JPWO2006061985A1 - 多色同時測定用ルシフェラーゼ発光方法および発光試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(3) 緑色発光ルシフェラーゼ、橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1種のルシフェラーゼによる発光反応における発光半減期が2時間以上である、(1)又は(2)記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
(a)ピロリン酸、ピロリン酸塩及びCoAからなる群より選択される少なくとも1種の化合物、
(b)ルシフェリン、
(c)アデノシン三リン酸、及び
(d)マグネシウムイオン
を含む、前記発光試薬。
(19) さらに、培養細胞の溶解に必要な成分を含む、(18)記載の発光試薬。
「赤色発光ルシフェラーゼ」とは、最大発光波長が610nm〜630nm、半値幅が53〜70nmの発光色を示すルシフェラーゼをいう。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2004‐353964号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明で使用する場合、サポニンは、セッケンボク樹皮由来、大豆由来、茶の実由来で抽出・精製されたものを用いることができる。サポニンの使用濃度は、0.001W/V%から10W/V%が適当であり、好ましくは0.05W/V%から1.0W/V%である。サポニンは、細胞を溶解する作用を有するので、培養細胞の溶解に必要な成分としても使用することができる。
pEX-Redを発現させて得られた鉄道虫由来赤色発光ルシフェラーゼによる発光反応の結果を図3に示すが、「ピッカジーン発光キット」により調製した従来のルシフェラーゼ発光試薬では、発光開始直後に一端急速に減衰し、その後20秒後から徐々に増加した。発光開始から20秒間で約60%の発光の変動、また30秒後から130秒後の100秒間で約16%の発光量の変動が確認され、定量的な発光量の測定を可能とする一定な発光強度を示す発光Kineticsが得られなかった。これに対し、多色発光用のルシフェラーゼ発光試薬による発光反応では、発光反応開始から20秒後に急速に減衰するも、その後一定の発光強度が得られ、発光開始30秒後から130秒後までの発光量の変動は100秒間で1.2%であった。
なお、本実施例の実験において、0.01%サポニン及び20mM NaFを多色発光用のルシフェラーゼ発光試薬に添加しないで、その代わりに細胞溶解剤に添加した場合(この際には、CHAPSを細胞溶解剤に添加しなくてもよい)にも、同様の結果が得られる。
なお、本実施例の実験において、0.01%サポニン及び20mM NaFを多色発光用のルシフェラーゼ発光試薬に添加しないで、その代わりに細胞溶解剤に添加した場合(この際には、CHAPSを細胞溶解剤に添加しなくてもよい)にも、同様の結果が得られる。
緑色:赤色:橙色=100:1:100
緑色:赤色:橙色=100:10:10
緑色:赤色:橙色=100:100:1
(2)橙色ルシフェラーゼをコントロールとした系
緑色:赤色:橙色=1:100:100
緑色:赤色:橙色=10:10:100
緑色:赤色:橙色=100:1:100
(3)赤色ルシフェラーゼをコントロールとした系
緑色:赤色:橙色=1:100:100
緑色:赤色:橙色=10:100:10
緑色:赤色:橙色=100:100:1
混合したライゼート20μLをルミノメーター(アトー社製 ルミネッセンサーMCA AB-2250型)用のキュベットの底部に採った。
なお、本実施例の実験において、0.01%サポニン及び20mM NaFを多色発光用のルシフェラーゼ発光試薬に添加しないで、その代わりに細胞溶解剤に添加した場合(この際には、CHAPSを細胞溶解剤に添加しなくてもよい)にも、同様の結果が得られる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (21)
- 緑色発光ルシフェラーゼ、橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも2種のルシフェラーゼによる発光反応において、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させることにより、発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下である発光を生ぜしめることを特徴とする、ルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 緑色ルシフェラーゼ、橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも2種のルシフェラーゼの各々による発光反応の発光強度を比較したときに、どの2つの組み合わせについても、発光強度比が1:1〜1:200の範囲内にある、請求項1記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 緑色発光ルシフェラーゼ、橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも1種のルシフェラーゼによる発光反応における発光半減期が2時間以上である、請求項1又は2記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.0001mM〜100mMのピロリン酸および/またはピロリン酸塩の存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜3のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001mM〜100mMのCoAの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜3のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001mM〜100mMのルシフェリンをルシフェリンと反応させる、請求項1〜5のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001 mM〜 100 mM のアデノシン三リン酸の存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜6のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001〜200mMのマグネシウムイオンの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜7のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001W/V%〜15W/V%のα−シクロデキストリンの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜8のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.1mM〜500mMのフッ化ナトリウムの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜9のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 0.001〜10W/V%のサポニンの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜10のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 1mM〜500mMのHEPES及びトリスの存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜11のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 還元剤の存在下で、ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる、請求項1〜12のいずれかに記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 還元剤が100mM以下の濃度で存在する、請求項13記載のルシフェリン/ルシフェラーゼの発光方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の方法を利用して、試料中のルシフェラーゼ量を測定する方法。
- 2種のルシフェラーゼ量を色識別により測定する、請求項15記載の方法。
- 3種のルシフェラーゼ量を色識別により測定する、請求項15記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の方法で発光を生ぜしめるための発光試薬であって、以下の成分:
(a)ピロリン酸、ピロリン酸塩及びCoAからなる群より選択される少なくとも1種の化合物、
(b)ルシフェリン、
(c)アデノシン三リン酸、及び
(d)マグネシウムイオン
を含む、前記発光試薬。 - さらに、培養細胞の溶解に必要な成分を含む、請求項18記載の発光試薬。
- 試料中のルシフェラーゼ量を測定するためのルシフェラーゼアッセイ試薬として用いられる、請求項18又は19記載の発光試薬。
- 請求項18〜20のいずれかに記載の発光試薬を含む発光試薬キット。
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