JPWO2006085697A1 - 脳血管疾患に対するアドレノメデュリンと間葉系幹細胞の併用療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、脳血管疾患の予防又は治療のための方法及び医薬キット、具体的には、間葉系幹細胞及びアドレノメデュリンとを併用する方法及び医薬キットに関する。また本発明は、該医薬キットの製造方法に関する。

Description

本発明は、脳血管疾患の予防又は治療用の医薬キット、及び脳神経機能の改善用の医薬キットに関する。また本発明は、該医薬キットの製造方法に関する。さらに本発明は、脳血管疾患の予防又は治療方法に関する。

脳血管疾患には、動脈硬化を起こして細くなった脳血管の血流が途絶える脳血栓と、心臓内で凝固した血液の固まりが脳血管に詰まる脳塞栓などがある。脳血栓は、高齢者に起こりやすく、知覚、運動、意識障害などが徐々に進行するが、脳塞栓は、突然に半身麻痺や言語障害によって始まることが多い。血栓又は塞栓により血流が途絶えた部分の脳細胞は短時間で壊死し、致命的な場合が多いが、救命されても脳細胞壊死は回復不能であり、後遺症が一生残る。現在の医療及び外科手術の発展にもかかわらず、脳梗塞は依然として発病及び死亡の主要因である。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多分化能を有し、移植したＭＳＣにはレシピエントの脳において神経細胞及び内皮細胞に分化するものもある（Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．Ｓｔｒｏｋｅ．３２：１００５−１０１１，２００１年）。最近の研究では、ＭＳＣが、特に損傷部位において血液脳関門を通過することができることが示されている（Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００１年（前掲）、Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．９２：６９２−６９９，２００３年、Ｃｈｏｐｐ Ｍ，Ｌｉ Ｙ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１：９２−１００，２００２年）。さらに、実験脳梗塞動物の脳へのＭＳＣの移植は、神経学的機能の回復を改善することが示されている（Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００１年（前掲）、Ｃｈｏｐｐ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００２年（前掲））。ＭＳＣ移植の効果は、移植したＭＳＣの数に依存する（Ｃｈｅｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００１年（前掲））。しかしながら、移植後のＭＳＣの生存能は比較的低い（Ｍａｎｇｉ ＡＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．９：１１９５−１２０１，２００３年）。従って、脳梗塞の再生処置に対するＭＳＣ治療の適用に関して、ＭＳＣ移植の効果を高める新しい手法が望まれている。
一方、アドレノメデュリン（ＡＭ）は、ヒト褐色細胞腫から最初に単離された強力な血管拡張性ペプチドである（特開平７−１９６６９３号公報、Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：５５３−５６０，１９９３年）。最近の研究では、アドレノメデュリンＤＮＡの筋肉内投与により、後肢虚血モデルにおいて、治療となりうるＡｋｔの活性化を介した血管形成が誘導されたことが示されている（Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０９：５２６−５３１，２００４年）。さらに、ＡＭは種々の細胞に対して抗アポトーシス作用を発揮することが示されている（Ｋａｔｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３８：２６１５−２６２０，１９９７年）。また、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路による心筋虚血／再潅流傷害におけるＡＭの抗アポトーシス作用が示されている（Ｏｋｕｍｕｒａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０９：２４２−２４８，２００４年）。別の報告では、内因性ＡＭは、代償機構により虚血脳において低酸素によりアップレギュレートされることが示されている（Ｓｅｒｒａｎｏ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１０９：７１７−７３１，２００２年）。以前の報告では、ＡＭによる前処理によって、ラット脳梗塞モデルにおいて脳傷害が低減し、神経障害が改善したことが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ）．１４３：１１５７−１１６１，２００１年）。

