらのヒダントイナーゼ等の酵素をコードするＤＮＡが連結したＤＮＡ断片と連結するベクターＤＮＡとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位等によってプラスミドに改変したものをいう。なお、改変には、前記した塩基の置換等の他に、変異剤やＵＶ照射等による変異処理又は自然処理等による改変が含まれる。なお、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。遺伝子の連結は、例えばＰＣＲなどで増幅した目的遺伝子とベクターＤＮＡのマルチクローニングサイトを同じ制限酵素で切断した後、それらの遺伝子を例えばライゲーションキットなどを用いて行うことができる。
次いで、得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体を得る。宿主細胞としては、細菌細胞、放射菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、タンパク質の大量生産に関する知見が数多くあることから、大腸菌（腸内細菌）が好ましく、より好ましくはエシャリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。特に、エシャリヒア・コリＪＭ１０９株（より好ましくは、ＤＥ３）が好適である。
次いで、得られた形質転換体を培地中で培養する。宿主細胞を大腸菌とする場合、培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地等の、大腸菌を培養するために通常用いられる培地が挙げられる。なお、培養条件及び生産誘導条件は、用いるベクターのマーカー、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
遠心分離して菌体を回収した後、該菌体を破砕又は溶菌させ、生成した酵素を回収する。回収された酵素は、粗酵素液として使用することができる。破砕方法としては、例えば超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等を利用することができる。溶菌方法としては、例えば卵白リゾチーム、ペプチターゼ処理又はこれらを組み合わせた方法を用いることができる。さらに、必要に応じて、通常の沈殿、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、これらの酵素を精製して用いることができる。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
なお、プラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選択等を扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９，ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢ ＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＥＳＳ等に記載されている方法を適用することができる。
従って、例えばＤ−フェニルアラニン（４ａ）を製造する場合、Ｄ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ及びＤ−カルバモイラーゼをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞にヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡを導入させることで形質転換体を作製し、これを培養することで得られた酵素を用いることができる。他方、Ｌ−フェニルアラニン（４ｂ）を製造する場合には、Ｌ−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−カルバモイラーゼをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞にヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡを導入させることで形質転換体を作製し、これを培養することで得られた酵素を用いることができる。また、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８６，１９−３０，２００１に記載されるようなアースロバクター・アウレセンスの酵素遺伝子を用いることができる。さらに、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，３１７−３２０，２０００に記載されるようなアースロバクター・スピーシーズの変異型ヒダントイナーゼを組み合わせてもよい。
そして、ベンジルヒダントイン（３）を培養物から得られた酵素で処理することにより、光学活性なフェニルアラニン（４）を製造することができる。酵素処理としては、前述した形質変換体を含む培地にベンジルヒダントイン（３）を直接添加して光学活性なフェニルアラニン（４）を製造してもよいし、上記形質変換体を、ベンジルヒダントイン（３）を含む反応液に直接添加してもよい。反応液の組成などは、ベンジルヒダントイン（３）の酵素反応が進行する限り特に限定されない。
形質変換体は、例えば、国際公開０３／０８５１０８号パンフレットの実施例８に記載の方法と同様の方法により調製することができる。この場合、前述の温度及びｐＨで、８時間〜６日静置すればよい。培養液又は反応液中に蓄積された光学活性なフェニルアラニン（４）は、定法により培養液又は反応液中より採取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることができる。
また、培養液又は反応液中の光学活性なフェニルアラニン（４）の定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができる。例えば、薄層クロマトグラフィーや、光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
なお、ベンジリデンヒダントイン（１）は、例えば、米国特許（ＵＳ２８６１０７９）に記載の方法と同様の方法により製造することができる。具体的には、下記反応スキームに示すように、シアノ置換ベンズアルデヒド及びヒダントインに、水中でエタノールアミンを加えて加熱する。次いで、析出した結晶を分離することによりベンジリデンヒダントイン（１）を得ることができる。
以下、本発明の実施例についてさらに詳細な説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントインの合成
水２５０ｍｌにヒダントイン２３．７ｇ（０．２３ｍｏｌ）、２−アミノエタノール５．４ｍｌ（０．０９ｍｏｌ）を加え、５０℃に加熱攪拌した。溶液が透明になったら、４−シアノベンズアルデヒド２５．１ｇ（０．１８ｍｏｌ）を加えて攪拌しながら一晩加熱還流した。反応液を放冷して室温に戻した後氷冷し、塩酸でｐＨ７に調整して１時間攪拌した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントイン３７．３ｇを得た。収率９７．２％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．４５（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，２Ｈ），７．８５（ｄ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１２．１［Ｍ−Ｈ］−
