JPWO2004085641A1

JPWO2004085641A1 - Stress-inducible promoter and method of using the same

Info

Publication number: JPWO2004085641A1
Application number: JP2005503987A
Authority: JP
Inventors: 和子篠崎; 幸次桂; 伊藤　裕介; 裕介伊藤
Original assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS
Current assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: CN1795267A; CN1795267B; CA2519997C; CA2519997A1; JP4219928B2; KR100703115B1; WO2004085641A1; KR20060018817A

Abstract

本発明は、イネ等の単子葉植物で有効に機能するストレス誘導性プロモーター、及び該プロモーターを用いた環境ストレス耐性植物に関する。すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる、イネ由来のプロモーター：（ａ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス誘導性のプロモーター活性を有するＤＮＡ、及び、前記プロモーターを導入した環境ストレス耐性植物に関する。The present invention relates to a stress-inducible promoter that functions effectively in monocotyledonous plants such as rice, and an environmental stress resistant plant using the promoter. Specifically, the present invention relates to a rice-derived promoter comprising the following DNA (a) or (b): (a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 10 (b) SEQ ID NO: 1 Alternatively, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and has stress-inducible promoter activity, and introducing the promoter Related to environmental stress resistant plants.

Description

本発明は、イネ由来のストレス誘導性プロモーターとその利用方法に関する。 The present invention relates to a rice-derived stress-inducible promoter and a method for using the same.

植物は、乾燥、高温、凍結、塩など、自然界における様々な環境ストレスに対応するための耐性機構を有している。最近では、こうしたストレス耐性機構が分子レベルで明らかになるにつれ、バイオテクノロジー的手法を用いたストレス耐性植物も作出されるようになってきた。例えば、ストレスを受けた細胞内にはＬＥＡタンパク質、水チャネルタンパク質、適合溶質合成酵素などのストレスタンパク質が誘導され、細胞をストレスから防御する。そこで、オオムギのＬＥＡタンパク質やタバコのｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ等の遺伝子、浸透圧調節物質（糖、プロリン、グリシンベタイン等）合成酵素の遺伝子を植物に導入する研究が試みられた。また、細胞膜脂質の修飾酵素であるシロイヌナズナのｗ−３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅやらん藻のＤ９ｄｅｓａｔｕｒａｓｅの遺伝子等を用いた研究も試みられた。これらの研究では、いずれも一つの遺伝子がカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに結合して植物に導入された。しかし、組換え植物のストレス耐性度が不安定であったり、導入遺伝子の発現レベルが低い等の問題から実用化に至ったものはなかった。
一方、ストレス耐性機構には複数の遺伝子が複雑に関与することがわかってきた（非特許文献１）。そこで、それらの発現を同時に活性化する転写因子の遺伝子を恒常的プロモーターに連結して導入し、植物のストレス耐性を高める研究も試みられた（非特許文献２）。しかし、複数の遺伝子が同時期に活性化されると、宿主植物のエネルギーが該遺伝子産物の生成や、該遺伝子産物に起因する細胞内代謝に向けられるため、植物自体の成長が遅れたり矮化してしまうという問題があった。
これに対し、発明者らはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）からストレス応答性エレメントに結合し、該エレメント下流の遺伝子の転写を特異的に活性化する転写因子をコードする遺伝子、ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、ＤＲＥＢ１Ｃ、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ｂを単離した（特許文献１）。そして、これらの遺伝子をストレス誘導性ｒｄ２９Ａプロモーターに連結して植物に導入することにより、矮化しないストレス耐性植物が作製できることを報告した（特許文献２）。
しかし、双子葉植物であるシロイヌナズナ由来のｒｄ２９Ａプロモーターは、単子葉植物中で機能はしてもその活性が弱い。したがって、単子葉植物において強い活性を有するストレス誘導性プロモーターが望まれていた。
特開２０００−６０５５８号公報特開２０００−１１６２６０号公報ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）Ｏｃｔ；１１５（２）ｐ３２７−３３４Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，（１９９８）１０：ｐ１３９１−１４０６ Plants have a tolerance mechanism for dealing with various environmental stresses in nature, such as drying, high temperature, freezing, and salt. Recently, as these stress tolerance mechanisms have become clear at the molecular level, stress-tolerant plants using biotechnological techniques have been created. For example, stress proteins such as LEA protein, water channel protein, and compatible solute synthase are induced in stressed cells to protect the cells from stress. Thus, studies have been attempted to introduce genes such as barley LEA protein and tobacco detoxification enzyme, and genes for osmotic regulators (such as sugar, proline, and glycine betaine) into the plant. In addition, studies using the Arabidopsis thaliana w-3 fatty acid desaturase and the cyanobacterium D9 desaturase genes, which are cell membrane lipid modifying enzymes, have also been attempted. In these studies, one gene was introduced into a plant by binding to the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. However, none of the recombinant plants have been put into practical use due to problems such as unstable stress tolerance of the recombinant plant and low expression level of the transgene.
On the other hand, it has been found that a plurality of genes are involved in a stress tolerance mechanism in a complicated manner (Non-Patent Document 1). Therefore, an attempt has been made to increase the stress tolerance of plants by introducing transcription factor genes that simultaneously activate their expression into a constitutive promoter (Non-patent Document 2). However, when multiple genes are activated at the same time, the energy of the host plant is directed to the generation of the gene product and intracellular metabolism caused by the gene product, so that the growth of the plant itself is delayed or hatched. There was a problem that.
On the other hand, the inventors bind to a stress-responsive element from Arabidopsis thaliana and encode a transcription factor that specifically activates transcription of a gene downstream of the element, DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB2A DREB2B was isolated (Patent Document 1). Then, it was reported that a stress-tolerant plant that does not hatch can be produced by linking these genes to a stress-inducible rd29A promoter and introducing the gene into a plant (Patent Document 2).
However, the rd29A promoter from Arabidopsis thaliana, which is a dicotyledonous plant, is weak in activity even though it functions in monocotyledonous plants. Therefore, a stress-inducible promoter having strong activity in monocotyledonous plants has been desired.
Japanese Patent Laid-Open No. 2000-60558 JP 2000-116260 A Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. et al. , Plant Physiol. (1997) Oct; 115 (2) p327-334. Liu et al. The Plant Cell, (1998) 10: p1391-1406.

本発明は、イネ等の単子葉植物において効果的に機能し得るストレス誘導性プロモーターを見出し、該プロモーターを用いて新規な環境ストレス耐性植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、イネゲノムより、強いストレス誘導性プロモーターを単離することに成功した。そして、該プロモーターを用いれば、単子葉植物の環境ストレス耐性を著しく向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明はイネ由来のストレス誘導性プロモーターに関する。該プロモーターは、具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる。
（ａ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス誘導性のプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここで、ストレスとは、乾燥ストレス、低温ストレス又は塩ストレスである。
また、本発明は前記プロモーターを含む組換えベクターを提供する。該ベクターは、本発明のプロモーター支配下に他の構造遺伝子や調節遺伝子を含んでいてもよく、特にストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子を含んでいることが好ましい。
ストレス耐性を向上させる構造遺伝子の好適な例としては、プロリン合成の鍵酵素Ｐ５ＣＳ遺伝子（ＹｏｓｈｉｂａＹ．ｅｔａｌ（１９９９）ＢＢＲＣ２６１）、ガラクチノール合成遺伝子ＡｔＧｏｌＳ３遺伝子（ＴａｊｉＴ．ｅｔａｌ（２００２）ＰｌａｎｔＪ．２９：４１７−４２６）が挙げられる。
また、ストレス耐性を向上させる調節遺伝子の好適な例としては、シロイヌナズナ由来転写因子ＤＲＥＢ遺伝子（特開２０００−６０５５８号公報）、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子（特願２００１−３５８２６８、ＤｕｂｏｕｚｅｔｅｔａｌＰｌａｎｔＪ．ｉｎｐｒｅｓｓ）、及び植物ホルモンＡＢＡの生合成の鍵酵素ＮＣＥＤ遺伝子（ＩｕｃｈｉＳ．ｅｔａｌ（２００１）ＰｌａｎｔＪ．２７：３２５−３３３）等が挙げられる。
特に、シロイヌナズナ由来転写因子ＤＲＥＢ遺伝子、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子が好ましく、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましい。
さらに、本発明は本発明のベクターを適当な宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。ある態様において、該形質転換体は本発明のベクターを宿主植物に導入して得られるトランスジェニック植物である。この場合、宿主植物としては単子葉植物が望ましく、単子葉植物としてはイネが望ましい。
さらにまた、本発明は、本発明のプロモーターを植物に導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させる方法を提供する。本発明のプロモーターは単子葉植物において従来にない強いストレス誘導性プロモーター活性を有するため、単子葉植物のストレス耐性の向上により適している。An object of the present invention is to find a stress-inducible promoter that can function effectively in monocotyledonous plants such as rice, and to provide a novel environmental stress-tolerant plant using the promoter.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in isolating a strong stress-inducible promoter from the rice genome. And when this promoter was used, it discovered that the environmental stress tolerance of a monocotyledonous plant could be improved remarkably, and completed this invention.
That is, the present invention relates to a stress-inducible promoter derived from rice. Specifically, the promoter consists of the following DNA (a) or (b).
(A) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10
(B) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10, and has stress-inducible promoter activity
Here, the stress is drought stress, low temperature stress or salt stress.
The present invention also provides a recombinant vector comprising the promoter. The vector may contain other structural genes and regulatory genes under the control of the promoter of the present invention, and particularly preferably contains structural genes and / or regulatory genes that improve stress tolerance.
Preferable examples of structural genes that improve stress tolerance include the key enzyme P5CS gene for proline synthesis (Yoshiba Y. et al (1999) BBRC 261), the galactinol synthesis gene AtGolS3 gene (Taji T. et al (2002) Plant J 29: 417-426).
In addition, preferable examples of regulatory genes that improve stress tolerance include Arabidopsis-derived transcription factor DREB gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-60558), rice-derived transcription factor OsDREB gene (Japanese Patent Application No. 2001-358268, Dubouzet et al Plant J And the key enzyme NCED gene for biosynthesis of the plant hormone ABA (Iuchi S. et al (2001) Plant J. 27: 325-333).
In particular, Arabidopsis transcription factor DREB gene and rice transcription factor OsDREB gene are preferable, and rice transcription factor OsDREB gene is most preferable.
Furthermore, the present invention provides a transformant obtained by introducing the vector of the present invention into a suitable host. In one embodiment, the transformant is a transgenic plant obtained by introducing the vector of the present invention into a host plant. In this case, a monocotyledonous plant is desirable as the host plant, and rice is desirable as the monocotyledonous plant.
Furthermore, this invention provides the method of improving the stress tolerance of this plant by introduce | transducing the promoter of this invention into a plant. Since the promoter of the present invention has unprecedented strong stress-inducible promoter activity in monocotyledonous plants, it is more suitable for improving the stress tolerance of monocotyledonous plants.