そこで、本発明は、述した実状に鑑み、脳血管疾患を効果的に予防又は治療するための方法及び手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、１）アドレノメデュリン（ＡＭ）注入又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）移植により、脳虚血境界領域において、血管形成が誘導され、神経細胞のアポトーシスが阻害されたこと、２）ＡＭの注入によって、ＭＳＣ移植の血管形成能及び抗アポトーシス作用が増大したこと、３）ＡＭにより、移植されたＭＳＣそれ自体のアポトーシスが阻害され、生着ＭＳＣ数が増大したこと、並びに４）ＡＭ及びＭＳＣの併用療法により、ＡＭ注入又はＭＳＣ移植単独よりも神経学的機能に顕著な改善が誘導されたことを確認し、ＡＭとＭＳＣとの併用が脳血管疾患の予防又は治療に有効であるという知見を得、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物を異なる容器に含むことを特徴とする脳血管疾患の治療用又は予防用医薬キットに関する。
上記医薬キットにおいて、間葉系幹細胞を含有する組成物は静脈内投与されることが好ましい。また、アドレノメデュリンを含有する組成物は静脈内投与されることが好ましい。
上記医薬キットにおいて、間葉系幹細胞は、投与対象の患者に由来することが好ましい。また、間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物は、同時に投与される、又は別々に投与されるものである。
上記医薬キットに関して、脳血管疾患は、限定されるものではないが、例えば急性脳梗塞又は慢性脳梗塞である。
また本発明は、間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物を異なる容器に含むことを特徴とする脳神経機能の改善用医薬キットに関する。
本発明はまた、間葉系幹細胞を含有する組成物及びアドレノメデュリンを含有する組成物を含む医薬キットの製造方法であって、
（ａ）被験体から採取した骨髄液由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を希釈又は培養するステップ、
（ｂ）培養したＭＳＣを薬学的に許容される担体中に懸濁するステップ、
（ｃ）アドレノメデュリンを薬学的に許容される担体と混合するステップ、
を含む、上記方法に関する。
さらに本発明は、有効量の間葉系幹細胞及び有効量のアドレノメデュリンを被験体に投与することを含む、脳血管疾患の治療又は予防方法に関する。
本発明により、脳血管疾患の治療若しくは予防又は脳神経機能の改善に有用な医薬キット、及び脳血管疾患の治療又は予防方法が提供される。かかる医薬キットは、従来の間葉系幹細胞の移植又はアドレノメデュリンの投与の単独処置と比較して効果的に脳血管疾患を治療し、脳神経機能を改善するものである。従って本発明は、医療又は薬学分野において有用である。

図１は、移植したＭＳＣの生着及び分化を示す写真である。赤色蛍光（ＰＫＨ２６）標識したＭＳＣは脳虚血境界領域で高頻度に観察された。ＰＫＨ２６陽性ＭＳＣ（赤色）には、神経マーカー（ＮｅｕＮ）（緑色）を発現（Ａ）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）（緑色）を発現（Ｂ）、又は内皮細胞マーカー（ｖＷＦ）（緑色）を発現（Ｃ）するものがあった。バー＝２０μｍ。
図２は、対照群（白丸）、ＭＳＣ群（白四角）、ＡＭ群（黒丸）、及びＭＳＣ＋ＡＭ群（黒四角）における、１日目、７日目及び１４日目の神経学的スコアを示す。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、対照群に対して、†Ｐ＜０．０５、ＭＳＣ群に対して、‡Ｐ＜０．０５、ＡＭ群に対して。
図３は、脳虚血境界領域（上）及び対側非虚血性組織（下）におけるフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）染色の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２５μｍ。
図４は、脳虚血境界領域（上）及び非虚血性組織（下）におけるｖＷＦ染色を用いた血管形成の定量分析を示すグラフである。
図５は、Ｋｉ６７染色の代表的な顕微鏡写真である。バー＝５０μｍ。
図６は、Ｋｉ６７陽性微細血管数の定量分析を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、対照群に対して、†Ｐ＜０．０５、ＭＳＣ群に対して、‡Ｐ＜０．０５、ＡＭ群に対して。
図７は、脳虚血境界領域におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な顕微鏡写真である。ＭＳＣ＋ＡＭ群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数（ＤＡＢ、褐色）は他の３つの群よりも顕著に低減した。
図８は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の定量分析を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、対照群に対して、†Ｐ＜０．０５、ＭＳＣ群に対して、‡Ｐ＜０．０５、ＡＭ群に対して。バー＝２０μｍ。