（実施例１）
５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩の合成
アルゴン雰囲気下、水３８４ｍｌに５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントイン１９．２ｇ（０．０９ｍｏｌ）、塩酸７．８ｍｌ（０．０９ｍｏｌ）を加えて攪拌した。スラリー溶液に５％パラジウム炭素（ＡＤ，水分５３．１％）１６．４ｇを加え、反応容器内を水素置換して、室温で９時間激しく攪拌した。ろ過によりパラジウム炭素を除去し、母液を結晶が析出するまで減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−ブタノール５０ｍｌを加えての減圧濃縮を２回行った。残渣に２−ブタノール１００ｍｌを加え、２時間攪拌した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、白色結晶の５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩１６．１ｇを得た。収率６９．８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．９５（ｔ，２Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｔ，１Ｈ），７．２１（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：３９．２５，３９．４６，３９．６７，３９．８８，４０．０９，４０．３０，４０．５１，５８．５８，１２８．９６，１３０．３５，１７５．４３
ＭＳ（ＥＳＩ）：２２０．１［Ｍ＋Ｈ］＋，２１８．３［Ｍ−Ｈ］−
（実施例２）
５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントインの合成
水３０ｍｌに５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩２．７ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）、亜硝酸ナトリウム０．９ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら一晩加熱還流した。反応液を放冷して室温に戻した後、塩酸でｐＨ２に調整して１時間攪拌した。２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５に調整した後、減圧濃縮した。残存する水分を除くため、エタノール３０ｍｌを加えての減圧濃縮を行った。残渣にエタノール１５０ｍｌを加えて攪拌した。スラリー溶液をろ過、母液を減圧濃縮し、残渣に２−プロパノール１５ｍｌを加えてスラリー洗浄した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン１．６ｇを得た。収率６８．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．９１（ｄ，２Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ），５．１３（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），７．２１（ｄ，２Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），１０．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：３９．２５，３９．４６，３９．６７，３９．８８，４０．０９，４０．３０，４０．５１，５８．７７，６３．０２，１２６．５４，１２９．８１
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１９．０［Ｍ−Ｈ］−
（実施例３）
Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの合成
水１７７０ｍｌに５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン６５．３ｇ（０．３０ｍｏｌ）、硫酸マンガン５水和物０．４ｇを加え、３７℃に加熱した。この水溶液に、国際公開０３／０８５１０８号パンフレットの実施例８に記載の方法で得たＥ．ｃｏｌｉ Ｄ９株の菌体溶液を４ｇ乾燥菌体／Ｌとなるように加え、反応液を水酸化ナトリウム水溶液と酢酸を用いてｐＨ７．２〜７．５の間になるように調整した後、２４時間攪拌した。反応液をｐＨ２に調整し、１０％サニゾール水溶液９ｍｌを加えて５５℃で３０分攪拌した。活性炭（白鷺炭ＡＷ５０：武田薬品工業株式会社製）１８ｇを加え、更に１時間攪拌した。セライトろ過し、母液をｐＨ７に調整して減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−プロパノール３００ｍｌを加えて再度減圧濃縮を２回行った。残渣に２−プロパノール４００ｍｌを加えて攪拌後、ろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン（塩化ナトリウムを含む。）１０６．９ｇを得た。なお、ＨＰＬＣで分析することにより、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの含有量は４７．０ｗｔ％であることを確認した（収率 ７３．２％、光学純度９９．０％ｅｅ以上）。なお、光学純度は以下の条件でＨＰＬＣ測定したものである。
光学純度のＨＰＬＣ測定条件：
カラム ： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：２ｍＭ ＣｕＳＯ４／ＩＰＡ＝９５／５，ＵＶ：２５４ｎｍ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，
温度：室温
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．２１（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ）ＭＳ（ＥＳＩ）：１９４．３［Ｍ−Ｈ］−
（実施例４）
（１）ヒダントイナーゼ、Ｌ−カルバモイラーゼ発現プラスミドの構築
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＨＤ＿ｕｐ（配列番号１）、ＨＤ＿ｄｏｗｎ（配列番号２）によって、ヒダントイナーゼ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理後、予めＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理したｐＴｒｐ４にライゲートした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ３９１２Ｈ４と命名した。