図１は、各ストレス負荷時におけるａ００２２（ＬＩＰ９）のノザン解析結果を示す。
図２は、ａ００２２（ＬＩＰ９）のプロモーター領域の塩基配列を示す。
図３は、Ｇｕｓ発現用コンストラクトの構造を示す。
（Ｔ_ｇ７：ｇ７ターミネーター、ＨＰＴ：ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ、Ｐ_ｎｏｓ：Ｎｏｓプロモーター、Ｔ_ｎｏｓ：Ｎｏｓターミネーター）
図４は、各種プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換タバコ又はイネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ活性を示すグラフである。
図５は、ＬＩＰ９プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、塩ストレス負荷時のＧＵＳ染色結果を示す写真である。
図６は、形質転換イネと野性株における、導入遺伝子及び各標的遺伝子（ＬＩＰ９（ａ００２２）、ＷＳＩ７２４（ａ００６６）、ｓａｌＴ（ａ２６６０）の発現量をノザン法で比較した結果である。図中ａ、ｂ、ｃはそれぞれそれぞれ形質転換体のラインを示す。
図７は、ａ００６６（ＷＳＩ７２４）のプロモーター領域の塩基配列を示す。
図８は、ＷＳＩ７２４プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ活性を示すグラフである（右：乾燥ストレス負荷、左：コントロール）。
図９は、ＷＳＩ７２４プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ染色結果を示す写真である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−８０８４７号の明細書に記載された内容を包含する。FIG. 1 shows the northern analysis results of a0022 (LIP9) at each stress load.
FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the promoter region of a0022 (LIP9).
FIG. 3 shows the structure of the Gus expression construct.
( _Tg7 : g7 terminator, HPT: hygromycin phosphotransferase, _Pnos : Nos promoter, _Tnos : Nos terminator)
FIG. 4 is a graph showing GUS activity under drought stress in transformed tobacco or rice introduced with a GUS gene linked to various promoters.
FIG. 5 is a photograph showing the result of GUS staining when salt stress is applied in transformed rice introduced with the GUS gene linked to the LIP9 promoter.
Fig. 6 shows the results of comparing the expression levels of the transgene and each target gene (LIP9 (a0022), WSI724 (a0066), salT (a2660)) in the transformed rice and wild strains by the Northern method. b and c each represent a line of transformants.
FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the promoter region of a0066 (WSI724).
FIG. 8 is a graph showing GUS activity during drought stress load in transformed rice introduced with the GUS gene linked to the WSI724 promoter (right: drought stress load, left: control).
FIG. 9 is a photograph showing the results of GUS staining under drought stress in transformed rice introduced with the GUS gene linked to the WSI724 promoter.
This specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2003-80847, which is the basis of the priority of the present application.