図９は、移植後のＭＳＣアポトーシスの代表的な顕微鏡写真である。移植したＭＳＣは赤色蛍光（ＰＫＨ２６）で標識した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑色）は脳虚血境界領域で高頻度に観察された。ＡＭの注入によりＴＵＮＥＬ陽性ＭＳＣは低減した（二重陽性細胞、重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅｄ））。
図１０のＡは、３日目におけるＴＵＮＥＬ陽性ＭＳＣ数の定量分析を示すグラフである。図１０のＢは、１４日目における生着ＭＳＣ数を示すグラフである。図１０のＣは、ＴＵＮＥＬ陽性非ＭＳＣ数の定量分析を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５。バー＝１００μｍ。

以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００５年２月１４日に出願された日本国特許出願第２００５−３６４１９号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、特定の理論に限定されるものではないが、以下の知見に基づくものである。すなわち、脳梗塞発症後のアドレノメデュリン（ＡＭ）注入によってラットの神経学的機能が改善したことが示され、またＡＭの注入によって脳虚血境界領域において新生血管形成が誘導された。一方、ＡＭはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介して種々の細胞に対して強力な抗アポトーシス作用を有することが示されており（Ｋａｔｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３８：２６１５−２６２０，１９９７年及びＯｋｕｍｕｒａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０９：２４２−２４８，２００４年）、本明細書に記載の実験では、ＡＭの短期間にわたる注入によってＴＵＮＥＬ陽性細胞が顕著に低減したことが確認された。これらの結果は、アドレノメデュリン（ＡＭ）が脳虚血境界領域における血管形成の誘導及び神経細胞アポトーシスの阻害によって、少なくとも部分的に神経学的機能を改善することを示唆している。
また、本明細書に記載の実験では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が多量の血管形成因子であるＶＥＧＦを分泌することが示された。実際、ＭＳＣは脳虚血境界領域において血管形成を誘導し細胞アポトーシスを阻害することがｉｎ ｖｉｖｏで証明された（図３〜８）。さらに、移植したＭＳＣの一部は神経細胞及び内皮細胞に分化した。従って、ＭＳＣは、その分化を介してだけではなく、その血管形成因子及び抗アポトーシス因子の分泌能により神経防御作用を有すると考えられる。しかしながら、移植したＭＳＣの大部分は３日目においてＴＵＮＥＬ染色に陽性（アポトーシス細胞）であった。興味深いことに、ＡＭの注入によりアポトーシス細胞数が有意に低減した。また、ＭＳＣ移植とＡＭ注入を行った場合には、ＭＳＣ移植のみを行った場合と比較して生着ＭＳＣ数が顕著に多かった。さらに、ＡＭにより非ＭＳＣのアポトーシスが阻害されたが、このことは、ＡＭの脳虚血境界領域に対する直接の防御作用を示唆している。さらに、ＡＭ注入とＭＳＣ移植の併用によって、ＭＳＣ移植又はＡＭ注入単独と比較して神経学的機能が顕著に改善された。
脳虚血の処置のためのＭＳＣの移植は、最近研究されている（Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ，Ｓｔｒｏｋｅ．３２：１００５−１０１１，２００１年、Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．９２：６９２−６９９，２００３年、Ｃｈｏｐｐ Ｍ，Ｌｉ Ｙ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１：９２−１００，２００２年、Ｍａｎｇｉ ＡＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．９：１１９５−１２０１，２００３年）。本発明者は、以前に鬱血性心不全患者におけるＡＭ注入の安全性を実証している（Ｎａｇａｙａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０００；１０１：４９８−５０３）。従って、ＡＭ注入とＭＳＣ移植を用いた併用療法は、脳血管疾患の治療若しくは予防のため又は脳神経機能の改善のために新規で有望な治療方法となりうる。また、同様の病態を示す他の心血管疾患や肺、腎、肝疾患などの血流障害の病態にも有効な可能性が推測される。
１．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の調製
本発明において使用する、間葉系幹細胞は、当技術分野で公知の方法により調製することができる（例えば、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８４：１４３−１４７参照）。間葉系幹細胞は、好ましくは骨髄から得られる。本発明においては、移植後の拒絶反応を回避するため、間葉系幹細胞の投与対象となる被験体と同種の動物から、好ましくはその被験体から骨髄液などを採取し、同種動物又は該被験体由来の間葉系幹細胞を得ることが好ましい。特に、本発明の医薬キットを使用する対象の被験体に由来する間葉系幹細胞、すなわち自己由来の間葉系幹細胞を利用することが好ましい。ここで、被験体は、間葉系幹細胞を調製することができる動物であれば特に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト、ペット動物（ネコ、イヌなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギなど）などである。