ｐＴｒｐ３９１２Ｈ４を鋳型として、プライマーＳＤｍ２（配列番号３）、ＨＤ＿ｄｏｗｎ（配列番号２）によって、ＳＤ配列を含むヒダントイナーゼ遺伝子を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（プロメガ製）にライゲートした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＳＤ−Ｈと命名した。
ｐＳＤ−ＨをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理して得られる１．５ｋｂ長のＳＤ配列を含むヒダントイナーゼ遺伝子領域（遺伝子断片Ｈ）と、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＣＨ＿ｕｐ（配列番号４）、ＣＨ＿ｄｏｗｎ（配列番号５）によって、Ｌ−カルバモイラーゼ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理して得られる１．０ｋｂ長の遺伝子断片（遺伝子断片Ｃ）を調製した。ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理したｐＴｒｐ８に遺伝子断片Ｃ、及び遺伝子断片Ａをライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換後、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８Ｃ−ＳＤ−Ｈと命名した。
ｐＴｒｐ８Ｃ−ＳＤ−Ｈを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にヒダントインラセマーゼ遺伝子発現プラスミドｐＴｒｐ４Ｒを導入することにより、ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ、Ｌ−カルバモイラーゼの酵素遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｌ６株を作製した。
（２）酵素菌体の調製
Ｌ６株を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌ ａｇａｒ）を用いて、３０℃で２０時間培養した。５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール、２０ｍｇ／Ｌ 硫酸コバルト５水和物を含むＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム）に接種し、３４℃、１６時間、振とう培養を行った。培養終了後、遠心分離（８，０００ｇ、１０分、４℃）によって菌体を沈殿として回収した。
（３）Ｌ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの合成
０．１Ｍ 燐酸二水素カリウム−燐酸一水素二カリウム緩衝水溶液（ｐＨ７．２）３ｍｌに５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン０．１ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）、塩化コバルト１．３ｍｇを加え、３７℃に加熱した。この水溶液に、前述の工程で得たＥ．ｃｏｌｉ Ｌ６株菌体溶液を４ｇ乾燥菌体／Ｌとなるように加え、６日間攪拌した。反応液をｐＨ２に調整し、１０％サニゾール水溶液０．０２ｍｌを加えて５５℃で３０分攪拌した。活性炭（白鷺炭ＡＷ５０：武田薬品工業株式会社製）４０ｍｇを加え、更に１時間攪拌した。セライトろ過し、母液をｐＨ７に調整して減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−プロパノール０．５ｍｌを加えて再度減圧濃縮を２回行った。残渣に２−プロパノール０．６ｍｌを加えて攪拌後、ろ過、減圧乾燥して、Ｌ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン（塩化ナトリウムを含む。）７７ｍｇを得た。（収率 ６９．２％）
（実施例５）
Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩の合成
メタノール４３ｍｌにＤ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン４．３ｇ（２１．９ｍｍｏｌ）を加え、５℃に冷却、攪拌した。塩化チオニル２．７ｍｌ（３５．０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、室温で一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮後、メタノール１５ｍｌを加え再度減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル２０ｍｌを加えてスラリー洗浄した。溶液をろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩４．３ｇを得た。収率７９．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．１２（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），４．２５（ｔ，１Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ），７．２８（ｄ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１０．３［Ｍ＋Ｈ］＋
（実施例６）
Ｄ−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル
メタノール６０ｍｌ、水３０ｍｌにＤ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩１０．２ｇ（４１．１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌し、２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート１３．６ｇをメタノール１０ｍｌに溶解させて加えた。ｐＨ８以上に保ち、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣に水５０ｍｌ、酢酸エチル１００ｍｌを加えて攪拌、不溶物をろ過した。母液を分層し、酢酸エチル層を０．５Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水各１００ｍｌで洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、ヘプタン５０ｍｌを加えて再度減圧濃縮した。残渣にヘプタン１００ｍｌを加えて一晩攪拌し、スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステルを１０．２ｇ得た。収率７９．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．４２（ｓ，９Ｈ），３．０８（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），４．９８（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：３０９．９［Ｍ＋Ｈ］＋