本発明のプロモーターは、低温、乾燥、塩などの環境ストレスに対して特異的に誘導されるイネ由来のプロモーターである。
１．本発明のプロモーターの同定
本発明のプロモーターは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体間で、その発現が著しく異なる遺伝子（ストレス誘導性遺伝子）をスクリーニングし、次いでゲノム情報から該遺伝子のプロモーターと考えられる配列をスクリーニングすることにより同定することができる。
以下、本発明のプロモーターを同定するプロセスについて説明する。
１．１ｍＲＮＡの調整
まず、ストレス誘導性遺伝子をスクリーニングするための、ｍＲＮＡを調製する。
ｍＲＮＡの供給源としては、葉、茎、根、花など植物体の一部又は全体のいずれであってもよい。また、植物体は、その種子をＧＭ培地、ＭＳ培地、＃３培地などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体を用いてもよいし、カルスや無菌条件下で育てた植物体の培養細胞を用いてもよい。
本スクリーニングでは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体との間での遺伝子発現量の相違を比較するため、ｍＲＮＡは前記両個体のそれぞれについて調整する必要がある。ストレスの負荷方法は、用いる植物によって適宜設定される。一般には、乾燥ストレスは、２〜４週間、水を与えず育てることにより負荷することができる。また低温・凍結ストレスは、１５〜−１０℃で、１〜１０日間育てることにより負荷することができる。さらにまた、塩ストレスは１００〜６００ｍＭＮａＣｌで１時間〜７日間育てることにより負荷することができる。例えば、イネの場合であれば、水耕栽培で生育させたイネを、低温ストレスなら１０〜−４℃、塩ストレスなら１５０〜２５０ｍＭＮａＣｌ、乾燥ストレスなら脱水状態等に暴露する。
ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体は、それぞれ液体窒素で凍結し、乳鉢などで摩砕後、得られた摩砕物から、グリオキサール法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法、塩化リチウム−尿素法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法などにより粗ＲＮＡ画分を抽出する。次いで、この粗ＲＮＡ画分から、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロースなどを用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。必要であれば、さらにショ糖密度勾配遠心法などによりｍＲＮＡを分画して用いてもよい。
１．２ストレス誘導性遺伝子のスクリーニング
ストレス誘導性遺伝子のスクリーニングは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体間で、その遺伝子発現量の相違を比較することにより行う。遺伝子発現量の比較方法は、特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、又はクロスハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いることができる。
なかでも、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ等の固相試料を用いた方法は、数千〜数万の遺伝子の発現を、定性的かつ定量的に、一度で検出することが可能という点で、前記スクリーニングの実施に好適である。
（１）ｃＤＮＡマイクロアレイの調製
前記スクリーニングに用いるｃＤＮＡマイクロアレイは、プロモーターの検出対象である単子葉植物（例えばイネ）のｃＤＮＡがスポットされているものであれば特に限定されず、既成のものを用いてもよいし、公知の方法に基づいて作製してもよい（例えば、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ（２００１）１３：６１−７２Ｓｅｋｉｅｔａｌ参照）。
ｃＤＮＡマイクロアレイの作製には、まず目的とする植物のｃＤＮＡライブラリーの調製が必要である。ｃＤＮＡライブラリーは、（１）の方法に従って調製したｍＲＮＡを鋳型として、公知の方法により作製することができる。スポットするｃＤＮＡは単子葉植物由来のものであれば特に限定されないが、後のゲノムデータベースの解析の利便性からイネ等のゲノム解析が進んだ単子葉植物のものが好ましい。植物は平常状態（無処理）の植物でもよいが、好ましくは乾燥、塩、低温等のストレスに暴露した植物である。
ｃＤＮＡライブラリーの作製では、まず市販のキット（ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等）を用いて、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡに適切な制限酵素切断部位を含むアダプターを付加した後、ラムダファージベクターのクローニング部位に挿入する。これを市販のキット（例えば、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等）を用いてｉｎｖｉｔｒｏパッケージングし、宿主大腸菌に感染・増幅すれば、目的とするｃＤＮＡライブラリーが得られる。
ｃＤＮＡライブラリーが作製されたら、このｃＤＮＡ、あるいは該ｃＤＮＡのうち特異性の高い部分（例えば、３’側の反復配列を含まないＵＴＲ領域）をＰＣＲ増幅し、アレイ固定用プローブを作製する。この作業を繰り返して目的とする全ての遺伝子のプローブが調製できたら、これらを市販のスポッター（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製など）を用いてスライドグラス上にスポッティングする。かくして、目的とするｃＤＮＡマイクロアレイが得られる。
（２）遺伝子発現量の検出
ｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現量の検出は、サンプルｍＲＮＡ（或いはｃＤＮＡ）を適当な試薬でラベルし、これをアレイ上のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせたときのシグナル強度として測定することができる。遺伝子の発現量は、通常アレイ上にスポットされたｃＤＮＡプローブ量のばらつきを考慮し、適当なコントロールとの比較値、あるいは比較する２サンプル間の発現量比として求めることが望ましい。本スクリーニングの場合であれば、ストレスを負荷しない無処理の植物由来のｍＲＮＡをコントロールとして、ストレスを付加した植物由来のｍＲＮＡの相対的発現量を検出すればよい。
検出は、コントロールとサンプルのｍＲＮＡ（あるいはそのｃＤＮＡ）を、それぞれ異なる蛍光色素（例えば、Ｃｙ３とＣｙ５）でラベルし、アレイ上のｃＤＮＡプローブと共にハイブリダイズさせることにより行う。例えば、ストレスを負荷した個体よりｍＲＮＡを抽出し、Ｃｙ５標識ｄＣＴＰ存在下逆転写してＣｙ５標識ｃＤＮＡを調製する。次に、ストレスを負荷しない無処理の個体よりｍＲＮＡを抽出し、同様の方法でＣｙ３標識ｃＤＮＡを調製する。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡ（サンプル）とＣｙ３標識ｃＤＮＡ（コントロール）を等量ずつ混合し、アレイ上のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。なお、標識用色素はサンプルにＣｙ３を、コントロールにＣｙ５を利用してもよいし、その他の適当な標識試薬を用いてもよい。
得られた蛍光強度を蛍光シグナル検出機で読み取り、数値化すれば、この値はコントロールに対するサンプルの遺伝子発現量比に相当する。スキャナーで読み取った蛍光強度は必要に応じて、誤差の調整や各試料毎のばらつきの正規化を行ってもよい。正規化は、ハウスキーピング遺伝子等各サンプルで共通に発現している遺伝子を基準に行うことができる。さらに、信頼性限界ラインを特定して、相関性の低いデータを除いてもよい。
（３）ストレス誘導性遺伝子の選択
ストレス誘導性遺伝子は、上記アレイによる解析の結果、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体との間で発現量が著しく異なる遺伝子として特定される。ここで、「著しく異なる」とは、例えば、インテンシティー１０００以上で、両者の発現量が少なくとも３倍以上異なることを意味する。
（４）ノザン・ブロッティングによる発現解析
こうして選択された遺伝子は、さらにノザン解析等により、ストレス誘導性に当該遺伝子の発現が高まることを確認する。例えば、前述した方法で、様々なレベルの塩、乾燥、温度等のストレスに植物を暴露する。そして、該植物からＲＮＡを抽出し、これを電気泳動にかけて分離する。分離されたＲＮＡはニトロセルロース膜に転写し、前記遺伝子に特異的な標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせれば、その発現量を検出することができる。
選択された遺伝子が、ストレス依存的に発現が向上していれば、該遺伝子はストレス誘導性であることが確認できる。こうして、イネｃＤＮＡライブラリーより選択されたストレス誘導性遺伝子の例として、本発明にかかるａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）及びａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）を挙げることができる。なお、ａ００２２及びａ００６６はマイクロアレイ上に固定されているｃＤＮＡのＩＤＮｏ．である。
１．３プロモーター配列のスクリーニング
（１）遺伝子データベースからの推定
次に、既存の遺伝子データベース（例えば、ＤＤＢＪのデータベース等）を基に検索ソフト（例えば、Ｂｌａｓｔ等）を用いてストレス誘導性遺伝子のプロモーター配列を検索する。イネのように、ほとんどのゲノムが解読されている植物では、特定されたストレス誘導性遺伝子を支配するプロモーター配列の探索は既存のデータベースを用いてすべて可能となる。プロモーター配列は、ゲノム上で前記ストレス誘導性遺伝子（ｃＤＮＡ）と相同性の高いゲノム遺伝子の上流領域から、プロモーターと考えられる領域として選ばれる。例えば、ストレス誘導性遺伝子のゲノム情報に基づき、これらの遺伝子の開始コドンと推定される位置から約１〜２ｋｂ上流付近をプロモーター領域と推定する。
ところで、公知のストレス誘導性プロモーターの中には、その配列中に該プロモーター活性に関わるシスエレメント；例えば、乾燥ストレス応答性エレメント（ＤＲＥ；ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）、アブシジン酸応答性エレメント（ＡＢＲＥ；ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）、低温ストレス応答性エレメントなど、
を有するものがある。このシスエレメントにストレス誘導性の転写因子が結合すると、前記プロモーターが活性化され、その支配下にあるストレス耐性付与遺伝子を発現させる。したがって、検索した上流領域に前記シスエレメントが含まれていれば、その領域はストレス誘導性プロモーターである可能性が非常に高いといえる。
かくして、前述のａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）と相同性が高い遺伝子のゲノム情報が得られ、その１．１ｋｂ上流領域より推定ＬＩＰ９プロモーター配列（配列番号１）がスクリーニングされた。同様にして、ａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）と相同性が高い遺伝子の上流領域より推定ＷＳＩ７２４プロモーター配列（配列番号１０）がスクリーニングされた。
（２）ストレス誘導性プロモーターの機能確認
次に推定プロモーター配列について、ストレス負荷時における該プロモーター活性の変化により、その機能の確認を行う。
まず、前項で推定されたプロモーター配列を基にプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プロモーターのクローニングを行う。次に、該プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結して作製したレポータープラスミドを植物に導入し、該植物（好ましくはそのＴ_２世代）のストレス負荷時におけるレポーターの発現を調べる。なお、レポーターとしては、例えばβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ：ｐＢＩ１２１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社等）、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられるが、活性が数値で与えられること、染色によって発現が視覚的に観察できるという点でＧＵＳが好ましい。
１．４本発明のプロモーター
以上の結果、イネゲノム由来のＬＩＰ９プロモーター配列（配列番号１）は、乾燥、低温、塩等の各ストレス依存的に高い発現を示すストレス誘導性プロモーターであることが確認された。
このように、ＬＩＰ９プロモーターはすべてのストレスに対して特異的に誘導されるプロモーターである。以下にその構造的、機能的特徴を挙げる。
１）ＬＩＰ９プロモーターは、その構造中に乾燥ストレス誘導に関与するシスエレメントＤＲＥを２つ含む（図２参照）。
２）ＬＩＰ９プロモーターは、シスエレメントＤＲＥに結合してその下流の遺伝子の転写を活性化させるイネ由来の転写因子：ＯｓＤＲＥＢ１遺伝子（特願２００１−３５８２６８号）の過剰発現体で高発現している。
３）ＬＩＰ９プロモーターにはＯｓＤＲＥＢ１遺伝子が結合するＤＲＥ配列が存在することからＯｓＤＲＥＢ遺伝子の過剰発現の最適プロモーターであることが予測される。
一方、ＷＳＩ７２４プロモーターも、その構造中にＤＲＥ配列が２つ含まれていること、及びａ００６６のストレス負荷時の発現パターン（乾燥、塩、低温誘導性で、低温による誘導性が乾燥、塩に比べて遅い）から、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子のターゲットになっていることが予想された。
なお、本発明のプロモーターは配列番号１又は配列番号１０で示される塩基配列を有するＤＮＡに限定されず、配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡも、ストレス誘導性プロモーター活性を有する限り、本発明のストレス誘導性プロモーターに含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、ホルムアミド濃度が３０〜５０％、３７〜５０℃、６×ＳＳＣの条件、好ましくはホルムアミド濃度が５０％、４２℃、６×ＳＳＣの条件をいう。
２．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明のプロモーターを含むベクターである。該ベクターは、本発明のプロモーターの下流に他の構造遺伝子又は調節遺伝子を機能しうる態様で含んでいてもよい。そのような遺伝子の好適な例は、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子である。なお、「機能しうる態様」とは、他の構造遺伝子又は調節遺伝子が本発明のプロモーターの支配下で適切に発現されるような態様を意味する。
ここで、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子とは、乾燥ストレス、低温ストレス又は塩ストレス等の環境ストレスに対する植物の耐性を高める機能を担うタンパクをコードする遺伝子であって；例えば、ＬＥＡタンパク質、水チャネルタンパク質、適合溶質合成酵素、タバコのｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ、浸透圧調節物質（糖、プロリン、グリシンベタイン等）合成酵素、細胞膜脂質の修飾酵素であるシロイヌナズナのｗ−３ｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅ、らん藻のＤ９ｄｅｓａｔｕｒａｓｅの遺伝子、プロリン合成の鍵酵素であるＰ５ＣＳ、ガラクチノール合成遺伝子ＡｔＧｏｌＳ３遺伝子を挙げることができる。
また、ストレス耐性を向上させる調節遺伝子とは、ストレス誘導性プロモーターの活性や、ストレス耐性を付与する遺伝子の発現を調節することにより、植物のストレス耐性を向上させる遺伝子であって；例えば、シロイヌナズナ由来の転写因子：ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、及びＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（特開２０００−６０５５８号公報参照）、イネ由来の転写因子：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、及びＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（特願２００１−３５８２６８号）、ならびに植物ホルモンＡＢＡの生合成の鍵酵素であるＮＣＥＤ遺伝子等を挙げることができる。
特に、本発明のプロモーターが特定のシスエレメントを含む場合は、該シスエレメントに結合し、そのプロモーター活性を向上させる転写因子の遺伝子を、プロモーター下流に連結させることが好ましい。
前述のように、本発明にかかるＬＩＰ９プロモーターはその構造内にＤＲＥ配列を２つ含む。したがって、ＬＩＰ９プロモーターの下流に連結させる遺伝子としては、ＤＲＥＢ遺伝子又はＯｓＤＲＥＢ遺伝子（例えば、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、ＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ遺伝子）が好ましく、特にＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましい。
また、ＷＳＩ７２４プロモーターもＤＲＥ配列を２つ含み、ＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていることが予想されていることから、その下流に連結させる遺伝子としては、ＤＲＥＢ遺伝子又はＯｓＤＲＥＢ遺伝子（例えば、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、ＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ遺伝子）が好ましく、特にＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましいと考えられる。
本発明のベクターは、適当なベクターに本発明のプロモーターあるいは、該プロモーターと他の調節遺伝子や構造遺伝子を機能しうる態様で連結（挿入）して構築される。プロモーターを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられる。又はジＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスをベクターとして用いてもよい。
本発明のプロモーターのベクターへの挿入は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、これをベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結すればよい。
本発明の組換えベクターは、さらに、所望によりスプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有してもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などを用いることができる。
３．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、プロモーター活性が発現し得る態様で宿主中に導入することにより構築することができる。ここで、宿主は本発明のプロモーターが機能しうるものであれば特に限定されないが、植物が好ましく、特にイネ等の単子葉植物がより好ましい。
植物や植物細胞を宿主とする場合、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジンなどから株化した細胞や該植物から調製したプロトプラストが用いられる。植物への組換えベクターの導入方法としては、Ａｂｅｌらのポリエチレングリコールを用いる方法［Ａｂｅｌ，Ｈ．ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＪ．５：４２１−４２７（１９９４）］やエレクトロポレーション法などが挙げられる。
４．ストレス耐性トランスジェニック植物
（１）トランスジェニック植物の作製
本発明のプロモーターの支配下に、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子を機能しうる態様で連結して植物に導入することにより、環境ストレス、特に、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレスなどに対して抵抗性が向上されたトランスジェニック植物を作出することができる。宿主植物としては、特に単子葉植物が好ましい。
植物宿主への本発明のプロモーター等の導入方法としては、アグロバクテリウム感染法などの間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などの直接導入法などが挙げられる。従来、イネのような単子葉植物では、アグロバクテリウム感染法を用いたトランスジェニック植物の作製は困難といわれてきたが、アセトシリンゴンを加えることによってアグロバクテリウムがイネに感染可能となり、単子葉植物においても利用可能となってきた。
以下にアグロバクテリウムを用いたトランスジェニック植物の作製について説明する。
まず、本発明のプロモーターとストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子とを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入して植物導入用組換えベクターを作製する。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ^Ｒ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入して、植物への形質導入用に用いる。
上記の方法以外に、三者接合法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４）］によっても植物導入用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３など）を保有する大腸菌、及びアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培養して植物導入用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、構造遺伝子の後に、植物用のターミネーターなどを配置させる必要がある。本発明において利用可能なターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれらのものに限定されるものではない。
さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を使用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。本発明のプロモーター及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
こうして調製したアグロバクテリウムを採取した植物切片に感染させれば、目的とするトランスジェニック植物が作製できる。
トランスジェニック植物は、適切な抗生物質を加えた培地に播種し、目的のプロモーターや遺伝子を保有する個体を選択する。選択された個体は、ボンソル１号や黒土等の入った鉢に植え替えてさらに生育させる。一般に、導入遺伝子は宿主植物のゲノム中に同様に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。そこで、プローブとして導入遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノザン法で検定することによって、より導入遺伝子が強く発現している形質転換体を選抜することができる。
（２）ストレス耐性の確認
本発明のプロモーターやストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子が、トランスジェニック植物及びその次世代に組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はサザン分析等を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
また、トランスジェニック植物における導入遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、該植物の細胞及び組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノザン解析を用いて導入した遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。あるいは、導入した遺伝子の転写産物を、抗体を用いたウエスタン分析等により直接、分析してもよい。
本発明のプロモーターを導入したトランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性は、例えばバーミキュライト、パーライト、ボンソルなどを含む土を入れた植木鉢にトランスジェニック植物を植え、或いは水耕栽培を行い、各種環境ストレスを負荷した場合の生存を調べることによって評価することができる。環境ストレスとしては、低温、乾燥、塩等が挙げられる。例えば、乾燥ストレスに対する耐性は、２〜４週間、水を与えずその生存を調べることにより評価することができる。また低温・凍結ストレスに対する耐性は、１５〜−１０℃に、１〜１０日間おいた後、２日〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。また、塩ストレスは１００〜６００ｍＭＮａＣｌで１時間〜７日間おいた後、１〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。かくして、本発明のプロモーターを用いれば、植物（特に単子葉植物）を矮化させることなくそのストレス耐性を著しく向上させることができる。
（３）トランスジェニック植物の好適な例
本発明にかかるトランスジェニック植物の好適な例として、ＬＩＰ９あるいはＷＳＩ７２４プロモーター支配下にＯｓＤＲＥＢ遺伝子を機能しうる態様で連結したベクターをイネ、コムギ等の単子葉植物に導入したトランスジェニック植物を挙げることができる。ＬＩＰ９プロモーターにはＤＲＥ領域が２つ含まれているため、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子は該シスエレメントに結合することにより、効果的にそのストレス耐性効果を示すことができる。同様に、ＷＳＩ７２４プロモーターにもＤＲＥ領域が２つ含まれているため、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子の発現を高めて、植物のストレス耐性を向上させることができる。The promoter of the present invention is a rice-derived promoter that is specifically induced by environmental stress such as low temperature, dryness, and salt.