骨髄には主に造血幹細胞と間葉系幹細胞が含まれる。例えば、骨髄液少量（数ｍｌ）を分離することなくそのまま培地（１５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ）に入れて３７℃で培養する。それにより、接着系細胞である間葉系幹細胞が増殖し、浮遊系細胞である造血幹細胞は排除され、１〜３週間で間葉系幹細胞が得られる。
また、得られた細胞が間葉系幹細胞であるか否かは、公知の細胞マーカーを利用して、例えば、ＣＤ２９若しくはＣＤ９０の存在、又はＣＤ３４若しくはＣＤ４５の不在を検出することにより、確認することができる。
調製した間葉系幹細胞は、通常の方法に従って薬学的に許容される担体と混合するか、又は薬学的に許容される担体中に希釈若しくは懸濁することにより、該細胞の投与に適した組成物とすることができる。適切な担体の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油などが挙げられる。また、組成物には、医薬において通常用いられる賦形剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などが含まれてもよい。また、間葉系幹細胞は、凍結乾燥した無菌の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給し、その投与の前に、粉末又は濃縮物を適切な媒質に希釈又は懸濁することもできる。
間葉系幹細胞を含む組成物は、移植に適した投与剤形をとることができる。特に限定されるものではないが、例えば注射又は注入（静脈内注射、脳動脈への注射、開頭による脳実質への注入など）により間葉系幹細胞を含む組成物を投与する場合、投与剤形は、滅菌注射剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤などの形態であり、特に滅菌注射剤が好ましい。
２．アドレノメデュリン（ＡＭ）の調製
アドレノメデュリンとは、血管新生作用、血管拡張作用及び血圧降下作用などを有する公知のペプチドである（特開平７−１９６６９３号公報）。アドレノメデュリンの精製手法、並びにそのアミノ酸配列及び塩基配列を用いた作製方法も公知である。また、アドレノメデュリンの活性（例えば、血管形成作用、アポトーシス阻害作用など）を有する限り、使用するアドレノメデュリンのペプチドに、アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加、又は他の基若しくは物質の結合、修飾などが含まれていてもよい。このような望ましい活性を保持する改変型ペプチドの調製も当技術分野では周知である。
本発明においては、アドレノメデュリンは、通常の方法に従って薬学的に許容される担体と混合するか、又は薬学的に許容される担体中に溶解することにより、投与に適した組成物とすることができる。適切な担体の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油などが挙げられる。また、組成物には、医薬において通常用いられる賦形剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などが含まれてもよい。アドレノメデュリンもまた、凍結乾燥した無菌の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給することができる。そして、その投与の前に、粉末又は濃縮物を適切な媒質（例えば、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液など）に希釈又は懸濁し、液状組成物として投与することができる。
アドレノメデュリンを含む組成物は、投与経路に応じて適切な投与剤形をとることができる。例えば、静脈内経路、脳動脈への投与又は開頭による脳実質への注入により注射剤として投与される場合には、アドレノメデュリンを含む組成物の投与剤形は、滅菌注射剤、溶液剤などの形態であり、特に滅菌注射剤が好ましい。また、吸入投与により投与される場合には、噴霧剤を含有する溶液剤、懸濁剤などの形態でありうる。
３．脳血管疾患の治療又は予防
本発明は、間葉系幹細胞とアドレノメデュリンとを用いた脳血管疾患の治療又は予防に関する。また本発明の医薬キットは、間葉系幹細胞を含有する組成物とアドレノメデュリンを含有する組成物とを異なる容器に含むものである。本発明の医薬キットを用いて、脳血管疾患の治療若しくは予防、又は脳神経機能の改善のために、間葉系幹細胞とアドレノメデュリンの併用療法を行うことが可能となる。
本発明において対象となる被験体は、脳血管疾患を患う若しくは患うリスクのある被験体、又は脳神経機能が低下した被験体であれば特に限定されるものではない。例えば、動物、特にヒト、ペット動物（ネコ、イヌなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヤギなど）を挙げることができる。