（参考例１）
５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントインの合成
水２５０ｍｌにヒダントイン２３．７ｇ（０．２３ｍｏｌ）、２−アミノエタノール５．４ｍｌ（０．０９ｍｏｌ）を加え、５０℃に加熱攪拌した。溶液が透明になったら、４−シアノベンズアルデヒド２５．１ｇ（０．１８ｍｏｌ）を加えて攪拌しながら一晩加熱還流した。反応液を放冷して室温に戻した後氷冷し、塩酸でｐＨ７に調整して１時間攪拌した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントイン３７．３ｇを得た。収率９７．２％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．４５（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，２Ｈ），７．８５（ｄ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１２．１［Ｍ−Ｈ］−
（実施例１）
５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩の合成
アルゴン雰囲気下、水３８４ｍｌに５−（４−シアノベンジリデン）ヒダントイン１９．２ｇ（０．０９ｍｏｌ）、塩酸７．８ｍｌ（０．０９ｍｏｌ）を加えて攪拌した。スラリー溶液に５％パラジウム炭素（ＡＤ，水分５３．１％）１６．４ｇを加え、反応容器内を水素置換して、室温で９時間激しく攪拌した。ろ過によりパラジウム炭素を除去し、母液を結晶が析出するまで減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−ブタノール５０ｍｌを加えての減圧濃縮を２回行った。残渣に２−ブタノール１００ｍｌを加え、２時間攪拌した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、白色結晶の５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩１６．１ｇを得た。収率６９．８％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．９５（ｔ，２Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），４．３６（ｔ，１Ｈ），７．２１（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：３９．２５，３９．４６，３９．６７，３９．８８，４０．０９，４０．３０，４０．５１，５８．５８，１２８．９６，１３０．３５，１７５．４３
ＭＳ（ＥＳＩ）：２２０．１［Ｍ＋Ｈ］＋，２１８．３［Ｍ−Ｈ］−
（実施例２）
５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントインの合成
水３０ｍｌに５−（４−アミノメチルベンジル）ヒダントイン塩酸塩２．７ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）、亜硝酸ナトリウム０．９ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら一晩加熱還流した。反応液を放冷して室温に戻した後、塩酸でｐＨ２に調整して１時間攪拌した。２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５に調整した後、減圧濃縮した。残存する水分を除くため、エタノール３０ｍｌを加えての減圧濃縮を行った。残渣にエタノール１５０ｍｌを加えて攪拌した。スラリー溶液をろ過、母液を減圧濃縮し、残渣に２−プロパノール１５ｍｌを加えてスラリー洗浄した。スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン１．６ｇを得た。収率６８．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ２．９１（ｄ，２Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，２Ｈ），５．１３（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），７．２１（ｄ，２Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），１０．３９（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：３９．２５，３９．４６，３９．６７，３９．８８，４０．０９，４０．３０，４０．５１，５８．７７，６３．０２，１２６．５４，１２９．８１
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１９．０［Ｍ−Ｈ］−
（実施例３）
Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの合成
水１７７０ｍｌに５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン６５．３ｇ（０．３０ｍｏｌ）、硫酸マンガン５水和物０．４ｇを加え、３７℃に加熱した。この水溶液に、国際公開０３／０８５１０８号パンフレットの実施例８に記載の方法で得たＥ．ｃｏｌｉ Ｄ９株の菌体溶液を４ｇ乾燥菌体／Ｌとなるように加え、反応液を水酸化ナトリウム水溶液と酢酸を用いてｐＨ７．２〜７．５の間になるように調整した後、２４時間攪拌した。反応液をｐＨ２に調整し、１０％サニゾール水溶液９ｍｌを加えて５５℃で３０分攪拌した。活性炭（白鷺炭ＡＷ５０：武田薬品工業株式会社製）１８ｇを加え、更に１時間攪拌した。セライトろ過し、母液をｐＨ７に調整して減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−プロパノール３００ｍｌを加えて再度減圧濃縮を２回行った。残渣に２−プロパノール４００ｍｌを加えて攪拌後、ろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン（塩化ナトリウムを含む。）１０６．９ｇを得た。なお、ＨＰＬＣで分析することにより、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの含有量は４７．０ｗｔ％であることを確認した（収率 ７３．２％、光学純度９９．０％ｅｅ以上）。なお、光学純度は以下の条件でＨＰＬＣ測定したものである。
光学純度のＨＰＬＣ測定条件：
カラム ： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：２ｍＭ ＣｕＳＯ４／ＩＰＡ＝９５／５，ＵＶ：２５４ｎｍ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，
温度：室温
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．２１（ｍ，２Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ）ＭＳ（ＥＳＩ）：１９４．３［Ｍ−Ｈ］−