1. Identification of the promoter of the present invention
The promoter of the present invention is screened for genes (stress-inducible genes) whose expression is remarkably different between a plant individual loaded with stress and a plant individual not loaded, and then screened for a sequence considered to be the promoter of the gene from genomic information. Can be identified.
Hereinafter, the process for identifying the promoter of the present invention will be described.
1.1 mRNA regulation
First, mRNA for preparing a stress-inducible gene is prepared.
The supply source of mRNA may be any part or the whole of a plant body such as leaves, stems, roots, and flowers. In addition, the plant body may be a plant body in which seeds are sown on a solid medium such as GM medium, MS medium, # 3 medium, and grown under aseptic conditions, or grown under callus or aseptic conditions. Plant cultured cells may also be used.
In this screening, in order to compare the difference in gene expression level between plant individuals loaded with stress and plant individuals not loaded, it is necessary to adjust mRNA for each of the two individuals. The stress loading method is appropriately set depending on the plant to be used. In general, drought stress can be applied by growing without water for 2-4 weeks. Moreover, low temperature and freezing stress can be loaded by growing at 15 to -10 ° C for 1 to 10 days. Furthermore, salt stress can be applied by growing for 1 hour to 7 days at 100-600 mM NaCl. For example, in the case of rice, rice grown in hydroponics is exposed to 10 to −4 ° C. for low-temperature stress, 150 to 250 mM NaCl for salt stress, and dehydrated for dry stress.
The plant individual loaded with stress and the plant individual not loaded were each frozen in liquid nitrogen, ground in a mortar, etc., and then obtained from the ground product, glyoxal method, guanidine thiocyanate-cesium chloride method, lithium chloride-urea method, A crude RNA fraction is extracted by a proteinase K-deoxyribonuclease method or the like. Subsequently, from this crude RNA fraction, poly (A) is obtained by affinity column method using poly U-sepharose or the like using oligo dT-cellulose or Sepharose 2B as a carrier, or batch method. ⁺ RNA (mRNA) is obtained. If necessary, mRNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
1.2 Screening for stress-inducible genes
The screening of stress-inducible genes is performed by comparing the difference in gene expression level between plant individuals loaded with stress and those not loaded. The gene expression level comparison method is not particularly limited, and for example, a known method such as RT-PCR method, real-time PCR method, subtraction method, differential display method, differential hybridization method, or cross-hybridization method is used. be able to.
In particular, the method using a solid phase sample such as a gene chip or cDNA microarray can detect the expression of several thousand to several tens of thousands of genes qualitatively and quantitatively at one time. It is suitable for implementation.
(1) Preparation of cDNA microarray
The cDNA microarray used for the screening is not particularly limited as long as the cDNA of the monocotyledonous plant (for example, rice) that is the target of detection of the promoter is spotted, and an existing one may be used. (See, for example, The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al).
In order to produce a cDNA microarray, it is first necessary to prepare a cDNA library of the target plant. The cDNA library can be prepared by a known method using the mRNA prepared according to the method (1) as a template. The spotted cDNA is not particularly limited as long as it is derived from a monocotyledonous plant, but is preferably a monocotyledonous plant whose genome analysis has advanced, such as rice, for the convenience of later analysis of the genome database. The plant may be a plant in a normal state (untreated), but is preferably a plant exposed to stress such as drying, salt, and low temperature.
In the preparation of a cDNA library, first, mRNA is reverse-transcribed using a commercially available kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE), etc.) to synthesize single-stranded cDNA, and double-stranded cDNA is synthesized using this as a template. Synthesize. Next, an adapter containing an appropriate restriction enzyme cleavage site is added to the obtained double-stranded cDNA, and then inserted into the cloning site of the lambda phage vector. If this is packaged in vitro using a commercially available kit (eg, Gigapack III Gold packaging extract (manufactured by STRATAGENE), etc.), and infecting and amplifying the host E. coli, the desired cDNA library is obtained.
When the cDNA library is prepared, this cDNA or a highly specific portion of the cDNA (for example, a UTR region not including a 3 ′ repetitive sequence) is PCR-amplified to prepare an array fixing probe. When this procedure is repeated and probes for all the desired genes are prepared, they are spotted on a slide glass using a commercially available spotter (for example, manufactured by Amersham). Thus, the target cDNA microarray is obtained.
(2) Detection of gene expression level
Detection of the gene expression level by a cDNA microarray can be measured as signal intensity when a sample mRNA (or cDNA) is labeled with an appropriate reagent and hybridized with a cDNA probe on the array. The expression level of the gene is usually determined as a comparison value with an appropriate control or an expression level ratio between two samples to be compared in consideration of variations in the amount of cDNA probe spotted on the array. In the case of this screening, the relative expression level of plant-derived mRNA to which stress is applied may be detected using untreated plant-derived mRNA that does not load stress as a control.
Detection is performed by labeling control and sample mRNA (or cDNA thereof) with different fluorescent dyes (for example, Cy3 and Cy5) and hybridizing them with cDNA probes on the array. For example, mRNA is extracted from an individual loaded with stress and reverse transcribed in the presence of Cy5-labeled dCTP to prepare Cy5-labeled cDNA. Next, mRNA is extracted from an untreated individual not loaded with stress, and Cy3-labeled cDNA is prepared by the same method. Cy5 labeled cDNA (sample) and Cy3 labeled cDNA (control) are mixed in equal amounts and hybridized with cDNA on the array. The labeling dye may use Cy3 as a sample and Cy5 as a control, or other appropriate labeling reagent.
If the obtained fluorescence intensity is read with a fluorescence signal detector and digitized, this value corresponds to the gene expression level ratio of the sample to the control. The fluorescence intensity read by the scanner may be adjusted for error or normalized for each sample as necessary. Normalization can be performed on the basis of genes that are commonly expressed in each sample, such as housekeeping genes. Further, the reliability limit line may be specified to exclude data having low correlation.
(3) Selection of stress-inducible genes
The stress-inducible gene is identified as a gene whose expression level is significantly different between a plant individual loaded with stress and a plant individual unloaded with stress as a result of the analysis by the array. Here, “remarkably different” means that, for example, the intensity is 1000 or more and the expression levels of both differ by at least 3 times.
(4) Expression analysis by Northern blotting
The gene thus selected is further confirmed to be stress-inducible in expression of the gene by Northern analysis or the like. For example, the plants are exposed to various levels of salt, drought, temperature, and other stresses as described above. Then, RNA is extracted from the plant and separated by electrophoresis. If the separated RNA is transferred to a nitrocellulose membrane and hybridized with a labeled cDNA probe specific to the gene, its expression level can be detected.
If the selected gene is expressed in a stress-dependent manner, it can be confirmed that the gene is stress-inducible. Thus, examples of the stress-inducible gene selected from the rice cDNA library include a0022 (LIP9: SEQ ID NO: 2) and a0066 (WSI724: SEQ ID NO: 8) according to the present invention. A0022 and a0066 are the ID Nos. Of cDNAs immobilized on the microarray. It is.
1.3 Screening of promoter sequences
(1) Estimation from gene database
Next, the promoter sequence of the stress-inducible gene is searched using search software (for example, Blast) based on an existing gene database (for example, DDBJ database). In plants such as rice, where most genomes have been decoded, the search for promoter sequences that govern the identified stress-inducible genes can all be made using existing databases. The promoter sequence is selected as a region considered to be a promoter from the upstream region of the genome gene having high homology with the stress-inducible gene (cDNA) on the genome. For example, based on the genomic information of stress-inducible genes, the region near the upstream of about 1 to 2 kb from the presumed start codon of these genes is estimated as the promoter region.
By the way, among the known stress-inducible promoters, there are cis elements involved in the promoter activity in the sequence; for example, a drought stress responsive element (DRE), an abscisic acid responsive element (ABRE; abscisic) acid response element), low temperature stress responsive element, etc.
Some have When a stress-inducible transcription factor binds to this cis element, the promoter is activated, and a stress tolerance gene under its control is expressed. Therefore, if the cis element is included in the searched upstream region, it can be said that the region is very likely to be a stress-inducible promoter.
Thus, genomic information of a gene having high homology with the aforementioned a0022 (LIP9: SEQ ID NO: 2) was obtained, and a putative LIP9 promoter sequence (SEQ ID NO: 1) was screened from the 1.1 kb upstream region. Similarly, a putative WSI724 promoter sequence (SEQ ID NO: 10) was screened from the upstream region of a gene having high homology with a0066 (WSI724: SEQ ID NO: 8).
(2) Confirmation of function of stress-inducible promoter
Next, the function of the putative promoter sequence is confirmed by the change in the promoter activity during stress loading.
First, a primer is prepared based on the promoter sequence estimated in the previous section, PCR is performed using genomic DNA as a template, and the promoter is cloned. Next, a reporter plasmid prepared by linking a reporter gene downstream of the promoter is introduced into a plant, and the plant (preferably its T ₂ The reporter expression during the stress load of the generation) is examined. Examples of the reporter include β-glucuronidase (GUS: pBI121, Clontech, etc.), luciferase gene, green fluorescent protein gene, etc., but the activity can be given numerically and the expression can be visually observed by staining. GUS is preferable in this respect.
1.4 Promoter of the present invention
As a result, it was confirmed that the rice genome-derived LIP9 promoter sequence (SEQ ID NO: 1) is a stress-inducible promoter exhibiting high expression depending on each stress such as dryness, low temperature, and salt.
Thus, the LIP9 promoter is a promoter that is specifically induced against all stresses. The structural and functional characteristics are listed below.
1) The LIP9 promoter contains two cis elements DRE involved in drought stress induction in its structure (see FIG. 2).
2) The LIP9 promoter is highly expressed in an overexpressed rice transcription factor: OsDREB1 gene (Japanese Patent Application No. 2001-358268) that binds to the cis element DRE and activates transcription of the downstream gene.
3) Since the DRE sequence to which the OsDREB1 gene binds exists in the LIP9 promoter, it is predicted to be the optimal promoter for overexpression of the OsDREB gene.
On the other hand, the WSI724 promoter also contains two DRE sequences in its structure, and the expression pattern during stress loading of a0066 (dry, salt, low temperature inducibility, low temperature inductivity is dry, compared to salt Therefore, it was predicted to be the target of the OsDREB gene.