本発明により治療又は予防することができる脳血管疾患又は障害は、脳血管の損傷などに起因するものであれば特に限定されるものではないが、虚血性疾患又は障害、例えば、脳虚血、脳梗塞（急性期脳梗塞及び慢性期脳梗塞）、脳血栓、脳塞栓及び脳卒中；並びに出血性疾患又は障害、例えば、脳内出血、脳血腫及びクモ膜下出血などを含む。本発明において「脳血管疾患」とは、このような疾患若しくは障害、又はその症候を意味する。
また、本発明により改善することができる脳神経機能は、特に限定されるものではないが、感覚、運動、反射、思考、行動、記憶、意識などが挙げられる。脳神経機能は、例えば、改変神経学的重篤度スコア（Ｃｈｅｎ Ｊ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５−１０１１）を用いて評価することができ、このスコアの低下は脳神経機能の改善を示す。また本発明によって意識障害を軽減し、生命予後を改善させる可能性がある。
本発明において、各組成物は、異なる容器に含まれる。例えば、バイアル、チューブ、シリンジ、アンプルなどの密閉可能な容器に、単回用量又は分割用量の各組成物を入れることができる。各組成物の用量は、投与経路、投与回数、剤形などに応じて異なるが、当技術分野で慣用の手法を用いて適宜決定することができる。
本発明において、各組成物は、当技術分野で一般的な方法に従って被験体に投与することができる。例えば限定されるものではないが、間葉系幹細胞を含有する組成物及びアドレノメデュリンを含有する組成物は、非経口的に、例えば静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、及び動脈内経路などにより投与することができ、好ましくは静脈内投与する。あるいは、一定期間にわたり持続注入するため、各組成物は、点滴、カテーテル、経皮パッチ又は埋込型浸透圧ポンプなどの当技術分野で公知の持続注入手段を用いて投与することも可能である。
本発明においては、有効量の間葉系幹細胞及び有効量のアドレノメデュリンを投与する。ここで「有効量」とは、対象の被験体において、脳血管疾患の治療若しくは改善、その症状の軽減、脳血管疾患の予防を行うのに十分な量であり、当業者であれば、種々の要因を考慮して適宜決定することができる。間葉系幹細胞を含有する組成物は、例えば１×１０^６〜１×１０^８細胞／投与、好ましくは１×１０^７〜１×１０^８／投与の投与量で、必要に応じて繰り返し投与することができる。また、アドレノメデュリンを含有する組成物は、例えば０．１〜４．０ｍｇ／日、好ましくは１．０〜２．０ｍｇ／日の投与量で、１時間〜７日、好ましくは１２時間〜３日にわたり投与することができる。しかしながら、投与量は、組成物の投与経路、投与回数、患者の病状、年齢及び体重などを考慮して決定すべきである。
間葉系幹細胞を含有する組成物とアドレノメデュリンを含有する組成物は、同時に投与してもよいし又は別々に連続して若しくは一定期間をおいて投与してもよい。好ましくは、間葉系幹細胞を含有する組成物とアドレノメデュリンを含有する組成物を同時に投与し、その後、アドレノメデュリンを含有する組成物を、１時間〜７日、好ましくは１２時間〜３日にわたり、持続投与する。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例において得られた全てのデータは平均±ＳＥＭで表した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔを用いて、２つの群の差を比較した。４群におけるパラメータの比較は、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより、続いてニューマン−クールズ検定により行った。神経学的スコアの時間経過の比較は、ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより反復測定値について行い、続いてニューマン−クールズ検定により行った。確率値＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
〔実施例１〕
（１）脳梗塞モデルの作製
体重２３０〜２３６ｇの雄ルイスラット（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ．，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を全ての実験で使用した。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を、既に記載されているように管腔内糸により実施した（Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００３；９２：６９２−６９９）。この実験プロトコールは、国立循環器病センターの動物取扱委員の承認を得た。
（２）ＭＳＣの調製