（実施例４）
（１）ヒダントイナーゼ、Ｌ−カルバモイラーゼ発現プラスミドの構築
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＨＤ＿ｕｐ（配列番号１）、ＨＤ＿ｄｏｗｎ（配列番号２）によって、ヒダントイナーゼ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理後、予めＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理したｐＴｒｐ４にライゲートした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ３９１２Ｈ４と命名した。
ｐＴｒｐ３９１２Ｈ４を鋳型として、プライマーＳＤｍ２（配列番号３）、ＨＤ＿ｄｏｗｎ（配列番号２）によって、ＳＤ配列を含むヒダントイナーゼ遺伝子を増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（プロメガ製）にライゲートした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＳＤ−Ｈと命名した。
ｐＳＤ−ＨをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理して得られる１．５ｋｂ長のＳＤ配列を含むヒダントイナーゼ遺伝子領域（遺伝子断片Ｈ）と、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＣＨ＿ｕｐ（配列番号４）、ＣＨ＿ｄｏｗｎ（配列番号５）によって、Ｌ−カルバモイラーゼ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理して得られる１．０ｋｂ長の遺伝子断片（遺伝子断片Ｃ）を調製した。ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理したｐＴｒｐ８に遺伝子断片Ｃ、及び遺伝子断片Ａをライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換後、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ８Ｃ−ＳＤ−Ｈと命名した。
ｐＴｒｐ８Ｃ−ＳＤ−Ｈを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にヒダントインラセマーゼ遺伝子発現プラスミドｐＴｒｐ４Ｒを導入することにより、ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ、Ｌ−カルバモイラーゼの酵素遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｌ６株を作製した。
（２）酵素菌体の調製
Ｌ６株を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、２０ｇ／Ｌ ａｇａｒ）を用いて、３０℃で２０時間培養した。５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンナトリウム、２５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール、２０ｍｇ／Ｌ 硫酸コバルト５水和物を含むＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム）に接種し、３４℃、１６時間、振とう培養を行った。培養終了後、遠心分離（８，０００ｇ、１０分、４℃）によって菌体を沈殿として回収した。
（３）Ｌ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンの合成
０．１Ｍ 燐酸二水素カリウム−燐酸一水素二カリウム緩衝水溶液（ｐＨ７．２）３ｍｌに５−（４−ヒドロキシメチルベンジル）ヒダントイン０．１ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）、塩化コバルト１．３ｍｇを加え、３７℃に加熱した。この水溶液に、前述の工程で得たＥ．ｃｏｌｉ Ｌ６株菌体溶液を４ｇ乾燥菌体／Ｌとなるように加え、６日間攪拌した。反応液をｐＨ２に調整し、１０％サニゾール水溶液０．０２ｍｌを加えて５５℃で３０分攪拌した。活性炭（白鷺炭ＡＷ５０：武田薬品工業株式会社製）４０ｍｇを加え、更に１時間攪拌した。セライトろ過し、母液をｐＨ７に調整して減圧濃縮した。残存する水分を除くため、２−プロパノール０．５ｍｌを加えて再度減圧濃縮を２回行った。残渣に２−プロパノール０．６ｍｌを加えて攪拌後、ろ過、減圧乾燥して、Ｌ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン（塩化ナトリウムを含む。）７７ｍｇを得た。（収率 ６９．２％）
（実施例５）
Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩の合成
メタノール４３ｍｌにＤ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニン４．３ｇ（２１．９ｍｍｏｌ）を加え、５℃に冷却、攪拌した。塩化チオニル２．７ｍｌ（３５．０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、室温で一晩攪拌した。反応液を減圧濃縮後、メタノール１５ｍｌを加え再度減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル２０ｍｌを加えてスラリー洗浄した。溶液をろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩４．３ｇを得た。収率７９．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．１２（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），４．２５（ｔ，１Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ），７．２８（ｄ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：２１０．３［Ｍ＋Ｈ］＋
（実施例６）
Ｄ−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル
メタノール６０ｍｌ、水３０ｍｌにＤ−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩１０．２ｇ（４１．１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌し、２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート１３．６ｇをメタノール１０ｍｌに溶解させて加えた。ｐＨ８以上に保ち、室温で一晩攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣に水５０ｍｌ、酢酸エチル１００ｍｌを加えて攪拌、不溶物をろ過した。母液を分層し、酢酸エチル層を０．５Ｎ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水各１００ｍｌで洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、ヘプタン５０ｍｌを加えて再度減圧濃縮した。残渣にヘプタン１００ｍｌを加えて一晩攪拌し、スラリー溶液をろ過、減圧乾燥して、Ｄ−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）−（４−ヒドロキシメチル）フェニルアラニンメチルエステルを１０．２ｇ得た。収率７９．５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．４２（ｓ，９Ｈ），３．０８（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），４．９８（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）：３０９．９［Ｍ＋Ｈ］＋
本発明によれば、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを光学選択的に収率よく簡便に得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンを工業的に生産することが可能になる。さらに、かかる製造方法に有用な化合物及びその製造方法が提供される。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０８４８５０（出願日：２００５年３月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００５−０８４８５０（出願日：２００５年３月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
Claims (20)
- 下記式（１）
で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントインを還元して、下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩を得、次いで該アミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩のアミノ基を水酸基に変換して、下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを得、そして該ヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを酵素で処理して、下記式（４ａ）
で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩、或いは下記式（４ｂ）
で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩を得ることを特徴とする、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法。 - 還元が還元触媒下における水素添加により行われる、請求項１記載の製造方法。
- 還元触媒が遷移金属触媒である、請求項２記載の製造方法。
- 還元触媒がパラジウム触媒である、請求項２記載の製造方法。
- アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 下記式（１）
で表されるシアノ置換ベンジリデンヒダントインを還元することを特徴とする、下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩の製造方法。 - 還元が還元触媒下における水素添加により行われる、請求項９記載の製造方法。
- 還元触媒が遷移金属触媒である、請求項１０記載の製造方法。
- 還元触媒がパラジウム触媒である、請求項１０記載の製造方法。
- 下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩のアミノ基を水酸基に変換することを特徴とする、下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインの製造方法。 - アミノ基の水酸基への変換が亜硝酸塩との反応により行われる、請求項１３記載の製造方法。
- 下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントインを酵素で処理して、下記式（４ａ）
で表されるＤ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩、或いは下記式（４ｂ）
で表されるＬ−ヒドロキシメチル置換フェニルアラニン又はその塩を得ることを特徴とする、光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法。 - 酵素がヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１５記載の製造方法。
- 酵素がマイクロバクテリウム リクエファシエンスＡＪ３９１２株由来のヒダントインラセマーゼ、フラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のヒダントイナーゼ及びフラボバクテリウム エスピーＡＪ１１１９９株由来のカルバモイラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１５の製造方法。
- 酵素が組換えＤＮＡによって形質転換された菌体の培養物から得たものである、請求項１５記載の製造方法。
- 下記式（２）
で表されるアミノメチル置換ベンジルヒダントイン又はその塩。 - 下記式（３）
で表されるヒドロキシメチル置換ベンジルヒダントイン。
Applications Claiming Priority (3)
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| JP2005084850 | 2005-03-23 | ||
| JP2005084850 | 2005-03-23 | ||
| PCT/JP2006/306600 WO2006101266A1 (ja) | 2005-03-23 | 2006-03-23 | 光学活性なヒドロキシメチル置換フェニルアラニンの製造方法 |
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|---|---|
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-
2006
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- 2006-03-23 JP JP2007509381A patent/JPWO2006101266A1/ja active Pending
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| Publication number | Publication date |
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