The promoter of the present invention is not limited to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10, but from a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10. Any DNA capable of hybridizing with a DNA under stringent conditions is also included in the stress-inducible promoter of the present invention as long as it has stress-inducible promoter activity. Here, stringent conditions refer to conditions of formamide concentration of 30-50%, 37-50 ° C., 6 × SSC, preferably conditions of formamide concentration of 50%, 42 ° C., 6 × SSC.
2. Recombinant vector
The recombinant vector of the present invention is a vector containing the promoter of the present invention. The vector may contain another structural gene or a regulatory gene downstream of the promoter of the present invention in such a manner that it can function. Suitable examples of such genes are structural genes and / or regulatory genes that improve stress tolerance. The “functional aspect” means an aspect in which other structural genes or regulatory genes are appropriately expressed under the control of the promoter of the present invention.
Here, the structural gene for improving stress tolerance is a gene encoding a protein responsible for the function of enhancing plant tolerance to environmental stress such as drought stress, low temperature stress or salt stress; for example, LEA protein, water channel Protein, compatible solute synthase, tobacco detoxification enzyme, osmotic regulator (sugar, proline, glycine betaine, etc.) synthase, cell membrane lipid modifying enzyme, Arabidopsis thaliana w-3 fatty acid desaturase, cyanobacterium D9 desaturase gene And P5CS, which is a key enzyme for proline synthesis, and the Galactinol synthesis gene AtGolS3 gene.
A regulatory gene that improves stress tolerance is a gene that improves the stress tolerance of plants by regulating the activity of stress-inducible promoters or the expression of genes that confer stress tolerance; for example, derived from Arabidopsis thaliana Transcription factors: DREB1A, DREB2A, DREB1B and DREB1C genes (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-60558), rice-derived transcription factors: OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, and OsDREB2A genes (Japanese Patent Application Nos. 2001-3582) And NCED gene which is a key enzyme for biosynthesis of plant hormone ABA.
In particular, when the promoter of the present invention contains a specific cis element, it is preferable to link a gene of a transcription factor that binds to the cis element and improves the promoter activity downstream of the promoter.
As described above, the LIP9 promoter according to the present invention contains two DRE sequences in its structure. Therefore, as the gene to be linked downstream of the LIP9 promoter, the DREB gene or the OsDREB gene (for example, OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, OsDREB2A gene, OsDREB2B gene) is preferable, and the OsDREB gene is particularly preferable.
In addition, since the WSI724 promoter also includes two DRE sequences and is expected to be a target of OsDREB, a DREB gene or an OsDREB gene (for example, OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C) is linked downstream thereof. OsDREB1D, OsDREB2A gene, OsDREB2B gene) are preferable, and the OsDREB gene is considered most preferable.
The vector of the present invention is constructed by ligating (inserting) the promoter of the present invention, or the promoter and other regulatory genes or structural genes into an appropriate vector in such a manner that it can function. The vector for inserting the promoter is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. Plasmid DNA includes plasmids for E. coli hosts such as pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, plasmids for Bacillus subtilis such as pUB110 and pTP5, plasmids for yeast hosts such as YEp13, YEp24 and YCp50, and plant cell hosts such as pBI221 and pBI121 A plasmid etc. are mentioned. Alternatively, examples of diDNA include λ phage. Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect viruses such as baculovirus may be used as the vector.
The promoter of the present invention may be inserted into a vector by cleaving the purified DNA with an appropriate restriction enzyme and inserting it into a restriction enzyme site or a multicloning site of the vector.
The recombinant vector of the present invention may further contain a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like, if desired. In addition, as a selection marker, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, etc. can be used, for example.
3. Transformant
The transformant of the present invention can be constructed by introducing the recombinant vector of the present invention into a host in such a manner that promoter activity can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as the promoter of the present invention can function, but a plant is preferable, and a monocotyledon such as rice is more preferable.
When plants or plant cells are used as hosts, for example, cells established from rice, corn, wheat, Arabidopsis thaliana, tobacco, carrots, etc., or protoplasts prepared from the plants are used. As a method for introducing a recombinant vector into a plant, a method using polyethylene glycol by Abel et al. [Abel, H. et al. et al. Plant J.M. 5: 421-427 (1994)] and electroporation method.
4). Stress-tolerant transgenic plants
(1) Production of transgenic plants
Under the control of the promoter of the present invention, by introducing structural genes and / or regulatory genes that improve stress tolerance in a functional manner and introducing them into plants, environmental stress, in particular, low temperature stress, freezing stress, drought stress A transgenic plant with improved resistance to the above can be produced. As the host plant, a monocotyledonous plant is particularly preferable.
Examples of methods for introducing the promoter of the present invention into a plant host include indirect introduction methods such as an Agrobacterium infection method, and direct introduction methods such as a particle gun method, a polyethylene glycol method, a liposome method, and a microinjection method. . Conventionally, it has been said that monocotyledonous plants such as rice are difficult to produce transgenic plants using the Agrobacterium infection method, but Agrobacterium can infect rice by adding acetosyringone. It has also become available in cotyledon plants.
The production of a transgenic plant using Agrobacterium will be described below.
First, a DNA containing a promoter of the present invention and a structural gene and / or a regulatory gene that improves stress tolerance is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then an appropriate linker is ligated as necessary to obtain a cloning vector for plant cells. A recombinant vector for plant introduction is prepared by insertion. As the cloning vector, a binary vector plasmid such as pBI2113Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, or an intermediate vector plasmid such as pLGV23Neo, pNCAT, or pMON200 can be used.
When a binary vector plasmid is used, a target gene is inserted between the above-described binary vector boundary sequences (LB, RB), and this recombinant vector is amplified in E. coli. Then, the amplified recombinant vector was Agrobacterium tumefaciens C58, LBA4404, EHA101, C58C1Rif. ^R Introduced into EHA105, etc. by freeze-thaw method, electroporation method, etc., and used for transduction of plants.
In addition to the above method, Agrobacterium for plant introduction can also be prepared by the triple joining method [Nucleic Acids Research, 12: 8711 (1984)]. That is, Escherichia coli having a plasmid containing a target gene, Escherichia coli having a helper plasmid (for example, pRK2013), and Agrobacterium are mixed and cultured on a medium containing rifampicillin and kanamycin to give a conjugate for plant introduction. Agrobacterium can be obtained.
In order to express a foreign gene in a plant body, it is necessary to arrange a terminator for a plant after the structural gene. Examples of terminator sequences that can be used in the present invention include terminators derived from cauliflower mosaic virus and nopaline synthase genes. However, the terminator is not limited to these as long as it is known to function in plants.
Furthermore, it is preferable to use an effective selection marker gene in order to efficiently select a target transformed cell. The selection markers used in this case include kanamycin resistance gene (NPTII), hygromycin phosphotransferase (htp) gene that imparts resistance to the antibiotic hygromycin to plants, and phosphite that imparts resistance to bialaphos. One or more genes selected from noslysin acetyltransferase (bar) gene and the like can be used. The promoter and selectable marker gene of the present invention may be incorporated together in a single vector, or two types of recombinant DNAs each incorporated in separate vectors may be used.
The target transgenic plant can be produced by infecting the plant section from which the Agrobacterium thus prepared was collected.
Transgenic plants are sown in a medium supplemented with appropriate antibiotics, and individuals having the desired promoter or gene are selected. The selected individual is replanted in a pot containing Bonsol No. 1 or black soil, and further grown. In general, a transgene is similarly introduced into the genome of a host plant, but there is a phenomenon called position effect in which the expression of the transgene differs depending on the place of introduction. Therefore, a transformant in which the transgene is strongly expressed can be selected by testing by the Northern method using the DNA fragment of the transgene as a probe.
(2) Confirmation of stress tolerance
Confirmation that the promoter of the present invention and the structural gene and / or regulatory gene for improving stress tolerance are incorporated into a transgenic plant and its next generation is to extract DNA from these cells and tissues according to a conventional method, It can be carried out by detecting the introduced gene using PCR or Southern analysis.
In addition, for analysis of the expression level and expression site of the transgene in the transgenic plant, RNA is extracted from the cells and tissues of the plant according to a conventional method, and the mRNA of the introduced gene is detected using the RT-PCR method or Northern analysis. This can be done. Alternatively, the transcription product of the introduced gene may be directly analyzed by Western analysis using an antibody or the like.
The tolerance of the transgenic plant introduced with the promoter of the present invention to environmental stress is, for example, planting the transgenic plant in a flower pot containing soil containing vermiculite, perlite, bonsol, etc. Can be assessed by examining survival. Examples of environmental stress include low temperature, drying, and salt. For example, tolerance to drought stress can be evaluated by examining its survival without water for 2-4 weeks. The resistance to low temperature and freezing stress can be evaluated by placing the cells at 15 to -10 ° C for 1 to 10 days, then growing them at 20 to 35 ° C for 2 to 3 weeks, and examining the survival rate. Further, salt stress can be evaluated by placing at 100 to 600 mM NaCl for 1 hour to 7 days and then growing at 20 to 35 ° C. for 1 to 3 weeks and examining the survival rate. Thus, if the promoter of the present invention is used, its stress tolerance can be remarkably improved without hatching plants (particularly monocotyledonous plants).
(3) Suitable examples of transgenic plants
Preferable examples of the transgenic plant according to the present invention include a transgenic plant in which a vector in which the OsDREB gene is linked under the control of the LIP9 or WSI724 promoter is introduced into a monocotyledonous plant such as rice or wheat. it can. Since the LIP9 promoter contains two DRE regions, the OsDREB gene can effectively exhibit its stress resistance effect by binding to the cis element. Similarly, since the WSI724 promoter also contains two DRE regions, the expression of the OsDREB gene can be increased and the stress tolerance of the plant can be improved.