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖は、既に記載されている方法に従って行った（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８４：１４３−１４７）。簡単に説明すると、雄ルイスラットを犠牲にし骨髄を採取した。骨髄細胞は、１００ｍｍディッシュに入れ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したα−ＭＥＮ中で培養した。非接着性造血細胞を培地の取り換えにより取り出した後、紡錘形の接着細胞は５〜７日までに可視できる対称的なコロニーを生じた。これらを約４〜５回の継代により５×１０^７細胞以上になるまで増殖させた。これらの接着細胞を０．０５％トリプシン及び２％ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて３７℃にて３分かけて回収した。これらの細胞は、既に記載されているように蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により分析した（Ｎａｇａｙａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４；２８７：Ｈ２６７０−２６７６）。培養接着細胞の大部分はＣＤ２９（９８±１％）及びＣＤ９０（９９±１％）に陽性であり、ＣＤ３４（２±１％）及びＣＤ４５（１±１％）に陰性だった。接着細胞の主要な集団がＭＳＣであることを確認した。ＭＳＣは、培養の２４時間後に、大量の抗アポトーシス因子及び血管形成因子（血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）を含む）を分泌した（９６０±１４ｐｇ／１０^６細胞）。
（３）ＭＳＣ移植及びＡＭ注入
（１）で行った２時間のＭＣＡＯの直後に、ラットをランダムに以下の４つの群に分けた：１）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）注射＋ビヒクル注入（対照群、ｎ＝２２）、２）ＭＳＣ注射＋ビヒクル注入（ＭＳＣ群、ｎ＝２８）、３）ＰＢＳ注射＋ＡＭ注入（ＡＭ群、ｎ＝２２）、並びに４）ＭＳＣ注射＋ＡＭ注入（ＭＳＣ＋ＡＭ群、ｎ＝２８）。ＰＢＳに懸濁したＭＳＣ（１×１０^６細胞）又はＰＢＳ単独を尾静脈に注射した。４匹のラットに管腔内糸を用いないで擬似手術を行った。アドレノメデュリン（０．０５μｇ／ｋｇ／分）又はビヒクルを、頸部皮下領域に埋め込んだミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）を用いて７日間注入した。この試験に使用したＡＭの量は、顕著な低血圧を起こすことなく抗アポトーシス作用を有する（Ｏｋｕｍｕｒａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４；１０９：２４２−２４８）。
〔実施例２〕
本実施例においては、虚血性脳半球におけるＭＳＣの分化を検出した。すなわち、赤色蛍光標識したＭＳＣを、既に記載されているように移植して、ＭＳＣの分化を調べた（Ｊｅａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．２０００；１０２：２７３−２８０）。
簡単に説明すると、懸濁したＭＳＣを蛍光標識（ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で標識した。標識の３分後に、ＦＢＳを１分間かけて添加して反応を停止させ、細胞をＰＢＳで洗浄した。最近の研究では、ＰＫＨ２６による細胞標識の感度及び特異性がほぼ１００％であり、移植細胞は宿主の脳において移植後少なくとも４ヶ月まで検出可能であることが示されている（Ｊｅａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．２０００；１０２：２７３−２８０）。ＭＣＡＯの１４日後にラットを過剰量のペントバルビタールで麻酔した。凍結切片の調製のため、ラットを正常生理食塩水を用いて経心臓で潅流し、直後に脳を取り出した。ブレグマ−１〜１ｍｍで解剖学的座標に対応するブロックを得て、液体窒素中で急速凍結した。一連の６μｍ薄の切片を得た。ＰＫＨ２６陽性細胞の数を盲目試験で計数し、５つの切片の平均として表した。ＭＳＣの分化を検出するために、免疫組織学的染色を行った。切片は、抗ｖＷＦポリクローナル抗体（１：２００、ＤＡＫＯ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：５００、ＤＡＫＯ）及びマウス抗ＮｅｕＮ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共にインキュベートした後、それぞれフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ウサギ免疫グロブリン抗体（ＤＡＫＯ）及びＦＩＴＣ結合マウス免疫グロブリン抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。
結果を図１に示す。静脈内投与したＭＳＣは脳虚血境界領域に生着した。ある程度のＭＳＣは神経マーカーであるＮｅｕＮ及びＧＦＡＰ陽性であった（図１Ａ及びＢ）。他のＭＳＣは血管内皮マーカーであるｖＷＦ陽性であった（図１Ｃ）。分化したＭＳＣの数は、ＭＳＣ群及びＭＳＣ＋ＡＭ群において有意差がなかった。対側非虚血組織においてＭＳＣはわずかにしか観察されなかった。
〔実施例３〕
本実施例においては、神経学的評価を行った。この神経学的評価は、改変神経学的重篤度スコアを用いて１、７及び１４日目に実施した（Ｃｈｅｎ Ｊ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５−１０１１）。