以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕イネのストレス誘導性遺伝子の同定
ｃＤＮＡマイクロアレイとノザン解析により、イネのストレス誘導性遺伝子を探索した。
１．イネｃＤＮＡマイクロアレイの作製
２〜３週間水耕栽培したイネ（日本晴）をそれぞれ乾燥、塩、低温処理を行った。乾燥処理は室温で風乾し、塩処理は２５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で栽培し、低温処理は４℃で栽培した。各ストレス処理を行ったイネは液体窒素で凍結後、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムを用いてｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型にして、ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ファージミドベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入し、クローニングした。このファージミドＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングした。得られた、ｃＤＮＡを含むラムダファージ粒子を宿主大腸菌に感染させ増幅した後、ファージ懸濁液として回収した。
上記ｃＤＮＡクローンの塩基配列をシークエンスして約１５００個の独立したクローンを選抜した。選抜したクローンをＰＣＲ法で増幅させ、ＧＴＭＡＳＳＳｙｓｔｅｍ（ＮｉｐｐｏｎＬａｓｅｒａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏａｔｅｄマイクロスライドグラス（ｍｏｄｅｌＳ７４４４；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）にスタンピングした後、ＵＶクロスリンクによって固定し、イネｃＤＮＡマイクロアレイを作製した（ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ（２００１）１３：６１−７２Ｓｅｋｉｅｔａｌ）。
２．マイクロアレイ解析
前項と同様の乾燥、塩、低温の各ストレス処理、又は１００μＭのアブシジン酸処理（５時間又は１０時間）を行ったイネ、ならびに無処理のイネの各々からｍＲＮＡを精製した。無処理のイネ由来のｍＲＮＡをコントロール、各ストレス又はアブシジン酸処理したイネ由来のｍＲＮＡをサンプルとして、それぞれＣｙ３、Ｃｙ５を用いた二蛍光標識法を用いて、ｃＤＮＡマイクロレイ解析を行った。マイクロアレイ解析の結果、インテンシティー：１０００以上で、コントロールに比較して３倍以上の発現量が認められた遺伝子をストレス誘導性遺伝子の候補として選択した。かくして、ａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）及びａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）がストレス誘導性遺伝子として選択された。
３．ノザンハイブリダイゼーションによる発現解析
前項で選択された遺伝子の発現特性をノザンハイブリダイゼーションにより解析した。まず、イネをアブシジン酸、乾燥、低温、塩、水の各ストレスに暴露し、それぞれ０，１，２，５，１０時間ごとにサンプリングした。なお、アブシジン酸、乾燥、低温、塩ストレスは、１．と同様の方法で付与し、水ストレスは純水に浸すことにより付与した。それぞれのサンプルから全ＲＮＡを調製し、電気泳動を行い、ノザン法により各遺伝子の発現を見た。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、ａ００２２はアブシジン酸、乾燥、低温，塩の各ストレスにより発現が誘導され、特にアブシジン酸、乾燥、塩では早い時間帯に発現の上昇がみられ、低温では遅いに時間帯に発現の上昇がみられた。また、ａ００６６は、そのストレス負荷時の発現パターン（乾燥、塩、低温誘導性で、低温による誘導性が乾燥、塩に比べて遅い）からＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていることが予想された。
〔実施例２〕プロモーター配列の解析
１．イネゲノムデータベースのスクリーニング
実施例１でストレス誘導性遺伝子として選択されたｃＤＮＡ：ａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）について、ＤＤＢＪのイネゲノムデータベースを利用し、ｂｌａｓｔにより相同部位の検索を行った。その結果、相同性が認められた遺伝子の開始コドンから５’側に向かって、１．１ｋｂ上流の配列をプロモーター配列（配列番号１）として選択した。また、ａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）についても同様の検索を行い、そのプロモーター配列（配列番号１０）が選択された。
図２にＬＩＰ９のプロモーター領域の構造を示す。図２から明らかなように、ＬＩＰ９はその構造中に２ヶ所のシス配列ＤＲＥ（（Ａ／Ｇ）ＣＣＧＡＣ）を持つことが確認された。また、図７にＷＳＩ７２４のプロモーター領域の構造を示す。ＷＳＩ７２４プロモーターについても、その構造中に２ヶ所のシス配列ＤＲＥ（（Ａ／Ｇ）ＣＣＧＡＣ）を持つことが確認された。
２．クローニング
選択されたプロモーター配列を基にプライマーを設計し、イネのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、クローニングを行った。用いたプライマー配列及びＰＣＲ条件は以下のとおりである。
ＬＩＰ９プロモーター用プライマー配列：

ＷＳＩ７２４プロモーター用プライマー配列：

ＰＣＲ条件：９５度１分５５度１分６８度２分３０サイクル
〔実施例３〕ストレスに対するＬＩＰ９プロモーター活性
（１）トランスジェニック植物の作製
ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔのプロモーター部位をトウモロコシのユビキチンプロモーターに置換して作られたＧ−ｕｂｉプラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様に切断したＬＩＰ９プロモーターの断片と連結した。ＬＩＰ９プロモーターを組み込んだプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断し、同様にｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断し切り出したＧｕｓ遺伝子と連結しＧｕｓ発現コンストラクト（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を作製した（図３）。プラスミドＧ−ＬＩＰ９：ＧＵＳを、培養後１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を作製した。このアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を以下のようにしてイネに感染させ、形質転換体を作製した。
イネの種子を７０％エタノールで１分浸漬し、さらに２％次亜塩素酸ナトリウムに１時間浸漬することにより滅菌し、次いで滅菌水により水洗後、Ｎ６Ｄ固形培地（１リットル当たり：ＣＨＵ［Ｎ６］ＢａｓａｌＳａｌｔＭｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ社製）３．９８ｇ、スクロース３０ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、カザミノ酸３００ｍｇ、Ｌ−プロリン２８７８ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸１ｍｇ、２，４−Ｄ２ｍｇ、ゲルライト４ｇ、ｐＨ５．８）のプレートに９粒ずつ播種し、２４日間培養してカルスを誘導した。形成された種子約２０粒分のカルスを、新たなＮ６Ｄ固形培地に移植し、さらに３日間培養した。
一方、上記アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を５ｍｌのリファンピシリン１００ｍｇ／ｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｌを含むＹＥＰ培地（１リットル当たり：Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ１０ｇ、Ｂａｃｔｏｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ４０６ｍｇ、ｐＨ７．２）で２８℃で２４時間培養した。このアグロバクテリウムを２０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（１リットル当たり：ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ１０ｍｇ、Ｈ_３ＢＯ_３３ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２ｍｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ２５０μｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２５μｇ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ２５μｇ、ＫＩ７５０μｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ１５０ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２５０ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ４０ｍｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ１５０ｍｇ、ニコチン酸１ｍｇ、チアミン塩酸１０ｍｇ、ピリドキシン塩酸１ｍｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、Ｌ−アルギニン１７６．７ｍｇ、グリシン７．５ｍｇ、Ｌ−グルタミン９００ｍｇ、アスパラギン酸３００ｍｇ、ＫＣｌ３ｇ、ｐＨ５．２）でＯ．Ｄ．_６６０が０．１になるようにうすめ、２０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を作製した。
つぎに、前述の３日間培養したカルスにアグロバクテリウム懸濁液を加え、１分間混合した。その後このカルスを滅菌したペーパータオルに置き、余分なアグロバクテリウム懸濁液を除去した後、滅菌した濾紙を敷いた２Ｎ６−ＡＳ固形培地（１リットル当たり：ＣＨＵ［Ｎ_６］ＢａｓａｌＳａｌｔＭｉｘｔｕｒｅ３．９８ｇ、スクロース３０ｇ、グルコース１０ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、カザミノ酸３００ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸１ｍｇ、２，４−Ｄ２ｍｇ、アセトシリンゴン１０ｍｇ、ゲルライト４ｇ、ｐＨ５．２）の上で２５℃３日間、暗黒下で培養した。３日間の培養後、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含む３％スクロース水溶液で白濁しなくなるまで十分に洗浄し、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン１０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地上で１週間培養した。その後カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン５０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地に移植して、１８日間培養した。さらにこのカルスを再分化培地（１リットル当たり：ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）４．６ｇ、スクロース３０ｇ、ソルビトール３０ｇ、カザミノ酸２ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸０．１ｍｇ、ＮＡＡ０．２ｍｇ、カイネチン２ｍｇ、カルベニシリン２５０ｍｇ、ハイグロマイシン５０ｍｇ、アガロース８ｇ、ｐＨ５．８）に移植した。１週間ごとに新しい培地に移植し直し、再分化して芽が１ｃｍ程度に生長したものはホルモンフリー培地（１リットル当たり：ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）４．６ｇ、スクロース３０ｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸０．１ｍｇ、ハイグロマイシン５０ｍｇ、ゲルライト２．５ｇ、ｐＨ５．８）に移植した。ホルモンフリー培地上で８ｃｍ程度に生長した植物体を合成粒状培土ボンソル１号（住友化学社製）を入れた植木鉢に移し、形質転換植物体の種子を得た。
同様にして、ｒｄ２９Ａプロモーター（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７，２８７−２９１）、又は３５Ｓプロモーター、ｓａｌＴプロモーター（配列番号５）をＧＵＳ遺伝子上流に結合したコンストラクトを作製し、イネ及び／又はタバコに導入した。
なお、ｓａｌＴプロモーターは、ＬＩＰ９プロモーターと同様のスクリーニングによってイネゲノム中より単離されたストレス誘導性プロモーターである。ｓａｌＴプロモーターに対応するマイクロアレイ上のｃＤＮＡのＩＤＮｏ．は、ａ２６６０である。ｓａｌＴプロモーターは、その構造中に特別なシス配列はもたないが、アブシジン酸、乾燥、低温、塩の各ストレスにより発現が誘導されることが確認されている（特願２００２−３７７３１６号参照）。
（２）乾燥ストレスに対するプロモーター活性
得られたＧＵＳ発現形質転換イネのＴ_２世代は２週間水耕栽培し、実施例１と同様にして乾燥ストレスに暴露した。
Ｇｕｓ発現形質転換タバコの場合、Ｔ_１世代は再生してきた植物体をプラントコーン内で３〜５週間生育させ、生長した葉を２等分し、一方をコントロールとし片方を室温で風乾し乾燥ストレスに暴露した。
各形質転換イネ及びタバコについて、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの分解による蛍光強度の変化からＧＵＳ活性を測定した。図４に、乾燥ストレス負荷時における各種プロモーター導入形質転換植物のＧＵＳ活性を示す。
図４から明らかなように、単子葉植物であるイネでは、ｒｄ２９ＡプロモーターよりもｓａｌＴプロモータやＬＩＰ９プロモーターがより強いストレス誘導性を示した。特に、ＬＩＰ９プロモータはｓａｌＴの約２倍という、強い活性を示した。ＬＩＰ９プロモーターは双子葉植物であるタバコでもストレス誘導性プロモーター活性を示したが、イネに比較してその活性は弱かった。
（３）塩ストレスに対するプロモーター活性
次に、ＬＩＰ９プロモーター−ＧＵＳコンストラクト導入イネの植物体全体を塩水に浸し、ＧＵＳ染色を行ったところ、植物体全体が染色された（図５）。このことから、ＬＩＰ９プロモーターは、ストレスを負荷された植物体全体で機能することが確認された。
〔実施例４〕ストレスに対するＷＳＩ７２４プロモーター活性
実施例３と同様にして、ＷＳＩ７２４プロモーターで形質転換したイネを作製し、そのストレス耐性を確認した。
（１）トランスジェニック植物の作製
ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔのプロモーター部位をトウモロコシのユビキチンプロモーターに置換して作られたＧ−ｕｂｉプラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様に切断したＷＳＩ７２４プロモーターの断片と連結した。ＷＳＩ７２４プロモーターを組み込んだプラスミドをＢａｍＨＩで切断して末端を平滑化した後、ｐＢＩＧベクターのＳｍａＩで切断した部位に連結してＧＵＳ発現コンストラクト（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）を作製した。次いで、プラスミドＷＳＩ７２４：ＧＵＳを、培養後１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）を作製した。このアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）をイネに感染させ、形質転換体を作製した。
（２）乾燥ストレスに対するプロモーター活性
得られたＧＵＳ発現形質転換イネを実施例３と同様にして乾燥ストレスに暴露し、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの分解による蛍光強度の変化からＧＵＳ活性を測定した。その結果、乾燥ストレスを負荷（切り取って２４時間放置）した形質転換イネの葉では、コントロール（切り取ってすぐに凍結）の葉に比較して、高いＧＵＳ活性が認められた。また、乾燥ストレス（２４時間）負荷後の形質転換イネをＧＵＳ染色したところ、根と葉の両方でＧＵＳ活性が認められた。
〔実施例５〕形質転換イネ中の導入遺伝子とＬＩＰ９及びＷＳＩ７２４遺伝子の発現
実施例３と同様にして、トウモロコシのユビキチンプロモーター、又は３５Ｓプロモーター支配下にＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子（配列番号６）又はＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（配列番号８）をイネに導入した形質転換体を作製した。そして、形質転換体の導入遺伝子ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＤＲＥＢ１Ｃと、導入遺伝子が発現を変化させたと考えられるＬＩＰ９（ａ００２２）、ＷＳＩ７２４（ａ００６６）、ｓａｌＴ（ａ２６６０）のｍＲＮＡレベルをノザン解析により調べた。
プローブとしては、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子（配列番号６）、ＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（配列番号７）、ＬＩＰ９遺伝子（ａ００２２：配列番号２）、ＷＳＩ７２４遺伝子（ａ００６６：配列番号８）、ｓａｌＴ遺伝子（ａ２６６０：配列番号９）を用いた（配列番号６、７については、配列表中の各コーディング領域の配列をプローブとして使用）。なお、コントロールとして、ベクターのみを形質転換したイネを同様に解析した。
形質転換イネは、５日間３０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む０．１％ベンーレート溶液中で選抜した後、ボンソル１号の入った鉢に植え替えて１２日間育てた。野性株も同様に育てた。各植物から全ＲＮＡを調製して、電気泳動を行い、実施例１と同様にノザン法で各遺伝子の発現を見た。結果を図６に示す。図中、ａ、ｂ、ｃはそれぞれ形質転換体のラインを示す。
この結果、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子を導入された形質転換イネでは、プロモーター領域にＤＲＥ配列を持つＬＩＰ９の発現は誘導されたが、プロモーター領域にＤＲＥ配列を持たないｓａｌＴの発現は導入遺伝子（ＯｓＤＲＥＢ１ＡやＤＲＥＢ１Ｃ）の発現と一致しなかった。また、ＬＩＰ９と同様にプロモーター領域にＤＲＥ配列を持ち、ＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていると予想されているＷＳＩ７２４遺伝子の発現も、これら形質転換体で誘導された。
ＬＩＰ９やＷＳＩ７２４プロモーター上にはＤＲＥ配列が存在し、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子の過剰発現体ではＬＩＰ９遺伝子やＷＳＩ７２４遺伝子が高発現している。ＬＩＰ９やＷＳＩ７２４はＯｓＤＲＥＢ１ＡをはじめとするＯｓＤＲＥＢ遺伝子の標的遺伝子と考えられ、したがってＬＩＰ９やＷＳＩ７２４プロモーターはＯｓＤＲＥＢ遺伝子を過剰発現するための最適なプロモーターと推定された。
〔参考例１〕ｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ，Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａの作製
まず、Ｇ−ｕｂｉ，Ｇ３５Ｓ−ＳｈΔは以下のように作製した。まずｐＢＩＧプラスミド（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：２０３（１９９０））をＢａｍＨＩで切断・平滑化処理した後、連結してＢａｍＨＩ切断部位をつぶし、さらにＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断した。この断片とｐＢＥ２１１３Ｎｏｔプラスミドを同様に切断して得られる約１．２ｋｂの断片とを連結して、ｐＢＩＧ２１１３Ｎｏｔプラスミドを作製した。
つぎにｐＢＩＧ２１１３ＮｏｔをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、同様に切断されたｒｄ２９Ａプロモーターの断片（約０．９ｋｂ，Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：２８７−２９１（１９９９））と連結して、ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔプラスミドを作製した。さらにこのｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断後、同様に切断されたトウモロコシのユビキチン遺伝子（Ｕｂｉ−１）のプロモーターの断片（約２．０ｋｂ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１８：６７５−６８９（１９９２））又はｐ３５Ｓ−ｓｈΔ−ｓｔｏｐのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとトウモロコシのスクロースシンターゼ遺伝子（Ｓｈ１）のイントロンの一部を含んだ断片（約１．６ｋｂ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ９６：１５３４８−１５３５３（１９９９））と連結してＧ−ｕｂｉプラスミド又はＧ３５Ｓ−ＳｈΔプラスミドを作製した。
前記ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ，Ｇ−ｕｂｉ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔはそれぞれＢａｍＨＩで切断した後、同様に切断したイネの転写因子をコードするＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子断片とｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、得られた連結物により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体を培養後、該培養物からプラスミドｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ，Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａをそれぞれ精製した。次いで、これらの塩基配列を決定し、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子がセンス方向に結合したものを選抜した。
上記のプラスミドｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａを持つ大腸菌ＤＨ５αとヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１及びアグロバクテリウムＣ５８を共に、ＬＢ寒天培地を用いて２８℃で２４時間混合培養した。生成したコロニーを掻き取り、１ｍｌのＬＢ培地に懸濁した。この懸濁液１０μｌをリファンピシリン１００ｍｇ／ｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、２８℃で２日間培養して、接合体アグロバクテリウムＣ５８（ｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）を得た。一方上記のプラスミドＧ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１ＡとＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａのプラスミドを、培養後１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）とアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）をそれぞれ得た。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, the scope of the present invention is not limited to these.
[Example 1] Identification of stress-inducible genes in rice Rice stress-inducible genes were searched by cDNA microarray and Northern analysis.
1. Production of Rice cDNA Microarray Rice (Nipponbare) that had been hydroponically cultivated for 2 to 3 weeks was dried, salted, and treated at low temperature. The drying treatment was air-dried at room temperature, the salt treatment was cultivated with a 250 mM NaCl solution, and the low temperature treatment was cultivated at 4 ° C. Rice subjected to each stress treatment was frozen with liquid nitrogen, and then total RNA was extracted by the guanidine thiocyanate-cesium chloride method, and mRNA was prepared using an Oligo (dt) -cellulose column. Using the obtained mRNA as a template, cDNA was synthesized using the HybridZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack cloning kit (manufactured by STRATAGENE) and inserted into the EcoRI-XhoI cleavage site of the HybridZAP-2.1 phagemid vector. And cloned. This phagemid DNA was packaged using Gigapack III Gold packaging extract (manufactured by STRATAGENE). The obtained lambda phage particles containing cDNA were amplified by infecting host E. coli, and then recovered as a phage suspension.
About 1500 independent clones were selected by sequencing the base sequence of the cDNA clone. The selected clones were amplified by PCR, stamped on poly-L-lysine-coated microslide glass (model S7444; Matsusunami) using GTASS System (Nippon Laser and Electronic Laboratory), and then fixed by UV link. A rice cDNA microarray was prepared (The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al).
2. Microarray analysis mRNA was purified from each of the rice subjected to the same dry, salt, and low-temperature stress treatments as in the previous section, or 100 μM abscisic acid treatment (5 hours or 10 hours) and untreated rice. CDNA microray analysis was performed using the two-fluorescence labeling method using Cy3 and Cy5, respectively, using untreated rice-derived mRNA as a control and each stress or abscisic acid-treated rice-derived mRNA as a sample. As a result of the microarray analysis, a gene having an intensity of 1000 or more and an expression level of 3 times or more compared to the control was selected as a stress-inducible gene candidate. Thus, a0022 (LIP9: SEQ ID NO: 2) and a0066 (WSI724: SEQ ID NO: 8) were selected as stress-inducible genes.
3. Expression analysis by Northern hybridization Expression characteristics of the genes selected in the previous section were analyzed by Northern hybridization. First, rice was exposed to abscisic acid, drying, low temperature, salt, and water stress, and sampled every 0, 1, 2, 5, and 10 hours, respectively. Abscisic acid, drying, low temperature, and salt stress are: The water stress was applied by immersing in pure water. Total RNA was prepared from each sample, electrophoresed, and the expression of each gene was observed by the Northern method. The results are shown in FIG.
As is apparent from FIG. 1, the expression of a0022 is induced by stresses of abscisic acid, dryness, low temperature, and salt. In particular, abscisic acid, dryness, and salt show an increase in expression at an early time, and at low temperatures it is slow. Increased expression was observed in the time zone. In addition, a0066 was predicted to be a target for OsDREB because of its expression pattern at the time of stress load (dryness, salt, low temperature inductivity and low temperature inductivity is slower than dryness, salt).
[Example 2] Analysis of promoter sequence Screening of Rice Genome Database For cDNA: a0022 (LIP9: SEQ ID NO: 2) selected as a stress-inducible gene in Example 1, homologous sites were searched by blast using DDBJ rice genome database. As a result, a sequence 1.1 kb upstream from the start codon of the gene for which homology was recognized toward the 5 ′ side was selected as the promoter sequence (SEQ ID NO: 1). A similar search was performed for a0066 (WSI724: SEQ ID NO: 8), and the promoter sequence (SEQ ID NO: 10) was selected.
FIG. 2 shows the structure of the promoter region of LIP9. As is clear from FIG. 2, it was confirmed that LIP9 has two cis sequences DRE ((A / G) CCGAC) in its structure. FIG. 7 shows the structure of the promoter region of WSI724. The WSI724 promoter was also confirmed to have two cis sequences DRE ((A / G) CCGAC) in its structure.
2. Cloning Primers were designed based on the selected promoter sequence, and PCR was performed using rice genomic DNA as a template for cloning. The primer sequences and PCR conditions used are as follows.
Primer sequence for LIP9 promoter:

Primer sequence for WSI724 promoter:

PCR conditions: 95 degrees 1 minute 55 degrees 1 minute 68 degrees 2 minutes 30 cycles [Example 3] LIP9 promoter activity against stress (1) Production of transgenic plant The pBIG29APHSNot promoter site is replaced with a maize ubiquitin promoter. The G-ubi plasmid was cleaved with BamHI-HindIII and ligated with the similarly cleaved fragment of the LIP9 promoter. A plasmid incorporating the LIP9 promoter was cleaved with BamHI-EcoRI, and pBI221 (Clontech) was similarly cleaved with BamHI-EcoRI and ligated with the cut-out Gus gene to produce a Gus expression construct (G-LIP9: GUS) (FIG. 3). ). Plasmid G-LIP9: GUS was introduced into Agrobacterium EHA105 washed with 10% glycerol after culturing by electroporation to produce Agrobacterium EHA105 (G-LIP9: GUS). The Agrobacterium EHA105 (G-LIP9: GUS) was infected with rice as follows to prepare a transformant.
Rice seeds were soaked in 70% ethanol for 1 minute, further sterilized by soaking in 2% sodium hypochlorite for 1 hour, then washed with sterilized water and then N6D solid medium (per liter: CHU [N6] Basal Salt Mixture (manufactured by Sigma) 3.98 g, sucrose 30 g, myo-inositol 100 mg, casamino acid 300 mg, L-proline 2878 mg, glycine 2 mg, nicotinic acid 0.5 mg, pyridoxine hydrochloride 0.5 mg, thiamine hydrochloride 1 mg, 2, 4 -D 2 mg, gellite 4 g, pH 5.8) 9 seeds each, and cultured for 24 days to induce callus. The callus of about 20 formed seeds was transplanted to a new N6D solid medium and further cultured for 3 days.
On the other hand, Agrobacterium EHA105 (G-LIP9: GUS) containing 5 ml of rifampicillin 100 mg / l and kanamycin 20 mg / l of YEP medium (per liter: Bacto peptone 10 g, Bacto yeast extract 10 g, NaCl 5 g, MgCl ₂ · _6H 2 O 406mg, it was cultured for 24 hours at 28 ℃ at pH 7.2). An AAM medium containing 20 mg / l acetosyringone (per liter: MnSO ₄ .5H ₂ O 10 mg, H ₃ BO ₃ 3 mg, ZnSO ₄ · 7H ₂ O 2 mg, Na ₂ MoO ₄ · 2H ₂ O 250 μg, CuSO ₄ · 5H ₂ O 25 μg, CoCl ₂ · 6H ₂ O 25 μg, KI 750 μg, CaCl ₂ · 2H ₂ O 150 mg, MgSO ₄ · 7H ₂ O 250 mg, Fe-EDTA 40 mg, NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O 150 mg, nicotinic acid 1 mg, thiamine hydrochloride 10 mg, pyridoxine hydrochloride 1 mg, myo-inositol 100 mg, L-arginine 176.7 mg, glycine 7.5 mg, L-glutamine 900 mg, aspartic acid 300 mg, KCl 3 g, pH 5.2). D. ₆₆₀ was reduced to 0.1, and 20 ml of Agrobacterium suspension was prepared.
Next, the Agrobacterium suspension was added to the callus cultured for 3 days and mixed for 1 minute. The callus was then placed on a sterilized paper towel to remove excess Agrobacterium suspension, and then 2N6-AS solid medium (per liter: CHU [N ₆ ] Basal Salt Mixture 3.98 g laid with sterilized filter paper. , Sucrose 30 g, glucose 10 g, myo-inositol 100 mg, casamino acid 300 mg, glycine 2 mg, nicotinic acid 0.5 mg, pyridoxine hydrochloride 0.5 mg, thiamine hydrochloride 1 mg, 2,4-D 2 mg, acetosyringone 10 mg, gellite 4 g, pH 5 .2) and cultured in the dark at 25 ° C. for 3 days. After culturing for 3 days, the cells were thoroughly washed with a 3% sucrose aqueous solution containing 500 mg / l carbenicillin until they became no cloudy, and cultured for 1 week on an N6D solid medium containing 500 mg / l carbenicillin and 10 mg / l hygromycin. Thereafter, the cells were transplanted to an N6D solid medium containing 500 mg / l carbenicillin and 50 mg / l hygromycin and cultured for 18 days. Furthermore, this callus was redifferentiated medium (per liter: mixed salt for Murashige-Skoog medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 4.6 g, sucrose 30 g, sorbitol 30 g, casamino acid 2 g, myo-inositol 100 mg, glycine 2 mg, nicotinic acid 0. 5 mg, pyridoxine hydrochloride 0.5 mg, thiamine hydrochloride 0.1 mg, NAA 0.2 mg, kinetin 2 mg, carbenicillin 250 mg, hygromycin 50 mg, agarose 8 g, pH 5.8). Replanted to a new medium every week, and re-differentiated to grow buds to about 1 cm is a hormone-free medium (per liter: 4.6 g mixed salt for Murashige-Skoog medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), sucrose. 30 g, glycine 2 mg, nicotinic acid 0.5 mg, pyridoxine hydrochloride 0.5 mg, thiamine hydrochloride 0.1 mg, hygromycin 50 mg, gellite 2.5 g, pH 5.8). Plants grown to about 8 cm on a hormone-free medium were transferred to a flower pot containing a synthetic granular soil bonsol No. 1 (manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.) to obtain transformed plant seeds.
Similarly, a rd29A promoter (Nature Biotechnology (1999) 17, 287-291), or a 35S promoter and a salT promoter (SEQ ID NO: 5) linked to the upstream of the GUS gene were prepared and introduced into rice and / or tobacco. .
The salT promoter is a stress-inducible promoter isolated from the rice genome by the same screening as the LIP9 promoter. ID No. of cDNA on the microarray corresponding to the salT promoter Is a2660. The salT promoter has no special cis sequence in its structure, but it has been confirmed that expression is induced by abscisic acid, drying, low temperature, and salt stress (see Japanese Patent Application No. 2002-377316). .
(2) T ₂ generation promoter activity resulting GUS expression transgenic rice to drought stress and 2 weeks water culture, and exposed to drought stress in the same manner as in Example 1.
For Gus expression transgenic tobacco, T ₁ generation were grown for 3-5 weeks plants have been reproduced in the plant corn, grown leaves 2 aliquoted and air dried drought the one to one with the control at room temperature Exposed to.
About each transformed rice and tobacco, GUS activity was measured from the change of the fluorescence intensity by decomposition | disassembly of 4-methylbelliferyl- (beta) -D-glucuronide. FIG. 4 shows the GUS activity of various promoter-introduced transformed plants under drought stress.
As is clear from FIG. 4, in rice, which is a monocotyledonous plant, the salT promoter and LIP9 promoter showed stronger stress-inducibility than the rd29A promoter. In particular, the LIP9 promoter showed a strong activity of about twice that of salT. The LIP9 promoter showed stress-inducible promoter activity even in tobacco, a dicotyledonous plant, but its activity was weaker than that in rice.
(3) Promoter activity against salt stress Next, the entire plant body of the LIP9 promoter-GUS construct-introduced rice was immersed in salt water and subjected to GUS staining, whereby the entire plant body was stained (FIG. 5). From this, it was confirmed that the LIP9 promoter functions in the whole plant loaded with stress.
[Example 4] WSI724 promoter activity against stress In the same manner as in Example 3, rice transformed with the WSI724 promoter was prepared, and its stress resistance was confirmed.
(1) Production of Transgenic Plant A G-ubi plasmid produced by replacing the promoter site of pBIG29APHSNot with a maize ubiquitin promoter was cleaved with BamHI-HindIII and ligated with a similarly cut fragment of WSI724 promoter. A plasmid incorporating the WSI724 promoter was cleaved with BamHI to blunt the ends, and then ligated to the site cleaved with SmaI of the pBIG vector to prepare a GUS expression construct (WSI724: GUS). Next, the plasmid WSI724: GUS was introduced into Agrobacterium EHA105 washed with 10% glycerol after culturing by electroporation to produce Agrobacterium EHA105 (WSI724: GUS). This Agrobacterium EHA105 (WSI724: GUS) was infected with rice to produce a transformant.
(2) Promoter activity against drought stress The obtained GUS-expressing transformed rice was exposed to drought stress in the same manner as in Example 3, and GUS activity was determined from the change in fluorescence intensity due to degradation of 4-methylbelliferyl-β-D-glucuronide. It was measured. As a result, the transformed rice leaves loaded with drought stress (cut and left for 24 hours) showed higher GUS activity than the control (cut and immediately frozen) leaves. In addition, when GUS staining was performed on transformed rice after loading with drought stress (24 hours), GUS activity was observed in both roots and leaves.
[Example 5] Expression of transgene and LIP9 and WSI724 genes in transgenic rice As in Example 3, OsDREB1A gene (SEQ ID NO: 6) or DREB1C gene (sequence) under the control of maize ubiquitin promoter or 35S promoter A transformant was prepared by introducing No. 8) into rice. Then, the mRNA levels of the transformants, transgenes OsDREB1A and DREB1C, and LIP9 (a0022), WSI724 (a0066), and salT (a2660), which are considered to have altered the expression of the transgene, were examined by Northern analysis.
As probes, OsDREB1A gene (SEQ ID NO: 6), DREB1C gene (SEQ ID NO: 7), LIP9 gene (a0022: SEQ ID NO: 2), WSI724 gene (a0066: SEQ ID NO: 8), salT gene (a2660: SEQ ID NO: 9) (For SEQ ID NOS: 6 and 7, the sequence of each coding region in the sequence listing was used as a probe). As a control, rice transformed with only the vector was similarly analyzed.
The transformed rice was selected in a 0.1% beanrate solution containing 30 mg / ml hygromycin for 5 days, then transplanted to a pot containing Bonsol No. 1 and grown for 12 days. Wild stocks were nurtured as well. Total RNA was prepared from each plant, electrophoresed, and the expression of each gene was observed by the Northern method as in Example 1. The results are shown in FIG. In the figure, a, b, and c represent lines of transformants, respectively.
As a result, in transformed rice plants introduced with the OsDREB1A and DREB1C genes, expression of LIP9 having a DRE sequence in the promoter region was induced, but expression of salT without a DRE sequence in the promoter region was induced by transgenes (OsDREB1A and DREB1C). ) Expression was not consistent. Similarly to LIP9, expression of the WSI724 gene, which has a DRE sequence in the promoter region and is expected to be a target for OsDREB, was also induced in these transformants.
A DRE sequence is present on the LIP9 or WSI724 promoter, and the LIP9 gene or the WSI724 gene is highly expressed in the overexpressed OsDREB1A gene. LIP9 and WSI724 are considered to be target genes of OsDREB genes including OsDREB1A. Therefore, LIP9 and WSI724 promoters were presumed to be optimal promoters for overexpression of the OsDREB gene.
Reference Example 1 Preparation of pBE35S: OsDREB1A, G-ubi: OsDREB1A and G35S-ShΔ: OsDREB1A First, G-ubi and G35S-ShΔ were prepared as follows. First, the pBIG plasmid (Nucleic Acids Research 18: 203 (1990)) was cleaved and smoothed with BamHI, ligated to cleave the BamHI cleavage site, and further cleaved with HindIII and EcoRI. This fragment was ligated with a fragment of about 1.2 kb obtained by cutting the pBE2113Not plasmid in the same manner to prepare a pBIG2113Not plasmid.
Next, pBIG2113Not was cleaved with HindIII and BamHI, and ligated with a similarly cleaved rd29A promoter fragment (about 0.9 kb, Nature biotechnology 17: 287-291 (1999)) to prepare pBIG29APHSNot plasmid. Further, after cutting this pBIG29APHSNot plasmid with HindIII and SalI, a fragment of the maize ubiquitin gene (Ubi-1) promoter similarly cut (about 2.0 kb, Plant Molecular Biology 18: 675-689 (1992)) or p35S -A fragment containing an intron of shΔ-stop CaMV 35S promoter and maize sucrose synthase gene (Sh1) (about 1.6 kb, Proceeding National Academy of Science USA 96: 15348-15353 (1999)). Thus, a G-ubi plasmid or a G35S-ShΔ plasmid was prepared.
The pBE2113Not, G-ubi and G35S-ShΔ were cleaved with BamHI and then ligated with the OsDREB1A gene fragment encoding the similarly cleaved rice transcription factor using ligation high (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). E. coli DH5α was transformed with the product. After culturing the transformant, plasmids pBE35S: OsDREB1A, G-ubi: OsDREB1A and G35S-ShΔ: OsDREB1A were purified from the culture. Subsequently, these base sequences were determined, and those in which the OsDREB1A gene was bound in the sense direction were selected.
E. coli DH5α having the plasmid pBE35S: OsDREB1A, E. coli HB101 having the helper plasmid pRK2013, and Agrobacterium C58 were mixed and cultured at 28 ° C. for 24 hours using an LB agar medium. The produced colonies were scraped off and suspended in 1 ml of LB medium. 10 μl of this suspension was applied to an LB agar medium containing 100 mg / l of rifampicillin and 20 mg / l of kanamycin, and cultured at 28 ° C. for 2 days to obtain a zygote Agrobacterium C58 (pBE35S: OsDREB1A). On the other hand, plasmids G-ubi: OsDREB1A and G35S-ShΔ: OsDREB1A described above were introduced into Agrobacterium EHA105 washed with 10% glycerol after culturing by electroporation, and Agrobacterium EHA105 (G-ubi: OsDREB1A ) And Agrobacterium EHA105 (G35S-ShΔ: OsDREB1A) were obtained.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Industrial applicability

本発明によれば、単子葉植物において有効に機能しうるストレス誘導性プロモーターが提供される。該プロモーターはＤＲＥ配列を含み、したがって、その支配下にＯｓＤＲＥＢ遺伝子等を連結して植物に導入すれば、イネ等の単子葉植物において、強いストレス耐性トランスジェニック植物を作出することができる。 According to the present invention, a stress-inducible promoter that can function effectively in monocotyledonous plants is provided. The promoter contains a DRE sequence. Therefore, if an OsDREB gene or the like is linked and introduced into a plant under the control of the promoter, a strong stress-resistant transgenic plant can be produced in a monocotyledonous plant such as rice.

配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プライマー
配列番号１２−人工配列の説明：プライマーSEQ ID NO: 3-description of artificial sequence: primer SEQ ID NO: 4-description of artificial sequence: primer SEQ ID NO: 11-description of artificial sequence: primer SEQ ID NO: 12-description of artificial sequence: primer

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

A rice-derived promoter comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10
(B) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 10, and has stress-inducible promoter activity

The promoter according to claim 1, wherein the stress is drought stress, low temperature stress or salt stress.

A recombinant vector comprising the promoter according to claim 1 or 2.

The vector according to claim 3, comprising a structural gene and / or a regulatory gene that further improves stress tolerance under the control of the promoter according to claim 1 or 2 in a manner capable of functioning.

Structural genes and / or regulatory genes that improve stress tolerance are selected from the key enzyme P5CS gene for proline synthesis, the galactinol synthesis gene AtGolS3 gene, the Arabidopsis transcription factor DREB gene, the rice transcription factor OsDREB gene, and the ABA synthase NCED gene The vector according to claim 4.

The vector according to claim 5, wherein the structural gene and / or regulatory gene that improves stress tolerance is a rice-derived transcription factor OsDREB gene.

A transformant obtained by introducing the vector according to any one of claims 3 to 6 into a host.

The transformant according to claim 7, wherein the host is a plant.

The transformant according to claim 8, wherein the host is a monocotyledonous plant.

A method for improving stress tolerance of a plant by introducing the promoter according to claim 1 or 2 into the plant.