簡単に説明すると、このスコアは、片側不全麻痺（ラットの尾による逆立て又は平面上でのラットの配置に対する応答）、感覚障害（配置、固有感覚）、竿秤試験（細い竿上での配置及び姿勢に対する応答、並びに落下前の時間）、無反射（耳介、角膜、驚愕）、並びに異常行動（発作、ミオクローヌス、筋張力障害）について動物を評価することにより得る。仕事の実施不能力について又は試験した反射の欠損について１ポイントを与える。
結果を図２に示す。１日目の神経学的重篤度スコアは４つの群において有意差がなかった（図２）。神経障害は全ての群において段階的に改善された。７日目及び１４日目の両方でＡＭ群及びＭＳＣ群には有意差がなかったが、７日目及び１４日目におけるＭＳＣ群及びＡＭ群のスコアは対照群よりも低かった（Ｐ＜０．０５）。興味深いことに、７日目及び１４日目のスコアは４つの群のなかでＭＳＣ＋ＡＭ群が最も低かった。従って、ＭＳＣ移植とＡＭ注入の併用により、脳神経機能が改善することが示された。
〔実施例４〕
本実施例においては、梗塞の大きさを測定した。
ラットは、１日目（各群、ｎ＝８）及び１４日目（各群、ｎ＝８）に安楽死させた。パラフィン包理切片の調製のために、ラットを４％パラホルムアルデヒドで経心臓で潅流した。脳は等間隔（２ｍｍ）の７つの解剖学的ブロックに切断し、各切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。梗塞の大きさは、既に記載されているように「間接法」により測定し（Ｃｈｅｎ Ｊ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５−１０１１）、完全対側半球の大きさの割合（パーセンテージ）として表した。
結果を表１のａ及びｂに示す。ＭＳＣ群又はＡＭ群における１日目の梗塞の大きさは、対照群よりも有意に小さかった（Ｐ＜０．０５、表１ａ）。さらに、ＭＳＣ＋ＡＭ群における梗塞の大きさは４つの群のなかで最も小さかった。ＭＳＣ群、ＡＭ群及びＭＳＣ＋ＡＭ群における体重の増大率（％）は、対照群のものよりも高かった（Ｐ＜０．０５、表１ｂ）。興味深いことに、体重の有意な増加は、処置後の神経学的スコアの低いラットにおいて観察された。以前の報告では、脳梗塞後の体重はビヒクル処置ラットよりもｂＦＧＦ処置ラットにおいて高かったことが示されている（Ｊｉａｎｇ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．１９９６；１３９：１７３−１７９）。これらの結果は、神経障害の早期回復により脳梗塞後の食物摂取障害が回復したことを示唆している。
対照：ビヒクル注入を行ったラット
ＭＳＣ：ＭＳＣ移植を行ったラット
ＡＭ：ＡＭ注入を行ったラット
ＭＳＣ＋ＡＭ：ＭＳＣ移植とＡＭ注入を行ったラット
データは平均±ＳＥＭである。
＊Ｐ＜０．０５、対照群に対して
†Ｐ＜０．０５、ＭＳＣ群に対して
‡Ｐ＜０．０５、ＡＭ群に対して
〔実施例５〕
血管形成は、１４日目（各群、ｎ＝８）に分析した。ブレグマ−１〜１ｍｍで解剖学的座標に対応するパラフィン切片を選択した。切片は、抗ｖＷＦ抗体と共にインキュベートし、続いてビオチニル化抗ウサギ免疫グロブリン及びストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。ＨＲＰ反応は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で検出した。血管形成を定量するために、既に記載されているようにして脳虚血境界領域及び対側非虚血性組織から８つの視野をランダムに選択し（Ｃｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００３；９２：６９２−６９９）、画像（×１００倍率）を顕微鏡（ＺＷＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ １３５）及びデジタルカメラ（ＺＷＩＳＳ ＡＸＩＯ ｃａｍ）を用いて取得した。各画像における抗ｖＷＦ免疫反応領域を、既に記載されているように、ソフトウエア（Ｗｉｎ Ｒｏｏｆ ５．０ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いた画像解析により測定した（Ｓｕｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３；１１１：１８４３−１８５１）。総褐色領域に相当する値は、１００μｍ^２当たりの染色血管領域の平均％として表した。新たに形成された血管を検出するため、モノクローナル抗Ｋｉ６７抗体（ＤＡＫＯ）を用いて、細胞増殖に関するマーカーであるＫｉ６７について組織切片を染色した。Ｋｉ６７陽性微細血管の数を計数し、８視野における平均として表した。
結果を図３〜６に示す。擬似手術と比較して、脳虚血境界領域における血管形成はＭＣＡＯ後に観察された（図３）。さらに、ＭＳＣ移植又はＡＭ注入により、脳虚血境界領域に血管形成が誘導され、特に、ＭＳＣ移植及びＡＭ注入の併用療法（ＭＳＣ＋ＡＭ）後に血管形成効果が顕著であった。定量分析により、ＭＳＣ群及びＡＭ群におけるｖＷＦ染色の領域が対照群のものよりも高いことが示された（対照群に対してＰ＜０．０５、図４）。ＭＳＣ群とＡＭ群とに有意差はなかった。興味深いことに、ＭＳＣ＋ＡＭ群におけるｖＷＦ染色の領域は、４つの群で最も高かった（ＭＳＣ群及びＡＭ群に対してＰ＜０．０５）。全ての群において非虚血性組織の新生血管形成には有意差はなかった（図３及び４）。
細胞増殖マーカーであるＫｉ６７の免疫染色の代表的な顕微鏡写真により、ＡＭ注入及びＭＳＣ移植によって脳虚血境界領域における新たに形成されたＫｉ６７陽性の微細血管の数が増大したことが示された（図５及び６）。
〔実施例６〕
本実施例においては、神経細胞及び移植ＭＳＣに対するＡＭの抗アポトーシス作用を検出した。
脳虚血境界領域に対するＡＭの抗アポトーシス作用を、ＭＣＡＯの２４時間後に調べた（各群、ｎ＝８）。パラフィン包理切片を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために調製した。ＴＵＮＥＬ染色は、市販のキット（ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｌｕｓ，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。視野当たりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数を計数し、８視野における平均として表した。
また、虚血性脳における移植ＭＳＣのアポトーシスを評価するため、さらに１２匹のラット（ＭＳＣ群、ｎ＝６；ＭＳＸ＋ＡＭ群、ｎ＝６）を３日目に安楽死させた。ＴＵＮＥＬ染色（ＡｐｏｐＴａｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｋｉｔ）には凍結切片を使用した。ＴＵＮＥＬ及びＰＫＨ２６陽性細胞数を計数し、切片５つにおける平均として表した。
結果を図７〜１０に示す。１日目に脳虚血境界領域においてＴＵＮＥＬ陽性細胞が高頻度に観察された（図７）。定量分析により、処置群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数が対照群よりも低いことが示された（対照群に対してＰ＜０．０５、図８）。興味深いことに、ＭＳＣ＋ＡＭ群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数はＭＳＣ群及びＡＭ群よりも有意に少なかった（ＭＳＣ群及びＡＭ群に対してＰ＜０．０５）が、ＭＳＣ群とＡＭ群には有意差はなかった。
移植したＭＳＣの大部分は３日目にＴＵＮＥＬ染色について陽性であった（図９）。脳虚血境界領域ではＡＭの注入によりＴＵＮＥＬ陽性ＭＳＣが減少した。定量分析により、ＭＳＣ＋ＡＭ群におけるアポトーシスＭＳＣの数はＭＳＣ群よりも有意に少なかったことが示された（Ｐ＜０．０５、図１０Ａ）。結果として、１４日目にＭＳＣ＋ＡＭ群において生着したＭＳＣの数は、ＭＳＣ群よりも顕著に高かった（Ｐ＜０．０５、図１０Ｂ）。神経細胞を含むＴＵＮＥＬ陽性非ＭＳＣの数もまたＡＭ注入により低減した（図１０Ｃ）。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

本発明により、脳血管疾患の治療若しくは予防又は脳神経機能の改善に有用な医薬キット、及び脳血管疾患の治療又は予防方法が提供される。かかる医薬キットは、従来の間葉系幹細胞の移植又はアドレノメデュリンの投与の単独処置と比較して効果的に脳血管疾患を治療し、脳神経機能を改善するものである。従って本発明は、医療又は薬学分野において有用である。

Claims (9)

1. 間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物を異なる容器に含むことを特徴とする脳血管疾患の治療用又は予防用医薬キット。
2. 間葉系幹細胞を含有する組成物が静脈内投与されるものである、請求項１記載の医薬キット。
3. アドレノメデュリンを含有する組成物が静脈内投与されるものである、請求項１又は２記載の医薬キット
4. 間葉系幹細胞が自己由来のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬キット。
5. 間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物が、同時に投与される、又は別々に投与されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬キット。
6. 脳血管疾患が、急性脳梗塞又は慢性脳梗塞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬キット。
7. 間葉系幹細胞を含有する組成物、及びアドレノメデュリンを含有する組成物を異なる容器に含むことを特徴とする脳神経機能の改善用医薬キット。
8. 間葉系幹細胞を含有する組成物及びアドレノメデュリンを含有する組成物を含む医薬キットの製造方法であって、
   （ａ）被験体から採取した骨髄液由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養するステップ、
   （ｂ）培養したＭＳＣを薬学的に許容される担体中に希釈又は懸濁するステップ、
   （ｃ）アドレノメデュリンを薬学的に許容される担体と混合するステップ、
   を含む、上記方法。
9. 有効量の間葉系幹細胞及び有効量のアドレノメデュリンを被験体に投与することを含む、脳血管疾患の治療又は予防方法に関する。